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技術 アンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法及びそのキット

出願人 MeijiSeikaファルマ株式会社
発明者 生方公子
出願日 1999年6月2日 (21年5ヶ月経過) 出願番号 1999-155399
公開日 2000年12月12日 (19年11ヶ月経過) 公開番号 2000-342268
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード 保存状況 ブレイクポイント 分離率 薬剤感受性検査 溶血血液 表層蛋白質 トランスペプチダーゼ活性 検査材料
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重要な関連分野

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図面 (5)

課題

解決手段

インフルエンザ菌のp6遺伝子、ftsI遺伝子、dacB遺伝子及びbla遺伝子を遺伝子増幅法により同時に検出することを特徴とするアンピシリン耐性インフルエンザ菌の存在及びその耐性度を判定する検査法、並びにそのキットを提供する。

概要

背景

インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)は、肺炎急性気管支炎中耳炎、あるいは細菌性化膿性髄膜炎などの感染症起炎菌となることが多い菌種としてよく知られた細菌である。この菌種におけるβ-ラクタム系薬耐性には、薬剤不活化する場合と、細菌細胞細胞質膜上に存在し、β-ラクタム系薬の標的であるペニシリン結合蛋白質(PBP)が変異した場合の、2つのメカニズムが知られている(Vega R., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 9: 164-168,1976.、Parr, T.R. Jr., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 25: 747-753, 1984.)。

薬剤を不活化して耐性化するのは、菌がβ-ラクタマーゼTEM型不活化酵素)産生能を有するようになったからである。TEM型不活化酵素は、TEM型と称される典型的なclassA型β-ラクタマーゼ産生遺伝子によりコードされ、TEM1型、TEM2型等の多種多様変異型報告されている(Bush,K., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39: 1211-1233, 1995.、井上, 日本臨床微生物学雑誌Vol.8, No.1, 59-64, 1998)。この不活化酵素はプラスミドと呼ばれる染色体外のDNAにコードされている。このようなタイプの耐性菌は、現在臨床検査材料からは15%前後の割合で分離される。

これに対し、PBPが変異したアンピシリン耐性インフルエンザ菌、すなわちBLNARと呼ばれる耐性菌は、諸外国においては1980年代にごくわずかに存在するすることが報告されていたが、我が国おいては最近までその存在は明らかにされていなかった。近年、BLNARの臨床検査材料からの分離率が上昇し、臨床的にも本菌株による難治重症感染症が問題となってきている。

しかし、臨床検査材料からのインフルエンザ菌の検出は、検体採取から処理されるまでの時間、あるいは検体保存状況培養方法によって左右されることが多く、くわえ治療のために最適な抗菌薬を証明する薬剤感受性検査に2日間を要し、しかもそのわりには得られた結果の信頼性に乏しいという状況から、迅速かつ正確なアンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法が望まれていた。

インフルエンザ菌の薬剤耐性に関わる因子としては、前述したように、β-ラクタマーゼ(TEM型不活化酵素)を産生してペニシリン系薬剤を不活化するもの、β-ラクタム系薬の作用標的であるPBPの変異によるアンピシリン耐性(BLNAR)の2種類が存在する。耐性に関わるPBPの変異としては、双頭酵素であるPBP3蛋白質は、β-ラクタマーゼ系薬の標的として重要なトランスペプチダーゼ活性領域側をコードするftsI遺伝子とPBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子が本発明者らによって解析された。ここで用いられる「PBPの変異」とは、欠失置換、挿入等を意味するが、PBP3及びPBP4は主に置換を意味し、PBP4は欠失をも意味する場合がある。

このようにインフルエンザ菌の耐性化に関わる遺伝子は一様ではないことに加え、本菌は従来法であるディスク法微量液体希釈法薬剤感受性を測定すると、接種菌量の影響を受けやすく、往々にして菌の膜を形成し、判定が困難な場合が多い。そのようなことから、精度の高い判定方法が望まれていた。

概要

アンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法及びそのキット見出す

インフルエンザ菌のp6遺伝子、ftsI遺伝子、dacB遺伝子及びbla遺伝子を遺伝子増幅法により同時に検出することを特徴とするアンピシリン耐性インフルエンザ菌の存在及びその耐性度を判定する検査法、並びにそのキットを提供する。

目的

したがって、本発明の目的は、インフルエンザ菌の存在及び2種類のアンピシリン耐性インフルエンザ菌の存在及びその耐性度を迅速かつ正確に判定する方法、並びにこれらの判定用キットを提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

