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技術 日本カンキツウイロイド2(JCVd2)遺伝子

出願人 農林水産省果樹試験場長
発明者 伊藤隆男家城洋之尾崎克己
出願日 1998年12月9日 (21年7ヶ月経過) 出願番号 1998-349472
公開日 2000年6月20日 (20年1ヶ月経過) 公開番号 2000-166567
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 棒状構造 供試サンプル 検定植物 アリゾナ 果樹類 塩化リチウム水溶液 無感染 電気溶出法
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この項目の情報は公開日時点(2000年6月20日)のものです。
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図面 (1)

解決手段

本発明は、配列番号1に示される塩基配列を含むRNAを提供する。さらに、本発明は、該塩基配列に基づいて設計した核酸プローブ及び核酸プライマーを提供する。

効果

本発明により、JCVd2ゲノムRNAの全塩基配列が明らかとなり、これにより、他のカンキツウイロイドとの類縁関係を明らかにすることが可能となる。さらに、JCVd2ゲノムRNAの塩基配列に基づいて設計した核酸プローブや核酸プライマーを用いることにより、JCVd2の選択的な遺伝子検出が可能となる。これにより、JCVd2に感染したカンキツ樹早期診断や迅速な幼苗検定が可能となり、ウイロイドフリーのカンキツ苗木供給に大きな効果を発揮する。

概要

背景

ウイロイド感染性を持つ環状の1本鎖RNA)による植物病害は、近年果樹類で多く発生しており、その症状の性質又は程度によって様々な被害をもたらす。カンキツに対して感染性を示すウイロイドとして、カラタチ台木剥皮の症状を示すカンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)、カラタチ台カンキツに矮化果実収量の低下をもたらすカンキツウイロイド(CVd)I、II、III及びIVの計5つのウイロイドグループが存在することが報告されており、その塩基配列も決定されている(谷、植物防疫、第51巻、第4号、21-25、1997)。さらに、最近になって、日本カンキツウイロイド2(JCVd2)が新たに発見されたが、その塩基配列は未だに決定されていない。

従来、これらのウイロイドを検出するためには、カンキツウイロイドの検定植物であるエトログシトロン系統アリゾナ861−S1を用いた木本検定によって、現れてくる病徴の観察を行う方法、若しくは罹病植物より低分子RNAを抽出、純化し、電気泳動法(PAGE)によってウイロイド様RNAを確認する方法(N. Duran-Vilaら,Proc. 12th Conf.IOCV, Riverside, 343-352, 1993)、又はこれらの方法の組合せ(N. Duran-vilaら、J. gen. Virol., 69, 3069-3080,1988)が用いられていた。

しかしながら、木本検定には観察に6〜9ヶ月の長期間を要するという欠点があり、また電気泳動法による方法には十分な感度が得られないという欠点がある。さらに、これらの方法では、一度に多数の試料を取り扱うことが困難であり、正確なウイロイドの同定はできない。そこで、ウイロイドの検出法として、遺伝子診断法による検出法が開発された(Maria Esther de Noronha Fonsecaら,J. Virol. Methods, 57, 203-207, 1996; N. Yoshikawaら,Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 62, 119-124, 1996)。この方法によれば、迅速かつ正確な検定が可能となり、また、一度に多数の試料を取り扱うことができる。

しかし、遺伝子診断法による検出法を行うには、検出対象となるウイロイドの塩基配列が決定されていなければならない。上記の5つのウイロイドグループについては塩基配列が決定されているため、この方法を使用することができるが、上記JCVd2については未だに塩基配列が決定されていないので、この方法を適用することができなかった。

概要

本発明は、配列番号1に示される塩基配列を含むRNAを提供する。さらに、本発明は、該塩基配列に基づいて設計した核酸プローブ及び核酸プライマーを提供する。

本発明により、JCVd2ゲノムRNAの全塩基配列が明らかとなり、これにより、他のカンキツウイロイドとの類縁関係を明らかにすることが可能となる。さらに、JCVd2ゲノムRNAの塩基配列に基づいて設計した核酸プローブや核酸プライマーを用いることにより、JCVd2の選択的な遺伝子検出が可能となる。これにより、JCVd2に感染したカンキツ樹早期診断や迅速な幼苗検定が可能となり、ウイロイドフリーのカンキツ苗木供給に大きな効果を発揮する。

目的

本発明の目的は、JCVd2の塩基配列を決定し、遺伝子診断法によるJCVd2の検出に利用できる核酸を提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

