図面 (/)

技術 AUR—1および/またはAUR—2関連疾患の診断および処置

出願人 スージェン・インコーポレーテッド
発明者 プラウマン,グレゴリー・ディーモジー,ケビン・ジー
出願日 1996年11月25日 (24年1ヶ月経過) 出願番号 1997-522807
公開日 2000年3月14日 (20年9ヶ月経過) 公開番号 2000-502895
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 ペプチド又は蛋白質 生物学的材料の調査,分析 微生物による化合物の製造 酵素・酵素の調製 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 補助突 共通触媒 参照文 循環条件 内部表 制御カスケード 微小管構築 インシチュー
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2000年3月14日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (1)

課題・解決手段

本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含んでいる細胞組織および動物、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを利用するアッセイ、および前記のものすべてに関連する方法に関している。AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドとAUR−1および/またはAUR−2結合相手間の異常な相互作用により特徴付けられるAUR−1および/またはAUR−2関連疾患または病態のための処置診断およびスクリーニング法が提供される。

概要

背景

概要

本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含んでいる細胞組織および動物、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを利用するアッセイ、および前記のものすべてに関連する方法に関している。AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドとAUR−1および/またはAUR−2結合相手間の異常な相互作用により特徴付けられるAUR−1および/またはAUR−2関連疾患または病態のための処置診断およびスクリーニング法が提供される。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
5件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしている単離、濃縮または精製された核酸分子

請求項2

該核酸分子がヒト核酸である請求項第1項に記載の核酸分子。

請求項3

分子配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも25の連続したアミノ酸をコードしている請求項第1項に記載の核酸分子。

請求項4

該分子が配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも50の連続したアミノ酸をコードしている請求項第1項に記載の核酸分子。

請求項5

該分子が配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも100の連続したアミノ酸をコードしている請求項第1項に記載の核酸分子。

請求項6

該分子が配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも200の連続したアミノ酸をコードしている請求項第1項に記載の核酸分子。

請求項7

該分子が配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも300の連続したアミノ酸をコードしている請求項第1項に記載の核酸分子。

請求項8

試料中のAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしている核酸を検出するための核酸プローブ

請求項9

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも25の連続したアミノ酸を含む請求項第8項に記載のプローブ

請求項10

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも50の連続したアミノ酸を含む請求項第8項に記載のプローブ。

請求項11

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも100の連続したアミノ酸を含む請求項第8項に記載のプローブ。

請求項12

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも200の連続したアミノ酸を含む請求項第8項に記載のプローブ。

請求項13

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも300の連続したアミノ酸を含む請求項第8項に記載のプローブ。

請求項14

AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドおよび宿主内で転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターをコードしている組換え核酸分子

請求項15

細胞内で機能的な転写領域、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしているRNA配列相補的な配列および細胞内で機能的な転写終止領域を含む組換え核酸分子。

請求項16

単離、濃縮または精製されたAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項17

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも25の連続したアミノ酸を含む請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項18

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも50の連続したアミノ酸を含む請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項19

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも100の連続したアミノ酸を含む請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項20

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも200の連続したアミノ酸を含む請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項21

該ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも300の連続したアミノ酸を含む請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項22

該ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項23

該ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項24

該ポリペプチドがAUR−1ポリペプチドである請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項25

該ポリペプチドがAUR−2ポリペプチドである請求項第16項に記載のAUR−1またはAUR−2ポリペプチド。

請求項26

AUR−1またはAUR−2ポリペプチドに特異的結合親和性を有する抗体。

請求項27

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも3つの連続したアミノ酸を含む請求項第26項に記載の抗体。

請求項28

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも4つの連続したアミノ酸を含む請求項第26項に記載の抗体。

請求項29

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも25の連続したアミノ酸を含む請求項第26項に記載の抗体。

請求項30

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも50の連続したアミノ酸を含む請求項第26項に記載の抗体。

請求項31

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも100の連続したアミノ酸を含む請求項第26項に記載の抗体。

請求項32

該ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される請求項第26項に記載の抗体。

請求項33

該ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請求項第26項に記載の抗体。

請求項34

該ポリペプチドがAUR−1ポリペプチドである請求項第26項に記載の抗体。

請求項35

該ポリペプチドがAUR−2ポリペプチドである請求項第26項に記載の抗体。

請求項36

AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドに特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ

請求項37

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも25の連続したアミノ酸を含む請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項38

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも50の連続したアミノ酸を含む請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項39

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも100の連続したアミノ酸を含む請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項40

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも200の連続したアミノ酸を含む請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項41

該AUR−1またはAUR−2ポリペプチドが配列ID番号:3または配列ID番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも300の連続したアミノ酸を含む請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項42

該ポリペプチドが哺乳類から単離、精製または濃縮される請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項43

該ポリペプチドがヒトから単離、精製または濃縮される請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項44

該ポリペプチドがAUR−1ポリペプチドである請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

請求項45

該ポリペプチドがAUR−2ポリペプチドである請求項第36項に記載のハイブリドーマ。

技術分野

0001

AUR−1および/またはAUR−2関連疾患の診断および処置
本発明はオーロラ(AURORA)1およびオーロラ2(”AUR−1および
AUR−2”)と称される新規タンパク質、AUR−1および/またはAUR−
2をコードしているヌクレオチド配列、ならびに種々のAUR−1および/また
はAUR−2関連疾患および病態の診断および処置に有用な種々の生成物および
方法に関している。

背景技術

0002

発明の背景に関する以下の説明は、本発明の理解を手助けするために提供され
ているものであり、本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

0003

細胞シグナル伝達は基本の機構であり、それにより、多様な細胞過程を制御す
外部刺激細胞の内部へ中継される。シグナル伝達の重要な生化学的機構の一
つにタンパク質の可逆的リン酸化が含まれており、それはタンパク質の構造およ
び機能を変化させることにより成熟タンパク質活性の制御を可能にしている。

0004

真核生物において最もよく特徴付けられたプロテインキナーゼはタンパク質の
セリンスレオニンおよびチロシン残基アルコール基リン酸化する。これら
キナーゼは、セリンおよびスレオニンを特異的にリン酸化するもの、およびチ
シンを特異的にリン酸化するものの二つの群に大きく分けることができる。”
二重特異性”キナーゼと称されているいくつかのキナーゼはチロシンならびにセ
リンスレオニン残基をリン酸化することができる。

0005

プロテインキナーゼは細胞内のそれらの位置によっても特徴付けることができ
る。いくつかのキナーゼはリガンドの結合のような外部環境応答してそれらの
触媒活性を直接的に変化できるトランスメンブラン受容体型タンパク質である。
他のものはトランスメンブランドメイン欠く非受容体型タンパク質である。こ
れらは細胞膜内部表面から核までの種々の細胞区画に見いだすことができる。

0006

多くのキナーゼは制御カスケードに関係しており、そのカスケードではそれら
基質にはその活性がリン酸化状態により制御されている他のキナーゼが含まれ
るであろう。最終的に、いくつかの下流エフェクターの活性はそのような経路
活性化により生じるリン酸化により調節されている。

0007

セリン/スレオニンキナーゼファミリーは、細胞増殖、移動、ホルモン分化
および分泌改変遺伝子発現により生じる転写因子のリン酸化、筋肉収縮グル
コース代謝、細胞タンパク質合成の調節および細胞周期の制御の調節に関与する
シグナリングカスケードを含む種々のシグナリングカスケードのすべての過程
見いだされる。
発明の要約

0008

本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含んでいる細胞、そのような
ポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを利用するアッセイおよび
上記のことすべてに関連する方法に関している。本発明は、我々がAUR−1お
よび/またはAUR−2と命名した新規タンパク質の単離および特性付けに基づ
いている。本明細書に示された配列が与えられた場合、それらのポリペプチドお
よび核酸はよく知られた標準的合成技術を用いて製造することができる。

0009

AUR−1およびAUR−2はセリン/スレオニンキナーゼに関連しており、
短いN−末端伸張が行われている。ショウジョウバエおよび酵母同族体は有糸分
裂制御に関係しているように思われる。ヒトタンパク質は癌および/または他の
信号伝達障害に関係しているようである。AUR1 RNAは正常および腫瘍
織両方に由来する急速に分裂している細胞に広く発現されている。しかしながら
AUR2 RNAはより限定されたパターンで発現され、ほとんどの正常組織
低いかまたは欠如しており、特に結腸直腸起源腫瘍由来細胞株の一部にのみ豊
富である。オーロラ1およびオーロラ2は両方とも胎児肝臓成人精巣および
での中間発現を示し、減数分裂におけるこれらのタンパク質の正常の役割を暗
示している。AUR1およびAUR2両方とも核分裂を制御しているようであり
、シグナリングの崩壊により倍数体細胞が生じる。この表現型は、その酵母同族
体IPL1で見られるような染色体誤分離によるようである。倍数性腫瘍細胞
およびp53腫瘍サプレッサー欠損した細胞を証明するものであるので、細胞
形質転換におけるAUR1およびAUR2の役割を試験した。

0010

ヒト遺伝子一次配列分析により、それらは高度に保存されたC−末端プロテ
インキナーゼドメイン、および弱く保存された74から130アミノ酸の、基質
結合モチーフとして制御的役割または機能を果たすであろうN−末端ドメイン
含んでいることが明らかにされた。ヒト遺伝子はまた、キナーゼドメインの活性
ループ中のcAMPPKリン酸化部位R/KR/KXS/Tも含んでおり
、細胞周期により制御されるCDC2/CDK関連タンパク質に類似した制御経
路が示唆される。

0011

AUR1およびAUR2の独特なN−末端領域から誘導されたプローブを用い
サザン分析は、それらがヒト細胞内において単一コピー遺伝子として存在する
ことを示している。しかしながら、低ストリンジェンシー条件下、我々はAUR
1プローブに弱くハイブリダイズする1.3kbおよび3.2kb SacI断
片を検出することができた。クローニングおよび配列分析により、この領域は多
フレームシフトを持つイントロンを持たないAUR1関連偽遺伝子(AUR3と
名付けられた)をコードしていることが明らかにされた。さらに、AUR3
伝子のすぐ上流は非常に安定なヘアピンループを形成することが予測される複雑
逆方向反復を持つ領域である。AUR3DNA配列はAUR1cDNA
最初のヌクレオチドから始まるAUR1と相同的である。この部位のすぐ上流は
、AUR3の予測されるヘアピンループである。我々は現在、AUR3への相同
性がこのヌクレオチドから上流へ続いているか、およびAUR1 cDNAが類
似のヘアピンループを含んでいるかまたはそのループが先だって存在するかどう
かを決定するためにAUR1ゲノムクローンの特性付けを行っている。

0012

本発明の有用性として細胞増殖の阻害剤スクリーニングする能力、および癌
処置のための小分子治療術を開発する能力が挙げられる。

0013

従って、本発明の第一の態様はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプ
チドをコードしている単離、濃縮または精製された核酸を特色とする。

0014

”AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド”とは配列ID番号:3
または配列ID番号:4に示されている配列、またはそれらの断片と実質的に類
似したアミノ酸配列を意味している。実質的に類似している配列は好適には配列
ID番号:3または配列ID番号:4の配列と少なくとも90%の同一性(より
好適には少なくとも95%、および最も好適には99−100%)を持っている
であろう。

0015

”同一性”とはその類似性または相関性を測定する配列の性質を意味している
。同一性は同一の残基の数を残基の総数割り、それに100を掛けることによ
り測定される。従って、正確に同一の配列の二つのコピーは100%の同一性を
持っているが、より少ない程度で保存されており、および欠失、付加または置換
を持つ配列はより低い程度の同一性を持っている。当業者にはいくつかのコン
ュータープログラム配列同一性の決定に利用できることが認められるであろう

0016

核酸に関して”単離された”とは天然供給源から単離されたまたは合成され
たDNAまたはRNAを含む、お互いに結合された6つ(好適には21、より好
適には39、最も好適には75)のヌクレオチドのポリマーを意味している。本
発明のある態様では、より長い核酸、例えば、300、600、900またはよ
り長いヌクレオチドの核酸および/または配列ID番号:1または配列ID番号
:2に示された完全長配列と少なくとも50%、60%、75%、90%、95
%または99%の同一性を持つ核酸が好適である。本発明の単離された核酸は、
天然には純粋なまたは分離された状態では観察されないという点で独特である。
用語”単離された”の使用は、天然に存在する配列がその正常な細胞(即ち、染
色体)環境から除去されていることを示している。従って、そのような配列は細
胞を含んでいない溶液中に存在しているか、または異なった細胞環境に置かれて
いるであろう。本用語は、配列が存在しているヌクレオチド鎖のみであること、
天然にそれに付随している非ヌクレオチド物質を本質的に含んでいないことを(
少なくとも約90−95%の純度)示しているわけではなく、単離された染色体
と区別されていることを意味している。