インフルエンザ菌のP6蛋白質をコードするp6遺伝子、PBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子、PBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子、及びアンピシリン不活化するTEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子の4遺伝子を同時に検出することを特徴とし、これらの検索によってインフルエンザ菌の存在、並びにβ-ラクタマーゼによらないPBP変異による耐性及びβ-ラクタマーゼによる耐性のメカニズムの異なる2種類のアンピシリン耐性インフルエンザ菌を同時に判定する方法。

請求項2

p6遺伝子はp6遺伝子の保存領域を有するDNA、ftsI遺伝子はftsI遺伝子の変異領域を有するDNA、dacB遺伝子はdacB遺伝子の変異領域を有するDNA、bla遺伝子はbla遺伝子の保存領域を有するDNAである請求項1に記載の方法。

請求項3

p6遺伝子の保存領域を有するDNAはp6遺伝子の74番目から278番目に相当するDNAであり、ftsI遺伝子の変異領域を有するDNAが配列番号1に記載のftsI遺伝子の118番目から668番目に相当するDNAであり、dacB遺伝子の変異領域を有するDNAが配列番号2に記載のdacB遺伝子の519番目から811番目に相当するDNAであり、bla遺伝子の保存領域を有するDNAはbla遺伝子の350番目から807番目に相当するDNAである請求項2に記載の方法。

請求項4

検出が、遺伝子増幅法で検出することを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の方法。

請求項5

遺伝子増幅法が、ポリメラーゼ増幅反応法である請求項4に記載の方法。

請求項6

ポリメラーゼ増幅反応法が、p6遺伝子、配列番号1、配列番号2又はbla遺伝子により表されるDNAの一部と実質的に同一な若しくは実質的に相補的プライマーを用いることを特徴とする請求項5に記載の方法。

請求項7

プライマーが配列番号10〜配列番号17で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項6に記載の方法。

請求項8

請求項6又は請求項7に記載のプライマーを含むことを特徴とする、アンピシリン耐性インフルエンザ菌2種類の存在及び耐性度の判定用キット

技術分野

tccatagttg cctgactccc c 21

背景技術

0001

本発明は、呼吸器感染症対策上重要なインフルエンザ菌の存在と耐性メカニズムの異なるアンピシリン耐性インフルエンザ菌2種類の存在及びその耐性度を同時に判定する方法並びにこのような判定を行うためのキットに関する。

0002

インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)は、肺炎急性気管支炎中耳炎、あるいは細菌性化膿性髄膜炎などの感染症起炎菌となることが多い菌種としてよく知られた細菌である。この菌種におけるβ-ラクタム系薬耐性には、薬剤不活化する場合と、細菌細胞細胞質膜上に存在し、β-ラクタム系薬の標的であるペニシリン結合蛋白質(PBP)が変異した場合の、2つのメカニズムが知られている(Vega R., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 9: 164-168,1976.、Parr, T.R. Jr., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 25: 747-753, 1984.)。

0003

薬剤を不活化して耐性化するのは、菌がβ-ラクタマーゼTEM型不活化酵素)産生能を有するようになったからである。TEM型不活化酵素は、TEM型と称される典型的なclassA型β-ラクタマーゼ産生遺伝子によりコードされ、TEM1型、TEM2型等の多種多様変異型報告されている(Bush,K., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39: 1211-1233, 1995.、井上, 日本臨床微生物学雑誌Vol.8, No.1, 59-64, 1998)。この不活化酵素はプラスミドと呼ばれる染色体外のDNAにコードされている。このようなタイプの耐性菌は、現在臨床検査材料からは15%前後の割合で分離される。

0004

これに対し、PBPが変異したアンピシリン耐性インフルエンザ菌、すなわちBLNARと呼ばれる耐性菌は、諸外国においては1980年代にごくわずかに存在するすることが報告されていたが、我が国おいては最近までその存在は明らかにされていなかった。近年、BLNARの臨床検査材料からの分離率が上昇し、臨床的にも本菌株による難治重症感染症が問題となってきている。

0005

しかし、臨床検査材料からのインフルエンザ菌の検出は、検体採取から処理されるまでの時間、あるいは検体保存状況培養方法によって左右されることが多く、くわえ治療のために最適な抗菌薬を証明する薬剤感受性検査に2日間を要し、しかもそのわりには得られた結果の信頼性に乏しいという状況から、迅速かつ正確なアンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法が望まれていた。

