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技術 RT—PCRによるカンキツタタ—リ—フウイルス及びカンキツウイロイドの同時検出方法

出願人 農林水産省果樹試験場長
発明者 伊藤隆男家城洋之尾崎克巳
出願日 1999年10月12日 (20年9ヶ月経過) 出願番号 1999-289356
公開日 2000年7月4日 (20年1ヶ月経過) 公開番号 2000-184893
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード タンカン ペア数 検出判定 電気泳動用ゲル 植物防疫 被検植物 核酸抽出法 RNA抽出用試薬
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解決手段

本発明は、被検植物由来する核酸が、配列番号3〜18に示す8種類の核酸プライマーペアのうちの少なくとも3種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中におけるカンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種の存否を同時に決定することを含む、前記ウイルス及びウイロイドの少なくとも3種を同時に検出する方法を提供する。

効果

本発明により、カンキツタターリーフウイルス(CTLV)及びカンキツウイロイドの同時検出が可能になり、これらの病原体の検出に要する費用、労力及び時間が大幅に減少する。

概要

背景

カンキツタターリーフウイルス(CTLV)は、カラタチ台カンキツに接木部異常の症状を起こす病原体として知られている。また、カンキツウイロイドには、カラタチ台木剥皮矮化の症状を示すカンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)を始めとしてカンキツウイロイド(CVd)I、II、III、IV、V及びVIの計7つのウイロイドグループが存在する。これらのウイロイドのうち、CVdV及びVIは、本発明者らが新たに発見したものである。

これらの病原体感染診断のために、これまで幾つかの手法が開発されている。CTLV感染の診断法としては、抗血清を用いた診断が広く行われており、また、その塩基配列に基づく遺伝子診断についても報告されている(N. Yoshikawaら、Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 62, 119-124 (1996))。カンキツウイロイド感染の診断法としては、CVdV及びVI以外のものについては、各々個別の塩基配列に基づく個別の遺伝子診断についての報告がある(X. Yangら、Phytopathology, 82, 279-285 (1992)、及び谷達児、植物防疫、第51巻第4号、21-25 (1997))。さらに、CEVd、CVdII及びIIIについては、これらの混合プライマーを用いて2種のウイロイドを同時検出する診断が報告されている(M. Tessitoriら、Proc. 13th Conf.IOCV., IOCV, Riverside, 230-235 (1996))。

しかし、カンキツ樹においては、上記のような多種類の病原体が一本の樹に同時に存在することが多く、さらに一度に多数の樹木を診断することが多い。このような場合に、病原体の検出を1種類又は2種類ずつ別個に行うことは、時間、労力及びコストが多大となる。従って、上述の病原体のうちのできるだけ多くの種類を同時に検出する方法は非常に有用であるということができ、その開発が望まれているところである。

概要

本発明は、被検植物由来する核酸が、配列番号3〜18に示す8種類の核酸プライマーペアのうちの少なくとも3種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中におけるカンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種の存否を同時に決定することを含む、前記ウイルス及びウイロイドの少なくとも3種を同時に検出する方法を提供する。

本発明により、カンキツタターリーフウイルス(CTLV)及びカンキツウイロイドの同時検出が可能になり、これらの病原体の検出に要する費用、労力及び時間が大幅に減少する。

目的

本発明の目的は、上記ウイルス及びウイロイドのうちの3種以上を、遺伝子診断の手法の一つであるRT-PCRを用いて同時に検出する方法、並びに該方法に使用することのできる核酸プライマーセットを提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

(i)配列番号3の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号4の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(ii)配列番号5又は配列番号19の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号6又は配列番号20の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iii)配列番号7の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号8又は配列番号21の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iv)配列番号9の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号10の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(v)配列番号11の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号12の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vi)配列番号13の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号14の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vii)配列番号15の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号16の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び(viii)配列番号17の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号18の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種を同時検出するための核酸プライマーセット

請求項2

前記(i)〜(viii)の核酸プライマーペアの全てを含む請求項1記載の核酸プライマーセット。

請求項3

被検植物由来する核酸が、(i)配列番号3の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号4の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(ii)配列番号5又は配列番号19の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号6又は配列番号20の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iii)配列番号7の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号8又は配列番号21の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iv)配列番号9の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号10の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(v)配列番号11の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号12の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vi)配列番号13の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号14の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vii)配列番号15の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号16の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び(viii)配列番号17の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号18の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中におけるカンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種の存否を同時に決定することを含む、前記ウイルス及びウイロイドの少なくとも3種を同時に検出する方法。

