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図面 (2)

課題

マンガン酸化能を有する新規微生物を提供すること

解決手段

マンガン酸化能を有するセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1又はマンガン酸化能を有するシュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3。

概要

背景

概要

マンガン酸化能を有する新規微生物を提供すること

マンガン酸化能を有するセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1又はマンガン酸化能を有するシュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3。

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請求項1

マンガン酸化能を有するセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1又はマンガン酸化能を有するシュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3。

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0001

本発明は、マンガン酸化能力を有する新規微生物、セデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1、及びセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1、アエロモナス属Aeromonas)GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2、シュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3のいずれかの1種若しくは2種以上と藻類とからなる微生物共生体、この共生体をKester人工海水希釈水溶液を用いて培養する方法、及びこの共生体を用いてマンガン含有水からマンガンを除去する方法及び該マンガンを利用する方法に関するものである。

0002

従来、水中から重金属とくにマンガンを除去する方法としては、種々の方法が知られているが、化学的処理ではマンガンイオンを含む水をpH10以上の強アルカリ性にすることで二酸化マンガン沈澱を作って水系から分離除去した後にその水を中和してから排出しており、また、微生物による除去方法栄養源となる多量の有機物を添加する必要があるだけでなく、通常はマンガン除去能力を示す微生物だけを分離純化して利用することが多く、それら微生物を継代培養して保存している間にマンガン除去能力を失うこともあるなど、いずれも除去性能コスト的に未だ満足し得るものはなく、安価で効率の良くマンガンを除去するマンガンを含む水の処理方法の開発が望まれている。

0003

本発明は、効率良く重金属とくにマンガンを除去する能力を有する新規な微生物とその微生物共生体が存在することを発見し、新規な微生物、微生物共生体、微生物共生体の培養方法、マンガン含有水からマンガンを除去する方法および回収したマンガンを再利用する方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0004

本発明者らは、特殊な微生物共生体が水中において、重金属とくにマンガンを、固体状のものではそれを捕獲し、溶解しているものではそれを酸化して沈殿させる作用を有していることを見出し、本発明を完成した。

0005

即ち、本発明は、マンガン酸化能を有するセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1またはマンガン酸化能を有するシュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3である。本発明には、次の発明も記載している。
(1)マンガン酸化細菌と藻類とが共生した微生物共生体。
(2) 藻類がオシラトリア(Ocillatoria)などの藍藻シアノバクテリア)、ナビキュラ(Navicula) などの珪藻ウロトリックス(Ulothrix)などの緑藻のいずれかの1種もしくは2種以上である上記(1)の微生物共生体。
(3) マンガン酸化細菌がセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1、アエロモナス属(Aeromonas)GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2、シュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3のいずれかの1種若しくは2種以上である微生物もしくは上記(1)又は(2)記載の微生物共生体。

0006

(4)人工海水(Kester)の希釈水溶液に有機栄養源を加えて培養するマンガン酸化細菌の培養方法。
(5)マンガン鉱汚泥を人工海水(Kester)の希釈水溶液を用いて、有機物を含有させることなく、培養する上記(1)又は(2)記載の微生物共生体の培養方法。

0007

(6)人工海水(Kester)の希釈水溶液の倍率が0.5〜20である上記(4)又は(5)記載の培養方法。
(7) pH5〜8の条件で、太陽光のみで育成する上記(6)記載の微生物の培養方法。
(8)マンガン酸化細菌を、マンガンを含有する水と接触させることにより、マンガンを酸化沈殿させ、水中のマンガンを除去することを特徴とする水処理方法

0008

(9)マンガン酸化細菌と藻類とが共生した微生物共生体を、マンガンを含有する水と接触させることにより、マンガンを酸化沈殿させ、水中のマンガンを除去することを特徴とする水処理方法。
(10) マンガン酸化細菌がセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1、アエロモナス属(Aeromonas)GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2、シュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3のいずれかの1種若しくは2種以上である上記(8)又は(9)の水処理方法。
(11) 上記(9)又は(10)で回収されたマンガンを乾電池釉薬等の製造原料として利用することを特徴とする回収マンガンの利用法

発明を実施するための最良の形態

0009

本発明の微生物共生体の入手源は、自然界においてマンガンイオンが溶解している水中とその周辺のマンガン沈澱物からであり、好ましくは有機物が少なく適度な光照射のある場所である。マンガン酸化能力を有する新規微生物、セデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1、アエロモナス属(Aeromonas)GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2又はシュワネラ属(Shewanella)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3の1種若しくは2種以上を含む微生物と藻類とからなる微生物共生体は、大量培養することができる。上記藻類としては、オシアトリア(Ocillatoria)などの藍藻(シアノバクテリア)、ナビキュラ(Navicula) などの珪藻、ウルトリックス(Ulothrix)などの緑藻が挙げられる。そして、上記培養条件は、酸性から弱アルカリ性、好ましくはpH5〜8で、かつ、有機物を含有しない水を用いて、太陽光のみで培養を行うことが望ましい。したがって、有機物を栄養源として特に人工的に添加する必要もないので、非常に簡単な方法でかつ安価に培養物を得ることができる。

