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課題

解決手段

Mre11タンパク質をコードするDNA又はMre11タンパク質のC末端ドメインの一部若しくは全部を欠失したタンパク質をコードするDNAを細胞に導入することを特徴とするテロメア長の調節方法。

概要

背景

テロメアは、真核細胞において線状染色体を構成する二本鎖DNA末端に存在する機能構造体である。この構造体は、多くの場合、単純な反復配列から成り、染色体同志の融合による染色体異常の防止、減数分裂期における相同染色体対合、遺伝子の発現制御、核内における染色体の存在様式の決定などに重要な役割を果たすことが知られている。

一般的に、二本鎖DNAの複製は、まずプライマーゼによりRNAプライマーが合成され、次いでDNAポリメラーゼにより、その先にDNA鎖伸長合成されることにより行われる。RNAプライマーは、DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって除去されると同時に、除去された部分はDNAポリメラーゼによってDNA鎖に置き換えられる。ところが、線状染色体の場合、新生鎖の5'最末端のRNAプライマーはDNA鎖に置き換えられることがないため、複製が終了したときには、RNAプライマーのサイズ分だけ短縮化することになる。従って、細胞分裂を繰り返す度に、娘細胞の染色体の末端は次第に短縮することになり、最後には染色体が不安定になり細胞は死に至る。一方、ガン細胞生殖細胞などの不死化細胞中では、テロメアを伸長させることのできるテロメラーゼが高発現しており、テロメア長の短縮が生じないことが明らかにされている。そこで、テロメラーセ活性の調節を作用機作とする細胞寿命調節剤抗ガン剤検索活発に行われている。

しかし、最近、酵母マウスなどでテロメラーゼの遺伝子を破壊した場合でもテロメアが短縮するまでに時間がかかること[Blasco, M. A.,et al.:Cell, 91:25-34 (1997);Rudolph, K. L., et al.:Cell, 96:701-12 (1999);Herrera, E.,et al.:Embo J, 18:2950-60(1999)]、テロメラーゼの活性には直接関係のない遺伝子の変異体でもテロメアの短縮や伸長が起こること[Boulton, S. J.,et al.:Embo J, 17:1819-28 (1998);Furuse, M., et al.: Embo J, 17:6412-25(1998);Wilson, S., et al.:Nucleic AcidsRes, 27:2655-61(1999)]が明らかとなり、テロメラーゼ以外の機能によってもテロメアが維持されている可能性が指摘されている[Nakamura, T. M., et al.:Science, 282:493-6 (1998);Reddel, R. R., et al. A review. Biochemistry (Mosc), 62:1254-62 (1997)]。なかでも、DNAの二本鎖切断修復等に関与していることが知られていたMre11-Rad50-Xrs2複合体が、テロメア長の調節にも関わっていることが報告された[Boulton, S. J. , et al.: Embo J, 17: 1819-28 (1998);Furuse, M.,et al.:Embo J, 17:6412-25 (1998);Le, S., et al.: Genetics, 152:143-52 (1999)]。Mre11-Rad50-Xrs2(Nbs1)複合体[Ajimura, M.,et al.: Genetics, 133:51-66 (1993);Johzuka, K.,et al.:Genetics, 139:1521-32 (1995)]は、強いDNA結合能を有する二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ一本鎖DNAエンドヌクレアーゼとしての機能を有するMre11を中心に形成されるタンパク質複合体であり[Furuse, M.,et al.:Embo J,17:6412-25 (1998);Paull, T. T.,et al.: Mol Cell, 1:969-79 (1998);Usui, T.,et al.:Cell, 95:705-16 (1998);Trujillo, K. M.,et al.:J Biol Chem,273:21447-50 (1998)]、DNA二本鎖切断の修復や染色体組換えの開始反応に必須な酵素である。出芽酵母サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)や分裂酵母シゾサッカマイセズ・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)では、この複合体酵素の構成タンパク質の一つでも失われると、テロメアの顕著な短縮が見られる[Boulton, S. J.,et al.:Embo J, 17:1819-28 (1998)]。Mre11-Rad50-Xrs2(Nbs1)複合体の各構成タンパク質は、いずれもそのホモログがヒト中に存在し[Dolganov, G. M.,et al.:Mol Cell Biol, 16:4832-41 (1996);Petrini, J. H.,et al.:Genomics, 29: 80-6 (1995)]、酵母からヒトに至る真核生物全般で共通の役割を果たすと考えられている。

概要

テロメア長の調節方法の提供。

Mre11タンパク質をコードするDNA又はMre11タンパク質のC末端ドメインの一部若しくは全部を欠失したタンパク質をコードするDNAを細胞に導入することを特徴とするテロメア長の調節方法。

目的

本発明は、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾することを特徴とするテロメア長の調節方法を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

真核細胞中の内在性Mre11タンパク質生理学的活性を修飾することを特徴とするテロメア長調節方法

請求項2

内在性Mre11タンパク質の生理学的活性の修飾が、外来Mre11タンパク質をコードするDNA又は外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン若しくはC末端ドメイン改変したタンパク質をコードするDNAを、該DNAが発現可能な状態で、細胞内に導入することにより行われるものである請求項1記載のテロメア長の調節方法。

請求項3

外来Mre11タンパク質が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項2記載の調節方法。(a)配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(b) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質

請求項4

外来Mre11タンパク質をコードするDNAが、以下の(c)又は(d)のDNAである請求項2記載の調節方法。(c) 配列番号1又は配列番号3で表される塩基配列を含むDNA(d) (c)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質をコードするDNA

