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技術 植物組織培養物の水浸状組織の発生抑制及び改善方法

出願人 日本製紙株式会社
発明者 藤井裕二村上章田辺稔明
出願日 1999年7月15日 (21年5ヶ月経過) 出願番号 1999-201852
公開日 2001年1月30日 (19年10ヶ月経過) 公開番号 2001-025330
状態 特許登録済
技術分野 植物の育種及び培養による繁殖 微生物、その培養処理
主要キーワード 水浸状 グロブルス 栄養繁殖性 伸長量 ガラス様 供試試料 ボーグ 生長促進効果
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この項目の情報は公開日時点(2001年1月30日)のものです。
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課題

植物組織培養において水浸状組織の発生を抑制し、かつ、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させ、しかも、ジベレリンによる植物組織の強力な生長促進作用を利用した、組織培養による植物の効率的な大量増殖方法を提供する。

解決手段

ジベレリン0.1〜5.0mg/l及び活性炭1〜15g/lを添加した植物組織培養用ゲランガム固体培地にて植物組織を培養する。

概要

背景

植物組織培養容器内栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を作成する組織培養技術は、栄養繁殖性花卉作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量増殖させる方法として近年盛んに用いられている。そして、こうした方法によるクローン苗の生産は、草本植物においては既に実生産の段階に達しており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらしている。

しかし、組織培養においては、培養している植物組織の細胞が水分を含んでガラス様を呈する、いわゆる水浸状の形態を取ることがある。こうした水浸状組織においては、培養物の増殖やシュート伸長、さらにはシュートからの発根阻害されるため、組織培養による大量増殖を行なう際にはしばしば問題となっていた。

現在のところ、こうした水浸状組織の発生を抑制するためには、植物組織の培養において、培地固化するための固化剤として寒天を用いるのが効果的であることが知られている。もっとも、この方法によっても、水浸状組織の発生を完全に防止することはできず、また、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させることはできなかった。

一方、ジベレリンは植物組織の強力な生長促進ホルモンとして知られているが、これを上記寒天培地に添加して植物組織を培養しても生長促進効果見出すことはできない。却って、その生長を阻害する場合すらある。

概要

植物組織培養において水浸状組織の発生を抑制し、かつ、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させ、しかも、ジベレリンによる植物組織の強力な生長促進作用を利用した、組織培養による植物の効率的な大量増殖方法を提供する。

ジベレリン0.1〜5.0mg/l及び活性炭1〜15g/lを添加した植物組織培養用ゲランガム固体培地にて植物組織を培養する。

目的

本発明は、植物組織培養において水浸状組織の発生を抑制し、かつ、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させ、しかも、ジベレリンによる植物組織の強力な生長促進作用を利用した、組織培養による植物の効率的な大量増殖方法を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ジベレリン0.1〜5.0mg/l及び活性炭1〜15g/lを添加した植物組織培養ゲランガム固体培地にて植物組織を培養することを特徴とする、植物組織培養における培養物水浸状組織の発生抑制及び改善方法

請求項2

培養される植物組織が、ユーカリ属に属する植物の組織である、請求項1に記載の植物組織培養における培養物の水浸状組織の発生抑制及び改善方法。

請求項3

ジベレリン0.1〜5.0mg/l及び活性炭1〜15g/lを添加した植物組織培養用ゲランガム固体培地。

請求項4

培養する植物組織が、ユーカリ属に属する植物の組織である、請求項4に記載の植物組織培養用ゲランガム固体培地。

技術分野

0001

本発明は、農業林業等に適用可能な、組織培養による植物体大量生産方法に関する。

背景技術

0002

植物組織培養容器内栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を作成する組織培養技術は、栄養繁殖性花卉作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量増殖させる方法として近年盛んに用いられている。そして、こうした方法によるクローン苗の生産は、草本植物においては既に実生産の段階に達しており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらしている。