0006

インフルエンザ菌の薬剤耐性に関わる因子としては、前述したように、β-ラクタマーゼ(TEM型不活化酵素)を産生してペニシリン系薬剤を不活化するもの、β-ラクタム系薬の作用標的であるPBPの変異によるアンピシリン耐性(BLNAR)の2種類が存在する。耐性に関わるPBPの変異としては、双頭酵素であるPBP3蛋白質は、β-ラクタマーゼ系薬の標的として重要なトランスペプチダーゼ活性領域側をコードするftsI遺伝子とPBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子が本発明者らによって解析された。ここで用いられる「PBPの変異」とは、欠失置換、挿入等を意味するが、PBP3及びPBP4は主に置換を意味し、PBP4は欠失をも意味する場合がある。

発明が解決しようとする課題

0007

このようにインフルエンザ菌の耐性化に関わる遺伝子は一様ではないことに加え、本菌は従来法であるディスク法微量液体希釈法薬剤感受性を測定すると、接種菌量の影響を受けやすく、往々にして菌の膜を形成し、判定が困難な場合が多い。そのようなことから、精度の高い判定方法が望まれていた。

課題を解決するための手段

0008

したがって、本発明の目的は、インフルエンザ菌の存在及び2種類のアンピシリン耐性インフルエンザ菌の存在及びその耐性度を迅速かつ正確に判定する方法、並びにこれらの判定用キットを提供することにある。

0009

このような現状において、本発明者らは種々の検討を行ない、変異を起こしていないPBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子、変異を起こしていないPBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子、アンピシリンを不活化するTEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子を遺伝子増幅法により同時に増幅し、アンピシリン耐性インフルエンザ菌の検出精度を高める方法を見出した。この方法によれば、インフルエンザ菌が変異を起こしていない正常な遺伝子を保有していれば遺伝子のDNA増幅が認められ、何らかの変異を生じた遺伝子を保有している際には、当該遺伝子のDNA増幅が認められない。

0010

したがって、PBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子とPBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子に変異を有し、TEM型不活化酵素を産生しない場合には、これら3つの遺伝子はすべてDNA増幅が認められないことになり、検査材料中にインフルエンザ菌が存在しない場合と同じ結果となる。

0011

そのようなことから、本発明者らは、検査材料中のインフルエンザ菌の存在を確認するため、インフルエンザ菌に特徴的な表層蛋白質であるP6蛋白質をコードするp6遺伝子(Nelson, M.B., et al, Infect. Immunology,56:128-134,1988)を上述した3つの遺伝子検索の中に加え、これら4種類の遺伝子を同時に増幅する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

発明を実施するための最良の形態

0012

すなわち、本発明は、インフルエンザ菌のp6遺伝子、PBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子、PBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子、及びアンピシリンを不活化するTEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子の4遺伝子を遺伝子増幅法により同時に検出することを特徴とし、これら遺伝子の増幅有無の検索によってインフルエンザ菌の存在、並びにβ-ラクタマーゼによらないPBP変異による耐性及びβ-ラクタマーゼによる耐性のメカニズムの異なる2種類のアンピシリン耐性インフルエンザ菌を同時に判定する方法及びその耐性度を判定する方法、並びにそれらの判定用キットを提供するものである。

0013

本発明の検査法において検出するインフルエンザ菌内在の遺伝子は、以下の遺伝子或いはDNA領域である。インフルエンザ菌のp6蛋白質をコードする遺伝子としては、p6遺伝子又はp6遺伝子の保存領域を有するDNAが好ましく、特にp6遺伝子の74番目から278番目に相当するDNAが好ましい。PBP3蛋白質をコードする遺伝子としては、ftsI遺伝子又はftsI遺伝子の変異領域を有するDNAが好ましく、特に配列番号1に記載の118番目から668番目に相当するDNAが好ましい。PBP4蛋白質をコードする遺伝子としてはdacB遺伝子又はdacB遺伝子の変異領域を有するDNAが好ましく、特に配列番号2に記載の519番目から811番目に相当するDNAが好ましい。TEM型不活化酵素をコードする遺伝子としては、bla遺伝子又はbla遺伝子の保存領域を有するDNAが好ましく、特にbla遺伝子の350番目から807番目に相当するDNAが好ましい。

0014

上記のp6遺伝子(アクセッション番号:No.M19391)及びbla遺伝子(アクセッション番号:No.J01749)のDNA塩基配列の位置を示す番号は、開始コドンから数えた番号であり、以下に記載するこれら遺伝子のDNA塩基配列の位置を示す番号も同じ意味を表している。

0015

さらに、配列番号1に記載の最初の塩基は、ftsI遺伝子(アクセッション番号:No.U32793)の開始コドンから数えて931番目に相当し、以下の配列番号3〜配列番号6の記載も同様である。すなわち、「118番目」とは、開始コドンから数えて1048番目であり、「668番目」とは開始コドンから数えて1598番目を意味している。