請求項5

外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質が、以下の(e)又は(f)のタンパク質である請求項2記載の調節方法。(e) 配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(f) 配列番号6で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質

請求項6

外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質をコードするDNAが、以下の(g)又は(h)のDNAである請求項2記載の調節方法。(g) 配列番号5で表される塩基配列を含むDNA(h) (g)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

請求項7

外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質が、以下の(i)又は(j)のタンパク質である請求項2記載の調節方法。(i) 配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(j) 配列番号8で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質

請求項8

外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAが、以下の(k)又は(l)のDNAである請求項2記載の調節方法。(k) 配列番号7で表される塩基配列を含むDNA(l) (k)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

請求項9

真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質を有効成分として含有してなるテロメア長調節剤

請求項10

内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質が、外来Mre11タンパク質をコードするDNA又は外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン若しくはC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有してなるDNA構築物である請求項9記載のテロメア長調節剤。

請求項11

外来Mre11タンパク質が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項10記載のテロメア長調節剤。(a) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(b) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質

請求項12

外来Mre11タンパク質をコードするDNAが、以下の(c)又は(d)のDNAである請求項10記載のテロメア長調節剤。(c) 配列番号1又は配列番号3で表される塩基配列を含むDNA(d) (c)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質をコードするDNA

請求項13

外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質が、以下の(e)又は(f)のタンパク質である請求項10記載のテロメア長調節剤。(e) 配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(f) 配列番号6で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質

請求項14

外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質をコードするDNAが、以下の(g)又は(h)のDNAである請求項10記載のテロメア長調節剤。(g) 配列番号5で表される塩基配列を含むDNA(h) (g)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

請求項15

外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質が、以下の(i)又は(j)のタンパク質である請求項10記載のテロメア長調節剤。(i) 配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(j) 配列番号8で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質

請求項16

外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAが、以下の(k)又は(l)のDNAである請求項10記載のテロメア長調節剤。(k) 配列番号7で表される塩基配列を含むDNA(l) (g)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

請求項17

真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質を有効成分として含有してなるテロメア長関連疾患の遺伝子治療剤

請求項18

内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質が、外来Mre11タンパク質をコードするDNA又は外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン若しくはC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有してなるDNA構築物である請求項17記載の遺伝子治療剤。

請求項19

テロメア長関連疾患が、悪性腫瘍又は細胞老化性疾患である請求項17記載の遺伝子治療剤。

請求項20

悪性腫瘍が、黒色腫肝細胞癌乳癌胃癌脳腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである請求項19記載の遺伝子治療剤。

請求項21

外来Mre11タンパク質が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項18記載の遺伝子治療剤。(a) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(b) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質

請求項22

外来Mre11タンパク質をコードするDNAが、以下の(c)又は(d)のDNAである請求項18記載の遺伝子治療剤。(c) 配列番号1又は配列番号3で表される塩基配列を含むDNA(d) (c)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質をコードするDNA

請求項23

外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質が、以下の(e)又は(f)のタンパク質である請求項18記載の遺伝子治療剤。(e) 配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(f) 配列番号6で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質

請求項24

外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質をコードするDNAが、以下の(g)又は(h)のDNAである請求項18記載の遺伝子治療剤。(g) 配列番号5で表される塩基配列を含むDNA(h) (g)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

請求項25

外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質が、以下の(i)又は(j)のタンパク質である請求項18記載の遺伝子治療剤。(i) 配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質(j) 配列番号8で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質

請求項26

外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAが、以下の(k)又は(l)のDNAである請求項18記載の遺伝子治療剤。(k) 配列番号7で表される塩基配列を含むDNA(l) (g)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

技術分野

列番号13:合成DNA

背景技術

0001

本発明は、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質生理学的活性を修飾することを特徴とするテロメア長調節方法、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質を有効成分として含有してなるテロメア長調節剤及び真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質を有効成分として含有してなるテロメア長関連疾患の遺伝子治療剤に関する。

0002

テロメアは、真核細胞において線状染色体を構成する二本鎖DNA末端に存在する機能構造体である。この構造体は、多くの場合、単純な反復配列から成り、染色体同志の融合による染色体異常の防止、減数分裂期における相同染色体対合、遺伝子の発現制御、核内における染色体の存在様式の決定などに重要な役割を果たすことが知られている。

0003

一般的に、二本鎖DNAの複製は、まずプライマーゼによりRNAプライマーが合成され、次いでDNAポリメラーゼにより、その先にDNA鎖伸長合成されることにより行われる。RNAプライマーは、DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって除去されると同時に、除去された部分はDNAポリメラーゼによってDNA鎖に置き換えられる。ところが、線状染色体の場合、新生鎖の5'最末端のRNAプライマーはDNA鎖に置き換えられることがないため、複製が終了したときには、RNAプライマーのサイズ分だけ短縮化することになる。従って、細胞分裂を繰り返す度に、娘細胞の染色体の末端は次第に短縮することになり、最後には染色体が不安定になり細胞は死に至る。一方、ガン細胞生殖細胞などの不死化細胞中では、テロメアを伸長させることのできるテロメラーゼが高発現しており、テロメア長の短縮が生じないことが明らかにされている。そこで、テロメラーセ活性の調節を作用機作とする細胞寿命調節剤や抗ガン剤検索活発に行われている。