0003

しかし、組織培養においては、培養している植物組織の細胞が水分を含んでガラス様を呈する、いわゆる水浸状の形態を取ることがある。こうした水浸状組織においては、培養物の増殖やシュート伸長、さらにはシュートからの発根阻害されるため、組織培養による大量増殖を行なう際にはしばしば問題となっていた。

0004

現在のところ、こうした水浸状組織の発生を抑制するためには、植物組織の培養において、培地固化するための固化剤として寒天を用いるのが効果的であることが知られている。もっとも、この方法によっても、水浸状組織の発生を完全に防止することはできず、また、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させることはできなかった。

0005

一方、ジベレリンは植物組織の強力な生長促進ホルモンとして知られているが、これを上記寒天培地に添加して植物組織を培養しても生長促進効果見出すことはできない。却って、その生長を阻害する場合すらある。

発明が解決しようとする課題

0006

本発明は、植物組織培養において水浸状組織の発生を抑制し、かつ、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させ、しかも、ジベレリンによる植物組織の強力な生長促進作用を利用した、組織培養による植物の効率的な大量増殖方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0007

本発明者らは、鋭意研究の結果、ジベレリンと活性炭を添加したゲランガム固体培地にて植物組織を培養することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成した。

0008

即ち、本発明は、ジベレリン0.1〜5.0mg/l及び活性炭1〜15g/lを添加した植物組織培養用ゲランガム固体培地にて植物組織を培養することを特徴とする、植物組織培養における培養物の水浸状組織の発生抑制及び改善方法であり、しかも、組織培養による植物の効率的な大量増殖を可能とする方法、及び、そのための培地に関する。

発明を実施するための最良の形態

0009

以下、本発明を詳細に説明する。

0010

本発明は、植物の組織培養に適用される。対象となる植物組織は、組織培養されているる植物組織であれば、カルス、多芽体不定芽不定根等、その種類にも、由来する植物種にも限定されない。なお、これらは、既にその一部又は全部が水浸状組織となったものであっても構わない。健康な植物組織の培養に適用した場合、本発明は水浸状組織の発生を抑制し、また、既に水浸状組織を発生させた組織に適用した場合、本発明はその水浸状組織を健康な組織へと回復させるからである。

0011

本発明において、上記植物組織を培養する培地にはジベレリン0.1〜5.0mg/l及び活性炭1〜15g/lを添加する。ジベレリン添加量0.1mg/l未満の場合は、本発明によってもその生長促進効果を発揮させることができず、一方、これが5.0mg/lを超える場合には、カルスの形成・増殖には有利であるが、多芽体、不定芽、不定根等の分化組織においては伸長を抑制する傾向が強く観察されるようになる。また、活性炭添加量が1g/l未満の場合は、本発明の水浸状組織の発生抑制及び改善効果、ジベレリンによる植物組織の生長促進効果を発揮することができず、一方、これが15g/lを超える場合には、培養している組織が粉状のカルスを形成しやすくなる。

0012

かかる培地を固化するための固化剤としては、ゲランガムを用いる。その添加量は、植物の組織培養に通常用いる量、即ち、2〜3g/l程度であればよい。液体培地やゲランガム以外の固化剤(寒天等)を用いた培地では、本発明の効果は達成できない。

0013

本発明の目的は、上記培地を用いて、植物組織を組織培養することにより達成される。これ以外の条件は、培養する植物や組織の種類、あるいは目的に応じて、既に公知の所定の条件に適宜設定してやればよい。