0016

また、配列番号2に記載の最初の塩基は、dacB遺伝子(アクセッション番号No.U32812)の開始コドンから数えて151番目に相当し、以下の配列番号7〜配列番号9の記載も同様である。すなわち、「519番目」とは、開始コドンから数えて669番目であり、「811番目」とは開始コドンから数えて961番目を意味している。

0017

尚、p6遺伝子の保存領域とは、種々のインフルエンザ菌株間で保存されているp6遺伝子のDNA領域である。bla遺伝子の保存領域は、種々のTEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子間で保存されているbla遺伝子のDNA領域である。これらの遺伝子配列登録されているGenBankで解析し、それぞれの保存領域を同定した。

0018

一方、ftsI遺伝子、dacB遺伝子の変異領域とは、本発明者らが、これら遺伝子の変異株を常法により解析し、同定したトランスペプチダーゼ活性領域の変異である。

0019

本発明で用いる遺伝子増幅法としては、公知のポリメラーゼ増幅反応PCR:Polymerase Chain Reaction)法が用いられる。PCR法においては、下記の4組みのプライマーを使用する。

0020

すなわち、プライマーはセンスプライマーアンチセンスプライマーの組からなるもので、(1)インフルエンザ菌のp6遺伝子を特異的に増幅できるもの、(2)変異のないPBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子を変異のあるftsI遺伝子と区別して特異的に増幅できるもの、(3)変異のないPBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子を変異のあるdacB遺伝子と区別して特異的に増幅できるもの、(4)TEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子を特異的に増幅できるもの、である。

0021

これらのプライマーについて、さらに詳しく説明する。(1)インフルエンザ菌のp6遺伝子を特異的に増幅できるプライマーとは、GenBankに登録されている各種菌株のp6遺伝子を解析し、保存領域を同定し、それを基にp6遺伝子のDNAの一部と実質的に同一な若しくは実質的に相補的オリゴヌクレオチドを設計した。

0022

(2)本発明者らが、配列番号1に記載の感受性株の有する変異のないftsI遺伝子と種々のアンピシリン耐性インフルエンザ菌のftsI遺伝子上のトランスプチダゼ活性領域のDNA塩基配列を比較し、明らかにした変異領域を基に、前記するようなプライマーを設計した。このプライマーは、配列番号1に記載のDNAの一部と実質的に同一な若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドである。感受性株であるRd株のDNA(配列番号1)、アンピシリン感受性株であるT196株のDNA(配列番号3)、BLNARであるKK-1株のDNA(配列番号4)、587株のDNA(配列番号5)及びT066株のDNA(配列番号6)のDNA塩基配列を比較した結果を図1に示す。尚、これらの株は、臨床分離株であり、明治製菓株式会社薬品総合研究所に分譲可能な状態で保管されている。

0023

(3)本発明者らが、配列番号2に記載の感受性株の有する変異のないdacB遺伝子と種々のアンピシリン耐性インフルエンザ菌のdacB遺伝子上のトランスペプチダーゼ活性領域のDNA塩基配列を比較し、明らかにした変異領域を基に、前記するようなプライマーを設計した。このプライマーは、配列番号2に記載のDNAの一部と実質的に同一な若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドである。感受性株であるRd株のDNA(配列番号2)、アンピシリン感受性株であるT196株のDNA(配列番号7)、BLNARであるKK-1株のDNA(配列番号8)及びT040株のDNA(配列番号9)の塩基配列を比較した結果を図2に示す。尚、これらの株は、臨床分離株であり、明治製菓株式会社薬品総合研究所に分譲可能な状態で保管されている。

0024

(4)TEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子を特異的に増幅できるプライマーとは、GenBankに登録されている種々のTEM型不活化酵素をコードするbla遺伝子を解析し、保存領域を同定し、それを基にTEM1型不活化酵素をコードするbla遺伝子のDNAの一部と実質的に同一な若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを設計した。

0025

さらに詳しくは、このようなPCR法に用いるプライマーの塩基配列を、センスプライマーとアンチセンスプライマーの組で、以下に具体的に示す。すなわち、p6遺伝子の74番目から278番目に相当するDNAを増幅することができるプライマーは、配列番号10と配列番号11に記載の組であり、PBP3蛋白質をコードする配列番号1に記載のftsI遺伝子の118番目から668番目に相当するDNAを増幅することができるプライマーは、配列番号12と配列番号13に記載の組であり、PBP4蛋白質をコードする配列番号2に記載のdacB遺伝子の519番目から811番目に相当するDNAを増幅することができるプライマーは、配列番号14と配列番号15に記載の組であり、TEM1型不活化酵素をコードするbla遺伝子の350番目から807番目に相当するDNAを増幅することができるプライマーは、配列番号16と配列番号17に記載の組である。