0017

核酸に関して、用語”濃縮された”とは正常または病的細胞中、またはその配
列が取り出された細胞中よりも問題とする細胞または溶液中において、特定のD
NAまたはRNA配列が全DNAまたはRNA中の有意により高い割合(2−5
倍)を構成することを意味している。このことは、存在する他のDNAまたはR
NA量の優先的減少、または特定のDNAまたはRNA配列量の優先的増加また
はこれら二つの組み合わせにより生じうる。しかしながら、濃縮されたとは他の
DNAまたはRNA配列が存在しないことを示しているわけではなく、ただ問題
とする配列の相対量が有意に増加していることであることに注意されたい。本明
細書において用語”有意に”とは増加のレベルがそのような増加を行っている人
に有用であることを示すために使用されており、一般的には他の核酸と比較して
少なくとも2倍、より好適には少なくとも5から10倍またはそれ以上を意味し
ている。本用語はまた他起源のDNAまたはRNAが存在しないことを示してい
るわけではない。他起源DNAには例えば、酵母または細菌ゲノム、またはpU
C19のようなクローニングベクターからのDNAが含まれるであろう。この用
語は、一つのmRNAレベルが他のmRNAに比べて自然に増加するウイルス
染または腫瘍型増殖のような天然に起こる出来事とは区別される。すなわち、本
用語は所望の核酸の比率を上昇させるために人が介在したような状況のみを含む
ことを意味している。

0018

ヌクレオチド配列が精製された形であることはまたいくつかの目的に有利であ
る。核酸に関して用語”精製された”とは絶対的な純度(均一試料のような)を
要求してはいない;それよりも、配列が天然の環境にあるよりも相対的に純粋で
あるという指標を表している(天然のレベルと比較して、このレベルは少なくと
も2−5倍以上でなければならない、例えば、mg/mlで)。cDNAライブ
ラリーから単離された個々のクローン電気泳動的に均一になるまで精製される
であろう。これらのクローンから得られ、特許請求されるDNA分子は、全DN
Aまたは全RNAから直接得ることができる。cDNAクローンは天然には存在
しないが、好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質(メッセンジャー
RNA)の操作により得られる。mRNAからのcDNAライブラリー構築
は、合成物質(cDNA)の作成が含まれ、純粋な個々のcDNAクローンは、
cDNAライブラリーを運んでいる細胞のクローン選択により合成ライブラリー
から単離できる。従って、mRNAからのcDNAライブラリーの構築および別
々のcDNAクローンの単離を含むプロセスにより天然のmRNAを約106倍
に精製することができる。少なくとも1桁、好適には2または3桁、およびより
好適には4または5桁程度の精製は明白に企図される。

0019

”AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド”とは、配列ID番号:
3または配列ID番号:4の完全長アミノ酸配列に示した、25(好適には30
、より好適には35、最も好適には40)またはそれ以上の連続したアミノ酸配
列、または本明細書に記載したようなそれらの機能性誘導体を意味している。あ
る態様では、100、200、300またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチド
が好適である。AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドは、完全長核
酸配列、またはポリペプチドの機能性活性が保持されている限り完全長核酸配列
の任意の一部によりコードされることができる。

0020

好適な態様において、単離された核酸は配列ID番号:3または配列ID番号
:4の完全長アミノ酸配列に示した核酸配列、その機能性誘導体、またはその少
なくとも25、30、35、40、50、100、200または300の連続し
たアミノ酸をコードする核酸配列を含むか、それらから本質的に成るか、または
それらから成る;本AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドは、AU
R−1および/またはAUR−2の少なくとも25、30、35または40の連
続するアミノ酸を含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成る。
核酸はcDNAクローニングまたは減法ハイブリダイゼーションにより天然の供
給源から単離することができる;天然の供給源は哺乳類(ヒト)の血液、精液
たは組織であることができ、核酸はトリエステル法または自動化DNA合成機に
より合成することができる。さらに別の態様において、本核酸は保存されたまた
特有の領域であり、例えば、追加のポリペプチドの同定およびクローニングを
容易にするためのハイブリダイゼーションプローブの設計に、追加のポリペプチ
ドのクローニングを容易にするためのPCRプローブの設計に、およびポリペプ
チド領域に対する抗体を得るために有用なものである。本発明のアミノ酸配列の
例としては以下のアミノ酸配列が含まれる(それらをコードしている単離された
、精製されたまたは濃縮された核酸もまた本発明の範囲内である):
ENSYPWPYGRQ(配列ID番号:5)
CISGP(配列ID番号:6)
FPO(配列ID番号:7)
VNSGQ(配列ID番号:8)
KEPVTPSA−LV(配列ID番号:9)
LMSRSNVQPTAAP(配列ID番号:10)
VQNQKQKQLQATSVPH(配列ID番号:11)
PVSRPLNNTQK(配列ID番号:12)
VMENSSGTPD(配列ID番号:13)
ILTRHFTID(配列ID番号:14)
SKQPLSAPENNPEEQASKQK(配列ID番号:15)

0021

”保存された核酸領域”とは、低ストリンジェンシー条件下、特定の核酸配列
がハイブリダイズできる、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドを
コードしている二つまたはそれ以上の核酸上に存在する領域を意味している。A
UR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしている核酸のスクリ
ニングに適した低ストリンジェンシー条件はAbeら、J.Biol.Che
m.,19:13361(1992)に提供されている(図を含む全文のまま本
明細書において援用される)。好適には、保存された領域は20ヌクレオチドの
うち5つ以上は異ならない。

0022

”特有な核酸領域”とは、他の天然に存在するポリペプチドをコードしている
配列中には存在しないが、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドを
コードしている完全長核酸には存在している配列を意味している。そのような領
域は好適にはAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしてい
る完全長核酸に存在する30または45の連続したヌクレオチドを含んでいる。
特に、特有な核酸領域は好ましくは哺乳類起源である。

0023

本発明はまた、試料中のAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドま
たはAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしている核酸を
検出するための核酸プローブも特色としている。本核酸プローブは配列ID番号
:1または配列ID番号:2に示した配列またはそれらの機能性誘導体にハイブ
ダイズするであろう核酸を含んでいる。

0024

好適な態様において本核酸プローブは、配列ID番号:1または配列ID番号
:2に示した完全長配列の少なくとも12、75、90、105、120、15
0、200、250、300または350の連続するアミノ酸をコードしている
核酸またはその機能性誘導体にハイブリダイズする。所望される特異性および
選択性に依存して、種々の低または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーショ
ン条件が使用されるであろう。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
では高度に相補的である核酸配列のみがハイブリダイズする。好適には、そのよ
うな条件は20の連続するヌクレオチドの内、1または2の不適正な組み合わせ
を持つ核酸のハイブリダイゼーションを防止する。

0025

本プローブ使用法として、ハイブリダイゼーションが起こる条件下、試料と
核酸プローブを接触させ、AUR−1および/またはAUR−2 RNAへ結合
したプローブの存在または量を検出することによる、試料中のAUR−1および
/またはAUR−2 RNAの存在または量を検出することが挙げられる。プロ
ーブとAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしている核酸
配列との間に形成された核酸デュープレックスは検出された核酸の配列同定に使
用される(例えば、Nelsonらによる、Nonisotopic DNAP
robe Techniques,p.275 Academic Press
,San Diego(Kricka,ed.,1992)、図を含む全文のま
ま本明細書において援用される、を参照されたい)。そのような方法を実施する
ためのキットは、核酸プローブが中に配備された容器を含むように構築されるで
あろう。

0026

本発明はまた、好適には細胞または生物体中の組換え体核酸を特色としている
。組換え体核酸は配列ID番号:lまたは配列ID番号:2に示した配列または
その機能性誘導体、および宿主細胞中で転写を開始させるのに有効なベクター
たはプロモーターを含んでいるであろう。組換え体核酸は代わりに、細胞中で機
能的である転写開始領域、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドを
コードしているRNA配列と相補的な配列および細胞中で機能的である転写終止
領域を含むこともできる。

0027

本発明の別の態様は、単離された、濃縮された、または精製されたAUR−1
および/またはAUR−2ポリペプチドを特色としている。

0028

ポリペプチドに関して”単離された”とは、2(好適には7、より好適には1
3、最も好適には25)またはそれ以上のアミノ酸がお互いに結合されたポリマ
ーを意味し、天然の供給源から単離されたまたは合成されたポリペプチドを含む

ある態様においては、配列ID番号:3または配列ID番号:4に示した402
、407、413または425の連続したアミノ酸のようなより長いポリペプチ
ドが好適である。本発明の単離されたポリペプチドは、天然には純粋なまたは分
離された状態では観察されないという点において独特である。用語”単離された
”の使用は、天然に存在する配列がその正常な細胞環境から除去されていること
を示している。従って、そのような配列は細胞を含んでいない溶液中に存在して
いるか、または異なった細胞環境に置かれているであろう。本用語は、配列が存
在しているアミノ酸鎖のみであること、天然にそれに付随している非ヌクレオ
ド物質を本質的に含んでいないことを(少なくとも約90−95%の純度)示し
ているわけではない。

0029

ポリペプチドに関して、用語”濃縮された”とは正常または病的細胞中、また
はその配列が取り出された細胞中よりも問題とする細胞または溶液中において、
特定のアミノ酸配列が全アミノ酸中の有意により高い割合(2−5倍)を構成す
ることを意味している。このことは、存在する他のアミノ酸量の優先的減少、ま
たは特定のアミノ酸配列量の優先的増加またはこれら二つの組み合わせにより生
じうる。しかしながら、濃縮されたとは他のアミノ酸配列が存在しないことを示
しているわけではなく、ただ問題とする配列の相対量が有意に増加していること
であることに注意されたい。本明細書において用語”有意に”とは増加のレベル
がそのような増加を行っている人に有用であることを示すために使用されており
、一般的には他のアミノ酸と比較して少なくとも2倍、より好適には少なくとも
5から10倍またはそれ以上を意味している。本用語はまた他起源のアミノ酸が
存在しないことを示しているわけではない。他起源アミノ酸には例えば、酵母ま
たは細菌ゲノム、またはpUC19のようなクローニングベクターによりコード
されているアミノ酸が含まれるであろう。本用語は所望の核酸の比率を上昇させ
るために人が介在したような状況のみを含むことを意味している。

0030

アミノ酸配列が精製された形であることはまたいくつかの目的に有利である。
ポリペプチドに関して用語”精製された”とは絶対的な純度(均一試料のような
)を要求してはいない;それよりも、配列は天然の環境にあるよりも相対的に純
粋であるという指標を表している(天然のレベルと比較して、このレベルは少
なくとも2−5倍以上でなければならない、例えば、mg/mlで)。少なくと
も1桁、好適には2または3桁、およびより好適には4または5桁程度の精製は
明白に企図される。本物質は好適には機能的に有意なレベルで夾雑物を含んでい
ない、例えば、90%、95%または99%の純度である。

0031

好適な態様において、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドは配
列ID番号:3または配列ID番号:4に示した完全長配列またはその機能性誘
導体の少なくとも25、30、35、40、50、100、150、200、2
50、300または350の連続したアミノ酸を含んでいる。

0032

本発明のさらに別の態様は、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチ
ドに対して特異的結合親和性を持つ抗体(例えば、モノクローナルまたはポリク
ローナル抗体)を特色としている。本抗体はAUR−1および/またはAUR−
2ポリペプチドに特異的に結合できるアミノ酸の配列を含んでいる。”特異的結
合親和性”とは、特定の条件下、抗体が他のポリペプチドに結合するよりもより
高い親和性でAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドに結合すること
を意味している。

0033

AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドへの特異的結合親和性を持
つ抗体は、免疫複合体が形成される条件下で試料と抗体を接触させ、AUR−1
および/またはAUR−2ポリペプチドに結合した抗体の存在および/または量
を検出することにより、試料中のAUR−1および/またはAUR−2ポリペプ
チドの存在および/または量を検出するための方法に使用することができる。そ
のような方法を実施するための診断キットは、本抗体を包含する第一の容器およ
び抗体の結合相手と標識との複合体を包含する第二の容器を含むように構築され
るであろう。

0034

本発明の別の態様は、AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドへの
特異的結合親和性を持つ抗体を産生するハイブリドーマを特色としている。”ハ
イブドーマ”とは抗体(例えば、AUR−1および/またはAUR−2抗体)
を分泌できる不死化細胞株を意味している。好適な態様において、AUR−1お
よび/またはAUR−2抗体はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチ
ドを特異的に結合できるアミノ酸の配列を含む。

0035

別の態様において、本発明は組換えAUR−1および/またはAUR−2ポリ
ペプチドまたはその特有の断片を含んでいるポリペプチドを記載している。”特
有の断片”とは他の天然にポリペプチドには存在しない完全長AUR−1および
/またはAUR−2ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を意味している。好適
には、そのような配列は全配列中に存在する6つの連続したアミノ酸から成って
いる。より好適には、そのような配列は全配列中に存在する12の連続したアミ
ノ酸から成っている。さらにより好適には、そのような配列は全配列中に存在す
る18の連続したアミノ酸から成っている。

0036

”組換えAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド”とは、その位置
(例えば、天然に観察されるものと異なった細胞または組織に存在する)、純度
または構造の点において天然に存在するポリペプチドとは性質が異なるように組
換えDNA技術により産生されたポリペプチドを含んでいることを意味している
。一般的に、そのような組換えポリペプチドは通常天然に観察される量とは異な
った量で細胞内に存在するであろう。

0037

別の態様において、本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチ
ドをコードしている精製された核酸を含む組換え細胞または組織を記載している
。そのような細胞において、核酸はそのゲノム制御要素の調節下にあるか、また
外因性プロモーターを含む外因性制御要素の調節下にあるであろう。”外因性
”とは、インビボにおいてAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドの
コード配列と通常は転写的に結合されていないプロモーターを意味している。

