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技術 変異型イソプロピルマレートシンターゼをコードするDNA、L−ロイシン生産性微生物、および、L−ロイシンの製造法

出願人 味の素株式会社
発明者 グシャチネルミハイルマルコヴィッチルンツマリヤグリゴリエヴナコズロフユーリーイヴァノヴィッチイヴァノフスカヤリリナヴァレリエヴナヴォロシロヴァエリヴィラボリソヴナ
出願日 2000年6月30日 (20年5ヶ月経過) 出願番号 2000-198835
公開日 2001年2月13日 (19年9ヶ月経過) 公開番号 2001-037494
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 酵素・酵素の調製
主要キーワード ケトイソカプロン酸 IPMS ケトイソ吉草酸 BCD PCR反応装置 上流域 アミノ酸発酵 供与菌
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2001年2月13日)のものです。
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課題

L−ロイシン生産能に優れた微生物を提供し、そして安価かつ効率的なL−ロイシンの製造法を提供する。

解決手段

L−ロイシン生産能を有し、かつL−ロイシンによる阻害解除されたα−イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするDNAにより形質転換された微生物を培地で培養し、該培地中にL−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からL−ロイシンを採取することによって、L−ロイシンを製造する。

概要

背景

従来、L−ロイシンは、主としてブレビバクテリウム属コリネバクテリウム属またはセラチア属に属するL−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている(アミノ酸発酵、学会出版センター、397〜422頁、1986年)。最も高いレベルでL−ロイシンを蓄積するのは、ブレビバクテリウムフラバムVKPM B-2736である。この株は、研究用ファーメンターで、スクロース含有培地を用いた72時間の醗酵で、L−ロイシンを26g/Lまで生産する(USSR発明者証第1394711号)。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム34株は、グルコースを含む培地でL−ロイシンを34g/Lまで生産する(Appl. Environ. Microbiol., 51, p.1024 (1986))。

上記のように、微生物のL−ロイシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のL−ロイシンの需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求められている。

ところで、エシェリヒア(Escherichia)属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子解析の進み方、遺伝子材料豊富さ等から優れたL−ロイシン生産菌として利用される可能性を有しているが、エシェリヒア属細菌によるL−ロイシン生産の報告は少ない。L−ロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌としては、β−チエニルアラニン耐性を有する微生物、β−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン耐性を有する微生物(以上、特公昭62-34397号公報)、4−アザロイシン耐性又は5,5,5−トリフルオロロイシン耐性を有する微生物(特開平8-70879号公報)が知られている。しかし、L−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びエシェリヒア属細菌におけるL−ロイシン耐性とL−ロイシン生産性との関係については知られていない。

概要

L−ロイシン生産能に優れた微生物を提供し、そして安価かつ効率的なL−ロイシンの製造法を提供する。

L−ロイシン生産能を有し、かつL−ロイシンによる阻害解除されたα−イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードするDNAにより形質転換された微生物を培地で培養し、該培地中にL−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からL−ロイシンを採取することによって、L−ロイシンを製造する。

目的

本発明は、上記観点から、L−ロイシン生産能に優れた微生物を提供し、そして、安価かつ効率的なL−ロイシンの製造法を提供することを課題とする。

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
0件

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請求項1

以下の(A)又は(B)のタンパク質をコードするDNA。(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(a)〜(e)から選ばれる置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。(a)482位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基への置換。(b)386位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換。(c)428位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への置換。(d)479位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。(e)462位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個アミノ酸欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその活性のL−ロイシンによる阻害が(A)のタンパク質と同等に解除されているタンパク質。

請求項2

前記置換が下記(a’)〜(e’)から選ばれる置換である請求項1記載のDNA。(a’)482位のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換。(b’)386位のグルタミン酸残基のリジン残基への置換。(c’)428位のプロリン残基のロイシン残基への置換。(d’)479位のグリシン残基のシステイン残基への置換。(e’)462位のグリシン残基のアスパラギン酸残基への置換。

