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図面 (1)

課題

抗原タンパク質凝集を生じることがなく、しかも人体に安全な百日咳生理活性物質類の不活性剤を用いた百日咳ワクチンを提供する。

解決手段

HA、PT及び69kを9:2:1の割合で混合して百日咳菌生理活性物質混合液を調製し、これに不活性剤としてカテキンO.2mM添加し、37℃、1時間反応させ、この反応液PBS緩衝液(pH7.4)に対して4℃で2日間透析して未反応の茶カテキン類分離除去し、次いでアジュバンドとしてAl(0H)3ゲル及びAlPO4 ゲルを添加して4℃で1晩放置して百日咳ワクチンを得る。カテキン類は、従来汎用されてきた「ホルマリン」の1/1000以下の低濃度で同様の百日咳生理活性物質類不活性化効果を奏し、しかも抗原タンパク質の変性によるワクチン力価の低下、沈澱形成、変色等の問題もない。

概要

背景

概要

抗原タンパク質凝集を生じることがなく、しかも人体に安全な百日咳生理活性物質類の不活性剤を用いた百日咳ワクチンを提供する。

HA、PT及び69kを9:2:1の割合で混合して百日咳菌生理活性物質混合液を調製し、これに不活性剤としてカテキンO.2mM添加し、37℃、1時間反応させ、この反応液PBS緩衝液(pH7.4)に対して4℃で2日間透析して未反応の茶カテキン類分離除去し、次いでアジュバンドとしてAl(0H)3ゲル及びAlPO4 ゲルを添加して4℃で1晩放置して百日咳ワクチンを得る。カテキン類は、従来汎用されてきた「ホルマリン」の1/1000以下の低濃度で同様の百日咳生理活性物質類不活性化効果を奏し、しかも抗原タンパク質の変性によるワクチン力価の低下、沈澱形成、変色等の問題もない。

目的

効果

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請求項1

請求項2

上記カテキン類は、茶生葉緑茶、烏龍又は紅茶を、水、熱水、各種アルコール類或いは酢酸エチルで抽出して得られた抽出物を分離精製して得られるカテキンであることを特徴とする請求項1に記載の百日咳ワクチン。

技術分野

0001

本発明は、百日咳菌(Bordetella pertussis )の感染により発症する急性呼吸器伝染病としての百日咳ワクチンに関する。

0002

百日咳ワクチンに関しては、従来我が国では百日咳菌に由来感染防御抗原生物活性物質、或いは菌体成分などを主成分とする百日咳生理活性物質類を「不活性化剤」で不活性化無毒化)して得られた百日咳トキソイドを有効成分として含有した百日咳ワクチンが各種認可され、既に市販されている。これら百日咳ワクチンの製造については、例えば特公昭57−5203号、特公平1−928号、特公平1−931号、特開昭62−5922号、特開昭64−349125号等に開示されている。

0003

ところで、百日咳ワクチン製造の際の「不活性剤」としては、従来から「ホルマリン」が汎用されてきたが、このホルマリンによる不活性化には抗原タンパク質凝集が起こりやすくワクチンの安定性に関して不十分であるという問題があった。

0004

この点に関しては、ホルマリンに代わる「不活性剤」として、例えば特開昭62−5922号においてカルボジイミドが開示されていたが、かかるカルボジイミドの安全性を疑問視する指摘もあった。

0005

そこで、本発明は、ホルマリンに代わる百日咳生理活性物質類の不活性剤であって、不活性化の際に抗原タンパク質の凝集を生じることがなく、しかも人体に対して安全であるものを見出し、かかる不活性剤を用いて安全かつ安定した百日咳ワクチンを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0006

かかる目的達成するために、本発明者らが鋭意研究を行なった結果、カテキン類、特に茶類を抽出して得られる茶カテキン類に百日咳生理活性物質類に対する優れた不活性作用発見し、かかる知見に基づいて本発明を想到するに至ったものである。

0007

すなわち、本発明の百日咳ワクチンは、百日咳生理活性物質類の不活性剤として「カテキン類」特に茶カテキン類を含有するものである。カテキン類は、従来汎用されてきた「ホルマリン」の不活性効果と比較して、1/1000以下の低濃度で百日咳生理活性物質類を有効に不活性化(無毒化)することができ、しかも、従来の製造方法で問題となっていた抗原タンパク質の変性によるワクチン力価の低下、沈澱形成、変色等を防ぐことができ、更にはワクチン製造にあたり百日咳毒素類毒素化を有効に進めることもできる。したがって、本発明よれば、高い抗原性を持ちしかも安定な百日咳ワクチンを提供することができる。