列番号1に示される塩基配列を含むRNA。

請求項2

配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基置換欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNA。

請求項3

配列番号2に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入されていてもよい塩基配列に相補的な塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2のRNAにハイブリダイズする一本鎖DNA

請求項4

請求項3記載の一本鎖DNAをセンス鎖又はアンチセンス鎖として含む二本鎖DNA

請求項5

日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部又は全部を含む核酸プローブ

請求項6

さらに標識を含む請求項5記載の核酸プローブ。

請求項7

前記日本カンキツウイロイド2のRNAが、(1)配列番号1に示される塩基配列を含むRNA、又は、(2)配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAのいずれかである請求項5又は6記載の核酸プローブ。

請求項8

前記核酸プローブがDNAである請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸プローブ。

請求項9

前記核酸プローブがRNAである請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸プローブ。

請求項10

請求項5〜9のいずれか1項に記載の核酸プローブを用いて、日本カンキツウイロイド2を検出する方法。

請求項11

被検植物中に存在する核酸が請求項5〜9のいずれか1項に記載の核酸プローブとハイブリダイズするか否かを調べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド2の存否を決定する請求項10記載の方法。

請求項12

日本カンキツウイロイド2のRNA又はその塩基配列においてウラシルチミンに置き換わったDNAの一部を含む核酸プライマー

請求項13

前記日本カンキツウイロイド2のRNAが、(1)配列番号1に示される塩基配列を含むRNA、又は、(2)配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAのいずれかである請求項12記載の核酸プライマー。

請求項14

前記核酸プライマーがDNAである請求項12又は13記載の核酸プライマー。

請求項15

前記核酸プライマーが、配列番号3に示される塩基配列を含む請求項14記載の核酸プライマー。

請求項16

日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマー。

請求項17

前記日本カンキツウイロイド2のRNAが、(1)配列番号1に示される塩基配列を含むRNA、又は、(2)配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAのいずれかである請求項16記載の核酸プライマー。

請求項18

前記核酸プライマーがDNAである請求項16又は17記載の核酸プライマー。

請求項19

前記核酸プライマーが、配列番号4に示される塩基配列を含む請求項18記載の核酸プライマー。

請求項20

請求項12〜15のいずれか1項に記載の核酸プライマー及び請求項16〜19のいずれか1項に記載の核酸プライマーを用いて、日本カンキツウイロイド2を検出する方法。

請求項21

被検植物中に存在する核酸が請求項12〜15のいずれか1項に記載の核酸プライマー及び請求項16〜19のいずれか1項に記載の核酸プライマーにより増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド2の存否を決定する請求項20記載の方法。

請求項22

被検植物中に存在するRNAから、請求項16〜19のいずれか1項に記載の核酸プライマーによりcDNAが合成され、さらにこのcDNAが請求項12〜15のいずれか1項に記載の核酸プライマー及び請求項16〜19のいずれか1項に記載の核酸プライマーにより増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド2の存否を決定する請求項20又は21記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、植物に感染する病原体であるウイロイド塩基配列に関し、より詳細には、カンキツ感染性を有する日本カンキツウイロイド2のRNA、そのcDNA、並びに日本カンキツウイロイド2の検出方法、及びそれに用いる核酸プローブ及び核酸プライマーに関する。

背景技術

0002

ウイロイド(感染性を持つ環状の1本鎖RNA)による植物病害は、近年果樹類で多く発生しており、その症状の性質又は程度によって様々な被害をもたらす。カンキツに対して感染性を示すウイロイドとして、カラタチ台木剥皮の症状を示すカンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)、カラタチ台カンキツに矮化果実収量の低下をもたらすカンキツウイロイド(CVd)I、II、III及びIVの計5つのウイロイドグループが存在することが報告されており、その塩基配列も決定されている(谷、植物防疫、第51巻、第4号、21-25、1997)。さらに、最近になって、日本カンキツウイロイド2(JCVd2)が新たに発見されたが、その塩基配列は未だに決定されていない。

0003

従来、これらのウイロイドを検出するためには、カンキツウイロイドの検定植物であるエトログシトロン系統アリゾナ861−S1を用いた木本検定によって、現れてくる病徴の観察を行う方法、若しくは罹病植物より低分子RNAを抽出、純化し、電気泳動法(PAGE)によってウイロイド様RNAを確認する方法(N. Duran-Vilaら,Proc. 12th Conf.IOCV, Riverside, 343-352, 1993)、又はこれらの方法の組合せ(N. Duran-vilaら、J. gen. Virol., 69, 3069-3080,1988)が用いられていた。