0026

5'-acgatgctgcaggcaatggt-3' (配列番号10)
5'-ccacgttcatcagtattacct-3' (配列番号11)
5'-gatactacgtcctttaaattaag-3' (配列番号12)
5'-gcagtaaatgccacatactta-3' (配列番号13)
5'-gctcgatgttgttgtacacg-3' (配列番号14)
5'-ctcggaataatgaatcggc-3' (配列番号15)
5'-taagagaattatgcagtgctgcc-3' (配列番号16)
5'-tccatagttgcctgactcccc-3' (配列番号17)

0027

前記配列番号12と配列番号13に記載のプライマーの位置をftsI遺伝子のDNA塩基配列とともに図1に示し、前記配列番号14と配列番号15に記載のプライマーの位置をdacB遺伝子のDNA塩基配列とともに図2に示した。

0028

これらのプライマー(配列番号10〜配列番号17)は、例えばDNA自動合成機等を用いて化学的にオリゴヌクレオチドを合成することにより調製することができる。合成するオリゴヌクレオチドの長さは、遺伝子増幅法のプライマーとして使用できる範囲であれば特に限定されないが、15〜40塩基程度が好ましい。

0029

前記プライマー(配列番号10〜配列番号17)は、前記DNAを増幅できるものであれば、これらの標識化合物であってもよい。プライマーの標識体は上記プライマーに検出可能な標識物を結合させたものが挙げられる。標識物としては非放射性で、直接測定が可能な蛍光物質フルオレッセイン及びその誘導体(フルオレッセインイソチオシアネート等)、並びにローダミン及びその誘導体(テトラメチルローダミンイソチオシアネート等)、並びに遅延蛍光を発する物質(DTTA:ジエチレントリアミン−N1,N2,N3,N4−四酢酸)等が挙げられる。

0030

尚、これらの標識物を検出するにあたっては、標識物と特異的に結合する物質を利用すれば、間接的に標識物を検出することができる。こうした場合の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等が挙げられ、ビオチンの場合には、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプテンとしては、2,4-ジニトロフェニル基を有する化合物ジゴキシゲニンを使うことができ、さらにはビオチンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用することができる。これらの標識化合物は、いずれも単独又は必要であれば、複数種の組み合わせで公知手段(特開昭59-93098号、特開昭59-93099号各公報参照)により、プライマーに導入することができる。

0031

以下に本発明の検出法の操作を詳細に説明する。
(1)検体の標準及び前処理
まず、目的のアンピシリン耐性インフルエンザ菌の存在及び耐性度を判定しようとする検体を用意する。検体としては、各種検査材料、上咽頭あるいは咽頭ぬぐい液、耳漏鼓膜切開液、喀痰髄液など、あるいはそれらから得られた細菌培養液、単離培養された細菌コロニー等が挙げられる。検査にはこれらの材料から遺伝子増幅法の試料となるインフルエンザ菌の核酸成分を抽出することが必要であるが、そのための方法としては、界面活性剤蛋白質分解酵素プロテイナーゼKを使用する。この方法によって得られた核酸抽出液はその一部をそのまま遺伝子増幅法に使用することができる。

0032

(2)遺伝子増幅反応
上記検体に前記プライマー(配列番号10〜配列番号17)を加えることにより、検体中に目的とするインフルエンザ菌が存在すれば、プライマーの伸長反応に基づくPCR法を行うことができる。PCR法はプライマーの他に耐熱性DNAポリメラーゼDNA合成基質となる核酸を用い、通常の方法で実施することができる。

0033

(3)検出
プライマー伸長反応により増幅されたDNAと検出プライマーとの結合物を検出すれば、被検体中のアンピシリン耐性インフルエンザ菌を検出することができる。本発明における遺伝子増幅法によるDNA増幅の有無の判定は、増幅されたDNAのサイズを電気泳動で確認する方法や、識別可能な標識を施したプライマーを用いて遺伝子増幅を行った増幅DNAをそれと相補的な配列を持つプローブを固定した固相担体捕獲して増幅DNAの標識で識別する方法(特開平1-252300号公報)等により行うことができる。