0010

以下に、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
(1)微生物の入手場所
自然界から微生物を入手した。

0011

(2)微生物の採取方法
オシラトリア(Ocillatoria)などの藍藻(シアノバクテリア)、ナビキュラ(Navicula) などの珪藻、ウロトリックス(Ulothrix)などの緑藻をはじめとする微細な藻類などの微生物から構成される繁茂体,二酸化マンガンなどの沈澱物、あるいはその両者より構成される集合体、などの試料から菌を入手するが、標準的には藻類の表面から3mmまでのものを1ml採取し9mlの水に加えて全体を10mlとして用いた。なお、この微生物は、以下に示す実験より3種類の微生物からなることが判明したが、この混合微生物をGSJ−MITA−ASHORO−MN−MAT−1と名付けて、工業技術院生命工学工業研究所技術研究所への寄託を試みたが凍結処理による保存ができないため、受託拒否された。

0012

(3)マンガン酸化細菌の育成、選別、単離
温泉組成に近い塩類濃度の人工無機塩類水溶液として、Kester人工海水(KSW:Kester et. al., 1967)の20%水溶液を調製した。前述の入手試料を人工無機塩類水溶液によって段階希釈した懸濁水を、1/2 TZ-Mn培地(Maruyama et al., 1993)中のKSW濃度を20%に改良したYF1-Mn培地(Mita et al., 1994)で調製した寒天平板培地に塗布し、20℃あるいは37℃で培養して育成した。出現したコロニーの中からTMBZ・HCl水溶液を青色に呈色させる能力を有するコロニーだけを選別し、これらの中から形状の異なるコロニーをそれぞれ分離し、菌株を単離した。ここでは,菌の名称を便宜上、Mn-24(A)をGSJ/MITA24A/ASHO−RO/1菌株,Mn-24(B)をGSJ/MITA24B/ASHO−RO/2菌株、Mn-24(C)をGSJ/MITA24C/ASHO−RO/3菌株と称する。

0013

(4)マンガン酸化細菌の菌株の同定方法
菌株の同定は、(財)日本食品分析センター委託した。菌株について形態観察生理的性試験キノン系および菌体内DNAのGC含量の測定を行ない、Kriegand Holt (1984), Holt et al. (1994), MacDonell and Colwell (1985), Lee et al. (1977), Nozue et al. (1992)を参考にして同定した。
(5)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1菌株の菌学的性質と同定
菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。この菌株は腸内細菌科の Cedecea davisae に近い性状を示したが、Cedecea 属の特徴であるリパーゼを有さないが、オキシダーゼ陰性通性嫌気性グラム陰性桿菌であることから、Cedecea属 に最も近似していた。そこで、この新規な微生物をセデセア属(Cedecea)GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1と命名して、平成10年11月25日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1として寄託した。寄託番号は FERM P−17064である。

0014

GSJ/MITA24A/ASHO−RO/1菌株の菌学的性質
試験項目) (試験結果)
形 態
グラム染色性
胞 子 −
運 動 性 +
鞭 毛 周 毛
酸素に対する態度通性嫌気性
オキシダーゼ−
カタラーゼ
OF F
集落の色調 NP(注1)
乳糖からのガスの生成 +(slow)
インドールの生成 −
メチルレッド試験
V P 反応 +
クエン酸塩の利用(シモンズ) +
硫化水素の生成 −
尿素の分解 −
フェニルアラニンデアミナーゼ
リジンデカルボキシダーゼ +(slow)
アルギニンジヒドロラーゼ
オルニチンデカルボキシラーゼ
ゼラチン液化
マロン酸塩の利用 +
グルコースからの酸の生成 +
グルコースからのガスの生成 −
酸の生成
セロビオース
グリセリン
マルトース
D−マンノース
L−ラムノース
サリシン
トレハロース
D−キシロース
エスクリン加水分解
硝酸塩還元
DNAの分解 −
リパーゼ−
ONPG
菌体内DNAのGC含量(モル%) 54
キノン系 Q-8
(注1)特徴的集落色素を生成せず

0015

(6)GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2菌株の菌学的性質と同定
菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。この菌株は、オキシダーゼが陰性で鞭毛が極単毛であったが、運動性を有する通性嫌気性グラム陰性桿菌であることや、菌体内DNA のCG含量やキノン系からみるとAeromonas 属に最も近似していた。そこで、この新規微生物をアエロモナス属(Aeromonas)GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2と命名したが、この菌は、活力が弱いので通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託できなかった。