請求項3

配列番号1に示す塩基配列において下記(i)〜(v)から選ばれる変異を有する塩基配列を有する請求項2記載のDNA。(i)1445位のシトシンチミンへの変異。(ii)1156位のグアニンアデニンへの変異。(iii)1283位のシトシンのチミンへの変異。(iv)1435位のグアニンのチミンへの変異。(v)1385位のグアニンのアデニン残基への変異。

請求項4

請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNAにより形質転換され、かつL−ロイシン生産能を有する微生物

請求項5

エシェリヒア属細菌である請求項4記載の微生物。

請求項6

エシェリヒアコリである請求項5記載の微生物。

請求項7

請求項4〜6のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養し、該培地中にL−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からL−ロイシンを採取することを特徴とするL−ロイシンの製造法

技術分野

K−12(野生株) なし 9 0.2 0.0

背景技術

0001

本発明は、変異型α−イソプロピルマレートシンターゼをコードするDNAに関する。また、本発明は、変異型α−イソプロピルマレートシンターゼを有するL−ロイシン生産性微生物およびそれを用いたL−ロイシンの製造法に関する。L−ロイシンは、食品及び飼料用の栄養添加物医療製薬及び化学工業における試薬、あるいはリジンのような他のアミノ酸の製造に用いられる微生物の成長因子として用いられる必須アミノ酸である。

0002

従来、L−ロイシンは、主としてブレビバクテリウム属コリネバクテリウム属またはセラチア属に属するL−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている(アミノ酸発酵、学会出版センター、397〜422頁、1986年)。最も高いレベルでL−ロイシンを蓄積するのは、ブレビバクテリウムフラバムVKPM B-2736である。この株は、研究用ファーメンターで、スクロース含有培地を用いた72時間の醗酵で、L−ロイシンを26g/Lまで生産する(USSR発明者証第1394711号)。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム34株は、グルコースを含む培地でL−ロイシンを34g/Lまで生産する(Appl. Environ. Microbiol., 51, p.1024 (1986))。

0003

上記のように、微生物のL−ロイシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のL−ロイシンの需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求められている。

発明が解決しようとする課題

0004

ところで、エシェリヒア(Escherichia)属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子解析の進み方、遺伝子材料豊富さ等から優れたL−ロイシン生産菌として利用される可能性を有しているが、エシェリヒア属細菌によるL−ロイシン生産の報告は少ない。L−ロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌としては、β−チエニルアラニン耐性を有する微生物、β−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン耐性を有する微生物(以上、特公昭62-34397号公報)、4−アザロイシン耐性又は5,5,5−トリフルオロロイシン耐性を有する微生物(特開平8-70879号公報)が知られている。しかし、L−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びエシェリヒア属細菌におけるL−ロイシン耐性とL−ロイシン生産性との関係については知られていない。

課題を解決するための手段

0005

本発明は、上記観点から、L−ロイシン生産能に優れた微生物を提供し、そして、安価かつ効率的なL−ロイシンの製造法を提供することを課題とする。

0006

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、α−イソプロピルマレートシンターゼ(以下、IPMSと略す)のL−ロイシンによる阻害解除が、L−ロイシン生産性に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。

0007

すなわち本発明は、以下の(A)又は(B)のタンパク質をコードするDNA(以下、本発明のDNAともいう)を提供する。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列において、下記(a)〜(e)から選ばれる置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。
(a)482位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(b)386位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
(c)428位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(d)479位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(e)462位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、IPMS活性を有し且つその活性のL−ロイシンによる阻害が(A)のタンパク質と同等に解除されているタンパク質。

0008

本発明のDNAは、好ましくは、前記置換が下記(a’)〜(e’)から選ばれる置換であるものである。
(a’)482位のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換。
(b’)386位のグルタミン酸残基のリジン残基への置換。
(c’)428位のプロリン残基のロイシン残基への置換。
(d’)479位のグリシン残基のシステイン残基への置換。
(e’)462位のグリシン残基のアスパラギン酸残基への置換。

0009

本発明のDNAの具体例としては、配列番号1に示す塩基配列において下記(i)〜(v)から選ばれる変異を有する塩基配列を有するものが挙げられる。
(i)1445位のシトシンチミンへの変異。
(ii)1156位のグアニンアデニンへの変異。
(iii)1283位のシトシンのチミンへの変異。
(iv)1435位のグアニンのチミンへの変異。
(v)1385位のグアニンのアデニン残基への変異。