0004

しかしながら、木本検定には観察に6〜9ヶ月の長期間を要するという欠点があり、また電気泳動法による方法には十分な感度が得られないという欠点がある。さらに、これらの方法では、一度に多数の試料を取り扱うことが困難であり、正確なウイロイドの同定はできない。そこで、ウイロイドの検出法として、遺伝子診断法による検出法が開発された(Maria Esther de Noronha Fonsecaら,J. Virol. Methods, 57, 203-207, 1996; N. Yoshikawaら,Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 62, 119-124, 1996)。この方法によれば、迅速かつ正確な検定が可能となり、また、一度に多数の試料を取り扱うことができる。

0005

しかし、遺伝子診断法による検出法を行うには、検出対象となるウイロイドの塩基配列が決定されていなければならない。上記の5つのウイロイドグループについては塩基配列が決定されているため、この方法を使用することができるが、上記JCVd2については未だに塩基配列が決定されていないので、この方法を適用することができなかった。

発明が解決しようとする課題

0006

本発明の目的は、JCVd2の塩基配列を決定し、遺伝子診断法によるJCVd2の検出に利用できる核酸を提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、カンキツから分離したJCVd2のRNAを鋳型とし、逆転写酵素DNAポリメラーゼを用いてJCVd2由来のRNA遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、配列番号1に示される塩基配列を含むRNAを提供する。

0008

さらに、本発明は、配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基置換欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAを提供する。ここで、「日本カンキツウイロイド2の機能を有する」とは、配列番号1に示される塩基配列を含むRNAの示す挙動と同一の挙動を示すことを意味する。ここでいう挙動としては、例えば、電気泳動したときの泳動度、未変性条件下での二次構造ヘアピン構造ハンマーヘッド構造など)、感染することのできる植物、各感染植物において示す病徴等が挙げられる。このようなRNAの塩基配列の、配列番号1に示される塩基配列に対する相同性(%)は特に制限されないが、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上である。

0009

さらに、本発明は、配列番号2に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入されていてもよい塩基配列に相補的な配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2のRNAにハイブリダイズする一本鎖DNAを提供する。前記ハイブリダイゼーションの条件は特に制限されないが、好ましくはM. E. N. Fonsecaら(J. Virol. Methods57, 203-207, 1996)の方法で用いられる条件である。このようなDNAの塩基配列の、配列番号2に示される塩基配列に相補的な配列に対する相同性(%)は特に制限されないが、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上である。さらに、本発明は、上記の一本鎖DNAをセンス鎖又はアンチセンス鎖として含む二本鎖DNAを提供する。

0010

さらに、本発明は、日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部又は全部を含む核酸プローブを提供する。核酸プローブは、さらに標識を含むことが好ましい。前記日本カンキツウイロイド2のRNAは、好ましくは、(1)配列番号1に示される塩基配列を含むRNA、又は、(2)配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAのいずれかである。また、前記核酸プローブは、DNAであってもRNAであってもよい。

0011

さらに、本発明は、上記の核酸プローブを用いて、日本カンキツウイロイド2を検出する方法を提供する。該方法では、被検植物中に存在する核酸が上記の核酸プローブとハイブリダイズするか否かを調べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド2の存否を決定することが好ましい。

0012

さらに、本発明は、日本カンキツウイロイド2のRNA又はその塩基配列においてウラシルチミンに置き換わったDNAの一部を含む核酸プライマーを提供する。前記日本カンキツウイロイド2のRNAは、好ましくは、(1)配列番号1に示される塩基配列を含むRNA、又は、(2)配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAのいずれかである。前記核酸プライマーは、DNAであることが好ましい。前記核酸プライマーとしては、例えば、配列番号3に示される塩基配列を含むものが挙げられる。

0013

さらに、本発明は、日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーを提供する。前記日本カンキツウイロイド2のRNAは、好ましくは、(1)配列番号1に示される塩基配列を含むRNA、又は、(2)配列番号1に示される塩基配列において1以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド2の機能を有するRNAのいずれかである。前記核酸プライマーは、DNAであることが好ましい。前記核酸プライマーとしては、例えば、配列番号4に示される塩基配列を含むものが挙げられる。