発明が解決しようとする課題

0004

しかし、最近、酵母マウスなどでテロメラーゼの遺伝子を破壊した場合でもテロメアが短縮するまでに時間がかかること[Blasco, M. A.,et al.:Cell, 91:25-34 (1997);Rudolph, K. L., et al.:Cell, 96:701-12 (1999);Herrera, E.,et al.:Embo J, 18:2950-60(1999)]、テロメラーゼの活性には直接関係のない遺伝子の変異体でもテロメアの短縮や伸長が起こること[Boulton, S. J.,et al.:Embo J, 17:1819-28 (1998);Furuse, M., et al.: Embo J, 17:6412-25(1998);Wilson, S., et al.:Nucleic AcidsRes, 27:2655-61(1999)]が明らかとなり、テロメラーゼ以外の機能によってもテロメアが維持されている可能性が指摘されている[Nakamura, T. M., et al.:Science, 282:493-6 (1998);Reddel, R. R., et al. A review. Biochemistry (Mosc), 62:1254-62 (1997)]。なかでも、DNAの二本鎖切断修復等に関与していることが知られていたMre11-Rad50-Xrs2複合体が、テロメア長の調節にも関わっていることが報告された[Boulton, S. J. , et al.: Embo J, 17: 1819-28 (1998);Furuse, M.,et al.:Embo J, 17:6412-25 (1998);Le, S., et al.: Genetics, 152:143-52 (1999)]。Mre11-Rad50-Xrs2(Nbs1)複合体[Ajimura, M.,et al.: Genetics, 133:51-66 (1993);Johzuka, K.,et al.:Genetics, 139:1521-32 (1995)]は、強いDNA結合能を有する二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ一本鎖DNAエンドヌクレアーゼとしての機能を有するMre11を中心に形成されるタンパク質複合体であり[Furuse, M.,et al.:Embo J,17:6412-25 (1998);Paull, T. T.,et al.: Mol Cell, 1:969-79 (1998);Usui, T.,et al.:Cell, 95:705-16 (1998);Trujillo, K. M.,et al.:J Biol Chem,273:21447-50 (1998)]、DNA二本鎖切断の修復や染色体組換えの開始反応に必須な酵素である。出芽酵母サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)や分裂酵母シゾサッカマイセズ・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)では、この複合体酵素の構成タンパク質の一つでも失われると、テロメアの顕著な短縮が見られる[Boulton, S. J.,et al.:Embo J, 17:1819-28 (1998)]。Mre11-Rad50-Xrs2(Nbs1)複合体の各構成タンパク質は、いずれもそのホモログがヒト中に存在し[Dolganov, G. M.,et al.:Mol Cell Biol, 16:4832-41 (1996);Petrini, J. H.,et al.:Genomics, 29: 80-6 (1995)]、酵母からヒトに至る真核生物全般で共通の役割を果たすと考えられている。

課題を解決するための手段

0005

本発明は、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾することを特徴とするテロメア長の調節方法を提供することを目的とする。

0006

本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾することにより、該細胞のテロメア長を調節することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

0007

すなわち、本発明は、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾することを特徴とするテロメア長の調節方法である。ここで、内在性Mre11タンパク質の生理学的活性の修飾は、外来Mre11タンパク質をコードするDNA又は外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン若しくはC末端ドメイン改変したタンパク質をコードするDNAを、該DNAが発現可能な状態で、細胞内に導入することにより行われ得る。

0008

さらに、本発明は、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質を有効成分として含有してなる、テロメア長調節剤又はテロメア長関連疾患(例えば、黒色腫肝細胞癌乳癌胃癌脳腫瘍及び細胞老化性疾患など)の遺伝子治療剤である。ここで、内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾する物質としては、外来Mre11タンパク質をコードするDNA又は外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン若しくはC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有してなるDNA構築物が挙げられる。

0009

本発明において、前記外来Mre11タンパク質としては、以下の(a)又は(b)のタンパク質が挙げられる。
(a) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2又は配列番号4で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸欠失置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質

0010

さらに、本発明において、前記外来Mre11タンパク質をコードするDNAとしては、以下の(c)又は(d)のDNAが挙げられる。
(c) 配列番号1又は配列番号3で表される塩基配列を含むDNA
(d) (c)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質をコードするDNA

0011

さらに、本発明において、前記外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質としては、以下の(e)又は(f)のタンパク質が挙げられる。
(e) 配列番号6で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(f) 配列番号6で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質

0012

さらに、本発明において、前記外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質をコードするDNAとしては、以下の(g)又は(h)のDNAが挙げられる。
(g) 配列番号5で表される塩基配列を含むDNA
(h) (g)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(ヌクレアーゼ活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA

0013

さらに、本発明において、前記外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質としては、以下の(i)又は(j)のタンパク質が挙げられる。
(i) 配列番号8で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(j) 配列番号8で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質

発明を実施するための最良の形態

0014

さらに、本発明において、前記外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAとしては、以下の(k)又は(l)のDNAが挙げられる。
(k) 配列番号7で表される塩基配列を含むDNA
(l) (k)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMre11タンパク質の生理学的活性(二本鎖DNA結合活性を除く)を有するタンパク質をコードするDNA
以下、本発明を詳細に説明する。