請求項4

前記(i)〜(viii)の核酸プライマーペアの全てを用いて、カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIを同時に検出する請求項3記載の方法。

請求項5

被検植物に由来する核酸が、被検植物中に存在するRNAのcDNAである請求項3記載の方法。

請求項6

(i)配列番号3の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号4の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(ii)配列番号5又は配列番号19の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号6又は配列番号20の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iii)配列番号7の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号8又は配列番号21の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iv)配列番号9の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号10の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(v)配列番号11の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号12の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vi)配列番号13の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号14の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vii)配列番号15の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号16の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び(viii)配列番号17の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号18の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種の同時検出用キット

請求項7

前記(i)〜(viii)の核酸プライマーペアの全てを含む請求項6記載のキット

技術分野

0001

本発明は、植物ウイルス又はウイロイド検出方法に関し、より詳細には、カンキツ感染性を有するカンキツタターリーフウイルス(CTLV)及びカンキツウイロイドをRT-PCRにより同時検出するための特異的なプライマーに関する。

背景技術

0002

カンキツタターリーフウイルス(CTLV)は、カラタチ台カンキツに接木部異常の症状を起こす病原体として知られている。また、カンキツウイロイドには、カラタチ台木剥皮矮化の症状を示すカンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)を始めとしてカンキツウイロイド(CVd)I、II、III、IV、V及びVIの計7つのウイロイドグループが存在する。これらのウイロイドのうち、CVdV及びVIは、本発明者らが新たに発見したものである。

0003

これらの病原体感染診断のために、これまで幾つかの手法が開発されている。CTLV感染の診断法としては、抗血清を用いた診断が広く行われており、また、その塩基配列に基づく遺伝子診断についても報告されている(N. Yoshikawaら、Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 62, 119-124 (1996))。カンキツウイロイド感染の診断法としては、CVdV及びVI以外のものについては、各々個別の塩基配列に基づく個別の遺伝子診断についての報告がある(X. Yangら、Phytopathology, 82, 279-285 (1992)、及び谷達児、植物防疫、第51巻第4号、21-25 (1997))。さらに、CEVd、CVdII及びIIIについては、これらの混合プライマーを用いて2種のウイロイドを同時検出する診断が報告されている(M. Tessitoriら、Proc. 13th Conf.IOCV., IOCV, Riverside, 230-235 (1996))。

0004

しかし、カンキツ樹においては、上記のような多種類の病原体が一本の樹に同時に存在することが多く、さらに一度に多数の樹木を診断することが多い。このような場合に、病原体の検出を1種類又は2種類ずつ別個に行うことは、時間、労力及びコストが多大となる。従って、上述の病原体のうちのできるだけ多くの種類を同時に検出する方法は非常に有用であるということができ、その開発が望まれているところである。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明の目的は、上記ウイルス及びウイロイドのうちの3種以上を、遺伝子診断の手法の一つであるRT-PCRを用いて同時に検出する方法、並びに該方法に使用することのできる核酸プライマーセットを提供することにある。

課題を解決するための手段

0006

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、カンキツ樹から分離したRNAを鋳型として使用し、CTLV、CEVd並びにCVdI、II、III、IV、V及びVIの遺伝子RNAに特異的な核酸プライマーペア数種類を含む核酸プライマーセットを用いるRT-PCRを行うことによって、前記ウイルス及びウイロイドの3種以上を同時に検出判定することに成功し、本発明を完成するに至った。

0007

すなわち、本発明は、(i)配列番号3の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号4の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(ii)配列番号5又は配列番号19の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号6又は配列番号20の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iii)配列番号7の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号8又は配列番号21の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iv)配列番号9の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号10の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(v)配列番号11の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号12の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vi)配列番号13の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号14の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vii)配列番号15の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号16の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び(viii)配列番号17の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号18の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種を同時検出するための核酸プライマーセットを提供する。前記核酸プライマーセットは、好ましくは前記(i)〜(viii)の核酸プライマーペアの全てを含む。

0008

さらに、本発明は、被検植物由来する核酸が、(i)配列番号3の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号4の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(ii)配列番号5又は配列番号19の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号6又は配列番号20の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iii)配列番号7の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号8又は配列番号21の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iv)配列番号9の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号10の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(v)配列番号11の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号12の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vi)配列番号13の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号14の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vii)配列番号15の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号16の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び(viii)配列番号17の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号18の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを用いる増幅処理により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中におけるカンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種の存否を同時に決定することを含む、前記ウイルス及びウイロイドの少なくとも3種を同時に検出する方法を提供する。前記方法では、好ましくは前記(i)〜(viii)の核酸プライマーペアの全てを用いて、カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIを同時に検出する。前記被検植物に由来する核酸は、好ましくは被検植物中に存在するRNAのcDNAである。