0014

さらに、本発明は、日本カンキツウイロイド2のRNA若しくはその塩基配列においてウラシルがチミンに置き換わったDNAの一部を含む核酸プライマー、及び日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーを用いて、日本カンキツウイロイド2を検出する方法を提供する。該方法では、被検植物中に存在する核酸が日本カンキツウイロイド2のRNA若しくはその塩基配列においてウラシルがチミンに置き換わったDNAの一部を含む核酸プライマー及び日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーにより増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド2の存否を決定することができる。

0015

さらに、該方法では、被検植物中に存在するRNAから、日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーによりcDNAが合成され、さらにこのcDNAが日本カンキツウイロイド2のRNA若しくはその塩基配列においてウラシルがチミンに置き換わったDNAの一部を含む核酸プライマー及び日本カンキツウイロイド2のRNAと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーにより増幅されるか否かを調べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド2の存否を決定することができる。cDNAの合成に用いる核酸プライマーとしては、例えば、配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。増幅に用いる核酸プライマーとしては、例えば、配列番号3に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。

発明を実施するための最良の形態

0016

以下、本発明を詳細に説明する。JCVd2のRNAは、JCVd2感染樹から抽出することができる。該感染樹としては、感染の事実が確認されているものであればよく、発病の有無を問わない。樹木の種類としては、JCVd2が感染できるものであればよく、特に限定しないが、好ましくはカンキツ、より好ましくはウンシュウミカン、オレンジ、エトログシトロン等を用いる。「カンキツ」とは、一般的にミカン科ミカン亜科(Rutaceae Lignosae)に属する植物を意味し、例としては、ウンシュウミカン、オレンジ、カラタチ等が挙げられる。

0017

樹木がJCVd2に感染しているかどうかは、公知の方法により確認することができ、例えば、電気泳動を行うことにより確認することができる。上記の抽出に使用できるJCVd2感染樹の例としては、例えば、JCVd2感染エトログシトロン系統アリゾナ861−S1(Citrus medica L. Var. Ethrog Engl.)が挙げられる。抽出に用いる樹木の部分としては、JCVd2が存在する可能性のある部分であればよいが、好ましくは樹皮及び/又は葉を用いる。さらに、これらの樹皮及び/又は葉は、核酸抽出を効率よく行うことができるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を用いて粉砕することができる。

0018

JCVd2のRNAを抽出する方法としては、公知のいずれの方法を用いてもよく、特に限定しないが、好ましくは抽出用緩衝液として知られる種々の溶液を用いることができる。本発明に使用する好適な抽出用緩衝液としては、例えば、0.83%ドデシル硫酸ナトリウム、5%ポリビニルピロリドン、1M塩化リチウム、0.017MEDTApH7.0、1.4%2−メルカプトエタノールを含む0.13M Tris-HCl緩衝液(pH 8.9)が挙げられる。この際に、JCVd2のRNAを十分に抽出するためには、該抽出用緩衝液中で磨砕処理を行うことが好ましい。この処理は公知の方法を用いて行うことができる。このようにして得られる試料から、遠心分離などの公知の方法を用いて液体だけを回収し、該液体から、エタノール沈殿又はイソプロパノール沈殿などの公知の方法を用いて核酸を濃縮することができる。さらに核酸分子を濃縮するために、濃縮した核酸を再び抽出緩衝液などの溶液に懸濁し、フェノールクロロホルム、フェノール/クロロホルム等によって抽出した後、エタノール沈殿法、イソプロパノール沈殿法等によって沈殿させてもよい。また、抽出用緩衝液によりJCVd2のRNAを抽出した後に、遠心分離、沈殿及び再懸濁を行うことなく、直接フェノール、クロロホルム、フェノール/クロロホルム等による抽出を行ってもよい。以上のようにして、JCVd2のRNAを含有する粗抽出核酸試料を得ることができる。

0019

さらに、JCVd2のRNAの純度を上げるために、上記の粗抽出核酸試料を精製処理することができる。この精製処理は公知の方法を用いて行うことができ、特に限定しないが、例えば、塩化リチウム水溶液を用いる低分子核酸抽出法によって行う。さらに、試料中のDNAを分解するために、DNase等の酵素を用いて処理することが好ましく、これは公知の方法により行うことができる。このような処理によって得られる液体試料から、上記のフェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿などの方法を適宜用いて、精製核酸試料を得ることができる。