0038

別の態様において、本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチ
ドへ結合できるAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド結合剤を特色
としている。結合剤は好適にはAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチ
ド上に存在するエピトープを認識する精製抗体である。他の結合剤としては本A
UR−1および/またはAUR−2ポリペプチドへ結合する分子およびAUR−
1および/またはAUR−2ポリペプチドへ結合する類似の分子が含まれる。そ
のような結合剤はPDGFR活性を測定するアッセイのような、AUR−1およ
び/またはAUR−2結合パートナー活性を測定するアッセイを用いて同定され
るであろう。

0039

抗体に関して”精製された”とは、抗体が精製された形であるような、天然に
存在する抗体とは異なった抗体を意味している。好適には、抗体は標準技術によ
り均一な調製試料として提供される。クローン化ポリペプチドの抗体の使用には
、治療術または診断手段としての使用が含まれる。

0040

本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドまたは等価な配列
を含むヒト細胞をスクリーニングするための方法を特色としている。本方法は、
本明細書においてAUR−1および/またはAUR−2を同定するために記載さ
れている技術のような本分野では日常および標準の技術を用いて、ヒト細胞中の
新規ポリペプチドを同定することを含んでいる(例えば、クローニング、サザン
またはノーザンブロット分析、インシチューハイブリダイゼーション、PCR増
幅など)。

0041

本発明はまたヒト細胞について、AUR−1および/またはAUR−2ポリペ
プチドの結合パートナーをスクリーニングする方法、および他の生物体のAUR
−1および/またはAUR−2または対応する結合パートナーをスクリーニング
する方法を特色としている。本発明はまた、上記の方法により同定されたペプチ
ドの精製された、単離された、または濃縮されたものも特色としている。

0042

別の態様において、本発明はAUR−1および/またはAUR−2およびAU
R−1および/またはAUR−2結合パートナー間の相互作用を妨害できる試薬
を同定するアッセイを提供する。そのようなアッセイはインビトロまたはインビ
ボで実施され、本明細書にも詳しく説明されており、あるいは、1995年6月
7日に出願された米国特許出願第08/487,088号(図を含み本明細書に
おいて援用される)に記載されている増殖アッセイまたは1995年10月13
日に出願された米国特許出願第60/005,167号(図を含み本明細書にお
いて援用される)に記載されているアッセイのような現存するアッセイを修正
ることにより得ることもできる。本発明の遺伝子を使用するように改変しうる別
のアッセイは1994年10月13日に公開された国際特許出願第WO94/2
3039号に記載されている。他の可能性としては、自己リン酸化アッセイにお
けるキナーゼ活性の検出、またはヒストンミエリン塩基性タンパク質ガンマ
チューブリンまたは中心体タンパク質のような標準基質に対するキナーゼ活性の
試験が挙げられる。結合パートナーはツーハイブリッドスクリーン内へタンパク
質のN−末端部分を加えることにより、または二重特異性キナーゼのホスホチロ
シンを検出することにより同定されるであろう(FieldsおよびSong、
米国特許第5,283,173号(1994年2月1日公開)、本明細書におい
て援用される)。

0043

オーロラ活性の阻害剤が決定されるであろう一つの手段は、ChanおよびB
otstein(Genetics 135:677−691,1993)によ
り記載されているような温度感受性酵母突然変異体を用いるスクリーニング系
ある;Francisco et al.,Mol.Cell.Bio.14(
7):4731−4740,1994、もまた参照されたい、これらは両方とも
図を含んで全文のまま本明細書において援用される。簡単に記すと、26℃で生
存可能でオーロラの酵母同族体(ipl1)の温度感受性形を発現する酵母株
CY72−3D−1(ipl 1−2)は37℃では増殖できない。この株を推
定基質相互作用ドメインを含むipl1のN−末端部分および触媒ドメインを含
むオーロラ1または2のC−末端部分から成るハイブリッドオーロラ遺伝子を含
んでいる発現プラスミドトランスフェクションすると、増殖温度に対する感受
性が克服される。オーロラ発現酵母株は次に試験物質存在下、37℃で増殖させ
る。オーロラ触媒機能阻害する物質存在下では増殖は明らかに起こらないであ
ろう。可能性のある阻害剤としては真菌海洋生物、植物などのような種々の生
物体から単離された低分子量化学物質および/または天然物が含まれる。

0044

上記の本発明の要約は本発明を制限するものではなく、本発明の他の特色およ
び利点は、以下に記載の好適な態様および請求の範囲から明らかになるであろう

好適な態様の説明

0045

本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードしている核酸、そのような核酸を含む細胞、組織および動物
そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを使用するアッ
セイおよび上記すべてに関連する方法に関している。
I.AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしている核酸

0046

本明細書に記載された単離核酸分子機能的均等物は本発明の範囲内に含まれ
ている。遺伝子コード縮重は、同一のアミノ酸を特定し、従って同一のタンパ
ク質を与える他のコドンによるある種のコドンの置換を可能にする。メチオニン
およびトリプトファンを除いて既知のアミノ酸は2つ以上のコドンでコードでき
るので、核酸配列は実質上変化可能である。従って、AUR−1および/または
AUR−2遺伝子の一部またはすべてが配列ID番号:1または配列ID番号:
2に示された配列とかなり異なった形の核酸配列を与えるように合成できる。し
かしながら、コードされたアミノ酸配列は保存されているであろう。

0047

加えて、核酸配列は配列ID番号:1または配列ID番号:2に示された核酸
式またはその誘導体の5’−末端および/または3’−末端への少なくとも一つ
のヌクレオチドの付加、欠失または置換により生じたヌクレオチド配列を含んで
いてもよい。付加、欠失または置換がヌクレオチド配列によりコードされている
配列ID番号:3または配列ID番号:4のアミノ酸配列を変化させないならば
、この点において任意のヌクレオチドまたはポリペプチドを使用してもよい。例
えば、本発明の核酸配列またはその誘導体の5’−末端に開始コドンとしてAT
Gが付加された、または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の3’−末
端に終止コドンとしてTTA、TAGまたはTGAが付加された核酸配列を含む
ことを本発明は意図している。さらに、本発明の核酸分子は必要性に応じてその
5’−末端および/または3’−末端に制限エンドヌクレアーゼ認識部位が加え
られている。

0048

与えられた核酸配列のそのような機能性改変は、それらに融合された外来核酸
配列によりコードされている異種タンパク質の分泌および/またはプロセッシン
グを促進する機会を授ける。従って、遺伝子コードにより許されたAUR−1お
よび/またはAUR−2遺伝子およびそれらの断片のヌクレオチド配列のすべて
の改変は本発明に包含されている。

0049

さらに、非改変核酸分子により産生されるポリペプチドと実質的に同じ効用
たは活性を持つ構造的改造されたポリペプチドを製造するために、コドンを欠
落させるまたは縮重コドン以外のコドンによる一つまたはそれ以上のコドンを置
換することが可能である。本分野で認められているように、産生のもとになる二
つの核酸分子において核酸分子間の相違が遺伝子コードの縮重と関連していなく
ても、二つのポリペプチドは機能的に等価である。
II.AUR−1および/またはAUR−2検出のための核酸プローブ

0050

本発明の核酸プローブは、本発明の別の核酸分子を得るため、通常のハイブリ
ダイゼーション法により適当な染色体またはcDNAライブラリーの探査に使用
される。染色体DNAまたはcDNAライブラリーは本分野で認められている方
法(”Molecular Cloning:A Laboratory Ma
nual、第二版、Sambrook、Fritsch & Maniatis
編、Cold Spring Harbor Laboratory、1989
参照)に従って適当な細胞から調製されるであろう。

0051

もしくは、問題とするポリペプチドのアミノ酸配列のN−末端およびC−末端
部分に対応するヌクレオチド配列を持つ核酸プローブを得るために化学合成が実
施される。例えば、本発明の断片を得るため、適当な染色体またはcDNAライ
ブラリーを利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プロトコール(”A G
uide to Methodsand Applications”、Mi
chaelら編、Academic Press、1990)に本質的に従った
認知されているPCR技術に従って実施されるPCRにおいて、合成された核酸
プローブがプライマーとして使用されるであろう。

0052

当業者は本分野では既知のコンピューターアラインメントおよび配列分析(”
Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l”、第二版、Sambrook、Fritsch & Maniatis編、
Cold Spring Harbor Laboratory、1989参照
)の方法を用い、本明細書に開示されている配列に基づいてそのようなプローブ
を容易に設計することができる。本発明のハイブリダイゼーションプローブは放
性標識酵素標識蛍光標識ビオチンアビジン標識、化学発光などの標準
標識技術により標識できる。ハイブリダイゼーション後、プローブは既知の方法
を使用して可視化されるであろう。

0053

本発明の核酸プローブにはRNAならびにDNAプローブが含まれ、そのよう
なプローブは本分野では既知の方法を用いて発生される。核酸プローブは固形
持体上に固定されていてもよい。そのような固形支持体の例としては、ポリカー
ボネートのようなプラスチックアガロースおよびセファロースのような複合炭
化物およびポリアクリルアミドおよびラテックスビーズのようなアクリル性樹
脂が挙げられる。そのような固形支持体へ核酸プローブを結合させる技術は本分
野ではよく知られている。

0054

本発明の核酸探査法に適した試験試料には、例えば、細胞または細胞の核酸抽
出物、または生物体液が含まれる。上記の方法に使用される試料はアッセイ形式
検出法およびアッセイされる組織、細胞または抽出物の性質に基づいて変化す
るであろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は本分野ではよく知られており、
利用される方法に合致した試料を得るために容易に適応させることができる。
III.AUR−1および/またはAUR−2を検出するためのプローブに基づい
た方法およびキット

0055

試料中のAUR−1および/またはAUR−2の存在を検出する一つの方法は
(a)ハイブリダイゼーションが起こる条件下、該試料と上記の核酸プローブを
接触させ、および(b)該核酸分子へ結合した該ブローブの存在を検出すること
を含む。当業者は上記のような本分野では既知の技術に従って核酸プローブを選
択するであろう。試験される試料としてヒト組織のRNA試料が挙げられるが、
それに制限されるべきではない。

0056

試料中のAUR−1および/またはAUR−2の存在を検出するためのキット
は、上記の核酸プローブが配備された少なくとも一つの容器を含む。キットはさ
らに一つまたはそれ以上の下記のものを含む他の容器を含んでいてもよい:洗浄
試薬および結合核酸プローブの存在を検出できる試薬。検出試薬の例として、放
射性標識プローブ、酵素標識プローブ(西ワサビペルオキシダーゼアルカリ
ホスファターゼ)およびアフィニティー標識プローブ(ピオチン、アビジンま
たはステプタジン)が挙げられるが、それらに制限されるわけではない。

0057

詳しく説明すると、区分化されたキットとしては試薬が別々の容器に含まれて
いる任意のキットが挙げられる。そのような容器としては小さなガラス容器、プ
ラスチック容器またはプラスチックまたは紙の細長小片が挙げられる。そのよ
うな容器は、試料および試薬が交差混入しないように、および各々の容器の試薬
または溶液が一つの区画から他の区画へ定量的様式で加えられるように、一つの
区画から他の区画への試薬の効率的な移動を可能にしている。そのような容器に
は、試験試料を受け入れるであろう容器、アッセイで使用されるプローブまたは
プライマーを含む容器、洗浄試薬リン酸緩衝液トリス緩衝液などのような)
を含む容器、およびハイブリダイズしたプローブ、結合された抗体、増幅された
生成物などを検出するのに使用される試薬を含む容器が含まれるであろう。当業
者は、本発明に記載されている核酸プローブは本分野でよく知られている確立
れたキット様式の一つに容易に取り込ませることができることを容易に認識する
であろう。
IV.AUR−1および/またはAUR−2核酸分子から成るDNA構築物および
これらの構築物を含んでいる細胞。

0058

本発明はまた、5’から3’へ、宿主細胞中で転写を開始させるのに有効なプ
モーターおよび上記の核酸分子から成る組換え体DNA分子にも関している。
加えて、本発明はベクターおよび上記の核酸分子からなる組換えDNA分子にも
関している。本発明はまた細胞中で機能的な転写領域、上記のポリペプチドに対
応するアミノ酸配列をコードしているRNA配列に相補的な配列、および該細胞
中で機能的な転写終止領域から成る核酸分子にも関している。上記の分子とは単
離されたおよび/または精製されたDNA分子であろう。

0059

本発明はまた上記の核酸分子を含んでおり、それによりペプチドを発現するこ
とができる細胞または組織にも関している。通常は産生されないまたは通常は低
レベルでしか産生されないタンパク質を遺伝子操作により細胞が産生するように
された場合、細胞は”所望のポリペプチドを発現するように改変された”と称さ
れる。当業者は真核生物かまたは原核生物細胞内へゲノム、cDNAまたは合成
配列を導入および発現するための方法を容易に適応させることができる。

0060

もしもDNAのような核酸分子が転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド
配列を含んでおり、およびそのような配列がポリペプチドをコードしているヌク
レオチド配列に”作動可能なように結合されて”いるならば、ポリペプチドを”
発現可能”であると称される。作動可能な結合とは、制御DNA配列および発現
されると考えられるDNA配列が遺伝子配列発現を可能にする様式で連結されて
いる結合である。遺伝子配列発現に必要とされる制御領域の厳密な性質は生物体
間で異なるであろうが、原核生物においては、プロモーター(RNA転写の開始
に関する)並びにDNA配列(RNAに転写された時、合成開始の信号を発する
であろう)の両方を含むプロモーター領域を一般的に包含しているであろう。そ
のような領域は通常、TATAボックスキャッピング配列、CAAT配列など
のような転写および翻訳の開始に関係している5’−非コード配列を含んでいる
であろう。