0008

ここで、本発明における「百日咳生理活性物質類」とは、百日咳菌に由来の感染防御抗原、生物活性物質、菌体成分などを包含する意であり、例えば繊維状赤血球凝集素(以下「FHA」という。),百日咳毒素(以下「PT」という。)、69kDa外膜タンパク質(以下「69k」という。)、易熱性毒素間又は皮膚破壊毒素易熱性凝集原内毒素又はリボ多糖類ヒスタミン増感因子白血球又はリンパ球多因子アジュバンド活性因子アデニル酸サイクラーゼ、インスリン分泌活性増強因子などのいずれか、或いはこれらの2種類以上を混合してなるものである。本発明においては、特にFHA及びPTを含有する混合物、中でもFHA、PT及び69kからなる混合物をワクチンの主要成分とするのが好ましい。

0009

本発明における「カテキン類」とは、ツバキ科に由来する生葉茶生葉)、これを処理して得られる緑茶、烏龍茶又は紅茶を、水、熱水、各種アルコール類或いは酢酸エチルで抽出して得られた抽出物を分離精製して得られるカテキン類、すなわち (-)エピカテキン(EC)、(-) エピカテキン・ガレート(ECg)、 (-)エピガロカテキン(EGC)、(-) エピガロカテキン・ガレート(EGCg)のいずれか、或いはこれらの2種類以上の混合物を包含する意である。なお、茶カテキン、EC、ECg、EGC、EGCgの分離精製手段は公知の各種方法によればよく、例えば茶乾燥葉、緑茶、烏龍茶又は紅茶を、熱水、温水又は冷水で抽出し(茶:水=1:50、5〜60minmin)、得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分離する。すなわち、セファデクLH20樹脂を詰めたカラムに前記抽出物を載せて水洗した後、0〜65%濃度のエタノール水溶液にて樹脂吸着部を溶出し、0〜30%エタノール溶出分画と35〜65%エタノール溶出分画を得る。そして、そのうちの35〜65%エタノール溶出分画部を更にHPLC(カラム;YMC−Pack A312(ODS)、移動層;0.05%リン酸(88V )+アセトニトリル(10V )+酢酸エチル(2V )、波長;280nm、流速;1ml/min)により、EC、ECg、EGC及びEGCgを分離精製すればよい。

0010

本発明における「カテキン類の濃度」は、0.01mM〜10mM、特に0.05mM〜0.5mMとなるように調整するのが好ましい。

0011

カテキン類は、百日咳生理活性物質類中の生体高分子と結合してかかる生理活性物質を変性させてこれらの活性を有効に失活させていると考えることができる。また、カテキン類は、上述のように古来より日常的に飲用されてきたお茶から抽出される成分であるため、その安全性についても保証されている。

0012

百日咳ワクチンの製造方法としては、上述の百日咳生理活性物質類若しくは百日咳生理活性物質類混合溶液にカテキン類を添加混合して不活性化反応させ、この反応溶液透析などによって不活性剤としてのカテキン類を除去して百日咳トキソイドを得、かかる百日咳トキソイドにアジュバンドを添加混合して当該アジュバンドに百日咳トキソイドを吸着させることにより百日咳ワクチンを製造することができる。得られた百日咳ワクチンは、アンプルバイアル瓶などに分注し、必要に応じて乾燥凍結した後、密封するなどすればよい。

0013

アジュバンドとしては、水酸化アルミニウム(Al(0H)3 )ゲルのほか、リン酸アルミニウムゲルリン酸カルシウムゲル等の抗原徐放性沈降性アジュバンド、ムラミルペプチド誘導体ポリヌクレオチド等の抗体産生誘起性アジュバンドを使用することができる。

0014

なお、上記の製造方法の過程において、百日咳トキソイドに公知の安定化剤を添加することにより百日咳ワクチンをより一層安定化させることができる。

発明を実施するための最良の形態

0015

次に、本発明の好適な実施例としてのワクチン製造方法の一例を説明する。

0016

(百日咳ワクチン製造例)FHA、PT及び69kを、FHA:PT:69k=9:2:1であって蛋白質濃度250μg/mlとなるように混合して百日咳菌生理活性物質混合液を調製する。次いで、この百日咳菌生理活性物質混合液にカテキンO.2mM添加し、37℃、1時間反応させ、この反応液PBS緩衝液(pH7.4)に対して4℃で2日間透析して未反応の茶カテキン類を分離除去する。そして、これにアジュバンドとしてAl(0H)3ゲル及びAlPO4 ゲルをそれぞれ最終濃度90μg/mlとなるように添加して4℃で1晩放置後、タンパク質濃度150μ/mlに調整すれば百日咳ワクチンを得ることができる。

0017

(百日咳毒素不活化検討試験)百日咳菌(B.pertussis東株I相菌)を2.8%カザミノ酸加 Stainer- Sholte培地で36℃、5日間静置培養した。培養後、遠心して培養上清を得、この上清AF-heparin Toyopearl 650Mカラム(25X27mm) に載せてFHAを吸着させ、このカラムをリン酸緩衝食塩液(PBS)で洗浄後、0.5MNaCl加10mMリン酸緩衝液(pH7.2)を流して「FHA」を溶出した。