0020

精製核酸試料からJCVd2のRNAを単離するため、該試料をさらに分離する。分離に用いる方法としては公知の方法を使用することができるが、好ましくは電気泳動法を使用することができる。本発明に使用することのできる分離法の例としては、例えば、シークエンシャポリアクリルアミドゲル電気泳動法(sPAGE)(Roistacherら、Graft-transmissible diseases of citrus: Handbook for detection and diagnosis,FAO, Rome, 286pp, 1991)が挙げられる。ウイロイドRNAは、未変性条件ゲル内では分子内結合によって棒状構造をとるが、変性条件ゲル内では分子内結合の切断によって環状構造をとる。従って、ウイロイドRNAは、変性条件ゲルでの電気泳動では、未変性条件ゲルを用いる場合に比べて著しく遅く泳動される。このウイロイドRNAの性質を利用して、JCVd2のRNAを電気泳動法を用いて特定する方法は、当業者であれば容易に確立することができる。また、電気泳動における特性の知られている他のウイロイド分子との比較によって、JCVd2のRNAを特定することもできる。以上のようにして、JCVd2のRNAを単離することができる。

0021

次いで、単離されたJCVd2のRNAに基づいてcDNA合成を行い、クローニング及び部分的な配列決定を行う。cDNA合成の方法としては公知の方法を用いることができ、特に限定しないが、例えば、ランダムプライマーを使用する方法を用いることができる。この際に、cDNA Synthesis Kits(ベーリンガーマンハイム社製)などの市販のキットを用いてもよい。

0022

合成したcDNAをクローニングする方法としては公知の方法を用いることができる。例えば、適切なベクターライゲーションした後に、該ベクターを大腸菌などの適切な宿主に導入してもよい。この場合には、ベクターとしては、例えば、pBluescript(Stratagene)などの公知のベクターを適切な制限酵素消化したものを用いることができる。ライゲーションの方法としては、当業者であれば適切な方法を選択することができるため、特に限定しないが、例えば、ライゲーションキット(宝酒造社製)などの市販のキットを用いることができる。宿主への導入については、当業者に公知のいずれの方法をも用いることができ、例えば、E. coli Competent Cells JM109(宝酒造社製)などの市販のキットを用いてもよい。

0023

部分的な配列決定は、上述のようにして得たクローンを用いて、公知の方法により行うことができる。通常用いられる方法に従えば、クローンから目的のインサートを含むプラスミドを抽出し、これを用いて適切な方法により配列決定を行う。プラスミドの抽出方法としては、例えば、少量迅速調製法を用いることができる。多くの場合には、複数のプラスミドが得られるが、これらのサイズについては、例えば、電気泳動法などの公知の方法を用いて確認することができる。得られるプラスミドに含まれるインサートの配列決定の方法としては、公知のいずれの方法を用いてもよいが、好ましくはジデオキシ法を用いる。以上のようにして、JCVd2のcDNAの部分的な塩基配列を決定することができる。また、JCVd2のRNAは、JCVd2のcDNAの塩基配列中のTをUに置換したものであるので、JCVd2のRNAの塩基配列も決定される。

0024

JCVd2のcDNAの部分的塩基配列に基づいて1組のプライマーを合成し、該プライマーを用いてJCVd2のcDNAを増幅する。プライマーの合成は、公知の方法を用いて行うことができ、その方法については特に限定しない。合成するプライマーの配列は、上記の部分的塩基配列に基づいて、適切と思われるものでよいが、適切な例を挙げれば、以下のような配列がある。

0025

CB2-CP:5'-CGTCGACGAAGGCTCCTCAGTC-3'(配列番号3)
CB2-CM:5'-ACGACCGCTCAGTCTCCTCT-3' (配列番号4)
CB2-TP:5'-TTCTTGTGGTTCCTGTGGTG-3' (配列番号5)
CB2-TM:5'-GTCTCCGAGGAGCCCTCAGG-3' (配列番号6)
これらのプライマーは、CB2-CPとCB2-CMの組合せ及びCB2-TPとCB2-TMの組合せで用いることができ、CB2-CP及びCB2-TPはフォワードプライマー、CB2-CM及びCB2-TMはリバースプライマーである。