0061

必要なら、AUR−1および/またはAUR−2遺伝子をコードしている配列
の3’側の非コード領域が上記の方法により得られる。この領域は終止およびポ
リアデニル化のようなその転写終止制御配列を保持しているであろう。従って、
AUR−1および/またはAUR−2遺伝子をコードしているDNA配列に天然
で連続している3’−領域を保持することにより、転写終止信号が提供されるで
あろう。転写終止信号が発現宿主細胞中で満足できるほど機能しない場合は、宿
主細胞中で機能的な3’領域に置換されるであろう。

0062

二つのDNA配列(プロモーター領域配列およびAUR−1および/またはA
UR−2配列)は、もし二つのDNA配列間の結合の性質が(1)フレームシフ
突然変異の導入を生ぜず、(2)AUR−1および/またはAUR−2遺伝子
配列の転写に関するプロモーター領域配列の能力を妨害せず、または(3)プロ
モーター領域配列により転写されるべきAUR−1および/またはAUR−2遺
伝子配列の能力を妨害しないならば、作動可能なように結合されていると称され
る。従って、もしプロモーターがDNA配列の転写を達成できたのであれば、プ
ロモーター領域はそのDNA配列に作動可能なように結合されているであろう。
従って、AUR−1および/またはAUR−2遺伝子を発現するには、適した宿
主に認識される転写および翻訳信号が必要とされる。

0063

本発明は原核生物または真核生物細胞両方におけるAUR−1および/または
AUR−2遺伝子(またはそれらの機能性誘導体)の発現を包含している。原核
生物宿主は一般的に組換えタンパク質生産が非常に効率的で都合がよく、それ
故、AUR−1および/またはAUR−2遺伝子のための好適な発現系の一つの
型である。最もしばしば原核生物は大腸菌の種々の株で代表される。しかしなが
ら、他の細菌株を含む他の微生物株もまた使用できる。

0064

原核生物系においては、宿主と一致する種から誘導された複製部位および調節
配列を含むプラスミドベクターが使用されるであろう。適したプラスミドベクタ
ーの例としてはpBR322およびpUC118などが含まれ;適したファージ
またはバクテリオファージの例にはγgt10およびγgt11などが含まれ;
適したウイルスベクターの例にはpMAM−neoおよびpKRCなどが含まれ
るであろう。好適には、本発明で選択されたベクターは選択された宿主細胞中で
複製する能力を持っている。

0065

認められている原核生物宿主には、大腸菌、バシラスストレプトミセス、シ
ュードモナスサルモネラセラチアなどのような細菌が含まれている。しかし
ながら、そのような条件下ではペプチドはグリコシル化されていないであろう。
原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび調節配列と一致していなけ
ればならない。

0066

原核生物細胞中でAUR−1および/またはAUR−2(またはそれらの機能
性誘導体)を発現するには、AUR−1および/またはAUR−2配列を機能性
原核生物プロモーターに作動可能なように連結する必要がある。そのようなプロ
モーターは構成的またはより好適には制御可能(即ち、誘導可能または脱抑制
能)であろう。構成的プロモーターの例にはバクテリオファージλのintプロ
モーター、pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のblaプロモーター、
およびpPR325のクロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
配列のCATプロモーターなどが含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの
例にはバクテリオファージλの主要右および左プロモーター(PLおよびPR)、
大腸菌のtrp、recA、λacZ、λacIおよびgalプロモーター、枯
草菌のα−アミラーゼ(Ulmanen et al.,J.Bacterio
l.162:176−182(1985))およびζ−28特異的プロモーター
(Gilman et al.,Gene sequence 32:11−2
0(1989))、バシラスのバクテリオファージのプロモーター(Grycz
an,The Molecular Biology of the Baci
lli,Academic Press,Inc.,NY(1982))、およ
びストレプトミセスプロモーター(Ward et al.,Mol.Gen.
Genet.203:468−478(1986)が含まれる。原核生物プロモ
ーターはGlick(J.Ind.Microbiol.1:277−282(
1987));Cenatiempo(Biochimie 68:505−5
16(1986));およびGottesman(Ann.Rev.Genet
.18:415−442(1984))による総説がある。

0067

原核生物細胞における適切な発現にはまた、遺伝子配列コード配列の上流のリ
ボソーム結合部位の存在を必要とする。そのようなリボソーム結合部位は例えば
、Goldらにより(Ann.Rev.Microbiol.35:365−4
04(1981))記載されている。調節配列、発現ベクターおよび形質転換法
などの選択は、遺伝子を発現するために使用された宿主細胞の型に依存している
。本明細書において使用される場合、”細胞”、”細胞株”および”細胞培養
互換性を持って使用され、すべてのそのような呼称子孫を含んでいる。従っ
て、用語”形質転換体”または”形質転換された細胞”には一次対照細胞、およ
継代の数にかかわらずそれらから誘導された培養物が含まれる。故意のまたは
偶然の突然変異のためDNA含有物において全ての子孫は正確に同一ではないで
あろうことが理解される。しかしながら、定義したように、突然変異体の子孫は
もともと形質転換された細胞の機能性と同じ機能性を持っている。

0068

本発明の発現系で使用されるであろう宿主細胞は、もしそれらが問題とするA
UR−1および/またはAUR−2ペプチド発現での使用に適していれば厳密に
は制限されない。適した宿主としてしばしば真核生物細胞が挙げられる。好適な
真核生物宿主には、例えば、酵母、真菌、昆虫細胞、インビボまたは組織培養
れた哺乳類細胞が挙げられる。宿主として有用であろう哺乳類細胞には、ヒーラ
ー細胞、VEROまたはCHO−K1のような線維芽細胞起源の細胞、またはリ
ンパ起源の細胞またはそれらの誘導体が挙げられる。好適な哺乳類宿主細胞には
SP/2およびJ558L、ならびに正しい翻訳後プロセッシングのより優れた
能力を提供するIMR332のような神経芽細胞腫細胞株が含まれる。

0069

加えて、植物細胞もまた宿主として利用可能であり、カリフラワーモザイク
イルス35Sおよび19S、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニ
ル化信号配列のような植物細胞に合致する調節配列も利用可能である。別の好適
な宿主は昆虫細胞である、例えば、ショウジョウバエ幼虫。宿主として昆虫細胞
を使用すると、ショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが使
用できる。Rubin,Science 240:1453−1459(198
8)。もしくは、昆虫細胞中で大量のAUR−1および/またはAUR−2を発
現させるためにバキュロウイルスベクターが遺伝子操作できる(Jasny,S
cience 238:1653(1987);Miller et al.,
Genetic Engineering(1986),Setlow,J.K
.,ら編,Plenum,第8章,pp.277−297)。

0070

酵母をグルコース豊富培地で増殖させた場合に多量に産生され、解糖系
素をコードしている活性に発現された遺伝子配列からのプロモーターおよび終止
要素を取り込んだ一連酵母遺伝子配列発現系が利用できる。既知の解糖系遺伝
子配列もまた非常に能率的な転写調節信号を提供できる。酵母は翻訳後ペプチド
修飾も実施できるという本質的な利点を提供する。酵母において所望のタンパク
質の産生に利用できる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを
利用する多数の組換えDNA戦略が存在する。酵母はクローン化哺乳類遺伝子配
列生成物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を運ぶペプチド(すなわち、
プレペプチド)を分泌する。哺乳類宿主に対し、AUR−1および/またはAU
R−2発現のためにいくつかの可能なベクター系が利用可能である。

0071

宿主の性質に依存して、広範囲の転写および翻訳制御配列が用いられるであろ
う。転写および翻訳制御信号は、制御信号高レベルの発現を持つ特定の遺伝子
配列に付随しているアデノウイルスウシパピローマウイルス、サイトメガロウ
イルス、シミアンウイルスなどのようなウイルス源から誘導されるであろう。も
しくは、アクチンコラーゲンミオシンなどのような哺乳類発現生成物からの
プロモーターが使用されるであろう。遺伝子配列の発現を変えることができるよ
うに、抑制または活性化が可能な転写開始制御信号が選択されるであろう。温度
を変化させることにより発現が抑制または開始できるように温度感受性であるか
、または化学物質代謝物のような)制御を受ける制御信号が興味を引かれる。

0072

真核生物宿主におけるAUR−1および/またはAUR−2の発現は真核生物
制御領域の使用を必要とする。そのような領域は一般的に、RNA合成の開始を
指示するのに十分なプロモーター領域を含んでいるであろう。好適な真核生物プ
ロモーターには例えば、マウスメタロチオネインI遺伝子配列のプロモーター(
Hamer et al.,J.Mol.Appl.Gen.1:273ー28
8(1982));ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight,
Cell 31:355−365(1982));SV40初期プロモーター(
Benoist et al.,Nature(London)290:304
−310(1981));酵母gal4遺伝子配列プロモーター(Johnst
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79
:6971−6975(1982);Silver et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.(USA) 81:5951−5955(198
4)が含まれる。

0073

真核生物mRNAの翻訳は第一のメチオニンをコードしているコドンで開始さ
れる。このため、真核生物プロモーターとAUR−1および/またはAUR−2
(またはそれらの機能性誘導体)をコードしているDNA配列間の結合がメチオ
ニンをコードできる妨害コドン(すなわち、AUG)を含まないことを確実にす
ることが好適である。そのようなコドンの存在は融合タンパク質の形成(もし、
AUGコドンがAUR−1および/またはAUR−2コード配列と同じ読み枠
に存在すれば)またはフレームシフト突然変異(もし、AUGコドンがAUR−
1および/またはAUR−2コード配列と同じ読み枠内に存在しなければ)を生
じる。

0074

AUR−1および/またはAUR−2核酸分子および作動可能に連結されたプ
ロモーターは受容体原核または真核細胞内へ非複製DNA(またはRNA)とし
て導入され、それは線状分子であってもよいが、より好適には閉じた共有結合
よる環状分子であろう。そのような分子は自律性複製ができないので、遺伝子の
発現は導入された配列の過渡的発現を通して起こるであろう。もしくは、宿主染
体内へ、導入されたDNA配列を組み込むことにより永続的発現が起こるであ
ろう。

0075

所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体内へ組む込むことができるベクターを用い
てもよい。導入されたDNAが染色体内へ安定に組み込まれた細胞は、発現ベク
ターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つまたはそれ以上のマーカーも導入す
ることにより選択できる。マーカーは自己栄養性宿主へ原栄養性、生命破壊剤
性(例えば、抗生物質)または銅のような重金属などを提供する。選択可能マー
カー遺伝子配列は発現されるべきDNA遺伝子配列へ直接結合することもできる
し、共トランスフェクションにより同一細胞内へ導入することもできる。一本鎖
結合タンパク質mRNAの最適の合成には追加の要素も必要とされる。これらの
要素にはスプライス信号、ならびに転写プロモーターエンハンサーおよび終止
信号が含まれる。そのような要素を取り込んでいるcDNA発現ベクターにはO
kayama,Molec.Cell.Biol.3:280(1983)によ
り記載されているようなベクターが挙げられる。

0076

導入された核酸分子は、受容体宿主中で自律性複製ができるプラスミドまたは
ウイルスベクター内へ取り込ませることができる。この目的には広範囲のベクタ
ーが用いられるであろう。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する
際の重要な因子として:ベクターを含んでいる受容体細胞が認識されるおよびベ
クターを含んでいない受容体細胞からそれらが選択される容易さ;特定の宿主中
に望まれるベクターのコピーの数;および異なった種の宿主間でベクターを”往
復する”ことが可能であることが望まれているかどうかが挙げられる。

0077

好適な原核生物ベクターには大腸菌中で複製できるようなプラスミドが含まれ
る(例えば、pBR322、ColE1、pSC101、pACYC184、Π
VXのような)。そのようなプラスミドは例えば、Sambrookにより記載
されている(”Molecular Cloning:A Laborator
y Manual”,第2版,Sambrook,Fritsch,& Man
iatis編,Cold Spring Harbor Laboratory
(1989)参照)。バシラスプラスミドとしてはpC194、pC222、p
T127などが含まれる。そのようなプラスミドはGryczanにより記載さ
れている(The Molecular Biology of the Ba
cilli,Academic Press,NY(1982),pp.307
−329)。適したストレプトミセスプラスミドにはp1J101(Kenda
ll et al.,J.Bacteriol.169:4177−4183
(1987)およびφC31のようなストレプトミセスバクテリオファージ(C
hater et al.,:Sixth International Sy
mposium on Actinomycetales Biology,A
kademiai Kaido,Budapest,Hungary(1986
),pp.45−54)が含まれる。シュードモナスプラスミドはJohnら(
Rev.Infect.Dis.8:693−704(1986))およびIz
aki(Jpn.J.Bacteriol.33:729−742(1987)
)により概説されている。

0078

好適な真核生物プラスミドには、例えば、BPV、ワクシニア、SV40、2
ミクロンサークルなどまたはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラス
ドは本分野ではよく知られている(Botstein et al.,Miam
i Wntr.Symp.19:265−274(1982);Broach,
”The Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces:Life Cycle and Inherit
ance”,Cold Spring Harbor Laboratory,
Col Spring Harbor,NY,p.445−470(1981)
;Broach,Cell 28:203−204(1982);Bollon

0079

et al.,J.Ctin.Hematol.Oncol.10:39−4
8(1980);Maniatis,”Cell Biology:A Com
prehensive Treatise,Vol.3,Gene Seque
nce Expression,Academic Press,NY,pp.
563−608(1980))。