0010

本発明は、また、本発明のDNAにより形質転換され、かつL−ロイシン生産能を有する微生物(以下、本発明の微生物ともいう)を提供する。また、本発明の微生物は、好ましくは、エシェリヒア属細菌であり、より好ましくは、エシェリヒア・コリ(E. coli)である。

発明を実施するための最良の形態

0011

本発明は、さらに、本発明の微生物を培地で培養し、該培地中にL−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からL−ロイシンを採取することを特徴とするL−ロイシンの製造法を提供する。

0012

以下、本発明を詳細に説明する。

0013

<1>本発明のDNA
本発明のDNAは、野生型IPMSをコードするDNAにおいて、コードされるIPMSのL−ロイシンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものである。

0014

本発明において「L−ロイシンによるフィードバック阻害が解除される」とは、そのフィードバック阻害の程度が低下していることを意味する。フィードバック阻害の程度の低下は、L−ロイシンの存在によるIPMS活性の低下を測定し、野生株または親株と比較することによって評価することができる。

0015

IPMSとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のIPMSが挙げられる。また、IPMSのL−ロイシンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、配列番号2に記載されるIPMSのアミノ酸配列中の以下の置換が挙げられる。
(a)482位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(b)386位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
(c)428位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(d)479位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
(e)462位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。

0016

これらの置換は、好ましくは、以下の通りである。
(a’)482位のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換。
(b’)386位のグルタミン酸残基のリジン残基への置換。
(c’)428位のプロリン残基のロイシン残基への置換。
(d’)479位のグリシン残基のシステイン残基への置換。
(e’)462位のグリシン残基のアスパラギン酸残基への置換。

0017

野生型IPMSをコードするDNAとしては、エシェリヒア属細菌由来のIPMSをコードするものが挙げられ、より具体的には配列番号2に示すアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、さらに具体的には配列番号1に示す塩基配列が挙げられる。これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、本発明のDNAに含まれる。なお、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。

0018

本発明のDNAの具体例としては、配列番号1に示す塩基配列において下記(i)〜(v)から選ばれる変異を有する塩基配列を有するものが挙げられる。
(i)1445位のシトシンのチミンへの変異。
(ii)1156位のグアニンのアデニンへの変異。
(iii)1283位のシトシンのチミンへの変異。
(iv)1435位のグアニンのチミンへの変異。
(v)1385位のグアニンのアデニン残基への変異。

0019

また、菌種菌株の違いにより保持するIPMSの配列がわずかに相異することが予想されるが、このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものをコードするDNAも本発明のDNAに含まれる。すなわち、上記変異型IPMSのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、IPMS活性を有し且つその活性のL−ロイシンによる阻害が上記変異型IPMSと同等に解除されているタンパク質をコードするDNAも、本発明の変異型IPMSをコードするDNAに包含される。このようなDNAには、上記のようなアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加には、IPMSを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じ得る変異を有するもの(mutant又はvariant)も含まれる。

0020

(1)野生型IPMS遺伝子の取得
野生型IPMS遺伝子あるいは他の変異を有するIPMS遺伝子を含有するDNAの供与菌としては、好ましくはエシェリヒア属に属する微生物が挙げられる。具体的にはナイトハルトらの著書(Neidhardt, F.C. et.al., Escherichia coliand Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1)にあげられるものが利用できる。例えば、E. coli K-12株、JM109株、MC1061株などがあげられる。IPMS遺伝子を含有するDNAの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のIPMS遺伝子を含むDNAが取得できる。

0021

以下に、IPMS遺伝子を含有するDNAの調製例について述べる。まず、野生型のIPMS遺伝子をもつE. coli例えばK-12株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキスペプトン肉エキスコーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦浸出液等の1種類以上の窒素源に、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、硫酸マグネシウム塩化ナトリウム塩化マグネシウム塩化第2鉄、硫酸第2鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、更に必要に応じて糖質原料ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発pHは、6〜8に調整するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で4〜24時間、通気攪拌深部培養振盪培養または静置培養等により行う。