0026

増幅用の鋳型となるcDNAは公知の方法により合成することができる。本発明の場合には、例えば、JCVd2のRNAを鋳型として使用し、RNA-PCRキット(宝酒造社製)などの市販のキットを用いて合成することができる。この際に使用するプライマーとしては、例えば、ランダムプライマーが挙げられる。このようにして得られる一本鎖cDNA及びJCVd2のRNAを鋳型として使用し、上述のプライマーを用いて、JCVd2のcDNAを増幅する。増幅に用いる方法としては、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる。PCRを行う方法としては公知の方法を用いることができ、特に限定しないが、例えば、TaKaRa Taq(宝酒造社製)などの市販のPCRキットを用いることができる。この際に使用するプライマーとしては、例えば、上述のCB2-CPとCB2-CMの組合せ、又はCB2-TPとCB2-TMの組合せが挙げられる。以上のようにして、JCVd2のcDNAを増幅することができる。

0027

次いで、増幅したcDNAの塩基配列を決定し、最終的にJCVd2のRNAの全塩基配列を決定する。配列決定は、上述のようにして得た増幅産物を用いて、公知の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、それぞれの増幅に用いたプライマーセットを使用するダイレクトシークエンス法が挙げられる。

0028

以上のようにして決定される各クローンの配列を相互に比較することにより、JCVd2のcDNAの全塩基配列を決定することができ、したがって、JCVd2のRNAの全塩基配列を決定することができる。この全塩基配列の決定は、当業者であれば容易に行うことができる。このようにして決定される塩基配列の例としては、例えば、配列番号1のRNA配列及び配列番号2のcDNA配列が挙げられる。

0029

JCVd2のRNAの塩基配列を、他のウイロイドの塩基配列と比較した結果、CVdIに属するウイロイド(Ashulinら、Nucleic AcidsRes., 19, 4767, 1991、Hatayaら、Arch. Virol., 143, 97-980, 1998)と最も近似していたが、その相同性は約82〜84%という低い値であった。一般的に、2つのウイロイドが同種のものであるとするのは、その相同性が90%以上の場合である。従って、JCVd2のRNAは既知のウイロイドとは異なる新規なRNAである。

0030

JCVd2のRNA又はcDNAは、以上のようにして得ることができるが、本発明によって提供される塩基配列、RNAについては配列番号1の塩基配列、DNAについては配列番号2の塩基配列、に基づいて、公知の他の方法により調製することもできる。また、以下のプライマーを用いて、植物から抽出したJCVd2のRNAを鋳型として、PCRによる増幅を行ってもよい。PCR増幅の具体的な方法としては、好ましくはRT−PCR(逆転写PCR)を用いる。

0031

CB2-CP:5'-CGTCGACGAAGGCTCCTCAGTC-3'(配列番号3)
CB2-CM:5'-ACGACCGCTCAGTCTCCTCT-3' (配列番号4)
CB2-TP:5'-TTCTTGTGGTTCCTGTGGTG-3' (配列番号5)
CB2-TM:5'-GTCTCCGAGGAGCCCTCAGG-3' (配列番号6)

0032

なお、プライマーとしてCB2-CPとCB2-CMの組合せを用いて得られた第一の増幅産物は、配列番号2中の塩基第96番〜第95番(すなわち、配列番号2で示される塩基配列を有する環状DNAを、塩基第95番と第96番の間で切断したもの)を含み、CB2-TPとCB2-TMの組合せを用いて得られた第二の増幅産物は、配列番号2中の塩基第8番〜第7番(すなわち、配列番号2で示される塩基配列を有する環状DNAを、塩基第7番と第8番の間で切断したもの)を含む。これらの増幅産物から本発明のRNA及び二本鎖cDNAを調製するためには、上記第一の増幅産物及び上記第二の増幅産物を制限酵素Hph Iでそれぞれ消化し、得られる2つの断片をDNA Ligation Kit Ver2 (Takara)などを用いてライゲーションすることができる。