0034

本発明キットは、上記本発明方法を用いてインフルエンザ菌の存在及び耐性度を判定するもので、上記のようなプライマーを具備してなるもので、必要に応じて各プライマーに検出可能な任意の標識物を導入してもよい。具体的には、p6遺伝子の74番目から278番目に相当するDNA、PBP3蛋白質をコードする配列番号1に記載のftsI遺伝子の118番目から668番目に相当するDNA、PBP4蛋白質をコードする配列番号2に記載のdacB遺伝子の519番目から811番目に相当するDNA、TEM1型不活化酵素をコードするbla遺伝子の350番目から807番目に相当するDNAをそれぞれ増幅することのできる前記8種類のプライマー(配列番号10〜配列番号17)を具備してなるもので、必要に応じて各プライマーに検出可能な任意の標識物を導入してもよい。また、本発明のキットは、必要に応じてPCR反応試薬と合わせることもできる。以下、これらの試薬類について具体的に説明する。

0035

(A)遺伝子増幅反応を行うための試薬
特定の遺伝子増幅反応を行うための前記プライマー、DNA鎖を合成(増幅)するための単位DNA及びDNA伸長酵素を含むものである。DNA伸長酵素としては、任意のDNAポリメラーゼを用いることができるが、好ましくは熱安定性のDNAポリメラーゼであるTaq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼを用いることにより、迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる。

0036

(B)遺伝子増幅反応生成物固定化するための担体
本発明により増幅されたDNAを固定可能な固相担体で、具体的にはマイクロタイターウエルアガロースビーズラテックス粒子磁性ラテックス粒子等の固相材料が挙げられる。好ましくは操作性及び機械化に優れたマイクロタイターウエル又は磁性ラテックス粒子が適している。これらの固相担体にDNAを非特異的吸着共有結合イオン結合化学結合等の任意の結合様式で固定化することができる。

0037

(C)その他の試薬類
洗浄液は、未反応プライマー、PCR反応試薬等を除去するための洗浄液であって、本検出反応に影響がないものであれば特に限定されない。一般にリン酸緩衝液を用いることができる。増幅反応生成物のDNAに結合した標識プライマーを間接的に測定するための試薬は、プライマーに直接検出可能な標識以外の標識を導入した場合、その標識を間接的に測定するための試薬類を含むものである。例えば、標識がハプテンである場合、a)ハプテンと特異的に結合する抗体に酵素を結合させたもの、b)当該酵素の基質等が挙げられる。これらの具体例としては、酵素がアルカリフォスファターゼの場合、基質として4-メチルウンベリフリルフォスフェート、4-ニトロフェニルフォスフェート、NADP等が挙げられる。

0038

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

0039

実施例1:検体からのDNA抽出
臨床検査材料(上咽頭ぬぐい液)を2mlのミューラーヒント液体培地混釈し、混釈液の1.5mlを遠心分離してインフルエンザ菌の菌体を集めた。遠心分離後はその上清をほぼ完全に捨て、沈渣に10μlの滅菌水を加えて懸濁した。次いで懸濁液の5μlを溶菌液[ 100mMトリス-塩酸緩衝液(pH8.9)、 0.1%トリトンX-100、 200μg/mlプロテナーゼK、 0.45%ツイーン20、 0.45%ノニデットP-40] 30μlに加えて60℃で20分間の溶菌操作を行い、更に95℃で10分間加熱して菌体からDNAを抽出させた。

0040

実施例2:ポリメラーゼ増幅反応
PCRは、上記のDNA溶液PCR反応液の入ったAチューブとBチューブにそれぞれ2μlづつ加えて実施した。PCR反応液の組成は、次に示す各プライマーを3pmole/30μl、TaqDNAポリメラーゼ0.5 U(宝酒造社製)/30μl、dATP・dGTP・dCTP・dTTPをそれぞれ2.4μg/30μl、1.5 mM塩化マグネシウム、50 mM塩化カリウム、0.001%ゼラチン、10 mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.3)である。その他に、Aチューブにはp6遺伝子増幅用プライマー[配列番号10;5'-acgatgctgcaggcaatggt-3'及び配列番号11;5'-ccacgttcatcagtattacct-3']とTEM1型不活化酵素をコードするbla遺伝子増幅用プライマー[配列番号16;5'-taagagaattatgcagtgctgcc-3'及び配列番号17;5'-tccatagttgcctgactcccc-3']、一方Bチューブには、PBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子増幅用プライマー[配列番号12;5'-gatactacgtcctttaaattaag-3'及び配列番号13;5'-gcagtaaatgccacatactta-3']とPBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子増幅用プライマー[配列番号14;5'-gctcgatgttgttgtacacg-3'及び配列番号15;5'-ctcggaataatgaatcggc-3]を含む。PCRは94℃で15秒のDNA熱変性工程、57℃で15秒のプライマーのアニーリング工程、72℃で15秒のDNA鎖伸長工程という3段階の温度サイクルを35回繰り返して行った。