0009

さらに、本発明は、(i)配列番号3の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号4の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(ii)配列番号5又は配列番号19の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号6又は配列番号20の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iii)配列番号7の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号8又は配列番号21の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(iv)配列番号9の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号10の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(v)配列番号11の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号12の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vi)配列番号13の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号14の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、(vii)配列番号15の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号16の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペア、及び(viii)配列番号17の塩基配列を含む核酸プライマーと配列番号18の塩基配列を含む核酸プライマーとの核酸プライマーペアからなる群より選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを含む、カンキツタターリーフウイルス、カンキツエクソコーティスウイロイド並びにカンキツウイロイドI、II、III、IV、V及びVIの少なくとも3種の同時検出用キットを提供する。前記キットは、好ましくは前記(i)〜(viii)の核酸プライマーペアの全てを含む。

発明を実施するための最良の形態

0010

以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明の方法
本発明の方法では、カンキツタターリーフウイルス(CTLV)、カンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)並びにカンキツウイロイド(CVd)I、II、III、IV、V及びVIのそれぞれに特異的な核酸プライマーペアを用いて、被検植物から、前記ウイルス及びウイロイドの少なくとも3種を同時に検出する。被検植物は特に制限されるものではなく、いずれの種類の植物でもよいが、好ましくはカンキツ樹である。「カンキツ」とは、一般的にミカン科ミカン亜科(RutaceaeLignosae)に属する植物を意味し、例としては、ウンシュウミカン、オレンジ、カラタチ等が挙げられる。

0011

上記のウイルス及びウイロイドのそれぞれに特異的な核酸プライマーペアは、それぞれのゲノムの塩基配列に基づいて設計することができる。CTLV、CEVd、並びにCVdI、II、III及びIVのゲノムの塩基配列としては、例えば、既に報告されているものを挙げることができ、それらの塩基配列は下記表1に示すアクセス番号GenBank登録されている。複数の配列が登録されている場合には、それらの配列の間で変異の見られない領域に基づいて、核酸プライマーペアを設計することが好ましい。

0012

0013

CVdV及びVIの塩基配列としては、例えば、本発明者らが配列決定したものが挙げられ、その塩基配列はそれぞれ配列番号1及び2に示されるが、これらに制限されるものではない。 上記核酸プライマーペアの設計は、使用する検出法の特徴を考慮して行う。例えば、最終的に電気泳動法によって検出する場合には、同時に検出するウイルス又はウイロイド由来のバンドが相互に重ならないように、各核酸プライマーペア間の塩基数を調整することができる。また、複数のウイルス又はウイロイドに分析条件下でハイブリダイズする核酸プライマーペアであっても、該核酸プライマーペア間の塩基数が該ウイルス又はウイロイドの間で十分に異なっていれば、使用することができる。ただし、このような場合には、電気泳動法による検出において目的のバンド以外のもの(ノイズ)が多数得られ、検出の精度が落ちる可能性がある。従って、あるウイルス又はウイロイドに分析条件下でハイブリダイズする核酸プライマーは、同条件下において他のウイルス又はウイロイドにハイブリダイズしないように設計することが好ましい。以上のようにして、当業者であれば適切な核酸プライマーペアを設計することができるため、各核酸プライマーの塩基配列は特定のものに制限されないが、その具体例としては、例えば、下記表2に示す塩基配列を挙げることができる。

0014

0015

表2において、CTLV-AP及びCTLV-AMからなる核酸プライマーペアはCTLVを検出することができ、CEV-AP2及びCEV-AM2からなる核酸プライマーペアはCEVdを検出することができ、CBLV-AP2及びCBLV-CMからなる核酸プライマーペアはCVdIを検出することができ、CB2-AP及びCB2-CMからなる核酸プライマーペアはCVdVIを検出することができ、CV2-AP及びCV2-AMからなる核酸プライマーペアはCVdIIを検出することができ、CV3-AP及びCV3-AMからなる核酸プライマーペアはCVdIIIを検出することができ、CV4-AP4及びCV4-AM3からなる核酸プライマーペアはCVdIVを検出することができ、CB3-AP及びCB3-AM6からなる核酸プライマーペアはCVdVを検出することができる。ここで、CEVdを検出するためには、CEV-AP2に代えてCEV-AP3を用いることができ、また、CEV-AM2に代えてCEV-AM3を用いることができる。これらの核酸プライマーは、変異体間でより高い保存性を有する塩基配列を含むため、検定漏れの危険性を減らす上で有利である。同様に、CVdIを検出するためには、上記のCBLV-CMに代えてCBLV-CM2を用いることができ、該核酸プライマーもまた、同様の理由により検定漏れの危険性を減らす上で有利である。