0015

本発明のテロメア長の調節方法は、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾することに基礎を置くものである。ここで、「テロメア長の調節」とは、細胞内のテロメア長を短縮化すること及び細胞内のテロメラーゼ長を維持若しくは伸長することをいう。「内在性Mre11タンパク質」とは、細胞中に元来存在し且つMre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質をいう。「Mre11タンパク質の生理学的活性」とは、Rad50タンパク質及びXrs2(Nbs1)タンパク質と複合体を形成する活性、二本鎖DNA結合活性、二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性及び一本鎖DNAエンドヌクレアーゼ活性の少なくとも1つをいう。なお、二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性及び一本鎖DNAエンドヌクレアーゼ活性をまとめてヌクレアーゼ活性という。さらに、「修飾」とは、内在性Mre11タンパク質の生理学的活性の一部又は全部を、増強、低減又は欠損させることをいう。例えば、テロメア長の短縮化は、完全長の外来Mre11タンパク質をコードするDNA又は外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを、該DNAが発現可能な状態で、細胞に導入することにより行うことができる。ここで、「発現可能な状態」とは、DNA上にコードされているタンパク質が、該DNAを導入した細胞内で生成されるように、プロモーター等の発現に関わるDNA領域とともにベクター上に存在する状態をいう。一方、テロメア長の維持若しくは伸長は、外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを、該DNAが発現可能な状態で、細胞に導入することにより行うことができる。ここで、「外来Mre11タンパク質」とは、標的細胞の外に由来するMre11タンパク質をいう。また、「改変した」とは、機能ドメイン中の1以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加することをいう。

0016

1.外来Mre11タンパク質をコードするDNAの調製
(1) 外来Mre11タンパク質をコードするDNAの供給源
テロメア長の調節に使用することができる外来Mre11タンパク質をコードするDNAの供給源としては、Mre11タンパク質をコードするDNAを保有する生物由来の細胞であれば特に限定されず、あらゆる生物由来の細胞を使用することができる。例えば、ヒト(Homo sapiens)、マウス(Mus musculus)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ネナガヒトヨタケ(Coprinus cinereus)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などの様々な真核生物由来の細胞が挙げられる。好ましくは、テロメア長の調節に使用する外来Mre11タンパク質をコードするDNAは、テロメア長調節の標的となる細胞と同じ生物種由来のものであり得る。なお、シゾサッカロマイセス・ポンベにおいては、Mre11タンパク質に相当するタンパク質は、Rad32と呼ばれている。例えば、ヒト細胞のテロメア長を調節する場合には、ヒト由来のMre11タンパク質をコードするDNAを用いることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ細胞のテロメア長を調節する場合には、サッカロマイセス・セレビシエ由来のMre11タンパク質をコードするDNAを用いることが好ましい。

0017

(2)外来Mre11タンパク質をコードするDNAの調製
外来Mre11タンパク質をコードするDNAは、上記(1)記載の生物由来の細胞から調製したゲノムDNAライブラリー若しくはcDNAライブラリーからのMre11タンパク質をコードするDNAを含むクローンスクリーニングによって、あるいはゲノムDNAやcDNAなどを鋳型として用いたPCRによる直接増幅によって得ることができる。

0018

例えば、cDNAライブラリーからのスクリーニングによってMre11タンパク質をコードするDNAを得る場合に、まず、上記(1)の生物由来の細胞から、グアニジンチオシアネート法等によってmRNAを調製する。次いで、オリゴdT配列を含有する合成DNAプライマーをハイブリダイズさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成する。その後、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAリガーゼRNaseHを用いて常法に従って二本鎖cDNAを合成する。次いで、T4DNAポリメラーゼによりcDNAの末端を平滑化した後、いわゆるEcoRIアダプター等のDNAアダプターをT4DNAリガーゼによりcDNA鎖の両末端に付加する。次いで、DNAアダプターを付加したcDNA鎖を市販のλファージベクター(例えば、Stratagene社製λZAPなど)又はプラスミドベクター(例えば、PromegaBiotech社製pGEM2など)の制限酵素切断部位に常法に従って挿入することにより、組換えλファージDNA群又は組換えプラスミドDNA群を調製する。

0019

次いで、組換えλファージDNA群については、市販のin vitroパッケージングキット(例えば、PromegaBiotech社製ギガパックゴールドなど)などを用いてin vitroパッケージングを行い、組換えλファージDNAを有するλファージ粒子を製造する。得られたλファージ粒子を常法[Maniatis, T., et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989]に従い、例えば、大腸菌などの宿主形質導入し、得られた形質転換体を増殖させることによってファージcDNAライブラリーを得ることができる。

0020

一方、組換えプラスミドDNA群については、常法に従い、例えば、プラスミドDNAを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた形質転換体を増殖させることによって、プラスミドcDNAライブラリーを得ることができる。

0021

次いで、上記形質転換体を増殖させ、例えばDupon社製ジーンスクリーニングプラスなどのナイロン膜又はニトロセルロース膜上に移し取り、アルカリ存在下でタンパク質を除去する。膜上のλファージDNA又はプラスミドDNAに対して、Mre11タンパク質をコードするDNAの部分断片から作製した放射性標識プローブをハイブリダイズさせ、陽性クローンを選択する。ここで、使用するプローブは、Mre11タンパク質の部分アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、PCRによって調製することができる。例えば、PCRによって、酵母Mre11タンパク質をコードするDNAを含有するクローンのスクリーニングに使用するプローブを調製する場合には、プライマーとして、5'-gtgccattattatttcagaa-3'(配列番号9)及び5'-gggatcaagtacaactattttc-3'(配列番号10)などを用いることができる。次いで、得られた陽性クローンを培養し、培養物からファージDNA又はプラスミドDNAを調製する。