0041

実施例3:DNA増幅結果の判定
PCRによる遺伝子増幅の判定は、PCR後の反応液から10μlを採取し、それを3%アガロースゲル上で電気泳動を行い、DNAのバンドの有無とDNAサイズマーカーでDNA鎖長を確認することによって行った。それぞれの期待される増幅断片は、p6蛋白質をコードするp6遺伝子増幅断片は205塩基対、PBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子の増幅断片は551塩基対、PBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子の増幅断片は293塩基対、TEM1不活化酵素をコードするbla遺伝子の増幅断片は456塩基対の長さとなり、電気泳動での視覚判別が可能である。その電気泳動の結果の写真図3に示した。

0042

実施例4:インフルエンザ菌の耐性確認
インフルエンザ菌の薬剤耐性は以下のようにして確認した。すなわち、2%の溶血血液、15μg/mlのNAD、及び0.5%のイーストエキスを加えたミューラーヒントン寒天培地を用い、アンピシリンの最終濃度が64μg/mlから0.016μg/mlまでの2倍希釈系列濃度となる薬剤含有培地を作成した。これをアンピシリン耐性判定用培地とした。

0043

被験インフルエンザ菌はチョコレート寒天培地(BBL社製市販培地)で前培養後、滅菌綿棒にてかきとり、濁度が0.5となるようにミューラーヒントンブロスに懸濁した。この菌液を100倍に希釈した後、その10μlをアンピシリン耐性判定用の培地にスポットし、37℃で18時間培養した。判定は、寒天平板上に明らかなコロニー発育がみられた場合を発育(+)、みられないものを発育(-)として判定した。最小発育阻止濃度(MIC)は菌の発育が(-)となった薬剤濃度とした。加えて、被験菌株についてはペニシリナーゼチエック(昭和薬品化工社製P/Case TESTを使用して不活化酵素(β-ラクタマーゼ)の産生性を調べた。

0044

米国臨床検査法(NCCLS)によれば、アンピシリンに対するMICが2.0μg/ml以上でβ-ラクタマーゼ非産生株をBLNAR株、それ以下のMICの場合はアンピシリン感受性株、β-ラクタマーゼ酵素を産生する株は不活化酵素産生株としている。臨床分離のインフルエンザ菌111株(明治製菓株式会社薬品総合研究所に分譲可能な状態で保管している)についての成績を表1及び図4に示す。

0045

0046

β-ラクタマーゼ産生の15株では、すべてTEM1型不活化酵素をコードするbla遺伝子のDNA増幅が確認できた。これらの株のアンピシリンMICはすべて4μg/ml以上で、耐性と判定された。これに対し、β-ラクタマーゼを産生しない株ではTEM1型不活化酵素をコードするbla遺伝子のDNA増幅はみられなかった。

0047

一方、β-ラクタマーゼ非産生96株のうち、アンピシリンに1μg/ml以上のMICを示す34株は2株を除いてPBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子のDNAは増幅されず、当該遺伝子の変異が確認された。アンピシリンに0.5μg/mlのMICを示した10株では、ftsI遺伝子の変異を有している株と変異を有していない株とがそれぞれ5株づつ混在していた。アンピシリンに0.25μg/ml以下のMICを示した53株では1株の例外を除いて、ftsI遺伝子のDNA増幅が認められ、遺伝子変異のないことが確認された。PBP4蛋白質の変異株は5株認められたが,いずれもアンピシリンに対し0.5μg/ml以上のMICを示していた。

発明の効果

0048

本発明による遺伝子検査結果は薬剤感受性と高い相関を示していた。しかし、NCCLSがアンピシリンに対する感受性・耐性のブレイクポイントと定めた2μg/mlという薬剤濃度は遺伝子変異の結果が適切に反映されていない。臨床的には遺伝子検索の結果判明したPBP変異を有するBLNAR株におけるアンピシリンのMICは1μg/ml以上、PBP変異を有しない株のMICは0.25μg/ml以下、0.5μg/mlは緩衝濃度という考え方のほうが臨床により適していると考えられた。尚、いずれの菌株においてもp6遺伝子のDNA増幅がみられ、インフルエンザ菌であることが確認できた。

0049

本発明によってアンピシリン耐性インフルエンザ菌を検体から直接、高精度かつ迅速に検出することができ、インフルエンザ菌感染症に対し、早期に適切な治療を行うことが可能になった。

図面の簡単な説明

0050

<110>MEIJI SEIKA KAISHA,LTD.