0014

例えば、ジベレリン及び活性炭を添加する植物組織培養用培地としては、ムラシゲ・スクーグ(MS)やガンボーグのB5等、植物の組織培養用培地として一般的に良く知られた基本培地、あるいはこれを改変希釈したものを用いることができる。また、かかる培地に、ジベレリン及び活性炭の他、更に、植物ホルモンとしてサイトカイニン類オーキシン類を単独又は組合せて添加してもよく、また、炭素源としてショ糖5〜50g/lを添加して用いてもよい。ここで用いることができるサイトカイニン類やオーキシン類の種類も特に限定されるものではないが、サイトカイニン類としてはカイネチンベンジルアミノプリン(BAP)が、オーキシン類としてはナフタレン酢酸インドール酪酸等が入手も容易であり使いやすい。ユーカリ属の植物より得られた多芽体に本発明を適用する場合について述べると、MS培地又はこのMS培地の硝酸アンモニウム成分硝酸カリウム成分とを半減させた改変MS培地を基本培地として、これに植物ホルモンとしてBAP0.02〜1mg/l、ショ糖10〜50g/l、そして前記所定量のベンジルアデニン及び活性炭を加え、ゲランガムで固化させた培地を用いてこの多芽体を組織培養することにより、本発明の効果を達成することができる。

0015

本発明において、活性炭は培地中の水分及びジベレリンを一旦吸着して保持し、培養期間の経過に伴い減少するこれらの量に応じて、これらを徐々に培地中に再放出する役割を果たすと考えられる。

0016

もっとも、従来から、樹木の組織培養において、培地中に放出されるポリフェノール類等の有害物質を除去するため、培養に用いる寒天培地に活性炭を添加することは試みられていた。しかし、このような活性炭の添加は、むしろ培養物の著しい生長阻害を引起し、これは、活性炭が、培地中の有害物質のみならず、培養する植物にとって必要な成分をも吸着してしまうためであると考えられていた。

0017

これに対し、本発明者らは、ゲランガム固体培地に所定量のジベレリンと活性炭とを加えて植物の組織培養を行うことにより、水浸状組織の発生を抑制し、また、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させるばかりではなく、組織培養物の極めて良好な生長が観察されることを見出した。これは驚くべき効果であり、その理由はわからない。比較例6にて示すように、寒天培地を用いて組織培養を行なった場合には、活性炭による生長阻害を補うため、活性炭を添加したこの寒天培地に単にジベレリンを添加しても、生長阻害による影響は回復せず、却って、培養物の枯死を招くからである。

0018

以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。

0019

[実施例1]ユーカリプタス・シトリオドーラ(Eucalyptus citriodora(以下、E.シトリオドーラと略す。))5年生個体の当年生枝より特開平8−228621に示す方法で得られた多芽体について、ジベレリンを0.2、0.4、0.6、0.8、1.0又は3.0mg/l、活性炭を5g/l添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、ゲランガム2.5g/l)にて、24℃で1ヶ月間、16時間日長で組織培養を行い、多の伸長、水浸状組織の発生を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表1に示す。

0020

[比較例1]ジベレリン、活性炭を添加しないMSゲランガム固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、ゲランガム2.5g/l)を用いた他は、実施例1と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表1に示す。

0021

[比較例2]活性炭を添加せず、ジベレリンのみ0.6mg/lを添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、ゲランガム2.5g/l)を用いた他は、実施例1と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表1に示す。

0022

[比較例3]ジベレリンを添加せず、活性炭のみ5g/lを添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、ゲランガム2.5g/l)を用いた他は、実施例1と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表1に示す。

0023

表1.多芽体の生長及び水浸状組織の発生抑制に対する本発明の効果
ID=000002HE=075 WI=102 LX=0540 LY=0300

0024

なお、表1中、多芽の伸長量とは、多芽体から発生した各々の芽の伸長量の平均値を示したものである。また、水浸状組織の存在率は、水浸状組織が観察された多芽体の数を分子、培養に供した多芽体の数を分母として表した。

0025

この表1より明らかなように、組織培養用ゲランガム固体培地への活性炭の添加によって、培養物である多芽体からの水浸状組織の発生は、全ての供試試料において抑制された。また、ジベレリン及び活性炭を添加した培地にて培養した多芽体は、これらを添加しないで培養を行った多芽体と比べ2倍以上、ジベレリンのみを添加して培養を行った多芽体と比べても1.5倍以上の多芽の伸長を示した。