0016

GSJ/MITA24B/ASHO−RO/2菌株の菌学的性質
(試験項目) (試験結果)
形 態桿菌
グラム染色性−
胞 子 −
運 動 性 +
鞭 毛 極単毛
酸素に対する態度通性嫌気性
オキシダーゼ−
カタラーゼ−
OF F
集落の色調 NP(注1)
菌体内DNAのGC含量(モル%) 56
キノン系 Q-8, MK-8,DMK-8
(注1)特徴的集落色素を生成せず

0017

GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3菌株の菌学的性質と同定
菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。菌株は Shewanella putrefaciens である。 Shewanella は極鞭毛で、キノン系にメチルメナキノン(MMK)を有するグラム陰性桿菌であり、主に水生生物海洋生物から分離されている。なお、 Shewanella putrefaciens は MacDonell and Colwell (1985)によってAlteromonas 属から移行された菌である。

0018

この新規微生物をシュワネラプトレファシエンス(Shewanellaputrefaciens)GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3と命名し、平成11年2月17日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にGSJ/MITA24C/ASHO−RO/3として寄託した。寄託番号は、FERM P−17220である。

0019

GSJ/MITA24C/ASHO−RO/3菌株の菌学的性質
(試験項目) (試験結果)
形 態桿菌
グラム染色性−
胞 子 −
運 動 性 +
鞭 毛 極単毛
酸素に対する態度好気性
オキシダーゼ+
カタラーゼ+
OF O
集落の色調色系
Na+要求性
塩類要求性
0%NaCl培地での生育 +
1%NaCl培地での生育 +
海水培地での生育 +
DNAの分解 +
アルギニンジヒドロラーゼ−
オルニチンデカルボキシラーゼ+
リジンデカルボキシラーゼ
硫化水素の生成 +
溶血性血液) +
6%NaCl存在下での生育 +
4℃での生育 +
37℃での生育 +
42℃での生育 −
SA寒天培地での生育 −
酸の生成
D−リボース
マルトース+
L−アラビノース
資化性
イソロイシン
コハク酸塩
グリセリン−
グルコース+
グルコサミン
菌体内のDNAのGC含量(モル%) 48
キノン系 Q-8,Q-7,MMK-7, MK-7

0020

〔実施例2〕
イ.微生物共生体の採取とスクリーニング
(1)Kester人工海水を5倍希釈した溶液硫酸マンガンを添加して、マンガン(II)濃度を2〜3ppm程度にした溶液を孔径0. 2μmの滅菌済みフィルター無菌濾過した濾液(А液)を調製する。

0021

(2)緑色ないし深緑色、または褐色ないし黒色微生物マットを滅菌済みの袋や瓶などに採取し、А液が入っている滅菌済み試験管キャップ付)に全液量の約10%となる微生物マットを入れ、試験管ミキサーなどで良く混合する。すばやくこの液を2分し、滅菌済み試験管(キャップ付10ml)に分液する。この微生物マットに蛍光試薬のDAPIを添加して蛍光顕微鏡で観察し、シアノバクテリヤと細菌の存在を確認する。

0022

(3)2分した試験管の一方はオートクレーブにより、121℃、2気圧で15分間の滅菌処理を行い、それを滅菌済み試料懸濁液と称する。他方のなにも処理しない試験管を、未処理(生)の試料懸濁液と称する。
(4)それぞれ25mlのА液を入れた3本の滅菌済み試験管(キャップ付、50ml)を用意し、なにも加えていない試験管1、滅菌済みの試料懸濁液2mlを添加した試験管2、未処理(生)の試料懸濁液2mlを添加した試験管3を作成する。

0023

(5)これら3本の試験管は、それぞれ良く攪拌した後、自然光照射下、37℃で4日間、静置培養する。
(6)各液を孔径0. 2μmのフィルター(滅菌の必要はない)で濾過して、試験管に約0. 5mlを分取する。
(7)これらにそれぞれ、フォルムアルドキシム溶液0. 5ml、pH10緩衝液0. 5mlを加え、混合した後に約10分間放置する。
(8)試験管1からの反応液暗赤色に呈色する。試験管2からの反応液の呈色より試験管3からの反応液の呈色の方が顕著に弱ければ、目的の活性を有する(陽性)と判断されるので採用する。しかし、前記2と3の呈色にほとんど差がなければ活性がほとんどない(陰性)と判断して採用しない。
(9)この選別で採用された培養物は、マンガン除去に有効である。