0080

構築物を含んでいるベクターまたは核酸分子が調製されたら、DNA構築物は
種々の適した手段の一つにより適当な宿主細胞内へ導入される、すなわち、形質
転換、トランスフェクション、コンジュゲーション原形質体融合エレクトロ
プレーション、粒子技術、リン酸カルシウム沈澱、直接的マイクロインジェク
ションなど。ベクター導入後、受容体細胞をベクター含有細胞の増殖で選択する
選択培地中で増殖させる。クローン化遺伝子分子の発現はAUR−1および/ま
たはAUR−2またはそれらの断片の生成を生じる。これは形質転換された細胞
それ自体で、または分化するようにこれらの細胞を誘導した後に起こる(例えば
神経芽細胞腫ブロモデオキシウラシル投与することにより)。本発明のペ
プチドを形成させるために種々のインキュベーション条件が使用できる。最も好
適な条件は生理的条件模倣した条件である。
V.精製されたAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチド

0081

本分野では既知の種々の方法論が本発明のペプチドを得るために利用できる。
ペプチドは天然にこのペプチドを産生する組織または細胞から精製されるであろ
う。もしくは、上記のように単離された核酸断片が生物体でのAUR−1および
/またはAUR−2タンパク質の発現に使用できた。本発明の試料には、細胞、
細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物、または生物体液が含まれる。試料はア
ッセイ形式、検出方法および試料として使用された細胞または抽出物に基づいて
変化するであろう。

0082

供給源生物体が本発明のペプチドを天然に含んでいる限り、任意の真核生物体
が本発明のペプチドのための供給源として使用できる。本明細書で使用される場
合、”供給源生物体”とは、生物体が本サブユニットを最終的に単離された形で
発現するかどうかにかかわらず、本サブユニットのアミノ酸配列が誘導される原
生物体を意味している。

0083

当業者は、天然の夾雑物を含まないペプチドを得るためにタンパク質を単離す
る既知の方法を容易に追従できる。これらには、サイズ排除クロマトグラフィー
HPLCイオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマト
グラフィーが含まれるが、これらのみに制限されるわけではない。
VI.AUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドに結合親和性を持ってい
る抗体およびその抗体を含んでいるハイブリドーマ。

0084

本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドに結合親和性を持
っている抗体に関している。該ポリペプチドは配列ID番号:3または配列ID
番号:4に示したまたはそれらの機能性誘導体のアミノ酸配列、またはそれらの
アミノ酸の少なくとも9つの連続したアミノ酸(好適には、少なくとも20、3
0、35または40のそれらの連続したアミノ酸)を持っているであろう。

0085

本発明はまたAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドに特異的結合
親和性を持っている抗体にも関している。そのような抗体はAUR−1および/
またはAUR−2ポリペプチドに対するその結合親和性と別のペプチドに対する
その結合親和性を比較することにより単離されるであろう。AUR−1およびA
UR−2へ選択的に結合する抗体がAUR−1および/またはAUR−2および
他のポリペプチド間の区別が必要とされる方法で使用するために選択されるであ
ろう。そのような方法には、他のポリペプチドを含んでいる組織においての改変
AUR−1および/またはAUR−2発現の分析が含まれるが、それに制限され
るわけではない。

0086

本発明のAUR−1および/またはAUR−2タンパク質は、抗体の発生、医
薬組成物同定での使用およびDNA/タンパク質相互作用の研究のような種々の
操作および方法で使用できる。

0087

本発明のAUR−1および/またはAUR−2ペプチドは抗体またはハイブリ
ドーマの生成に使用できる。抗体が所望される場合、そのようなペプチドは本明
細書に記載したように発生され、免疫原として使用されることを当業者は認識す
るであろう。本発明の抗体はモノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならび
にこれらの抗体の断片、およびヒト化した形を含んでいる。本発明の抗体のヒト
化した形はキメラ化またはCDR移植のような本分野では既知の方法の一つを用
いて発生されるであろう。本発明はまた上記のモノクローナル抗体またはその結
合断片を産生するハイブリドーマにも関している。ハイブリドーマは特異的モノ
クローナル抗体を分泌できる不死化細胞株である。

0088

一般に、モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する技術は本分野で
よく知られている(Campbell,”Monoclonal Antibo
dy Technology:Laboratory Techniquesi
n Biochemistry and Molecular Biology
”,Elsevier Science Publishers,Amstrd
am,The Netherlands(1984);St.Grothet
al.,J.Immunol.Methods 35:1−21(1980))
。抗体を産生することが知られている任意の動物(マウス、ウサギなど)が選択
されたポリペプチドで免疫できる。免疫化の方法は本分野ではよく知られ
ている。そのような方法にはポリペプチドの皮下または腹腔内注射が含まれてい
る。当業者は免疫化に使用されるポリペプチドの量が免疫される動物、ポリペプ
チドの免疫原性および注射部位に基づいて変化するであろうことを認識するであ
ろう。

0089

ポリペプチドはペプチド免疫原性を増加させるために修飾されるかまたはアジ
バントを加えて投与される。ポリペプチドの免疫原性を増加させる方法は本分
野ではよく知られている。そのような方法には、抗原非相同タンパク質(グロ
ブリンまたはβ−ガラクトシダーゼのような)との結合または免疫化の間のアジ
ュバントの封入などが含まれる。

0090

モノクローナル抗体については、免疫化動物の牌臓細胞が取り出され、SP2
/0−Ag14骨髄腫細胞のような骨髄腫細胞と融合され、モノクローナル抗体
産生細胞になるようにされる。本分野ではよく知られた多くの方法の一つが、所
望の特性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定に使用できる。これら
の方法には、ELISAアッセイ、ウェスタンブロット分析またはラジオイムノ
アッセイ(Lutz et.al.,Exp.Cell Res.175:10
9−124(1988))が含まれる。所望の抗体を分泌しているハイブリド
マはクローン化され、本分野では既知の方法(Campbell,”Monoc
lonal Antibody Technology:Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molec
ular Biology”、上記文献、(1984))を使用しておよび亜
綱が決定される。

0091

ポリクローナル抗体については、免疫化動物から抗血清を含んでいる抗体が単
離され、上記の方法の一つを用いて所望の特異性を持つ抗体の存在がスクリーニ
ングされる。上記の抗体は検出可能なように標識されるであろう。抗体は放射性
同位元素、アフィニティー標識(ビオチン、アビジンなどのような)、酵素標識
(西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどのような)およ
び蛍光標識(FITCまたはローダミンのような)、常磁性原子などを使用して
検出可能なように標識できる。そのような標識を達成するための方法は本分野で
はよく知られており、例えば、Stemberger et al.,J.Hi
stochem.Cytochem.18:315(1970);Engval
et al.,Immunot.109:129(1972);Goding
,J.Immunol.Meth.13:215(1976)を参照されたい。
本発明の標識抗体は特定のペプチドを発現している細胞または組織を同定するイ
ビトロ、インビボおよびインシチュアッセイで使用できる。

0092

上記の抗体はまた固形支持体上に固定化してもよい。そのような固形支持体の
例には、ポリカーボネートのようなプラスチック、アガロースおよびセファロー
スのような複合炭化水素、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズのような
アクリル性樹脂が含まれる。そのような固形支持体へ抗体を結合させる技術は本
分野ではよく知られている(Weir et al.,”Handbook o
f Experimental Immunology”,第4版,Black
well Scientific Publications,Oxford,
England,第10章(1986);Jacoby et al.,Met
h.Enzym.34,Academic Press,N.Y.(1974)
)。本発明の固定化抗体免疫クロマトグラフィー同様にインビトロ、インビボ
およびインシチュアッセイで使用できる。

0093

さらに、当業者は推論により設計された抗ペプチドペプチドを発生させるため
特異的ペプチド配列へ結合できるペプチドを発生させるための現在利用可能な
方法、並びに、抗体に関して前に開示した技術、方法およびキットを容易に適用
できる、例えば、Hurby et al.,”Application of

0094

Synthetic Peptides:Antisense Peptid
es”,Synthetic Peptides,A User’s Guid
e,W.H.Freeman,NY,pp.287−307(1992)および
Kaspczak et al.,Biochemistry 28:9239
−8(1989)を参照されたい。

0095

抗ペプチドペプチドはAUR−1および/またはAUR−2ペプチド配列に観
察される塩基性アミノ酸残基を、疎水性および非荷電極性基を保ったまま酸性基
で置換することにより発生できる。例えば、リジンアルギニンおよび/または
ヒスチジン残基アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され、およびグルタ
ミン酸残基はリジン、アルギニンまたはヒスチジンで置換される。
VII.AUR−1および/またはAUR−2を検出するための抗体に基づいた方
法およびキット

0096

本発明は、(a)免疫複合体が形成する条件下、試料と上記抗体を接触させ、
および(b)ポリペプチドへ結合した該抗体の存在を検出することから成る試料
中のAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドを検出する方法を含んで
いる。詳しく説明すると、本方法は試験試料と一つまたはそれ以上の本発明の抗
体をインキュベートし、抗体が試験試料に結合したかどうかをアッセイする。正
常レベルと比較して試料中のAUR−1および/またはAUR−2レベルが変化
していると疾患が示唆されるであろう。

0097

抗体と試験試料をインキュベートする条件は色々である。インキュベーション
条件はアッセイで用いられる様式、用いられる検出法およびアッセイで使用され
る抗体の型および性質に依存している。当業者は通常利用可能な免疫学的アッセ
イ様式の一つ(ラジオイムノアッセイ酵素結合免疫吸着アッセイ、拡散に基づ
オークターロニーまたはロケット免疫蛍光アッセイのような)が本発明の抗体
の使用に容易に適用できることを認識するであろう。そのようなアッセイの例は
Chard,”An Introduction to Radioimmun
oassay and Related Techniques”Elsevi
er Science Publishers,Amsterdam,The
Netherlands(1986);Bullock et al.,”Te
chniques in Immunocytochemistry”Acad
enic Press,Orlando,FL第1巻(1982),第2巻(1
983),第3巻(1985);Tijssen,”Practice and

0098

Theory of Enzyme Immunoassays:Labor
atory Techniques in Biochemistry and

0099

Molecular Biology”Elsevier Science
Publishers,Amsterdam,The Netherlands
(1985)にみることができる。

0100

本発明の免疫学的アッセイ試験試料には、細胞、細胞のタンパク質膜抽出液
血液、血清血漿または尿のような体液が含まれる。上記の方法で使用される試
験試料はアッセイ様式、検出方法の性質およびアッセイされるべき試料として使
用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化するであろう。タンパク質抽出
物または膜抽出物を調製する方法は本分野ではよく知られており、利用されるシ
ステムに使用できる試料を得るために容易に適用できる。

0101

キットは前に説明した検出法を実施するのにすべての必要な試薬を含んでいる
。キットは(i)上記の抗体を含んでいる第一の容器、および(ii)抗体の結
合相手および標識から成る複合体を含んでいる第二の容器から成っているであろ
う。別の好適な態様において、キットはさらに一つまたはそれ以上の以下のもの
から成る一つまたはそれ以上の容器を含んでいる:洗浄試薬および結合された抗
体を検出できる試薬。

0102

検出試薬の例としては標識された第二抗体、または代わるものとして、もし第
一抗体が標識されているならば、標識抗体と反応できる発色的、酵素的または抗
結合試薬が挙げられるが、それらに制限されるわけではない。区画化されたキ
ットは核酸プローブキットのために前に説明したようなものでもよい。当業者は
本発明で説明された抗体が本分野ではよく知られている確立されたキット様式の
一つと容易に組み合わせることができることを容易に認識するであろう。
VIII.AUR−1および/またはAUR−2と相互作用する化合物の単離。

0103

本発明はまた、化合物をAUR−1および/またはAUR−2とインキュベー
トし、AUR−1および/またはAUR−2へ結合した化合物の存在を検出する
ことから成るAUR−1および/またはAUR−2へ結合できる化合物を検出す
る方法にも関している。化合物は例えば、血清、体液または細胞抽出物のような
複雑な混合物内に存在しているであろう。

0104

本発明はまた、化合物存在下にAUR−1および/またはAUR−2を産生す
る細胞をインキュベートし、AUR−1および/またはAUR−2活性またはA
UR−1および/またはAUR−2結合パートナー活性のレベルの変化を検出す
ることから成るAUR−1および/またはAUR−2活性またはAUR−1およ
び/またはAUR−2結合パートナー活性の作動薬または拮抗薬を検出する方法
にも関している。そのようにして同定された化合物は化合物の存在の指標である
活性の変化を起こすであろう。化合物は例えば、血清、体液または細胞抽出物の
ような複雑な混合物内に存在しているであろう。化合物が一度同定されたら、そ
れは本分野でよく知られた技術を用いて単離できる。

0105

本発明はまた、哺乳類にAUR−1および/またはAUR−2に対する作動薬
または拮抗薬を作動作用または拮抗作用を達成するのに十分な量で投与すること
から成る、哺乳類におけるAUR−1および/またはAUR−2関連活性を作動
させる(刺激する)または拮抗させる方法も包含している。AUR−1および/
またはAUR−2関連機能を作動させるまたは拮抗するのに十分な量を哺乳類に
作動薬または拮抗薬を投与することから成る、AUR−1および/またはAUR
−2関連活性の作動薬または拮抗薬で哺乳類における疾患を処置する方法もまた
本出願に包含されている。
IX.トランスジェニック動物