0016

上記ウイルス及びウイロイドの3種以上の同時検出は、被検植物に由来する核酸が上述の核酸プライマーペアの3種以上を用いる増幅処理によって増幅されるか否かを調べることにより行う。上記の被検植物に由来する核酸は、該被検植物中に含まれる核酸又はそれから誘導される核酸であればよく、特に制限されないが、好ましくは、該被検植物中に含まれるRNA由来のcDNAである。上記の被検植物に由来する核酸は、公知の核酸抽出法によって得ることができる。このような核酸抽出法は、市販のキットを用いて行ってもよく、被検植物から全RNAを抽出する場合には、例えば、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いることができる。核酸抽出に用いる被検植物の部位は、核酸を含んでいればいずれの部位でもよいが、好ましくは新梢部分である。

0017

上記の被検植物に由来する核酸として上記cDNAを用いる場合には、上述のようにして被検植物からRNAを抽出した後に、公知の方法を用いて該RNAからcDNAを合成するとよい。このようなcDNA合成は、First-Strand cDNASynthesis Kit(アマシャムファルマシアバイオテク社製)などの市販のキットを用いて行うこともできる。

0018

上記増幅処理は、通常、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって行う。該PCRにおいては、上述の核酸プライマーペアを使用することができる。その他の試薬反応条件反応温度、反応時間など)等は、当業者であれば適切に選択することができる。また、このようなPCRは、公知の装置を用いて行うことができる。

0019

以上のような増幅処理によって得られる増幅産物は、電気泳動法などの公知の方法によって検出することができる。このような方法の実施に必要な条件等は、当業者であれば適切に選択することができる。電気泳動法によって検出を行う場合には、上記ウイルス及びウイロイドに特異的な断片は、それぞれ泳動度の異なる断片として確認することができ、それらの特異的断片の有無により各ウイルス及びウイロイドの保毒を確認することができる。

0020

上記表2に示す核酸プライマーペアを用いて上記PCRを行った場合には、CTLVについては約455塩基、CEVdについては約370塩基、CVdIについては約230塩基、CVdIIについては約300塩基、CVdIIIについては約285塩基、CVdIVについては約210塩基、CVdVについては約170塩基、及びCVdVIについては約250塩基の増幅断片が検出される。

0021

2.本発明のキット
本発明のキットは、CTLV、CEVd並びにCVdI、II、III、IV、V及びVIのそれぞれに特異的な核酸プライマーペアから選択される少なくとも3種の核酸プライマーペアを含む。本発明のキットを使用することにより、被検植物から、前記ウイルス及びウイロイドの少なくとも3種を同時に検出することができる。

0022

本発明のキットは、さらに必要に応じて、ISOGEN、クロロホルムイソプロパノールエタノールなどのRNA抽出用試薬逆転写酵素、MgCl2、RNAPCR用緩衝液RNaseFree dH2O 2.5ml、dNTP混合物、RNase阻害剤などの逆転写反応用試薬(プライマーを除く)、MgCl2、RNA PCR用緩衝液、滅菌蒸留水DNAポリメラーゼなどのPCR反応用試薬(プライマーを除く)、染色剤電気泳動用ゲルなどの検出用試薬などを含んでもよい。また、本発明のキットは、各種プライマー及び各種試薬を用いて上記ウイルス及びウイロイドを検出するための説明書を含んでもよい。

0023

以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
〔実施例1〕RT-PCRによるCTLV及び7種カンキツウイロイド(CEVd、CVdI、II、III、IV、V及びVI)の同時検出(1)
CTLV及び3種カンキツウイロイド(CVdII、III及びV)を感染させたエトログシトロン、並びにCTLV及び7種カンキツウイロイド(CEVd、CVdI、II、III、IV、V及びVI)を感染させたエトログシトロンを対象として、CTLV及び7種カンキツウイロイドの同時検出を行った。対照区では、健全エトログシトロンを対象として上記検出を行った。なお、各種ウイルス又はウイロイドのカンキツ樹への感染は、接木接種することによって行った。