0022

このようにして得られた培養物を、例えば3,000 r.p.m.で5分間遠心分離してE. coli K-12株の菌体を得る。この菌体より、例えば斎三浦の方法(Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963))、K. S. Kirbyの方法(Biochem. J., 64,405, (1956))等の方法により染色体DNAを得ることができる。

0023

こうして得られた染色体DNAからIPMS遺伝子を単離するために、染色体DNAライブラリーを作製する。まず、染色体DNAを適当な制限酵素部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度1〜10ユニット/mlで様々な時間(1分〜2時間)染色体DNAに作用させてこれを消化する。

0024

ついで、切断された染色体DNA断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えDNAを作製する。具体的には、染色体DNAの切断に用いた制限酵素Sau3AIと相補的末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHIを、温度30℃以上、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で1時間以上、好ましくは1〜3時間、ベクターDNAに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体DNA断片混合物と切断開裂されたベクターDNAを混合し、これにDNAリガーゼ、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度4〜16℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で1時間以上、好ましくは4〜24時間作用させて組換えDNAを得る。

0025

得られた組換えDNAを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE7627 株(ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str,malA38, metB1, ilvH611, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76)のようなIPMS欠損変異株を形質転換して染色体DNAライブラリーを作製する。この形質転換は D. M. Morrisonの方法(Methodsin Enzymology 68, 326 (1979))あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel, M.and Higa,A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970))等により行うことができる。なお、JE7627株は国立遺伝学研究所(日本国静岡県三島市)より入手可能である。

0026

得られた染色体DNAライブラリーの中から、IPMS活性が増大した株あるいはIPMS遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株よりIPMS遺伝子の組換えDNAをもつ菌株を得る。例えば、IPMS欠損変異株はL−ロイシン要求性であるので、IPMS欠損変異株を宿主に用いた場合は、L−ロイシンを含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えDNAを回収することにより、IPMS遺伝子を含有するDNA断片を得ることができる。

0027

IPMS遺伝子を含有する組換えDNAをもつ候補株が、実際に IPMS遺伝子がクローニングされた組換えDNAを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してIPMS活性が増大していることを確認することにより達成できる。IPMSの酵素活性測定法は、Kohlhawらの方法(J. Biol. Chem., 244, 2218(1969))により行うことができる。

0028

そして、上記菌株より、IPMS遺伝子を含有するDNAがベクターDNAに挿入された組換えDNAを、例えば P. Guerry らの方法(J. Bacteriol., 116,1064, (1973))、D. B. Clewell の方法(J. Bacteriol., 110, 667(1972))などにより単離することができる。

0029

野生型IPMS遺伝子の取得は、染色体上にIPMS遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体DNAを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法(PCR:polymerase chain reaction; White, T.J. et al, TrendsGenet., 5, 185(1989)参照)により、IPMS遺伝子を増幅することによっても行える。増幅反応に用いるDNAプライマーは、IPMS遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するDNA二重鎖の両3’末端に相補するものを用いる。IPMS遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該DNA断片をプライマーとして全領域を含むDNA断片を染色体DNAライブラリーよりスクリーニングする必要がある。IPMS遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたIPMS遺伝子を含有するDNA断片を含むPCR反応液アガロースゲル電気泳動に供した後、目的のDNA断片を抽出することによって IPMS遺伝子を含有するDNA断片を回収できる。

0030

DNAプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知となっている配列(EMBLaccession number No. D10483又はNo.AE000117)を基にして適宜作成すればよいが、具体的には、IPMS遺伝子をコードする1572塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ましい。プライマーDNAの合成は、ホスホアミダイト法(Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)参照)等の常法により、市販のDNA合成装置(例えば、Applied Biosystems社製DNA合成機 model 380B等)を用いて行うことができる。また、PCR反応は、市販のPCR反応装置(宝酒造(株)製DNAサーマルサイクラーPJ2000型等)を使用し、TaqDNAポリメラーゼ(宝酒造(株)より供給されている)を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。