0022

また、PCRによる直接増幅によって、Mre11タンパク質をコードするDNAを調製する場合、まず、常法に従って、上記(1)の生物由来の細胞からゲノムDNA又はcDNAを調製する。次いで、得られたゲノムDNA又はcDNAを鋳型とし、Mre11タンパク質のN末端側のアミノ酸配列をコードするDNA及びC末端側のアミノ酸配列をコードするDNAをプライマーとしてPCRを行う。次いで、PCR増幅断片を適当なベクターに連結する。例えば、酵母Mre11タンパク質をコードするDNAを増幅するために使用することができるプライマーとしては、5'-atggactatcctgatccaga-3'(配列番号11)及び5'-gggatcaagtacaactattttc-3'(配列番号12)などが挙げられる。なお、PCRによる直接増幅法によってMre11タンパク質をコードするDNAを得る場合には、DNA合成酵素として、ミスリーディングの少ないpfuポリメラーゼを使用することが好ましい。

0023

上記の方法によって、得られたDNAは、ジデオキシ法等の公知の手法により塩基配列を決定することによって、Mre11タンパク質をコードするDNAであることを確認する。塩基配列の決定は、通常は自動塩基配列決定機(例えば、PERKIN-ELMER社製373ADNAシークエンサー等)用いて行うことができる。

0024

配列番号1及び配列番号3に、それぞれサッカロマイセス・セレビシエ及びヒト由来のMre11タンパク質をコードするDNAの塩基配列を、配列番号2及び4に、それぞれ該タンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がMre11タンパク質の生理学的活性を有する限り、当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。

0025

例えば、配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列の1若しくは数個、好ましくは20〜30個程度、さらに好ましくは10〜20個をアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列の1若しくは数個、好ましくは20〜30個程度、さらに好ましくは10〜20個をアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列の1若しくは数個、好ましくは20〜30個程度、さらに好ましくは10〜20個をアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。

0026

また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAも、Mre11タンパク質の生理学的活性を有するタンパク質をコード限り、本発明において使用することができる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が、33〜70mM、好ましくは50〜66mMであり、温度が40〜70℃、好ましくは55〜68℃での条件をいう。

0027

なお、Mre11タンパク質の生理学的活性とは、前記のように、二本鎖DNA結合活性、二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性及び一本鎖DNAエンドヌクレアーゼ活性をいうが、これらの活性は、古らの方法[Furuse et al.:EMBO J 17:6412-25(1998)]に従って測定することができる。

0028

2.外来Mre11タンパク質をコードするDNAへの変異の導入
外来Mre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変した変異型Mre11タンパク質をコードするDNAを、該DNAが発現可能な状態で細胞に導入した場合は、野生型Mre11タンパク質をコードするDNAを導入した場合よりも、さらにテロメア長は短縮化される。一方、外来Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変した変異型Mre11タンパク質をコードするDNAを、該DNAが発現可能な状態で細胞に導入した場合は、野生型Mre11タンパク質をコードするDNAを導入した場合とは異なり、テロメア長は維持若しくは伸長される。ここで、「ヌクレアーゼドメイン」とは、Mre11タンパク質を構成するアミノ酸配列上で、当該タンパク質の二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性及び一本鎖DNAエンドヌクレアーゼ活性を担うアミノ酸配列をいう。具体的には、例えば酵母Mre11タンパク質においては、N末端から225番目〜450番目の領域をいう。「C末端ドメイン」とは、Mre11タンパク質を構成するアミノ酸配列上で、当該タンパク質の二本鎖DNA結合活性を担うカルボキシ末端側のアミノ酸配列をいう。具体的には、例えば酵母Mre11タンパク質においては、N末端から600番目以降の領域をいう。

0029

変異型Mre11タンパク質をコードするDNAは、以下のようにして作製することができる。例えば、Mre11タンパク質のヌクレーゼドメインの特定のアミノ酸を別のアミノ酸に置換したタンパク質をコードするDNAの作製は、当該技術分野で周知の、PCRを利用した部位特異的変異誘発法[西郷薫ら:分子生物学実験プロトコールI、第263頁〜第270頁、丸善、1997]等により行うことができる。

0030

3.細胞へのMre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAの導入
細胞へのMre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAの導入は、以下のようにして行うことができる。すなわち、上記1又は2において得られたMre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターを作製後、得られた組換えベクターを、宿主細胞に導入することにより行う。

0031

(1)組換えベクターの作製
組換えベクターは、適当なベクターにMre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAを連結(挿入)することにより得ることができる。ここで使用することができるベクターは、宿主細胞中で複製し、可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。

0032

酵母宿主細胞用のプラスミドベクターとしては、pMAC561aur 、YEp13, YEp24,YCp50などが挙げられ、動物細胞宿主用のウイルスベクターとしてはレトロウイルス又はワクシニアウイルスなどが挙げられる。ベクターへのMre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNA の連結は、まず、該DNAを含むDNA断片を適当な制限酵素で切り出し、上記ベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに連結する方法などが採用される。

0033

Mre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAは、導入された宿主細胞中で発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、Mre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメントスプライシングシグナルポリA付加シグナル選択マーカーなどを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、G418耐性遺伝子等が挙げられる。

0034

なお、Mre11タンパク質のN末端から16番目のアスパラギン酸アラニンに置換されたMre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターpMACMre11D16A、及びC末端ドメインの欠失したMre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターpMACMre11ΔC49は、それぞれ大腸菌DH5α株に導入され(ERKNMRE11D16AYOPAUR及びERKNMRE11DC49YOPAUR)、工業技術院生命工学工業技術研究所県つくば市東1丁目1番3号)に、平成11年12月22日付でFERM P-17683及びFERM P-17684として寄託されている。

0035

(2)形質転換細胞の作製
形質転換細胞の作製は、組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより行うことができる。ここで、宿主としては、テロメアを含む線状染色体を有する真核生物細胞できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。