0024

検定すべきカンキツ樹の新梢部分を0.05〜0.1g採集し、この新梢部分試料から、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用い、説明書に従って全RNAを抽出した。この全RNA抽出液1μl(全RNA約1μgに相当)を95℃で5分間インキュベートした後に急冷することにより熱変性を行い、RNAの2次構造を解消した。この溶液を用い、First-StrandcDNASynthesis Kit(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従ってcDNAを合成した。

0025

次いで、そのcDNAを鋳型として用い、表2中の配列番号3〜18に示される塩基配列を有する16種の核酸プライマーからなるプライマーセット及びAmpli Taq Gold(Perkin Elmer社)を用い、説明書に従ってPCRを行った。このPCRは、DNAサーマルサイクラー480型(Perkin Elmer社)を使用し、94℃で10分間-62℃で10秒間-72℃で10秒間を1サイクル、94℃で30秒間(変性)-62℃で10秒間(アニーリング)-72℃で10秒間(伸長)を34サイクル、そして72℃で5分間-15℃で5分間を1サイクルの反応を行った。

0026

以上のようにして得られたPCR産物をDNAサイズマーカーとともに6%ポリアクリルアミドゲルローディングし、80Vで1時間45分電気泳動した後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電気泳動写真図1に示した。図1において、CTLVの場合は約455塩基、CEVdの場合は約370塩基、CVdIの場合は約230塩基、CVdIIの場合は約300塩基、CVdIIIの場合は約285塩基、CVdIVの場合は約210塩基、CVdV の場合は約170塩基、そしてCVdVIの場合は約250塩基の特異的断片の有無を確認することにより、これらのウイロイドを検出することができた。

0027

〔実施例2〕RT-PCRによるCTLV及び7種カンキツウイロイド(CEVd、CVdI、II、III、IV、V及びVI)の同時検出(2)
長崎レモン、長崎不知火、熊本不知火、和山不知火、茎頂接木不知火、長崎上野早生、福岡伊都早生、媛清見、静岡温州、熊本オレンジ、タンカン、福岡オレンジ及び静岡タンゼロの各カンキツ樹を対象として、CTLV及び7種カンキツウイロイドの同時検出を行った。対照区では、健全エトログシトロンを対象として上記検出を行った。

0028

検定すべきカンキツ樹の新梢部分を0.05〜0.1g採集し、この新梢部分試料から、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用い、説明書に従って全RNAを抽出した。この全RNA抽出液1μl(全RNA約1μgに相当)を95℃で5分間インキュベートした後に急冷することにより熱変性を行い、RNAの2次構造を解消した。この溶液を用い、First-StrandcDNASynthesis Kit(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従ってcDNAを合成した。

0029

次いで、そのcDNAを鋳型として用い、実施例1で使用した16種のプライマーからなるプライマーセット及びAmpli Taq Gold(Perkin Elmer社)を用い、説明書に従ってPCRを行った。このPCRは、DNAサーマルサイクラー480型(Perkin Elmer社)を使用し、94℃で10分間-62℃で10秒間-72℃で10秒間を1サイクル、94℃で30秒間(変性)-62℃で10秒間(アニーリング)-72℃で10秒間(伸長)を34サイクル、そして72℃で5分間-15℃で5分間を1サイクルの反応を行った。

0030

以上のようにして得られたPCR産物をDNAサイズマーカーとともに6%ポリアクリルアミドゲルにローディングし、80Vで1時間45分電気泳動した後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電気泳動写真を図2に示した。図2において、CEVdの場合は約370塩基、CVdIの場合は約230塩基、CVdIIの場合は約300塩基、CVdIIIの場合は約285塩基、CVdIVの場合は約210塩基、CVdV の場合は約170塩基、そしてCVdVIの場合は約250塩基の特異的断片の有無を確認することにより、これらのウイロイドを検出することができた。なお、本実施例では、CTLVは検出されなかった。

0031

〔実施例3〕RT-PCRによるCTLV及び7種カンキツウイロイド(CEVd、CVdI、II、III、IV、V及びVI)の同時検出(3)
実施例1及び2において用いたプライマーセットにおいて、CEV-AP2、CEV-AM2及びCBLV-CMに代えてCEV-AP3、CEV-AM3及びCBLV-CM2を混合したプライマーセットを用いて、実施例1及び2と同様の検出を行った。その結果、それぞれの実施例と同様の結果が得られた(データ示さず)。