0031

PCR法により増幅されたIPMS遺伝子は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、IPMS遺伝子への変異の導入などの操作がしやすくなる。用いられるベクターDNAと形質転換法、さらに IPMS遺伝子の存在の確認方法は上述した方法と同じである。

0032

なお、IPMS遺伝子の単離に関する報告としては、Hertberg, K.M. et al.,Gene, 8, 135-152(1980)、Davis, M.G. et al., J. Bacteriol., 129, 1078-1090(1977)などがある。

0033

上記のIPMS遺伝子の取得法は、野生型IPMSを有する微生物を変異処理し、変異型IPMSを生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得する場合の、変異型遺伝子の取得にも用いることができる。

0034

(2)IPMS遺伝子への変異の導入
上記のようにして得られたIPMS遺伝子に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントPCR法(Higuchi, R., 61, inPCRTechnology (Erlich, H.A.Eds., Stockton press(1989)))、部位特異的変異法(Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987)); Kunkel, T.A. et.al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こすことができる。

0035

また、目的遺伝子化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。

0036

さらに、染色体もしくはプラスミド上のIPMS遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法(Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159,1039(1984))がある。また、IPMS遺伝子を保有する微生物を紫外線照射する方法またはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、ランダムに変異を導入できる。

0037

変異型遺伝子の選択方法としては、まずIPMS遺伝子を含有するDNA断片とベクターDNAからなる組換えDNAを、直接ヒドロキシルアミン等で変異処理し、これで例えば E. coli W3110 株を形質転換する。次にL−ロイシンのアナログである、4−アザ−D,L−ロイシンまたは3−ヒドロキシ−D,L−ロイシンを含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養する。野生型のIPMS遺伝子を含有する組換えDNAを保持する株は、その組換えDNAにより発現されるIPMSがL−ロイシンのアナログにより阻害されるために、L−ロイシンの合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、L−ロイシンによる阻害の解除されたIPMS遺伝子を含有する組換えDNAを保持する株は、同組換えDNA中のIPMS遺伝子にコードされる変異酵素がL−ロイシンのアナログによる阻害を受けないので、L−ロイシンのアナログが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、L−ロイシンのアナログに耐性となっている株、すなわち阻害の解除された変異型IPMS遺伝子を含有する組換えDNAを保持する株を選択することができる。

0038

こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えDNAとして適当な宿主微生物に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたIPMSを保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌(E. coli)が挙げられる。

0039

また、組換えDNAから変異型IPMS遺伝子断片を取り出し、他のベクターDNAに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできることのできるベクターDNAとしては、プラスミドベクターDNAが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。

0040

さらに、変異型IPMS遺伝子の発現を効率的に実施するために、変異型IPMSをコードするDNA配列上流に、lac、trp、PL等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、IPMS遺伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。

0041

また、上記のように、変異型遺伝子を自律複製可能なベクターDNAに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのように染色体外DNAとして宿主に保持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショントランスポゾン(Berg,D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983))、Muファージ(特開平2−109985号公報)または相同性組換え(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972))を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。

0042

<2>本発明の微生物
本発明の微生物は、本発明のDNAにより形質転換され、かつL−ロイシン生産能を有する微生物である。

0043

本発明のDNAによる形質転換は、公知の方法により行うことができる。例えば、本発明DNAを含む断片を、宿主(形質転換される微生物)で機能するベクターと連結して組換えDNAを作成し、これを宿主に導入することによって行うことができる。ベクターは、宿主に合わせて適切に選択される。組換えDNAの導入は、これまでに報告されている方法に従って行うことができる。例えば、エシェリヒア・コリK-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.Biol., 53, 159 (1970))があり、バチルスズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法(Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977))がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法(Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen,A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978))も応用できる。また、電気パルス法(特開平2−207791号公報参照)も使用できる。この導入法は、宿主に合わせて適切に選択される。具体的には、上記<1>(2)において説明したようなベクター及び方法が挙げられる。

0044

本明細書において、「L−ロイシン生産能を有する」とは、培地中にL−ロイシンを蓄積することを意味し、好ましくは、培地からのL−ロイシンの採取が容易な量で蓄積することを意味する。