0106

本発明と関係があるトランスジェニック動物を産生するために種々の方法が利
用可能である。オスおよびメス前核の融合前に授精の前核内へDNAが注入
き、または胚細胞の核内へ注入され(例えば、二細胞の核)、続いて細胞分割
が開始される(Brinster et.al.,Proc.Nat.Acad
.Sci.USA 82:4438−4442(1985))。胚はウイルス(
特にレトロウイルス)で感染でき、本発明の無機イオン受容体ヌクレオチド配列
を運ぶように改変される。

0107

胚の内部細胞塊から誘導され、培養で安定化された多能性幹細胞は本発明のヌ
クレオチド配列を取り込むように培養中に操作できる。そだての母親内へ移植さ
れている胚盤胞内へ移植し、妊娠期間終結させることにより、そのような細胞
からトランスジェニック動物が産生できる。トランスジェニック実験に適した動
物はCharles River(Wilmington,MA)、Tacon
ic(Germantown,NY)、Harlan Sprague Daw
ley(Indianapolis,IN)などのような普通の商業的供給元
ら得ることができる。

0108

齧歯類胚の操作法および接合体の前核内へのDNAのマイクロインジェクシ
ン法は当業者にはよく知られている(Hoganら、上記文献)。サカナ、両生
類卵およびトリのためのマイクロインジェクション法はHoudebine a
nd Chourrout,Experientia 47:897−905(
1991)に詳述されている。動物の組織内へDNAを導入するための他の方法
は米国特許第4,945,050号(Sandfordら、1990年7月30
日)に記載されている。

0109

例示のために説明すると、トランスジェニックマウスを作るためメスマウスに
過排卵を誘導する。メスをオスと一緒にし、つがいをつくったメスをCO2窒息
または断頭により殺し、胚を切り出した卵管から回収する。取り巻いている卵丘
細胞を除去する。前核胚を洗浄し、注入時まで保存する。ランダム周期を持つ
成体メスマウスを精管切除したオスと対にする。受容体メスはドナーメスとして
同時につがわせる。次に胚が手術により移される。トランスジェニックラット
発生させる方法はマウスと同様の方法である。Hammer et.al.,C
ell 63:1099−1112(1990)を参照されたい。

0110

胚幹ES)細胞の培養方法および続いてのエレクトロポレーションリン酸
カルシウム/DNA沈澱および直接注入のような方法を用いるES細胞内へのD
NAの導入によるトランスジェニック動物の製造もまた当業者にはよく知られて
いる。例えば、Teratocarcinomas and Embryoni
c Stem Cells,A Practical Approach,E.
J.Robertson,ed.,IRL Press(1987)を参照され
たい。

0111

無作為遺伝子組込みを含む場合、本発明の配列を含んでいるクローンは耐性
コードしている遺伝子と同時にトランスフェクトされる。もしくは、ネオマイ
ン耐性をコードしている遺伝子が本発明の配列に物理的に連結される。トランス
フェクションおよび所望のクローンの単離は当業者にはよく知られたいくつかの
方法の一つにより実施される(E.L.Robertson、上記文献)。

0112

ES細胞内へ導入されたDNA分子もまた相同的組換え法により染色体内へ組
み込むことができる。Capecchi,Science 244:1288−
1292(1989)。組み込みの陽性選択のための方法(すなわち、neo耐
性)および二重陽性−陰性選択(すなわち、neo耐性およびガンシクロビル
性)および続いてのPCRによる所望のクローンの同定はCapecchi(上
記文献)およびJoynerら(Nature 338:153−156(19
89))により記載されており、それらの教えは本明細書において援用される。
方法の最後の段階は胚盤胞内への標的化ES細胞の注入および胚盤胞の偽妊娠
ス内への移植である。得られたキメラ動物繁殖させ、トランスジーンを運ぶ個
体を同定するためサザンブロッティングにより子孫を分析する。非齧歯類の哺乳
類および他の動物製造のための方法は他で議論されている。Houdebine
およびChourrout、上記文献;Pursel et.al.,Scie
nce 244:1281−1288(1989);およびSimms et.
al.,Bio/Technology 6:179−183(1988)を参
照されたい。

0113

従って、本発明はAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコード
しているトランスジーンまたはAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチ
ドの発現を達成する遺伝子を含んでいるトランスジェニック、非ヒト哺乳類を提
供する。そのようなトランスジェニック、非ヒト哺乳類はAUR−1および/ま
たはAUR−2ポリペプチドを導入した、AUR−1および/またはAUR−2
ポリペプチドの発現を制御した(すなわち、追加の遺伝子、アンチセンス核酸
たはリボザイムの導入により)効果を研究するインビボ試験系として特に有用で
ある。

0114

”トランスジェニック動物”とは、人工的に細胞内へ挿入されたDNAを含む
細胞を持つ動物であり、そのDNAはその細胞から発育した動物のゲノムの一部
となっている。好適なトランスジェニック動物は霊長類、マウス、ラット、ウシ
ブタウマヤギヒツジイヌおよびネコである。トランスジェニックDNA
はヒトAUR−1および/またはAUR−2ポリペプチドをコードしているであ
ろう。動物における天然の発現は、受容体の発現を減少させるのに有効な量のア
ンチセンスRNAまたはDNAを与えることにより減少しているであろう。
X.遺伝子治療

0115

AUR−1および/またはAUR−2またはその遺伝子配列はまた遺伝子療法
(Miller,Nature 357:455−460(1992)に概説さ
れている)に有用であろう。Millerは陽性の最初の結果を示したヒト遺伝
子治療への実際的な方法で進歩がもたらされたことを述べている。遺伝子治療
科学的基礎はMilligan,Science 260:926−931(1
993)に記載されている。

0116

一つの好適な態様において、AUR−1および/またはAUR−2コード配列
を含んでいる発現ベクターが細胞内に挿入され、細胞はインビトロで増殖され、
次に患者へ多量に注入される。別の好適な態様において、選択されたプロモータ
ー(例えば、強力なプロモーター)を含んでいるDNAセグメントが、プロモー
ターセグメント内因性AUR−1および/またはAUR−2遺伝子の発現を促
進するように内因性AUR−1および/またはAUR−2を含んでいる細胞内へ
導入される(例えば、プロモーターセグメントが内因性AUR−1および/また
はAUR−2遺伝子に直接結合されるようにプロモーターセグメントが細胞内へ
導入される)。

0117

遺伝子治療は腫瘍を標的としたAUR−1および/またはAUR−2cDNA
含有アデノウイルスの使用、遣伝子工学処理した細胞の移植による全身性AUR
−1および/またはAUR−2増加、AUR−1および/またはAUR−2ウイ
ルスの注入、または適当な組織へののAUR−1および/またはAUR−2の
注入を含んでいる。

0118

タンパク質複合体の活性を調節するため、そのような複合体の一つまたはそれ
以上の成分の改変形を導入することにより、標的細胞集団が修飾される。例えば
標的細胞内の複合体成分活性を減少または阻害することにより異常な信号伝達
が起こると、状態が悪化し、阻害されまたは転換される。タンパク質複合体の他
の成分と相互作用する能力を保持しているが信号伝達で機能できない一つの成分
の欠失またはミスセンス突然変異体が異常で有害な信号伝達を阻害するために使
用されるであろう。

0119

レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス
、ヘルペスウイルス、いくつかのRNAウイルスまたはウシパピローマウイルス
のようなウイルスから誘導される発現ベクターが、組換え体AUR−1および/
またはAUR−2タンパク質をコードしているヌクレオチド配列(例えば、cD

A)を標的細胞集団(例えば、腫瘍細胞)内へ送達するために使用されるであろ
う。コード配列含有組換え体ウイルスベクターの構築に、当業者にはよく知られ
ている方法が使用できる。例えば、Maniatis et al.,Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Co
ld Spring Harbor Laboratory,N.Y.(198
9)およびAusubel et al.,Current Protocol
s in Molecular Biology,Greene Publis
hing Associates and Willey Interscie
nce,N.Y.(1989)に記載されている技術を参照されたい。もしくは
タンパク質配列をコードしている組換え体核酸分子は標的細胞に送達するため
に裸のDNAまたは再構築系(例えば、リポソームまたは他の脂質系)で使用で
きる(例えば、Felgner et.al.,Nature 337:387
−8,1989を参照されたい)。ヒト遺伝子治療で使用するため、細胞内へプ
ラスミドDNAを直接導入するいくつかの他の方法が存在し、タンパク質へのプ
ラスミドの複合体形成による細胞上の受容体へのDNAの標的化が含まれる。M
iller、上記文献を参照されたい。

0120

その最も単純な様式において、遺伝子導入はマイクロインジェクション法によ
り細胞の核内へ微量のDNAを単純に注入することにより実施できる。Cape
cchiMR,Cell 22:479−88(1980)。一度組換え体遺
伝子が細胞内に導入されたら、それらは転写および翻訳のための細胞の普通の機
構により認識され、遺伝子産物が発現されるであろう。多数の細胞にDNAを導
入するための別の方法も試みられてきた。これらの方法には:DNAがCaPO
4で沈澱されピノサイトーシスにより細胞内へ取り込まれるトランスフェクショ
ン(Chen C.and Okayama H,Mol.Cell Biol
.7:2745−52(1987));膜に穴を誘導するために細胞を高電圧
ルスに暴露するエレクトロポレーション(Chu G.et al.,Nucl
eic AcidsRes.,15:1311−26(1987));DNA
脂溶性担体内に包まれ、それが標的細胞と融合するリポフェクションリポ
ーム融合(FelgnerPL.,et al.,Proc.Natl.Ac

d.Sci.USA.84:7413−7(1987));および小さな弾丸
結合されたDNAを用いる粒子衝撃法(Yang NS.et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.87:9568−72(1990)
)が含まれる。細胞内へDNAを導入するための別の方法は、DNAを化学的
修飾したタンパク質と結合させることである。

0121

アデノウイルスタンパク質エンドソーム不安定化でき、細胞内へのDNA
の取り込みを促進することが示されている。DNA複合体含有溶液へのアデノウ
イルスの混合、またはタンパク質架橋試薬を用いたアデノウイルスへ共有結合で
結合されているポリリジンへのDNAの結合は、組換え遺伝子の取り込みおよび
発現を本質的に改良する。Curiel DT et.al.,Am.J.Re
spir.Cell.Mol.Biol.,6:247−52(1992)。

0122

本明細書で使用される場合、”遺伝子導入”とは外来核酸分子を細胞内へ導入
する過程を意味している。遺伝子導入は遺伝子によりコードされている特定の産
物の発現を可能にするために普通行われる。産物にはタンパク質、ポリペプチド
アンチセンスDNAまたはRNA、または酵素的に活性なRNAが含まれる。
遺伝子導入は培養細胞でまたは動物への直接投与により実施できる。一般的に、
遺伝子導入には非特異的または受容体仲介相互作用により核酸が標的細胞と接触
する過程、膜を通してまたはエンドサイトーシスによる細胞内への核酸の取り込
み、および原形質膜またはエンドソームからの細胞質内への核酸の放出が含まれ
る。加えて、発現には細胞の核内への核酸の移動および転写のための適当な核因
子への結合が必要であろう。

0123

本明細書で使用される場合、”遺伝子治療”とは遺伝子導入の一つの形であり
、本明細書で使用される遺伝子導入の定義に含まれており、インビボまたはイン
ビトロで、特に細胞から治療用生成物を発現させるための遺伝子導入を意味して
いる。遺伝子導入は生体外で細胞に実施でき(それは次に患者に移植される)、
または患者に核酸または核酸−タンパク質複合体を直接投与しても実施できる。

0124

別の好適な態様において、AUR−1および/またはAUR−2をコードして
いる核酸配列を持つベクターが提供され、核酸配列は特定の組織で発現される。
組織特異的遺伝子発現の方法は1992年11月3日に出願され、1993年5
月13日に公開された国際特許出願第WO 93/09236号に示されている

0125

前に示したすべての前記ベクターにおいて、本発明のさらなる特色は、ベクタ
ーに含まれている核酸配列が、前に定義したように核酸の配列の多少またはすべ
てに付加、欠失または修飾を含んでいることである。

0126

別の好適な態様において、遺伝子置換の方法が示されている。本明細書で使用
される場合、”遺伝子置換”とは動物においてインビボで発現されることができ
る核酸配列を供給することを意味しており、それにより動物において失われたま
たは欠陥のある内因性遺伝子の機能を提供または増大させる。
実施例

0127

以下の実施例は本発明を制限するものではなく、単に本発明の種々の態様およ
び特色を表すものである。以下の実施例は新規タンパク質AUR−1およびAU
R−2の単離および特性付けを示している。

0128

プロテインキナーゼは数百の既知の構成酵素を持つ、真核生物タンパク質の最
も大きなファミリーの一つである。これらのタンパク質は、共通触媒コア構造
ら成る12の異なったサブドメインへ副分割できる250−300のアミノ酸ド
メイン共有している。これらの保存タンパク質モチーフはPCRに基づいたク
ローニング法を用いて利用され、既知のキナーゼの著しい拡大を導いた。プロテ
インキナーゼの触媒ドメインにおける配列の多アラインメントおよび続いての系
統的分析は系統樹へのそれらの分離を可能にした。このようにして、関連するキ
ナーゼはチロシンキナーゼサイクリック−ヌクレオチド依存性キナーゼ、カル
シウム/カルモデュリンキナーゼ、サイクリン−依存性キナーゼおよびMAP
キナーゼ、ならびにいくつかの他の定義があいまいなサブファミリーを含む異な
った枝またはサブファミリーにまとめられる。

