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技術 微生物ポリエステルの製造方法

出願人 キヤノン株式会社
発明者 今村剛士本間務須田栄矢野哲哉小林辰
出願日 1999年12月27日 (20年6ヶ月経過) 出願番号 1999-371872
公開日 2001年7月3日 (18年11ヶ月経過) 公開番号 2001-178487
状態 未査定
技術分野 微生物による化合物の製造 高分子組成物 ポリエステル、ポリカーボネート 生分解性ポリマー
主要キーワード ズダンブラック くい環 軟質部材 物質循環 鉱物由来 菌体内成分 乾燥重 ピークエリア
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2001年7月3日)のものです。
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図面 (3)

課題

微生物によりポリエステル、とりわけ側鎖に炭素二重結合を含むユニットを含有するPHA生産せしめる方法において、培養条件基質の種類を拡げた方法を提供する。

解決手段

1-ヘキセンを単一炭素源として含む培地中でポリエステル、好ましくは炭素二重結合を含むヒドロキシ脂肪酸ユニット例えば3-ヒドロキシヘキセン酸、3-ヒドロキシオクテン酸を含むポリエステル、を生産する能力を有する微生物、好ましくはシュードモナス属細菌例えばYN2株、を培養することを特徴とし、好ましくは培地中の微生物から生産ポリエステルを回収する工程を有する微生物ポリエステルの製造方法。

概要

背景

ポリ3-ヒドロキシ酪酸(PHB)に代表される微生物産生ポリエステルは、石油由来合成高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性を有している。

人類は長年にわたって合成高分子をプラスチック等として使用してきたが、それらのプラスチックが廃棄物となった場合、その分解されにくいという性質が災いし、廃棄物処理場蓄積される。また、焼却処理を行うことにより、ダイオキシン環境ホルモン等の有害物質の原因となり、環境汚染を引き起こすことが問題となっている。

一方、微生物産生ポリエステルは生分解されることにより自然の物質循環に取り込まれるので、環境保全を可能とするプラスチックとして利用することができる。また、医療用軟質部材としても今後有用視される可能性を有している(特開平5-159号公報)。

これまで、多くの細菌がPHB或いはその他のヒドロキシアルカン酸とのコポリマー菌体内に生成・蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」(生分解性プラスチック研究会編;(株)エヌ・ティーエス)、p178-197(1995年))。

近年、この様なポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を産業上利用していく上で、通常のモノマーユニットとは異なったユニットで構成されたPHAを生産させ、物理化学的特性多様性を拡げようとする試みがなされてきている。

その中で、特開平05-030 980号公報には、シュードモナスフルオレセンスFA-031(微工研条寄第3433号)を、増殖培養した後、オレイン酸或いはトリオレイン(オリーブ油)或いはトリグリセライド炭素源とする窒素源枯渇条件下での培養により、C4〜C16ユニットからなるポリヒドロキシ脂肪酸共重合体を生産し、C14、C16 ユニットに二重結合が確認されたことが開示されている。

更に、基質としてリノール酸を用いた場合は、ポリエステルはC4〜C16ユニットからなっており、C10、C12、C14、C16 ユニットに二重結合が認められた。更に、基質としてα-リノレン酸を用いた場合は、ポリエステルはC4〜C16ユニットからなっており、C8、C10、C12、C14、C16 ユニットに二重結合が認められたことが開示されている。

Int.J.Biol.Macromol.,12,85-91(1989)には、シュードモナスオレオボランス(Pseudomonas oleovorans)ATCC29 347株を、3-ヒドロキシ-6-オクテン酸或いは3-ヒドロキシ-7-オクテン酸を基質として培養し、3-ヒドロキシオクテン酸及び3-ヒドロキシヘキセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

Appl.Environ.Microbiol.,58(2),536-544(1992)には、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)KT2442株を、グルコースフルクトースグリセロールを基質として培養し、3-ヒドロキシドデセン酸及び3-ヒドロキシテトラデセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

Polymer,35(10),2090-2097(1994)には、シュードモナスオレオボランス(Pseudomonas oleovorans)ATCC29 347株を、n-オクタン1-オクテンを基質として培養し、3-ヒドロキシオクテン酸及び3-ヒドロキシヘキセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

Int.J.Biol.Macromol.,23,61-72(1998)には、シュードモナスレジノボランス(Pseudomonas resinovorans)NRRL B-2649株を、獣脂(tallow)を基質として培養し、3-ヒドロキシドデセン酸及び3-ヒドロキシテトラデセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