0018

他方、上記AF-heparin Toyopearl 650Mカラムを通過した画分をpH6.0に調整し、これをAffi-Gel Blue樹脂に加えて4℃、48時間放置した。このAffi-Gel Blue 樹脂をカラムに詰め、0.25Mのリン酸緩衝液(pH6.0)と0.05MのTris-塩酸緩衝液;pH7.2(bufferA)で洗浄し、0.75MのMgCl2 加bufferAを流して溶出させ、得られた溶出画分を0.5Mの食塩加bufferAに対して透析し、これをFetuin-conjugated Toyoperl 650M カラム(25X50mm) に流した後、このカラムを0.5MのNaCl加bufferA、1MのNaCl加bufferA、1MのNaCl及び2Mのurea加bufferA、0.5MのNaCl加bufferAの順で洗浄し、0.5MのNaCl加50mM diethanol-amineを流して「PT」を溶出した。

0019

上記のようにして得られた「FHA」又は「PT」に各種カテキン(0.2mM)又はホルマリン(200mM)を添加し、37℃、1時間反応させてFHA活性及びPT活性を測定した。なお、各種のカテキンとしては、緑茶茶葉から分離精製した純度95%以上のエピカテキン(EC)、エピカテキン・ガレート(ECg)、エピガロカテキン(EGC)、エピガロカテキン・ガレート(EGCg)を用いた。FHA活性は、ニワトリ赤血球凝集法にて測定し、赤血球凝集が観察される最大希釈倍率でその活性を表示し、また、PT活性は、CHO(Chinese hanmsterovary)細胞の凝集程度(clustering)の有無を判定し、全ての細胞のclusteringが観察された最大希釈倍率でその活性を表示し、これら各種カテキン及びホルマリンの百日咳毒素不活性度を下記表1に示した。

0020

0021

この結果、エピカテキン以外のカテキンは、従来から不活性剤として汎用されてきたホルマリンの約1/1000の濃度でFHA及びPTを効果的に不活性化することが明らかになった。

0022

(PTからの中和抗体誘導)PT溶液(30 μg/ml) に(-)エピガロカテキン(EGC)を最終濃度0.1mMとなるように添加し、37℃、1時間反応させた後、リン酸緩衝食塩水(PBS)に対して透析した。他方、PT溶液(250μg/ml) に最終濃度200mMとなるようホルマリンを添加し、37℃、1時間反応後、0.5MNaCl加0.1MのTris-塩酸緩衝液(pH8.0)に対して透析した。こうして得られたPT不活性化抗原(トキソイド)15μg/mouse をマウス(dd-Y, ♂、35週令)に、1週間間隔にて計3回免疫し、最終免疫日から1週間後に採血血清を得た。

0023

次に、各血清中のPT中和抗体価CHO細胞を細胞凝固法で測定した。先ず、Ham's F-123培地を希釈液としてサンプルカップ(200μl/tube) にPT標品(200CU/ml)を200μlずつ加えて37℃、1時間静置した。このサンプルカップ内の液を細胞培養用96−wellプレートの各wellに100μlずつ分注し、さらCHO細胞懸濁液を各well当たり100μlずつ加え, 培養後(5%CO2 、37℃、24時間)CHO細胞の細胞凝固の様子を検鏡し、正常増殖像の見られるwellの血清最大希釈率を中和抗体価(1CU:96−well plateのwell中のCHO細胞を100%凝固するに必要な最小抗原タンパク質質量)とし、この結果を下記表2に示した。

0024

0025

この表2より、茶カテキンは百日咳菌毒素に対して中和抗体を強く誘導し、有効で有用なワクチン製造が可能であることが明らかとなった。

0026

(カテキン不活性化百日咳ワクチンの効果)ワクチン製造法に準じて、各種カテキン、ホルマリンで不活性化した抗原(ワクチン)を調製し、このワクチン類のPBS希釈液をマウス(dd-Y,3.5週令、♀)の腹腔内に接種し、接種3週間後のマウスを網ゲージに入れて噴霧感染箱に吊るし、百日咳菌懸濁液のエアゾールを箱内に噴霧導入して噴霧感染処理を行った。噴霧感染処理2週間後、脱臼致死させたマウスの摘出し、その摩砕物の希釈液をBordet-Gengou培地に塗布して、36℃、4日培養後の、コロニー数から肺内生菌数調査し、この結果を図1に示した。

0027

カテキン不活性化ワクチンは、図1に示すように、ホルマリン不活性化ワクチンと同等か、それ以上の強い百日咳感染防御活性を示した。

発明の効果

0028

上述の試験結果より、茶カテキンは極めて優れた百日咳毒素不活化を示し、更にこれを含有してなる百日咳ワクチンは、従来の方法で調整されたワクチンよりも優れた感染防御効果を発揮することが確かめられた。これより、本発明のワクチンは、従来の方法で造られたワクチンと比較しても優れた百日咳免疫効果を示し、新しいワクチンとして極めて有用である。

図面の簡単な説明

0029

図1各種カテキン、ホルマリンで不活性化した各種抗原(ワクチン)の百日咳ワクチンの免疫効果を示したグラフである。

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