0045

本発明の微生物は、好ましくはエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。L−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば特公昭62-34397号公報、特開平8-70879号公報に記載されるようなβ−2−チエニルアラニン、3−ヒドロキシロイシン、4−アザロイシン及び5,5,5−トリフルオロロイシン等のロイシンアナログに対する耐性を有するものや、WO96/06926号国際公開パンフレットに記載されるような遺伝子組換え技術によって育種されるもの等が挙げられる。

0046

エシェリヒア属細菌において、L−ロイシンは、L−バリン生合成系の最終中間体(2−ケトイソ吉草酸)から分岐するL−ロイシン固有生合成経路を通って生合成される。エシェリヒア属細菌では、L−バリン生合成の最終段階の反応はilvGMEDAオペロンによってコードされている酵素群によって、L−ロイシン固有の生合成反応はleuABCDオペロンによってコードされている酵素群によって、それぞれ行われている。

0047

leuABCDオペロンは、leuA、leuB、leuC及びleuDの各遺伝子を有しており、leuAがIPMS、leuBがβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ、leuC及びleuDがα−イソプロピルマレートイソメラーゼをコードしている。これらの酵素のうち、IPMSはα−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応を、α−イソプロピルマレートイソメラーゼはα−イソプロピルリンゴ酸からβ−イソプロピルリンゴ酸への異性化反応を、β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼはβ−イソプロピルリンゴ酸からL−ロイシン生合成の最終中間体であるα−ケトイソカプロン酸への脱水素反応を、各々触媒する。

0048

上記のL−ロイシン生合成経路の反応のうち律速段階であるのは、α−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応であり、この反応を触媒するIPMSは、L−ロイシンによるフィードバック阻害を受ける。従って、このフィードバック阻害が解除されたIPMSをコードするDNAによる形質転換により、微生物にL−ロイシン生産能を付与したり、微生物のL−ロイシン生産能を向上できる。

0049

本発明のエシェリヒア属細菌は、さらに、通常の突然変異処理又は遺伝子工学的手法により、L−ロイシン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素の活性の増強は、例えば、ilvGMEDAオペロン又は/及びleuABCDオペロン、又はこれらの一部を有するDNA断片をプラスミド、ファージ又はトランスポゾンに挿入し、得られる組換えDNAをエシェリヒア属細菌に導入することによって行うことができる。

0050

leuABCDオペロンの塩基配列解析については、Nucleic Acid Res., 20,3305-3308 (1992)に記載されており、全塩基配列はデータベースDDBJaccession no. D10483、DDBJのインターネットアドレス:http://www.ddbj.nig.ac.jp)に登録されている。leuABCDオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒア属細菌染色体DNAを鋳型とするPCR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、White,T.J. et al.; TrendsGenet., 5, 185 (1989)参照)によって、leuABCDオペロンを含むDNA断片を増幅することによって取得できる。また、leuABCDオペロンは、前記文献に記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりエシェリヒア属細菌染色体DNAライブラリーをスクリーニングすることによっても、取得することができる。

0051

また、ilvGMEDAオペロンの全塩基配列及び該オペロンの上流域の塩基配列は、それぞれ Nucleic Acid Res., 15, 2137-2155 (1987)及び Gene, 97, 21-27 (1991)に記載されている。ilvGMEDAオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したプローブ又はプライマーを用いたPCR又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。尚、ilvGMEDAオペロンの取得にエシェリヒア・コリK-12株又はその誘導体を用いる場合には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性回復するように、ilvG遺伝子の復帰変異株を用いることが好ましい。ilvGMEDAオペロンの取得法及びトランスポゾンを用いて該オペロンをエシェリヒア属細菌細胞内で増幅する方法は、それぞれWO96/06926国際公開パンフレット、フランス特許公開第2627508号に詳細に記載されている。

0052

<3>L−ロイシンの製造法
上記のようにして得られるエシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培地中にL−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からL−ロイシンを採取することにより、L−ロイシンを効率よく製造することができる。

0053

本発明の製造法におけるエシェリヒア属細菌の培養および培養液からのL−ロイシンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するするものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。