概要

微生物によりポリエステル、とりわけ側鎖に炭素二重結合を含むユニットを含有するPHAを生産せしめる方法において、培養条件や基質の種類を拡げた方法を提供する。

1-ヘキセンを単一炭素源として含む培地中でポリエステル、好ましくは炭素二重結合を含むヒドロキシ脂肪酸ユニット例えば3-ヒドロキシヘキセン酸、3-ヒドロキシオクテン酸を含むポリエステル、を生産する能力を有する微生物、好ましくはシュードモナス属細菌例えばYN2株、を培養することを特徴とし、好ましくは培地中の微生物から生産ポリエステルを回収する工程を有する微生物ポリエステルの製造方法。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
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請求項1

1-ヘキセンを単一炭素源として含む培地中でポリエステル生産する能力を有する微生物を培養することを特徴とする、微生物ポリエステルの製造方法。

請求項2

ポリエステルのモノマーユニット中に、炭素二重結合を含むヒドロキシ脂肪酸ユニットが少なくとも一つ含まれることを特徴とする請求項1に記載の微生物ポリエステルの製造方法。

請求項3

炭素二重結合を含むヒドロキシ脂肪酸ユニットが、3-ヒドロキシヘキセン酸、3-ヒドロキシオクテン酸である請求項2に記載の微生物ポリエステルの製造方法。

請求項4

ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物が、シュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌である請求項1〜3のいずれかに記載の微生物ポリエステルの製造方法。

請求項5

該細菌が、シュードモナスチコリアイYN2株(Pseudomonas cichorii YN2;FERM P-17 411)である請求項4に記載の微生物ポリエステルの製造方法。

技術分野

0001

本発明は、ポリエステル微生物による製造方法に関する。

背景技術

0002

ポリ3-ヒドロキシ酪酸(PHB)に代表される微生物産生ポリエステルは、石油由来合成高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性を有している。

0003

人類は長年にわたって合成高分子をプラスチック等として使用してきたが、それらのプラスチックが廃棄物となった場合、その分解されにくいという性質が災いし、廃棄物処理場蓄積される。また、焼却処理を行うことにより、ダイオキシン環境ホルモン等の有害物質の原因となり、環境汚染を引き起こすことが問題となっている。

0004

一方、微生物産生ポリエステルは生分解されることにより自然の物質循環に取り込まれるので、環境保全を可能とするプラスチックとして利用することができる。また、医療用軟質部材としても今後有用視される可能性を有している(特開平5-159号公報)。

0005

これまで、多くの細菌がPHB或いはその他のヒドロキシアルカン酸とのコポリマー菌体内に生成・蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」(生分解性プラスチック研究会編;(株)エヌ・ティーエス)、p178-197(1995年))。

0006

近年、この様なポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を産業上利用していく上で、通常のモノマーユニットとは異なったユニットで構成されたPHAを生産させ、物理化学的特性多様性を拡げようとする試みがなされてきている。

0007

その中で、特開平05-030 980号公報には、シュードモナスフルオレセンスFA-031(微工研条寄第3433号)を、増殖培養した後、オレイン酸或いはトリオレイン(オリーブ油)或いはトリグリセライド炭素源とする窒素源枯渇条件下での培養により、C4〜C16ユニットからなるポリヒドロキシ脂肪酸共重合体を生産し、C14、C16 ユニットに二重結合が確認されたことが開示されている。

0008

更に、基質としてリノール酸を用いた場合は、ポリエステルはC4〜C16ユニットからなっており、C10、C12、C14、C16 ユニットに二重結合が認められた。更に、基質としてα-リノレン酸を用いた場合は、ポリエステルはC4〜C16ユニットからなっており、C8、C10、C12、C14、C16 ユニットに二重結合が認められたことが開示されている。

0009

Int.J.Biol.Macromol.,12,85-91(1989)には、シュードモナスオレオボランス(Pseudomonas oleovorans)ATCC29 347株を、3-ヒドロキシ-6-オクテン酸或いは3-ヒドロキシ-7-オクテン酸を基質として培養し、3-ヒドロキシオクテン酸及び3-ヒドロキシヘキセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

0010

Appl.Environ.Microbiol.,58(2),536-544(1992)には、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)KT2442株を、グルコースフルクトースグリセロールを基質として培養し、3-ヒドロキシドデセン酸及び3-ヒドロキシテトラデセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