<120>アンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法及びそのキット
<160>17

<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213>Haemophilus influenzae

<400> 1
tca gag tta atg cgt aac cgt gca att acc gat act ttt gag cca ggt 48
tct acg gta aaa cct ttc gtt gtt tta acc gca ctt caa cga ggt gta 96
gtt aaa cga gat gaa att att gat act acg tcc ttt aaa tta agc ggt 144
aaa gaa att gtg gac gtt gca cca cgt gct cag caa act tta gac gag 192
att tta atg aac tct agt aac cgt ggt gta agt cgt ctt gca tta cgt 240
atg cca cct agt gca tta atg gaa act tat caa aat gca ggt tta agt 288
aaa ccg aca gat tta ggc ttg atc gga gag caa gtt ggg att ttg aat 336
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gat att gtg gga att tta gag aaa gta gca att aaa aat aaa cgc gca 576
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att gaa aat gga cat tat gta aat aag tat gtg gca ttt act gcg ggt 672
att gca cca att agt gat 690

<210> 2
<211> 1170
<212> DNA
<213>Haemophilus influenzae

<400> 2
aat caa aac caa att att gct gat tat aat ggc tca acc ttt atg ctt 48
tct gca agc aca caa aaa gtt ttt aca gcc gtt gcc gct aaa ctt gca 96
tta gac gat caa ttc caa ttt gag acc gca ctt ttg agt aat ggg aaa 144
att caa aat ggg aat tta gat ggc aac tta atc gtg cgt ttc aca ggc 192
gat cct gat ctc aca aga ggt cag ctt tat agc tta ctt gcc gaa tta 240
aaa aaa caa ggc atc aaa aaa att aat ggc gat tta gta tta gat acc 288
tct gtt ttt tct agt cac gac cga gga tta ggt tgg att tgg aac gat 336
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aac tgt ttt tat gcg gaa cta gat gcg aat aaa aat cca ggt gaa ata 432
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ttc aat ggc aaa gtc ttg tta ccc caa aaa cca caa caa ggt cag cta 720
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aaa acg atg cta tcc gtt tta gaa tac atc gcc aaa aac gaa gat aaa 1008
cta cat tta atg gaa act ttc ccc atc gca ggt gta gat ggc acg atc 1056
agt ggg cga ggt gga tta att agc ccg cca tta gtg aaa aac gtg att 1104
gct aaa act ggt tct ttg aaa ggc gtt tat aac cta gct ggc ttt atg 1152
aca aat gcg cga ggg gaa 1170

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<211> 690
<212> DNA
<213>Haemophilus influenzae

<400> 3
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tct acg gta aaa cct ttc gtt gtt tta acc gca ctt caa cga ggt gta 96
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aaa gaa att gtg gac gtt gca cca cgt gct cag caa act tta gac gag 192
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<212> DNA
<213>Haemophilus influenzae

<400> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
<213>Haemophilus influenzae

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<212> DNA
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<213>Artificial Sequence

<220>
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<210> 11
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<212> DNA
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<220>
<221> STS
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<223> Synthetic DNA

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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213>Artificial Sequence

<220>
<221> STS
<222> 1..19
<223> Synthetic DNA

<400> 15
ctcggaataa tgaatcggc 19

<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213>Artficial Sequence

<220>
<221> STS
<222> 1..23
<223> Synthetic DNA

<400> 16
taagagaatt atgcagtgct gcc 23

<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213>Artficial Sequence

<220>
<221> STS
<222> 1..21
<223> Synthetic DNA

<400> 17

0051

図1第1図は、PBP3蛋白質をコードするftsI遺伝子上のトランスぺプチダーゼ活性領域の一部を示すDNA塩基配列である。Rd株は感受性株、T196株はアンピシリン感受性株、KK-1株、587株及びT066株はBLNARである。下線で示した個所は1対のプライマーの塩基配列に相当する。これら株のDNAで、同一の塩基は横棒で示し、異なる塩基は一文字表記で示している。
図2第2図は、PBP4蛋白質をコードするdacB遺伝子上のトランスぺプチダーゼ活性領域の一部を示すDNA塩基配列である。Rd株は感受性株、T196株はアンピシリン感受性株、KK-1株、T040株はBLNARである。下線で示した個所は1対のプライマーの塩基配列に相当する。これら株のDNAで、同一の塩基は横棒で示し、異なる塩基は一文字表記で示している。
図3第3図は、本発明の実施例2におけるPCR法で増幅されたDNA断片を実施例3における電気泳動を行い、その結果を撮影した写真を基に模式的に示した図である。
図4第4図は、本発明の実施例4における臨床分離インフルエンザ菌の最小発育阻止濃度(MIC)を示す図である。

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