0036

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒアパストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.:Methods. Enzymol., 194: 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.:J. Bacteriol., 153:163(1983)]等が挙げられる。

0037

動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルス初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。

0038

4.テロメア長の解析
テロメア長の解析は、テロメア配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いるサザンハイブリダイゼーション法によって行うことができる。例えば、酵母細胞のテロメア長を解析する場合、まず対照の酵母細胞及び被検酵母細胞からゲノムDNAを抽出する。次いで、得られたゲノムDNAを適当な制限酵素(例えば、XhoIなど)で消化した後、アガロースゲル電気泳動によってDNA断片を分離する。その後、ナイロン膜上にアルカリ条件下転写し、これにテロメア配列に特異的にハイブリダイズする標識プローブを適当な条件下でハイブリダイズさせる。ここで、プローブとしては、5'-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt-3'(配列番号13)の配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。膜を洗浄後、オートラジオグラフィーまたはイメージングプレート(例えば、富士写真フィルム社製BAS2000型)で視覚化し、対照酵母細胞のレーンと被検酵母細胞のレーンとを比較することによって、テロメア長の長短を明らかにすることができる。

0039

5.テロメア長調節剤及びテロメア長関連疾患の遺伝子治療剤としての応用
真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を修飾することにより、該細胞中のテロメア長を調節することが可能である。従って、真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を改変する物質を有効成分として含有する薬剤は、テロメア長調節剤及びテロメア長関連疾患の遺伝子治療剤として有用である。真核細胞中の内在性Mre11タンパク質の生理学的活性を改変する物質としては、例えば、Mre11タンパク質をコードするDNA又はMre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン又はC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有してなるDNA構築物などが挙げられる。

0040

(1)テロメア長調節剤
Mre11タンパク質又はMre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン又はC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有するDNA構築物は、テロメア長調節剤(例えば、テロメア長調節用試薬)として有用である。すなわち、テロメアを有する染色体を有する生物由来のあらゆる細胞について、テロメア長を調節することが可能である。テロメア長の短縮化を促進する場合には、Mre11タンパク質又はMre11タンパク質のヌクレアーゼドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有するDNA構築物を細胞内に導入する。一方、テロメア長を維持若しくは伸長する場合には、Mre11タンパク質のC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有するDNA構築物を細胞内に導入する。

0041

酵母細胞への遺伝子の導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.:Methods. Enzymol., 194: 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.:J. Bacteriol., 153:163(1983)]等が挙げられる。動物細胞への遺伝子の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。

0042

(2)テロメア長関連疾患の遺伝子治療剤
「テロメア長関連疾患」とは、疾患の発症にテロメア長が関連するあらゆる疾患をいう。例えば、テロメラーゼ活性が高まることによって染色体のテロメア長の短縮化が生じない悪性腫瘍(例えば、黒色腫、肝細胞癌、乳癌、胃癌、脳腫瘍など)や、正常細胞染色体のテロメア長と比較してテロメア長の短縮化が昂進してる老化性疾患などが挙げられる。Mre11タンパク質をコードするDNA又はMre11タンパク質のヌクレアーゼドメイン若しくはC末端ドメインを改変したタンパク質をコードするDNAを発現可能な状態で含有するDNA構築物を、テロメア長関連疾患に対する遺伝子治療剤として使用する場合は、前記DNA構築物を注射や遺伝子銃等により直接投与する方法が挙げられる。前記DNA構築物の作製することができるベクターとしては、アデノウイルスベクターアデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく、DNAを細胞内に移入することが可能となる。また、前記DNA構築物をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと本発明の遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水層脂質二分子層に本発明の遺伝子を保持させる(リポソーム-遺伝子複合体)。次に、該複合体を細胞とともに培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる(リポフェクション法)。そして、得られる細胞を以下の投与方法で投与すればよい。

0043

本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、上皮組織(皮膚の表皮)、各種臓器組織等に局所投与を行うこともできる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することもできる。本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢性別、症状、投与経路投与回数剤型によって異なるが、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人1日あたり0.1〜100mg/bodyの範囲が適当である。

0044

以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

0045

〔実施例1〕酵母Mre11タンパク質及び変異型酵母Mre11タンパク質をコードするDNA組換えベクターの調製
(1)Mre11タンパク質をコードするDNAの調製
YEp24酵母-大腸菌シャトルベクターを用いて構築した酵母DBY939株のゲノミックDNAライブラリー(M. Carlsonによって構築)を含有する大腸菌を、アンピシリンを含むLB寒天培地上植菌し、得られたコロニーをナイロン膜状に固着させ、常法に従ってコロニー由来のDNAを膜に固定した。MRE11タンパク質のN末端側のアミノ酸配列をコードするDNA配列、及びC末端側のアミノ酸をコードするDNA配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマー、出芽酵母野生型株ORD149株のゲノムDNAを鋳型として、PCR反応を行った。得られたDNAを大腸菌ベクターにクローニングし、この断片を切り出して[32P]-dCTPを用いて標識した。このプローブを先に作製したナイロン膜にストリンジェントな条件でハイブリダイズさせ、MRE11遺伝子断片を有するコロニーを識別した。このコロニーを単離して、同様のコロニーハイブリダイゼーションを繰り返し、MRE11遺伝子断片を有する単一クローンを得た。このプラスミドDNAから制限酵素処理によってMRE11断片を切り出し、別途大腸菌ベクターにクローニングし、プラスミドpMRE11trを得た。