0011

Polymer,35(10),2090-2097(1994)には、シュードモナスオレオボランス(Pseudomonas oleovorans)ATCC29 347株を、n-オクタン1-オクテンを基質として培養し、3-ヒドロキシオクテン酸及び3-ヒドロキシヘキセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

0012

Int.J.Biol.Macromol.,23,61-72(1998)には、シュードモナスレジノボランス(Pseudomonas resinovorans)NRRL B-2649株を、獣脂(tallow)を基質として培養し、3-ヒドロキシドデセン酸及び3-ヒドロキシテトラデセン酸ユニットを含むPHAを生産させる方法が示されている。

発明が解決しようとする課題

0013

このように、側鎖に炭素二重結合を含むユニットを含有するPHAを生産せしめる方法は様々に検討されてきているが、実用上、培養条件や基質の種類を更に拡げる必要があるとの認識を持つに至った。そして、比較的安価な石油等の鉱物由来有機原料を基質として用いた研究については十分になされていないのが現状である。

課題を解決するための手段

0014

本発明では上記の様な問題点を解決するための一つの方法を提供する。即ち、本発明の方法は、1-ヘキセンを単一炭素源として含む培地中でポリエステルを生産する能力を有する微生物を培養することを特徴とする、微生物ポリエステルの製造方法である。

0015

好ましくは、ポリエステルのモノマーユニット中には、炭素二重結合を含むヒドロキシ脂肪酸ユニット、より好ましくは、3-ヒドロキシヘキセン酸、3-ヒドロキシオクテン酸が少なくとも一つ含まれる。

0016

ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物としては、シュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌が好ましく、シュードモナスチコリアイYN2株(Pseudomonas cichorii YN2;FERM P-17 411)であるのがより好ましい。

0017

更に、培地中の微生物から生産ポリエステルを回収する工程を有することが好ましい。

発明を実施するための最良の形態

0018

本発明の一実施態様にかかる、ポリエステルの製造方法として、例えば、1-ヘキセンを単一炭素源として含む培地にて微生物を培養し、側鎖に炭素二重結合を含むユニットを含有するPHAを製造する方法が挙げられる。

0019

この様なポリエステルの製造方法として用い得る微生物としては、例えばPseudononas属に属する菌株であり、具体的にはシュードモナスチコリアイYN2株(Pseudomonas cichorii YN2;FERM P-17 411)が挙げられる。

0020

ここで、YN2株の菌学的性質を以下に示す。
培養温度:30℃
細胞形態:桿菌(0.8×1.5〜2.0 mm)
グラム染色:陰性
胞子形成:陰性
運動性:陽性
コロニー形状 :円形全縁なめらか低凸状、表層なめらか、
光沢、半透明
カタラーゼ:陽性
オキシダーゼ:陽性
O/F試験:非発酵性
硝酸還元:陰性
インドール産生 :陽性
ブドウ糖酸性化:陰性
アルギニンジヒドロラーゼ:陰性
ウレアーゼ:陰性
エスクリン加水分解:陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ:陰性
基質資化能
ブドウ糖 :陽性
L-アラビノース:陽性
D-マンノース:陰性
D-マンニトール:陰性
N-アセチル-D-グルコサミン:陰性
マルトース:陰性
グルコン酸カリウム:陽性
n-カプリン酸:陽性
アジピン酸:陰性
dl-リンゴ酸:陽性
クエン酸ナトリウム:陽性
酢酸フェニル:陽性
King'sB寒天での蛍光色産生 :陽性
4%NaClでの生育 :陽性(弱)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積:陰性(*)
Tween80の加水分解 :陽性
*nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染色することで判定。
以上に結果を、バージーズマニュアル第9版より参照し、Pseudomonas cichorii(シュードモナスチコリアイ)であると同定した。更に、PHAの生産挙動特異性から本菌株を新菌株であると認定し、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した(寄託番号:FERM P-17 411)。

0021

本発明で用いる培地としては、リン酸塩及びアンモニウム塩或いは硝酸塩等の窒素源を含む無機塩培地ならいかなる培地でも良いが、窒素源の濃度を調節することでPHAの生産性を向上せしめることが可能である。添加する1-ヘキセンは水への溶解性が良くなく、揮発性が高いので、培養の際には該微生物が必要とする酸素を確保した上で密閉する必要がある。

0022

無機塩培地の例として本発明の一方法に用いた培地の組成を以下に示す。

0023

[M9培地]
Na2HPO4 :6.3
KH2PO4 :3.0
NH4Cl :1.0
NaCl :0.5 g/L、pH=7.0
[1/10N-M9培地]
Na2HPO4 :6.3
KH2PO4 :3.0
NH4Cl :0.1
NaCl :0.5 g/L、pH=7.0
更に、良好な増殖及びPHAの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を0.3%(v/v)程度添加する必要がある。