0033

本発明のRNAの塩基配列は配列番号1に示されるものに限定されるものではなく、実質的にJCVd2として機能するものであれば、1以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されていてもよい。ここで、「日本カンキツウイロイド2の機能を有する」とは、配列番号1に示される塩基配列を含むRNAの示す挙動と同一の挙動を示すことを意味する。ここでいう挙動としては、例えば、電気泳動したときの泳動度、未変性条件下での二次構造(ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造など)、感染することのできる植物、各感染植物において示す病徴等が挙げられる。感染植物において示す病徴は感染する植物の種類によって異なるが、例えば、エトログシトロンにおいて示す病徴は中程度の葉の下垂葉脈褐変、矮化等である。このようなRNAの塩基配列の、配列番号1に示される塩基配列に対する相同性(%)は特に制限されないが、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上である。同様に、本発明の一本鎖cDNAの塩基配列は配列番号2に示されるものに相補的な配列に限定されるものではなく、本発明のRNAにハイブリダイズするものであれば、1以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されていてもよい。前記ハイブリダイゼーションの条件は特に制限されないが、好ましくはM. E. N. Fonsecaら(J. Virol. Methods57, 203-207, 1996)の方法で用いられる条件(すなわち、0.1%(w/v)M−ラウロイルサルコシン、0.02%(w/v)SDS、及びDIG nucleic acid detection kit(ベーリンガーマンハイム社製)に含まれる1%(w/v)ブロッキング試薬を含む5×SSC)と同一の条件である。このようなDNAの塩基配列の、配列番号1に示される塩基配列に相補的な配列に対する相同性(%)は特に制限されないが、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上である。また、本発明の二本鎖cDNAは、上記一本鎖cDNAをセンス鎖又はアンチセンス鎖として含むものであるため、その塩基配列において上記一本鎖cDNAと同様の置換、欠失、付加又は挿入があってもよい。このような、配列番号1又は2に示される塩基配列に対して1以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されている塩基配列を有するRNA又はDNAは、部位特異的変異誘発法(Zollerら, Nucleic Acids Res., Vol. 10, No. 20, 6487-6500 (1982))によって、当業者であれば容易に調製することができる。

0034

すでに、幾つかのカンキツウイロイドでは、決定された塩基配列を基に、RT−PCRなど様々な方法で遺伝子診断できることが報告されている(畑谷ら、植物防疫, 第51巻, 第4号, 21-25,1997)。従って、本発明のJCVd2のRNA遺伝子の塩基配列を利用することにより、JCVd2の遺伝子診断に利用できる核酸プローブやプライマーを設計することができる。上記核酸プローブの塩基数は、通常のハイブリダイゼーション解析に用いる塩基数であってよく、特に制限されないが、好ましくは10塩基以上、より好ましくは100塩基以上である。上記核酸プライマーの塩基数は、通常のPCRに用いる塩基数であってよく、特に制限されないが、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上である。

0035

これらの核酸プローブ又はプライマーは、JCVd2の塩基配列の部分配列を選択することによって設計することができる。選択される部分配列はどの部分であってもよく、特に制限されないが、JCVd2の塩基配列に特異的な部分であることが好ましい。ここで「JCVd2の塩基配列に特異的な」とは、JCVd2の塩基配列以外の配列に、分析条件下においてハイブリダイズしないことを意味する。上記核酸プローブは、選択された部分配列に基づいて、その配列に相補なDNA又はRNAとすることができ、上記核酸プライマーは、その配列に相同又は相補なDNAとすることができる。なお、上記核酸プローブは、JCVd2の全塩基配列に相補なDNA又はRNAであってもよい。

0036

植物(例えば、樹木など)からJCVd2を検出するための遺伝子診断法としては、例えば、RT−PCR法を応用する方法(X. Yangら、Phytopathol., 82,No.3, 279,1992; N. Yoshikawaら, Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 62, 119-124, 1996)や、非放射性標識cDNA(cRNAであってもよい)をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法(J. Romero-Durbanら, J. Virol. Methods, 55, 37-47, 1995; Maria Esther de Noronha Fonsecaら, J. Virol. Methods, 57, 203-207, 1996)などが挙げられる。また、上記のRT−PCR法及びマイクロプレートを用いるハイブリダイゼーション法を組合わせた方法(斉ら、植物防疫、第48巻第4号、169-173, 1994)も知られている。このような診断法は、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。

0037

RT−PCRを用いるJCVd2の検出は以下のようにして行うことができる。第一に、被検植物から核酸を調製する。これは公知の方法を用いて行うことができ、例えば、上述の方法を用いて行うことができる。第二に、調製した核酸中に含まれている可能性のあるJCVd2のRNAの一本鎖cDNA合成及び増幅を行う。