0129

最初に、チロシンキナーゼの異なったファミリーを示す受容体であるCCK
の同族体の同定に着手した。多アラインメントはCCK4は受容体チロシンキナ
ーゼのROSおよびTRF−ファミリーに最も密接に関係していることを示した
。我々はこれらの受容体のキナーゼサブドメインIおよびIX内の保存配列に対す
る縮重したプライマーを設計した。サブドメインIはキナーゼドメインのN−末
端にあり、保存モチーフGXGXXGXVを含んでおり、それはすべての種類の

ナーゼの触媒ユニットATPつなぎ止めることに関係している。サブドメ
ンIXはほとんど不変のAspを含んでおり、それはサブドメインVIB中の残基へ
結合することにより触媒ループを安定化するために働いている。この不変Asp
および隣接するアミノ酸はセリン/スレオニンキナーゼ(DXWA/SXGI
V)からチロシンキナーゼ(DVWSY/FGI/V)を区別するものとしてP
CR−クローニング法でしばしば使用される。すべての既知のプロテインキナー
ゼの比較に基づいて、PCRでCCK4およびそのニワトリ同族体KLGのみを
拾い出すであろうサブドメインIおよびIXに対する縮重したオリゴヌクレオチド
プライマーを設計した。

0130

我々は、ポリマラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた新規キナーゼの同定に使用
するため、CCK4のキナーゼドメイン内の保存残基に基づいた縮重プライマー
AおよびDVWを設計した。鋳型としてHEPM細胞sscDNAに適用した場
合、CCK4の多コピーならびに他のキナーゼに相同性を持つ567bpの新規
DNA断片(43−43)が単離された。新規配列はショウジョウバエオーロラ
キナーゼ(GeneBank寄託番号#X83465)に最も類似しており、そ
のクローンはヒトオーロラ1と名付けられた。この断片をプローブとして用い、
多数の結腸癌細胞株からのRNAをスクリーニングしたところ、腫瘍細胞のオー
ロラ1発現における明かな選択性を示した。

0131

オーロラ1プローブはまた、オーロラ1の完全読み取り枠に拡がる重複クロー
ンを単離するため、ヒト膵臓癌細胞株mRNAから構築されたcDNAライブラ
リーをスクリーニングするためにも使用された。単離された複数のクローンの内
、7つがヒトオーロラ1に対応していた。このスクリーニングの間にさらに二つ
の微かにハイブリダイズするクローンも単離され、配列分析によりそれらは関連
する、しかし異なったキナーゼに対応していることが明らかにされ、ヒトオーロ
ラ2と名付けられた。

0132

OS細胞中で発現された組換え体オーロラ1およびオーロラ2は39,00
0および46,000の明らかなMrで移動し、それらの一次アミノ酸配列に基
づいて予期される39264および46700の分子量と一致した。この分析は
、組換えタンパク質が哺乳類細胞で安定に産生できることを確立した。この推定

ナーゼの標的特異性を決定するためのリン酸化アッセイは進行中である。

0133

細胞内の内因性および組換えオーロラの発現を局所に制限するためAUR1お
よびAUR2のN−末端ドメインからのペプチド配列に対する特異的免疫試薬
ウサギで発生された。さらに、これらの試薬はオーロラの正常な生物学的役割を
よりよく理解するため、オーロラの基質を同定する試みに使用できる。

0134

AUR1およびAUR2の優先陰性および構成的活性形は、これらの推定セリ
ン/スレオニンキナーゼのオブレーションまたは過剰発現の生物学的結果を詳細
叙述するために有用であろう。改変DNA構築物を用いた最初の研究は、AU
R1およびAUR2レトロウイルス保存物でNIH3T3またはBALB/3T
3細胞を感染させたちょうど2時間後に細胞が多核化していることを示している
。この表現型は持続し、感染2日後にはいくつかの細胞は20ほどの核を持って
いることが観察された。多核化細胞は典型的には増加した細胞質および広がった
細胞境界を持っていた。アクチンおよびDAPI両方での免疫染色により、これ
らの核はすべて一つの細胞内に含まれており、およびアクチン細胞骨格は明らか
に正常であることが確認された。進行中の実験で核内の染色体含量および無損傷
、中心体の数および位置、および微小管ネットワークの一般的構成について取り
かかっている。

0135

正常、構成的活性および優先陰性の長期のAUR1およびAUR2発現の結果
、および特にこれらが逆の細胞形質転換を誘導するかどうかの特性付けは検討中
である。これらの組換えタンパク質を発現する安定なクローンは単離されている
。これらは増殖速度、DNA合成、細胞接触阻害(細胞増殖形成)、固着−非
依存性増殖(軟寒天アッセイ)、およびヌードマウスにおける腫瘍形成性につい
て特性付けされるであろう。

0136

オーロラは哺乳類中心体複製および分離において如何なる役割を果たしている
のであろうか? そのような機能の破壊または下方制御は、酵母、ショウジョウ
バエおよび両生類において中心体誤分離、単極紡錘体および非対照核分裂を起こ
すことが知られている。ヒトオーロラおよび酵母IPL1およびショウジョウバ
エオーロラ間の相同性は印象的である。それ故、ヒトオーロラが酵母IPL1の
機能的均等物であるかどうかを評価することが望まれた。酵母IPL1遺伝子は
サッカロミセスセレビジエにおいて高い適合度染色体分離を要求し(Fra
ncisco,L.,et al.,Mol.Cell.Biol.14:47
31−4740,1994)、温度感受性突然変異体が単離されている。ヒトオ
ーロラの種々の完全長およびキメラ体が酵母においてこの温度感受性突然変異体
補足できるかどうかを決定することが計画された。IPL1のN−末端ドメイ
ンおよびヒトオーロラのキナーゼドメインを含むキメラ構築物は、あまりよくは
保存されていないN−末端ドメインにより仲介される潜在的制御または細胞内局
在化の役割を避けながら、本キナーゼが機能的均等物であるかどうかを決定する
ことを可能にするであろう。もしヒト遺伝子がIPL1機能の喪失補償するな
らば、そのような株をヒトオーロラキナーゼの小分子阻害剤のスクリーニングに
使用できる。
実施例1:分子クローニング

0137

正常ヒト前立腺十二指腸卵巣肝臓脳下垂体、脳、胸腺および唾液腺
ら、ヒトHEPM細胞(口蓋間葉)から、原発トウィルム腫瘍および卵巣癌
から、および結腸直腸HT29、SW480、SW1463、SW1417
SW837、SW948、SW620、SW403、SW1116、T84、H
TC15、LS123およびCaco−2)、腎臓(Caki−1、Caki−
2)、肝臓(SK−HEP−1)、膵臓(HS766T,ASPC,Capan
−1)、および乳房(MCF7)起源のヒト腫瘍細胞株からChomczyns
kiおよびSacchiのグアニジン塩フェノール抽出プロトコール(P.C
homczynski and N.Sacchi,Anal.Biochem
.162,156(1987))を用いて全RNAが単離された。

0138

これらのRNAはGibcoBRL(Life Techonologies
,U.S.A.;Gerard,GF et al.(1989),FOCUS
11,66)から購入されたFirst Strand Synthesisキ
ットのためのSuperscript Preamplification S
ystemを用い、使用説明書推奨されている条件下で一本鎖cDNAを発生
させるための鋳型として使用された。典型的な反応では、10μgの全RNAま
たは2μgのポリ(A)+RNAと1.5μgのオリゴ(dT)12-18が60μ
lの反応液容量で使用された。生成物はRNaseHで処理し、H2Oで100
μlに希釈された。続いてのPCR増幅のためには、これらのsscDNAの1
−4μlが各々の反応に使用された。

0139

オリゴヌクレオチドは確立されたホスホロアミダイト化学を用いてAppli
ed Biosystems 394DNA合成機で合成され、エタノール
よる沈澱後、精製しないで使用された。縮重オリゴヌクレオチドプライマーは:
A = 5’−GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC−3’(配列
ID番号:16)(センス)および
DVW = 5’−AGNACNCCRAANGCCCACACRTC−3’(
配列ID番号:17)(アンチセンス)である。

0140

これらのプライマーは各々ペプチド配列EFGEVFLA(配列ID番号:1
8)(キナーゼサブドメインIからのセンス鎖)およびDVW(A/S)FGV
L(キナーゼサブドメインIXからのアンチセンス鎖)から誘導された。縮重した
ヌクレオチド残基名称はN=A、C、GまたはT;R=AまたはG;およびY=
CまたはTである。鋳型としてCCK4を用い、これらのプライマーは567b
pの生成物を産生する。

0141

上に掲げた一本鎖に適用されたプライマ−AおよびDVWを用いて、PCR反
応が実施された。10mMトリス・HCl(pH8.3)、50mM KCl
1.5mM MgCl2、200μMの各々のデオキシヌクレオシド三リン酸
0.001%ゼラチン、および1.5U AmpliTaq DNAポリメラ
ゼ(Perkin−Elmer/Cetus)、および1−4μlcDNAを
含有する混合物に、各々5μMの最終濃度になるようにプライマーが加えられた
。3分の95℃での変性に続いて、循環条件は最初の3サイクルが94℃で30
秒、37℃で1分、72℃へ2分で上昇、72℃で1分であり、続いての35サ
イクルは94℃で30秒、50℃で1分、および72℃で1分45秒であった。
500−600bp間に移動したPCR断片をGeneClean(Bio10
1)を用いて2%アガロースゲルから単離し、使用説明書に従ってpCRIIベ
クター(Invitrogen Corp.U.S.A.)内へT−Aクローン
化した。

0142

Qiagenカラムを用いてミニプラスミドDNA調製試料のためにコロニー
を選択し、プラスミドDNAはAmpliTaqDNAポリメラーゼFS
ABI,FosterCity,CA)を含むサイクルシークエンシング色素
ターミネーターキットを用いて配列決定した。配列決定反応生成物はABIP
rism 377DNAシークエンサーにかけ、BLASTアラインメント互
除法(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.21
5:403−10)を用いて分析した。新規クローン(#43−43)は鋳型と
してヒト胚口蓋間葉(HEPMまたはCRL1486)からの一本鎖cDNAに
対するプライマ−AおよびDVWでのPCRにより単離された。このクローンは
その後ヒトオーロラ1の断片であることが示された。

0143

ラムダZapII(Stratagene Cloning Systems
,La Jolla,CA)cDNAライブラリーは第一鎖cDNA合成のため
の鋳型として膵臓癌腫細胞株のプールからのmRNAを用いて構築された。0.
1mg/mlの変性、断片化サケ精子DNAを加えた、6xSSC、1xデンハ
ルト試薬、0.1%SDSを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、ヒトオーロ
ラ1をコードしているp43−43からのランダムプライム32P−標識挿入物
2x106cpm/ml)でファージをニトロセルロースフィルター上でスクリ
ーニングした。65℃で一夜ハイブリダイゼーション後、フィルターを65℃に
て0.1xSSC、0.1%SDSで洗浄した。完全長cDNAクローンは両方
の鎖について、T7ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーでの手に
よる配列決定(Tabor and Richardson,1978,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:4767−71)を用い
て配列決定された。
実施例2:ノーザンブロット分析

0144

荷電修飾ナイロン膜上の、16の異なった成人ヒト組織(脾臓、胸腺、前立腺
睾丸、卵巣、小腸結腸粘膜心臓、脳、胎盤肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、
膵臓および末梢血白血球)、4つの異なったヒト胎児組織(脳、肺臓、肝臓およ
び腎臓)、および8つのヒト癌細胞株(HL60、ヒーラー、K−562、MO
LT−4、Raji、SW480およびG361)からのノーザンブロット(レ

ン当たり2μgのポリA+RNAを含んでいる)はClontech(Palo
Alto,CA)から入手した。追加のノーザンブロットはヒト腫瘍細胞株から
単離された10μgの全RNAを変性ホルムアルデヒド1.2%アガロースゲル
泳動し、ナイロン膜に移すことにより調製された。

0145

ヒトオーロラ1クローン43−43からの527bp挿入物かまたはpSG2
0からの1162bpEcoRI断片、およびヒトオーロラ2クローン11−1
Aの1kbEcoRI断片かまたはpS621からの1257bpBamHI−
NotI断片から合成された無作為開始[32P]dCTP標識プローブフィル
ターをハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは6xSSC、0.1%S
DS、1xデンハルト試薬、100mg/ml変性ニシン精子DNA中、1−2
x106cpm/mlの32P−標識DNAプローブを加え、60℃にて一夜実施
された。フィルターは65℃にて0.1xSSC/0.1%SDSで洗浄し、K
odak XAR−2フィルムに一夜暴露した。

0146

約1.4kbの単一のAUR1mRNA転写体が同定され、胸腺および小腸
に最も豊富にあり、睾丸、卵巣、結腸、胎盤および脾臓は弱い信号を与えること
が観察された。前立腺および末梢血白血球は陰性であった。ヒト胎児肝臓および
腎臓もまた陽性であり、より弱い信号が胎児で観察され、胎児脳での発現は観
察されなかった(表)。