0024

[微量成分溶液]
ニトリロ三酢酸:1.5 ; MgSO4 :3.0 ;
MnSO4 :0.5 ; NaCl :1.0 ;
FeSO4 :0.1 ; CaCl2 :0.1 ;
CoCl2 :0.1 ; ZnSO4 :0.1 ;
CuSO4 :0.1 ; AlK(SO4)2 :0.1 ;
H3BO3 :0.1 ; Na2MoO4 :0.1 ;
NiCl2 :0.1 g/L
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、15℃から40℃、好ましくは20℃から30℃程度が適当である。

0025

培養は液体培養固体培養等該微生物が増殖し、PHAを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。

0026

本発明における菌体からのPHAの回収は、通常行われているクロロホルム抽出が最も簡便であるが、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、SDS等の界面活性剤処理リゾチーム等の酵素処理EDTA次亜塩素酸ナトリウムアンモニア等の薬剤処理によってPHA以外の菌体内成分を除去することによってPHAのみを回収する方法を採ることもできる。

0027

以下に実施例を示すが本発明は以下の実施例によって何等制限されうるものではない。

0028

実施例1.YN2株を用いた1-ヘキセン炭素源培養によるPHAの生産
酵母エキス0.1%を含むM9寒天培地上のYN2株のコロニーを、OD(600nm)=1.0となるように滅菌した生理食塩水に懸濁した。

0029

予め作成しておいた、炭素源を含まない1/10N-M9寒天培地20枚に、上記懸濁液を塗布し、1-ヘキセン雰囲気中で30℃で静置培養した。

0030

4日後、菌体を集め、メタノール洗浄して遠心分離によって集菌し、減圧乾燥した。この時の乾燥菌体重量は150mg であった。

0031

乾燥菌体クロロホルム50mL を加え、50℃で24時間攪拌してPHAを抽出した。クロロホルム層をろ過し、エバポレーター濃縮した後、冷メタノールに注加し、沈殿を回収して減圧乾燥した。この時のPHA乾燥重量は68mgであった。乾燥菌体あたりの重量%は約45%ということになる。

0032

得られたポリマーの組成は以下のようにして分析した。すなわち、ポリマー10mg を25mL 容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム2mL に溶解させ、3%硫酸を含むメタノール溶液2mL を加えて、100℃で還流しながら3.5時間反応させた。

0033

反応終了後、水2mL を加えて激しく10分間振とうした後に、2層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウム脱水した後ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS;島津QP-5050、DB-WAXキャピラリカラム(J&W))にかけて、各ヒドロキシアルカン酸メチルピークを同定した。結果を表1に示す。

0034

0035

値はGC-MS TICクロマトピークエリア
C4 :3-ヒドロキシ酪酸、
C6 :3-ヒドロキシヘキサン酸
C6: :3-ヒドロキシヘキセン酸、
C8 :3-ヒドロキシオクタン酸
C8: :3-ヒドロキシオクテン酸、
C10 :3-ヒドロキシデカン酸
C12 :3-ヒドロキシウンデカン酸
C12' :二重結合或いは枝別れをもつ3-HAユニットであると思われる。未同定
C14 :3-ヒドロキシテトラデカン酸、
C14: :3-ヒドロキシテトラデセン酸であると思われる。未同定。

0036

更に、得られたポリマーのNMR分析を行った(使用機器:FT-NMR:BrukerDPX400、測定核種: 1H,13C、使用溶媒:重クロロホルム(TMS入り))。

0037

図1図2に 1H-NMR及び 13C-NMRの各チャートを示す。また、表2に 1H-NMRのピーク帰属を示す。

0038

0039

以上の結果より、Pseudomonas cichorii(シュードモナスチコリアイ)YN2株(FERM P-17 411)を1-ヘキセン存在下で培養することにより、少なくとも3-ヒドロキシヘキセン酸及び3-ヒドロキシオクテン酸ユニットを含むPHAが合成された。

発明の効果

0040

本発明の方法により、1-ヘキセンを単一炭素源とし、側鎖に二重結合ユニットを持つ3-ヒドロキシ脂肪酸を含むポリヒドロキシアルカン酸の製造が可能となった。

図面の簡単な説明

0041

図11H-NMRのチャートを示す。
図213C-NMRのチャートを示す。

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