0054

培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は20〜40℃で、好ましくは30〜38℃の範囲で行う。培地のpHは通常5〜9の範囲であり、6.5〜7.2の範囲が好ましい。培地のpHは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、1〜3日の培養によって、培養液中にL−ロイシンが蓄積する。

0055

培養終了後、培養液から菌体などの固形物遠心分離膜分離法で除去し、イオン交換法濃縮法晶析法等によってL−ロイシンを採取、精製することが出来る。

0056

以上に説明したように、本発明の、L−ロイシンによる阻害が解除されたIPMSをコードするDNAは、L−ロイシン生産微生物育種に利用することができる。このDNAで形質転換された微生物を用いることによって、効率よくL−ロイシンを製造することができる。

0057

以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

0058

変異型IPMSをコードするDNAの取得
<1>L−ロイシン生産株の取得
エシェリヒア・コリ(E. coli)のL−ロイシン生産株を、標準的な研究用野生株E. coli K-12から以下のような選択により得た。E. coli K-12の細胞を、2 mg/mlのN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンを含む変異原溶液により、37℃で30分間処理した。次いで、細胞を0.8% NaCl溶液で2回洗浄し、1 mg/mlのL−ロイシンアナログ(4−アザロイシン)を含むM9寒天培地ディッシュ塗沫した。37℃でのインキュベーションで5日後に生じたコロニーを選び取り、そしてそれらのロイシン生産能を評価した。No.9、No.68、No.58、No.55及びNo.15の株がL−ロイシンを生産した。

0059

<2>L−ロイシン生産株からのleuA遺伝子の取得
得られたロイシン生産性変異株No.55及び野生株E. coli K-12のleuA遺伝子を、欠陥バクテリオファージMu d5005を用いるin vivoクローニング法(Groisman, E.A. et al., J. Bactriol., 168, 357(1986))によりクローニングした。次いで、クローニングしたleuA遺伝子の、オーバーラップする複数の断片を、表1に示すDNAプライマー(LeuA1及びLeuA2、LeuA3及びLeuA4、LeuA5及びLeuA6、LeuA7及びLeuA8、LeuA9及びLeuA10)を用いるPCRによって増幅した。

0060

表1PCRに用いたプライマー
─────────────────────────
プライマー名 配列(5'->3') 配列番号
─────────────────────────
LeuA1 ccaataccgtcccccggc 3
LeuA2 ggtgaaatacagcctgacc 4
LeuA3 gtgatgcggttaattgcctg 5
LeuA4 tgacctctcgttcggggcgt 6
LeuA5 gattcagctggatttggttc 7
LeuA6 cgacgatttgggcctggcg 8
LeuA7 ggcatgtaccgccgccagtga 9
LeuA8 gaagccttccgtattcatacc 10
LeuA9 cagcttggtggcgatgtgc 11
LeuA10 gcccgaagcgaggcgctct 12
─────────────────────────

0061

同じDNAプライマーを、予備的クローニングなしで、No.9、No.68、No.58およびNo.15の各株の染色体からのleuA遺伝子の増幅に用いた。断片の塩基配列はジデオキシチェーンターミネーション法で決定した。

0062

No.9、No.68、No.58、No.55およびNo.15の各株由来のleuA遺伝子は、表2に示す変異を有していた。

0063

各株の細胞を、6%グルコース、1.5%硫酸アンモニウム、0.2%リン酸二水素カリウム、0.1%硫酸マグネシウム、2.5%チョークおよび0.1 mg/mlチアミンを含む培地中32℃で10時間増殖させた。超音波処理および硫安沈殿により無細胞抽出液を得、これを酵素調製物として用いた。IPMS比活性は、Kohlhawらの方法(J.Biol. Chem., 244, 2218(1969))により測定した。I50は、酵素活性の50%阻害を生じるロイシン濃度である。L−ロイシン生産は、上記の培地中で48時間培養した後に測定した。

0064

以上の結果をまとめて表2に示す。

0065

表2ロイシン生産株の性質
────────────────────────────────────
菌株アミノ酸置換IPMSロイシン生産
(塩基置換)比活性I50
(nmol/min/mg (mM) (g/l)
protein)
────────────────────────────────────

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