0147

ヒトAUR2発現の同様な分析はより制限された発現プロフィールを示した。
単一の2.4kbAUR2転写体が成人睾丸および胸腺で検出され、[心臓、
胎盤、骨格筋]および胎児肝臓および腎臓では弱く、一方、他の正常組織では陰
性であった(表参照)。
ヒト正常組織および癌細胞におけるオーロラ1およびオーロラ2ノーザン分析
細胞型起源AUR 1 AUR 2
胸腺 正常組織 5 4
胎児肝臓 正常組織 4 2
胎児腎臓 正常組織 4 1
肺正常組織 3 0
十二指腸正常組織 2 1
結腸正常組織 2 0
胎児肺 正常組織 2 0
卵巣正常組織 2 0
睾丸 正常組織 2 2
脳 正常組織 0 0
小脳正常組織 0 0
唾液腺正常組織 0 0
心臓 正常組織 0 0
肝臓正常組織 0 0
膵臓正常組織 0 0
腎臓 正常組織 0 0
脾臓正常組織 0 0
正常組織 0 0
子宮正常組織 0 0
前立腺正常組織 0 0
骨格筋 正常組織 0 0
胎児の脳 正常組織 0 0
PBL正常組織 0 0
唾液腺 正常組織 0 0
細胞型 起源 AUR 1 AUR 2
胎盤 正常組織 0 0
SF−268CNS腫瘍4 ND
CCRF−CEM白血病4 ND
K−562 白血病 4 ND
HCC−2998結腸腫瘍4 ND
SW620 結腸腫瘍 4 2
KM−12 白血病 4 ND
MCF7/ADR−RES乳房腫瘍4 2
MDA−N 乳房腫瘍 4 ND
BT−549 乳房腫瘍 4 ND
SW480 結腸腫瘍 4 4
SW48 結腸腫瘍 4 ND
Calu−3肺腫瘍4 ND
Calu3 肺腫瘍 4 2
T47D 乳房腫瘍 4 2
A375メラノーマ4 0
SF767 CNS腫瘍 4 0
SW1417 結腸腫瘍 4 4
Caki2腎臓腫瘍4 0
Caki1 腎臓腫瘍 4 0
Caco2 結腸腫瘍 4 4
SW1417 結腸腫瘍 4 0
T98G CNS腫瘍 4 0
SF−539 CNS腫瘍 3 ND
SK−MEL−2 メラノーマ 3 ND
SK−MEL−5 メラノーマ 3 ND
細胞型 起源 AUR 1 AUR 2
R−48 胃腫瘍 3 ND
RF−1 胃腫瘍 3 ND
SW948 結腸腫瘍 3 ND
AGS 胃腫瘍 3 ND
HFL1 正常肺 3 ND
VCAR−8卵巣腫瘍2 ND
HT−29 結腸腫瘍 2 ND
MDA−MB−231 乳房腫瘍 2 ND
MDA−MB−435 乳房腫瘍 2 ND
SK−MEL−5 メラノーマ 2 ND
Kato−3 胃腫瘍 2 ND
Colo 205 結腸腫瘍 2 ND
Colo 320DM結腸腫瘍 2 2
WiDr 結腸腫瘍 2 ND
HT−29 結腸腫瘍 2 ND
SNU−C2B 結腸腫瘍 2 ND
HTC15 結腸腫瘍 2 2
T84 結腸腫瘍 2 0
SW948 結腸腫瘍 2 0
Daoy CNS腫瘍 2 0
OVCAR3 卵巣腫瘍 2 0
HS766T膵臓腫瘍2 0
SW1116 結腸腫瘍 2 0
Wilms腫瘍 腎臓腫瘍 2 0
UO−31 腎臓腫瘍 0 ND

0148

AUR1キナーゼドメイン中の配列からのプライマーを用いるノーザン分析お
よび半定量的PCRアッセイにより、いくつかの原発腫瘍および多様な新生物
源の多数の細胞株でAUR1mRNA発現プロフィールが決定された。結果は
表に含まれている。AUR1転写体はアッセイされたすべての腫瘍株で検出され
、いくつかのヒト結腸癌細胞株(SW480、Colo320、SW620、S
W1417、Caco2、SW12417)および肺癌腫(Calu3)、乳癌
腫(T47D、MCF7)、メラノーマ(A375)、腎臓癌腫(Caki−1
、Caki−2)、肝臓癌腫(SK−HEP−1)および神経腫瘍(SF767
、T98G)で最も高く発現されていた。AUR−1のより低い発現は他の結腸
癌腫(HTC15、T84、SW948、SW1116、HT29)、神経腫瘍
(Daoy)、卵巣癌腫(Ovcar3、原発腫瘍)、膵臓癌腫(HS766T
)および原発腎臓癌腫で観察された。

0149

腫瘍細胞株におけるAUR2発現プロファイルは、AUR1よりも著しくより
限られていた。AUR2の強い発現は結腸癌腫細胞株(Caco2、SW480
、SW1417、SW620)に限られる一方、弱い信号は他の結腸(HTC1
5、Co1o320)、乳房(T47D,MCF7)および肺(Calu3)腫
瘍細胞株で観察された。いくつかの他の腫瘍株は検出可能なAUR2転写体を持
っていなかった。
実施例3:オーロラ1の半定量的PCR検出

0150

RNAは種々のヒト細胞株新鮮凍結組織および原発腫瘍から単離された。
一本鎖cDNAは、Superscript Preamplificatio
n System(GibcoBRL)を使用し、上記のように10mgの各々
のRNAから合成された。これらの一本鎖鋳型は次に二つのオーロラ1−特異的
オリゴヌクレオチド(3476:5’−TTTGGCTCGGGAGAAGAA
AAGCCAT−3’(配列ID番号:19)および3506:5’−CAAT
CATCTCTGGGGGCAGTAGT−3’(配列ID番号:20))と
ともに35サイクルのPCR反応で使用した。反応生成物は2%アガロースゲル
電気泳動し、エチジウムブロミドで染色してUV光箱上で写真に撮った。各々
の試料に対して〜475bpオーロラ1特異的バンド相対強度見積もられた

実施例4:サザンブロット分析

0151

ゲノムDNAは標準法(Maniatisら)を使用して種々の形質転換され
たヒト細胞株(CaCO2、HTC15、LS147T,SKCO4、SW48
0、SW403、SW620、SW948、SW1417、SW1116、MC
F7、BT474)から単離された。細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し
消化緩衝液(100mM NaCl、10mMトリス pH8、25mM E
DTA、pH8、0.5%SDS、0.1mg/mlプロティナーゼK)に〜1
08細胞/mlで再懸濁した。細胞は50℃で12時間のインキュベーションに
より溶解し、続いてフェノール/クロロホルムで抽出し、等量の7.5M酢酸
ンモニウムおよび100%EtOHで沈澱させた。DNAはTE緩衝液に再懸濁
した。約20マイクログラムのゲノムDNAは、HindIIIまたはXhoIIに
より37℃で少なくとも4時間消化した後、1%アガロースゲルで分画した。D
NA断片をキャピラリー移動法(Southern,EM,J Mol Bio
98:503,1975)によりニトロセルロース膜に移し、上記ノーザンブロ
ット分析で説明したようにヒトオーロラ1およびオーロラ2−特異的プローブ
ハイブリダイズさせた。

0152

AUR1およびAUR2cDNAは両方ともHindIII制限酵素で認識さ
れる一つの部位を含んでいるので、DNAはHindIIIで制限分解された。A
UR1はすべての起源のものから等しい強度の単−4.3kbバンドを示し、そ
れはアッセイされた多数の腫瘍型中の単一コピー、非転位遺伝子であることを示
唆している。しかしながら、低ストリンジェンシー条件下では、AUR1プロー
ブへ弱くハイブリダイズする1.3kbおよび3.2kb SacI断片が検出
できた。クローニングおよび配列決定により、この領域は多数のフレームシフト
を持つ、イントロン無しのAUR1関連偽遺伝子(AUR3と名付けられた)を
コードしていることが明らかにされた。さらに、AUR3偽遺伝子のすぐ上流は
非常に安定なヘアピンループを形成することが予測される複雑な逆方向反復を持
つ領域である。AUR3DNA配列はAUR1と相同であり、AUR1 cD
NAの最初のヌクレオチドから始まっている。この部位のすぐ上流はAUR3の
予測されるヘアピンループである。AUR3への相同性がこのヌクレオチドから
上流
に続くのかどうか、およびAUR1 cDNAが同様のヘアピンループを含んで
いるのかまたはそれが前に置かれているのかどうかを決定するために、現在AU
R1ゲノムクローンの特性付けを行っている。AUR2は7.0kbおよび4.
3kbにバンド、およびすべての起源のものから〜10kbに微かではあるがよ
高分子量のバンドを示した。これらのデータはAUR2もまた単一コピー遺伝
子であることを示唆している。AUR2で探索したブロットで観察された多数の
バンドは、完全長cDNAプローブが使用されたことによるものであろう。
実施例5:ヒトオーロラ1およびオーロラ2をコードしているcDNAクローン
の配列分析

0153

ヒト膵臓癌腫ライブラリーから、正常ヒト十二指腸から各々単離された完全長
クローンから、およびHEPM細胞から単離された部分ヒトオーロラ1から、ヒ
トオーロラ1およびオーロラ2の全配列が決定された。

0154

1,244bpヒトオーロラ1(AUR1_h)ヌクレオチド配列が配列ID
番号:1または配列ID番号:2に示されており、344アミノ酸のポリペプチ
ドをコードしている一つの読み取り枠を含んでいる。AUR1_hコード領域に
は54ヌクレオチドの5’−非翻訳領域および132ヌクレオチドのポリ(A)
尾部で終わる3’−非翻訳領域が隣接している。

0155

2,198bpヒトオーロラ2(AUR2_h)ヌクレオチド配列が配列ID
番号:1または配列ID番号:2に示されており、403アミノ酸のポリペプチ
ドをコードしている一つの読み取り枠を含んでいる。AUR2_hコード領域に
は200ヌクレオチドの5’−非翻訳領域および768ヌクレオチドの3’−非
翻訳領域が隣接している。

0156

AUR1およびAUR2cDNAの配列はヒト膵臓腫瘍および正常ヒト十二
指腸の両方で配列決定され、いくつかの多形らしい部位を除いて配列の相違はな
かった。これらのあいまい性には以下の点が含まれている:
cDNAヌクレオチド解説
AURI1174 1つのクローンは挿入されたポリAを持っている
873 すべての十二指腸クローンでT、膵臓腫瘍でC
469 1つのクローンでT、他のすべてはC
848 1つのクローンでG、他のすべてはA−アミノ酸
EをGへ変化させる
1097 1つのクローンでG、他の2つはT
957 1つのクローンでG、他の4つはA
29 5つのクローンで103にスプライス、5つのク
ローンではスプライスなし(ブタのように)
AUR2 349 1つのクローンでT、多数の他のものでC(アミ
ノ酸PをLへ変化させる)
369 3つのクローンでA、多数の他のものでG(アミ
ノ酸VをIへ変化させる)

0157

AUR1およびAUR2のC−末端は真核生物プロテインキナーゼに特徴的な
12のサブドメインすべてを保存している。このAUR1およびAUR2キナー
ゼドメインにはN−末端が先立っており、各々74および130のアミノ酸であ
る。AUR1およびAUR2ヌクレオチドおよび演鐸されるアミノ酸配列(配列
ID番号:3または配列ID番号:4)と利用可能なDNAおよびタンパク質配
データベースの比較は、いくつかの高い配列同一性を共有するEST配列を除
いて独特であることを示している。しかしながら、それらはN−末端および触媒
ドメインの両方でショウジョウバエオーロラおよびサッカロミセスセレビジエ
IPL1遺伝子と著しい相同性を持っている。さらに、二つの出版されていない
データベース記載事項アフリカツメガエルからの同族体に近いようである(p
46APK−GB寄託番号#Z17206およびp46BPK−GB寄託番号#
Z17207)。

0158

ヒト、カエル、ショウジョウバエおよび酵母からのオーロラのN−末端ドメイ
ンは限られた配列同一性を共有している。必要とされるAUR2は豊富なグルタ
ミン酸を持っており、一つの残基で分離された対としてしばしば存在している。

0159

これらのタンパク質の触媒ドメインの比較は、AUR1はAUR2と70%の
アミノ酸同一性を共有し、ショウジョウバエオーロラとは61%および酵母IP
L1遺伝子とは45%を共有している。AUR2は、ショウジョウバエオーロラ
とは60%および酵母IPL1遺伝子とは45%を共有している。AUR1およ
びAUR2は両方とも他の既知のすべての哺乳類キナーゼとは45%未満の相同
性しか共有せず(最も近いのはcAMP依存性プロテインキナーゼである)、こ
れらショウジョウバエおよび酵母キナーゼの同族体であることを示唆している。

0160

AUR1およびAUR2は両方とも、ショウジョウバエおよび酵母キナーゼの
同族体で保持されており、およびサイクリン依存性キナーゼp34cdc2中の
既知の制御部位であるcAMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を含んで
いる(AUR1のTHR232およびAUR2のTHR288)。AUR2は追
加のPKA部位をSER342に含んでいる。両方のタンパク質はまた多数のカ
ゼインキナーゼII(AUR1およびAUR2に対し5および6)およびプロテイ
ンキナーゼC(AUR1およびAUR2に対し4および10)リン酸化部位を持
っている。AUR2はまたTYR344にチロシンリン酸化共通部位も持ってお
り、それはまたショウジョウバエオーロラでは保存されているが、AUR1また
は酵母IPL1には存在しない。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