0046

(2)変異型Mre11タンパク質をコードするDNAの調製
上記(1)において得られたMre11タンパク質をコードするDNAを用い、Hashimoto-Gotohらの方法[Hashimoto-Gotoh,T., et al.:Gene, 152:271-275(1995)]に従って、Mre11タンパク質のC末端ドメインを欠失したタンパク質(D16A型Mre11タンパク質ともいう)、N末端から16番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたタンパク質(DC49型 Mre11タンパク質ともいう)及びMre11タンパク質のC末端ドメインを欠失し且つN末端から16番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたタンパク質をコードするDNAを調製した。すなわち、16番目のコドンgatをgct(47番目の塩基をaからc)へ一塩基置換を行ってD16A変異の導入を行い、また643−644番目のコドンgct agtをgcc tagへ変更して終止コドンを導入しDC49型変異の導入を行った。

0047

(3) Mre11タンパク質又は変異型Mre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターの構築
上記(1)及び(2)において得られたMre11タンパク質及び変異型Mre11タンパク質をコードするDNA断片を、図1に示すように、オーレオバシジン耐性遺伝子を含む酵母・大腸菌シャトルベクターpMAC561aurのADH1プロモーターとCYC1ターミネーターとの間に存するEcoRI部位に挿入することにより、酵母内大量発現を可能にするベクターを構築した。野生型のMre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターをpMACMre11WT、N末端から16番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されたMre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターをpMACMre11D16A、C末端ドメインの欠失したMre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターをpMACMre11ΔC49、N末端から16番目のアスパラギン酸がアラニンに置換され且つC末端ドメインの欠失したMre11タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターをpMACMre11D16AΔC49と命名した。

0048

〔実施例2〕組換えベクターの酵母への形質転換
実施例1において得られた組換えベクターを、以下のようにして、フランス・キュリー研究所Alain Nicolas博士から入手した酵母サッカロマシセス・セレビシエORD149株(arg4rv/arg4bg及びtrp1-289/trp1-289対立遺伝子を有する二倍体)に形質転換した。すなわち、1Mソルビトール中で洗浄した酵母株をベクターと混合し、電気穿孔法によってDNAを細胞内に導入した後、1Mソルビトールを含むトリプトファン欠除寒天最小培地(酵母株はtrp1遺伝子に変異を有し、ベクターは選択マーカーTRP1遺伝子を有する)で培養し、プラスミドを有するコロニーを選択した。これらの酵母株をさらに0.2μg/mlのオーレオバシジンを含む培地中で培養した。

0049

〔実施例3〕テロメア長の解析
実施例2において得られた各形質転換体のテロメア長を、以下のようにして解析した。すなわち、ベクターpMAC561aurのみを持つ酵母細胞及び実施例2において得られた組換えベクターpMACMre11WT、pMACMre11D16A、pMACMre11ΔC49、pMACMre11D16AΔC49をそれぞれ有する形質転換酵母細胞を、0.2μg/mlのオーレオバシジンを含む栄養培地で12#16時間培養し、細胞を回収した。次いで、常法に従い、細胞からゲノムDNAを抽出し、制限酵素XhoIで消化後、アガロースゲル電気泳動によってDNA断片を分離した。アガロースゲル上のDNA断片をナイロン膜上にアルカリ条件下で吸引転写後、膜をChurchらの方法[Church,G.M.et.al.:Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 81:1991-1995(1984)]に従い、サザンハイブリダイゼーションによって解析した。プローブとしては5'-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt-3'(配列番号13)の20塩基からなるオリゴヌクレオチドの5'末端を放射性同位元素P32で標識したものを用い、50℃で20時間反応した。洗浄の後、オートラジオグラフィーまたは富士フィルムのイメージングプレートで視覚化した。

発明の効果

0050

酵母の染色体は、図2のような構造を有する。前記プローブのハイブリダイズし得る領域は、染色体の末端のテロメア(Y'タイプ)以外にも染色体の途中にも存在する(Xタイプ)。Mre11タンパク質をコードするDNAを有しないベクターだけを有する酵母に比べ、野生型Mre11タンパク質を大量発現した場合、およびヌクレアーゼドメインに変異を持つD16A型Mre11タンパク質を大量発現した場合では、Xタイプ・Yタイプいずれのテロメア領域においても短縮が見られた(図3)。特にヌクレアーゼドメインを変異させたD16A型Mre11タンパク質を大量発現した酵母の方が、テロメア長の短縮は顕著であった。これに対し、C末端の領域を欠くDC49型 Mre11タンパク質を発現させた系ではXタイプ・Yタイプいずれのテロメア領域においてもテロメア長の伸長が認められた。以上のことより、Mre11タンパク質のC末端ドメインを欠失したタンパク質をコードするDNAを細胞に導入することにより細胞のテロメア長を伸長することができ、Mre11タンパク質をコードするDNAを細胞に導入することにより細胞のテロメア長を短縮化することが可能であることがわかった。

0051

本発明の方法により、テロメア長の調節方法、テロメア長調節剤及びテロメア長関連疾患の遺伝子治療剤が提供される。

0052

SEQUENCE LISTING
<110>RIKEN ; Japan Science and Technology Corporation
<120> The method of telomere length
<130> P99-0437