発明の効果

0032

本発明により、カンキツタターリーフウイルス(CTLV)及びカンキツウイロイドの同時検出が可能になり、これらの病原体の検出に要する費用、労力及び時間が大幅に減少する。さらに、本発明により、上記病原体に感染したカンキツ樹の早期診断や迅速な幼苗検定が可能となるため、ウイロイドフリーのカンキツ苗木供給が容易になる。

0033

SEQUENCE LISTING

<110> Tohru Maotani, Director-General of National Institute of Fruit
Tree Science, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries

<120> Simultaneous Detection ofCitrus Tatter Leaf Virus and
7 Citrus Viroid Species

<130> P99-0487

<150> JP 10-288954
<151> 1998-10-12

<160> 18

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1
<211> 331
<212> RNA
<213> Citrus Viroid V

<400> 1
cggaggaaac uccguguggu uccugugggu caccccccgg cacccucuaa agaaaagaaa 60
gguaaggaga acucaccugu cgucgucgac gaaggcaugu gagcuucaaa cucgaugaag 120
agcgucagcg gacggccucu gagacgagcg auggacagua gagcucgucu cuaccagucg 180
cgugcugacu cucacgccca cccgcacggc ugcuccgaga gugagagcuc ucugccgcua 240
gucgagcgga cuccagagug acucucccac ccuauuuuca gcggagagcc ggcgguggag 300
uccccagggu aaaacacgau ugguguuucc c 331

<210> 2
<211> 327
<212> RNA
<213> Citrus Viroid VI

<400> 2
cggagacuuc uugugguucc uguggugaca ccccucagcc cuaccugcga aagaaaaaag 60
ucauuagaag gcgccagagg agacugagcg gucgucgucg acgaaggcuc cucagucgca 120
gagcgccgcu ggaucgacug gccuccggug gaaaacgaag auucgucuuc aauuucugua 180
accggaccgg ucuccuucgg ccgccgagcg cugguugccg cuagucgagc ggacuuccgu 240
cucuacccuc ccgaggcgcu uuucucacug accgacuucc guagcagcgg ggagagggug 300
aagcccugug aaccccugag ggcuccu 327

<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Tatter Leaf Virus gene

<400> 3
cctgaattga aaacctttgc tgccactt 28

<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Tatter Leaf Virus gene

<400> 4
tagaaaaacc acactaaccc ggaaatgc 28

<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Exocortis Viroid gene

<400> 5
gggaaacctg gaggaagtcg aggt 24

<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Exocortis Viroid gene

<400> 6
cggggatccc tgaaggactt cttc 24

<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid I gene

<400> 7
tccccttcac ccgagcgctg c 21

<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid I gene

<400> 8
acgaccagtc agctcctctg 20

<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid VI gene

<400> 9
ctgtaaccgg accggtctcc ttc 23

<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid VI gene

<400> 10
acgaccgctc agtctcctct 20

<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid II gene

<400> 11
ggcaactctt ctcagaatcc agc 23

<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid II gene

<400> 12
ccggggctcc tttctcaggt aagt 24

<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid III gene

<400> 13
ctccgctagt cggaaagact ccgc 24

<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid III gene

<400> 14
tcaccaactt agctgccttc gtc 23

<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid IV gene

<400> 15
tctggggaat ttctctgcgg gacc 24

<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid IV gene

<400> 16
tctatctcag gtcgcgaagg aagaagc 27

<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid V gene

<400> 17
cgtcgacgaa ggcatgtgag ctt 23

<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid V gene

<400> 18
gtccgctcga ctagcggcag agagc 25

<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Exocortis Viroid gene

<400> 19
ggaaacctgg aggaagtcga g 21

<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Exocortis Viroid gene

<400> 20
ccggggatcc ctgaaggact t 21

<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Citrus
Viroid I gene

<400> 21
tcgacgacga ccagtcagct 20

0034

カンキツタターリーフウイルス遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0036

カンキツエクソコーティスウイロイド遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0037

カンキツウイロイドI遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0038

カンキツウイロイドVI遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0039

カンキツウイロイドII遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0040

カンキツウイロイドIII遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0041

カンキツウイロイドIV遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0042

カンキツウイロイドV遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0043

カンキツエクソコーティスウイロイド遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0044

カンキツウイロイドI遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

0045

図1本発明の方法により行ったCTLV、CEVd並びにCVdI、II、III、IV、V及びVIの同時検出の結果を示す電気泳動写真である。
図2本発明の方法により行ったCTLV、CEVd並びにCVdI、II、III、IV、V及びVIの同時検出の結果を示す電気泳動写真である。

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