0024

ロ.微生物共生体の培養
本発明の微生物共生体の培養では、特に人工的に有機物の添加をしなくてもよく、Kester人工海水の20%水溶液にマンガン60ppmを含んだ溶液100mlに、あるいは採取地で共生体と接している試料水を滅菌した液100mlに、上記の選別方法で選別したものを1ml採取し9mlの水に加えて全体を10mlとした微生物共生体サンプルから0.2mlを加えて、自然光下あるいは人工照明下にて、37℃で静置して培養した。

0025

ハ.微生物共生体によるマンガンを含む水の処理
2. 4ppmの濃度でマンガンを含んでいる温泉水滅菌フィルターで濾過して、滅菌処理した。滅菌処理した水を以下のように調整して、A、B、Cの3つに分けてそれぞれ37℃の温度に保ち、自然光のなかで3日間放置した。

0026

Aは、滅菌処理した水になにも添加しなかったものである。Bは、(1)で育成した微生物共生体:温泉水を容積比で1:9にし、これをオートクレーブ中で121℃、2気圧で滅菌処理したものを、滅菌処理した水に対して0. 2%(容量比)添加したものである。Cは、1)で育成した微生物共生体:温泉水を容積比で1:9にしたものをそのまま生で、滅菌処理した水に対して0. 2%(容量比)添加したものである。なお、各A、B、Cの資料は均一に攪拌されたのち、静止放置された。

0027

放置した結果を図2に示す。Aは、3日の間、全く変化しなかった。Bは、2日の間に変化し、マンガンイオンは、1.8ppmにまで低下した。Cは、2日の間に大きく変化し、3日目には、 ほぼゼロにちかいところまでマンガンイオンが低下していた。

0028

〔実施例3〕微細藻類分類観察
生成中の二酸化マンガンの沈殿物を伴う未染色の微生物繁茂体をスライドガラスにとり、位相差顕微鏡或いは明視野顕微鏡で内部構造を観察し、細胞内に核を有しない原核生物である細菌及び藍藻と、核を有する真核生物である他の生物を区別する。また、同じ未染色の試料に紫外線照射してオレンジ色の蛍光を発する葉緑素自家蛍光落射蛍光顕微鏡下で観察することにより、藍藻、緑藻、珪藻等の藻類と別の微生物を区別する。さらに、蛍光試薬DAPIを添加した細胞に紫外線照射して、オレンジ色の蛍光を発する藍藻の核酸分布形と、青から白の蛍光を発する細菌の核酸の分布形とを合わせて観察する。これらの結果を組み合わせて一般の微生物図鑑から藍藻、緑藻、珪藻等の藻類の分類を観察する。本発明における微生物共生体中の藻類には、顕微鏡下での観察によってオシラトリア(Ocillatoria) などの藍藻、ナビキュラ(Navicula) などの珪藻、ウロトリックス(Ulothrix)などの緑藻などの生存が認められている。

0029

〔実施例4〕マンガン酸化細菌の菌株によるマンガンを含む水の処理
ペプトン酵母エキスなどの有機栄養を添加した人工海水溶液、あるいはその人工海水濃度を5倍程度まで希釈した溶液に、マンガン酸化細菌の菌株の1種または2種以上を接種した系を調整し、無接種の系とともに37℃或いは20℃において振とう培養する。この液の一部を分取して、660nm における吸光度(光学密度OD660)微生物量及び溶存マンガン濃度(Mn2+) を測定する。

0030

マンガンの初期濃度を60ppm として有機栄養を添加した20mlの100%人工海水溶液のpHを7.5 とし、マンガン酸化細菌の1白金耳を接種した系と、未接種(無菌)系の液を20℃で培養した結果を図1に示す。この図から、高塩濃度液体中でも二酸化マンガンの沈殿が生じ、化学的には沈殿しない水溶液から高濃度のマンガンイオンを除去することができることが判る。そして、この回収されたマンガンは、乾電池、釉薬等の製造原料として利用することができる。

発明の効果

0031

本発明の微生物、微生物共生体は、これまでに人工的に単離されたり、培養されたことはないものであり、そして、この微生物共生体を用いた重金属とくにマンガンの除去法は、マンガンを含む種々の水をpH10以上の強アルカリ性にする必要がないことから、廃水処理に適用してマンガンの除去を低コストで行うことができる。

0032

また、この処理法によりマンガンを含む廃棄物、例えば使用済み乾電池、古鉄材などから、元の資源である二酸化マンガンを再生することができる。更に、この処理法で得られる沈着した二酸化マンガンは、高品位であるため、乾電池、鉄、釉薬、ガラスなどの製造原料として有効に利用することができる。

図面の簡単な説明

0033

図1微生物の生育状態及びマンガンイオンの除去効果を示す図である。
図2本発明による水中のマンガンの除去効果を示す図である。

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