0026

なお、培地中へのジベレリン添加による生長促進の効果は、活性炭を併用した場合、添加量0.2g/lで十分に達成され、それ以上添加量を増加させても、この効果に殆ど変化は観察されなかった。

0027

[実施例2]ユーカリプタス・グロブルス(Eucalyptus globulus)5年生個体の当年生枝より特開平8−228621に示す方法で得られ、水浸状組織を発生した多芽体について、ジベレリンを0.6mg/l、活性炭を5g/l添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.2mg/l、ショ糖15g/l、ゲランガム2.5g/l)にて、実施例1と同様に組織培養を行ない、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表2に示す。

0028

[比較例4]活性炭を添加せず、ジベレリンのみ0.6mg/lを添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.2mg/l、ショ糖15g/l、ゲランガム2.5g/l)を用いた他は、実施例2と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表2に示す。

0029

表2. 多芽体の生長及び水浸状組織の回復に対する本発明の効果
ID=000003HE=030 WI=102 LX=0540 LY=1950

0030

表2より明らかなように、活性炭を添加したゲランガム固体培地にて組織培養を行なうことによって、多芽体に発生していた水浸状組織は、全ての供試試料において、健康な組織へと回復した。また、この場合も、ジベレリン及び活性炭を添加した培地にて培養した多芽体は、ジベレリンのみを添加して培養を行った多芽体と比べ、1.3倍程度の多芽の伸長を示した。

0031

[実施例3]ユーカリプタス・ユーロフィラ(Eucalyptus urophylla)×ユーカリプタス・グラディス(Eucalyptus grandis)3年生個体の当年生枝より特開平8−228621に示す方法で得られ、水浸状組織を発生した多芽体について、ジベレリンを0.5mg/l、活性炭を5、10、15g/l添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、ゲランガム2.4g/l)にて、実施例1と同様に組織培養を行ない、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。3週間培養後の結果を表3に示す。

0032

[比較例5]活性炭を添加せず、ジベレリンのみ0.5mg/lを添加したMSゲランガム固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、ゲランガム2.4g/l)を用いた他は、実施例2と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。3週間培養後の結果を表3に示す。

0033

表3.多芽体の水浸状組織回復に対する活性炭の効果
ID=000004HE=040 WI=080 LX=0200 LY=0500

0034

表3より明らかなように、活性炭を添加したゲランガム固体培地にて組織培養を行なうことによって、多芽体に発生していた水浸状組織は顕著に回復し、その効果は、活性炭添加量10g/lで十分に達成された。

0035

[比較例6]E.シトリオドーラ5年生個体の当年生枝より特開平8−228621に示す方法で得られた多芽体について、ジベレリンを0又は0.5mg/l、活性炭を0又は5g/l添加したMS寒天固体培地(BAP0.1mg/l、ショ糖10g/l、寒天8g/l)にて、実施例1と同様に組織培養を行ない、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。1ヶ月間培養後の結果を表4に示す。

0036

表4.寒天固体培地を用いた場合の多芽体の成長及び水浸状組織の発生抑制
ID=000005HE=040 WI=104 LX=0530 LY=1000

0037

表4より明らかなように、活性炭を添加した寒天固体培地にて組織培養を行うことによって、多芽の伸長は著しく阻害され、これは、同じ培地中にジベレリンを添加することによっても回復せず、むしろ、供試試料全てが枯死するという結果となった。また、本比較例においては、ジベレリンのみを添加した培地にて培養を行った多芽体もまた、著しい生長阻害を示し、ジベレリン自体による単なる生長促進効果すらも観察されなかった。

発明の効果

0038

本発明により、植物組織培養においてしばしば問題となっていた、培養組織からの水浸状組織の発生を抑制することができる。

0039

また、本発明においては、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させることもできる。

0040

しかも、本発明によれば、培養組織の成長を著しく促進させることができる。

0041

従って、本発明によれば、組織培養による植物の効率的な大量増殖が可能となる。

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