<160> 13
<210> 1
<211> 2079
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2076)
<400> 1
atg gac tat cct gat cca gac aca ata agg att tta att act aca gat 48
Met Asp Tyr Pro Asp Pro Asp Thr Ile Arg Ile Leu Ile Thr Thr Asp
1 5 10 15
aat cat gtg ggt tac aac gaa aat gat ccc att act ggc gat gat tct 96
Asn His Val Gly Tyr Asn Glu Asn Asp Pro Ile Thr Gly Asp Asp Ser
20 25 30
tgg aaa act ttc cat gaa gtc atg atg ctg gcc aaa aat aac aac gta 144
Trp Lys Thr Phe His Glu Val Met Met Leu Ala Lys Asn Asn Asn Val
35 40 45
gac atg gtt gta cag tcc ggt gat ctt ttt cac gtg aat aag cct tcc 192
Asp Met Val Val Gln Ser Gly Asp Leu Phe His Val Asn Lys Pro Ser
50 55 60
aag aag tca ctc tac caa gta ctg aaa act ttg aga tta tgt tgc atg 240
Lys Lys Ser Leu Tyr Gln Val Leu Lys Thr Leu Arg Leu Cys Cys Met
65 70 75 80
ggt gac aag cct tgc gag tta gaa tta ttg agc gat ccc tca caa gtt 288
Gly Asp Lys Pro Cys Glu Leu Glu Leu Leu Ser Asp Pro Ser Gln Val
85 90 95
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Phe His Tyr Asp Glu Phe Thr Asn Val Asn Tyr Glu Asp Pro Asn Phe
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aat att tct att ccc gta ttc ggc ata tca ggt aat cat gat gat gcg 384
Asn Ile Ser Ile Pro Val Phe Gly Ile Ser Gly Asn His Asp Asp Ala
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tcg ggg gac tca ctg ttg tgt cct atg gat ata ctt cat gcg act ggt 432
Ser Gly Asp Ser Leu Leu Cys Pro Met Asp Ile Leu His Ala Thr Gly
130 135 140
cta ata aat cat ttc ggg aaa gtc atc gaa tct gat aaa ata aaa gtc 480
Leu Ile Asn His Phe Gly Lys Val Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Val
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gtg cca tta tta ttt cag aaa ggg tcc act aag tta gca ttg tac gga 528
Val Pro Leu Leu Phe Gln Lys Gly Ser Thr Lys Leu Ala Leu Tyr Gly
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tta gcc gct gtt cgt gat gaa agg tta ttt aga act ttt aag gat ggt 576
Leu Ala Ala Val Arg Asp Glu Arg Leu Phe Arg Thr Phe Lys Asp Gly
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cat gaa cat gag tgt att ccg aat ctc gta cac aat cca att aaa aat 768
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290 295 300
Lys Met Lys Ser Ile Ser Leu Gln Asp Val Pro His Leu Arg Pro His
305 310 315 320
Asp Lys Asp Ala Thr Ser Lys Tyr Leu Ile Glu Gln Val Glu Glu Met
325 330 335
Ile Arg Asp Ala Asn Glu Glu Thr Lys Gln Lys Leu Ala Asp Asp Gly
340 345 350
Glu Gly Asp Met Val Ala Glu Leu Pro Lys Pro Leu Ile Arg Leu Arg
355 360 365
Val Asp Tyr Ser Ala Pro Ser Asn Thr Gln Ser Ser Ile Asp Tyr Gln
370 375 380
Val Glu Asn Pro Arg Arg Phe Ser Asn Arg Phe Val Gly Arg Val Ala
385 390 395 400
Asn Gly Asn Asn Val Val Gln Phe Tyr Lys Lys Arg Ser Pro Val Thr
405 410 415
Arg Ser Lys Lys Ser Gly Ile Asn Gly Thr Ser Ile Ser Asp Arg Asp
420 425 430
Val Glu Lys Leu Phe Ser Glu Ser Gly Gly Glu Leu Glu Val Gln Thr
435 440 445
Leu Val Asn Asp Leu Leu Asn Lys Met Gln Leu Ser Leu Leu Pro Glu
450 455 460
Val Gly Leu Asn Glu Ala Val Lys Lys Phe Val Asp Lys Asp Glu Lys
465 470 475 480
Thr Ala Leu Lys Glu Phe Ile Ser His Glu Ile Ser Asn Glu Val Gly
485 490 495
Ile Leu Ser Thr Asn Glu Glu Phe Leu Arg Thr Asp Asp Ala Glu Glu
500 505 510
Met Lys Ala Leu Ile Lys Gln Val Lys Arg Ala Asn Ser Val Arg Pro
515 520 525
Thr Pro Pro Lys Glu Asn Asp Glu Thr Asn Phe Ala Phe Asn Gly Asn
530 535 540
Gly Leu Asp Ser Phe Arg Ser Ser Asn Arg Glu Val Arg Thr Gly Ser
545 550 555 560
Pro Asp Ile Thr Gln Ser His Val Asp Asn Glu Ser Arg Ile Thr His
565 570 575
Ile Ser Gln Ala Glu Ser Ser Lys Pro Thr Ser Lys Pro Lys Arg Val
580 585 590
Arg Thr Ala Thr Lys Lys Lys Ile Pro Ala Phe Ser Asp Ser Thr Val
595 600 605
Ile Ser Asp Ala Glu Asn Glu Leu Gly Asp Asn Asn Asp Ala Gln Asp
610 615 620
Asp Val Asp Ile Asp Glu Asn Asp Ile Ile Met Val Ser Thr Asp Glu
625 630 635 640
Glu Asp Ala
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
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gtgccattat tatttcagaa 20
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<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 20

図面の簡単な説明

0053

配列番号9:合成DNA
配列番号10:合成DNA
配列番号11:合成DNA
配列番号12:合成DNA

0054

図1組換えベクターの構造を示した図である。
図2酵母染色体アームの概略図である。
図3組換えベクターを導入した酵母細胞のテロメア長を示す電気泳動写真である。

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