0038

一本鎖cDNAの合成は、公知の方法により行うことができるが、例えば、次のようにして行うことができる。まず、上述のようにして調製した核酸に、イオン交換滅菌水及びプライマーを添加する。ここで使用するプライマーとしては、例えば、ランダムプライマー、配列番号4又は6に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド等を用いることができる。次いで、得られる混合物を100℃前後で約5分間保持した後に急冷して熱変性した後、室温で静置することによりJCVd2のRNAと上記プライマーをアニールさせる。ここに反応溶液(一本鎖cDNA緩衝液、2−メルカプトエタノール、dNTP及びイオン交換水を含み、必要に応じてRNaseも含む。)及び逆転写酵素を添加し、逆転写反応を行う。該逆転写反応の温度条件及び時間はそれぞれ、使用する酵素の至適温度及びその温度での活性に依存する。以上のようにして一本鎖cDNAを合成することができるが、これはFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(アマシャムファルマシアバイオテク社製)などの市販のキットを用いて行ってもよい。

0039

次に、以上のようにして合成した一本鎖cDNAを増幅する。該増幅は公知の方法により行うことができるが、例えば、上記一本鎖cDNAにPCR緩衝液(Tris-HCl、KCl、MgCl2、ゼラチン等を含む。)、dNTP、プライマー及びDNAポリメラーゼを添加し、サイクル反応を行うことができる。ここで使用するプライマーは、JCVd2の塩基配列(配列番号1)に基づいて設計することができ、該プライマーの塩基配列は特定のものに限定されない。例えば、配列番号3に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを組み合わせて用いることができる。また、上述のRT−PCR法において、配列番号3に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドに代えて配列番号5又は7に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることができ、配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドに代えて配列番号6に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることができる。さらに、一本鎖cDNA合成に使用するプライマーとしては、ランダムプライマーを使用してもよい。上記サイクル反応の条件は、使用するプライマーのTm値、DNAポリメラーゼの至適温度等に基づいて、当業者であれば容易に設定することができる。以上のようにして一本鎖cDNAを増幅して二本鎖cDNAとすることができるが、これはTakara Taq(宝酒造社製)などの市販のキットを使用して行うことができる。

0040

最後に、このようにして得られるRT−PCR産物分析する。これは、RT−PCR産物を分離し、その後にJCVd2に由来する核酸を検出することにより行うことができる。分離法としては公知のいずれの方法を用いてもよいが、好ましくは電気泳動法、より好ましくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、例えば、6%ポリアクリルアミドゲルを使用し、80Vで1時間45分電気泳動することによって行うことができる。

0041

このようにして分離した核酸試料についてJCVd2由来核酸を検出するためには公知の方法を用いることができるが、例えば、核酸を銀染色によって可視化する方法又はサザンハイブリダイゼーション分析法を用いることができる。銀染色による可視化は、例えば、Hadidiら(J. Virol. Meth., 30, 261 (1990))の方法に従って行うことができる。サザンハイブリダイゼーション分析は公知の方法により行うことができるが、例えば、Hadidiら(Phytopathology, 80, 263-268 (1990))の方法に従って行うことができる。この場合に使用するプローブとしては、JCVd2に特異的な核酸プローブ、好ましくはcDNAプローブ又はcRNAプローブを用いることができる。このようなプローブの合成は、当業者であれば、本発明に基づいて容易に行うことができる。

0042

以上のようにして得られるデータから、JCVd2の存否を判断する。上記のcDNA増幅において、配列番号3に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合には約330bpの断片、配列番号5に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号6に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合には約330bpの断片、並びに、配列番号7に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合には約250bpの断片の有無によって、JCVd2の存否を判断することができる。これらの断片の塩基数は、公知の方法により容易に知ることができる。例えば、電気泳動を行う際に、公知のDNAサイズマーカーローディングしておくことにより、検出される断片の塩基数を知ることができる。

0043

ハイブリダイゼーション法を用いるJCVd2の検出は、M.E.N.Fonsecaら(J. Virol. Methods, 57, 203-207 (1996))の方法のような公知の方法により行うことができるが、例えば、以下のようにして行うことができる。第一に、DNAプローブ又はRNAプローブを調製する。これらのプローブは、検出可能な標識を含むことが好ましい。標識としては、後の検出が可能であれば放射性同位体ビオチンなどの公知のいずれの標識を用いてもよいが、好ましくは化学発光標識、より好ましくはジゴキシゲニン(DIG)を用いる。

0044

標識DNAプローブは化学的合成法などの公知の方法により調製することができるが、好ましくは、本発明のcDNAを含有するプラスミドを用いて調製する。この場合には、本発明のcDNAを含有するプラスミドDNAを、適当な制限酵素で切断し、生成する断片を精製することができる。該精製は、フェノール/クロロホルム処理及びエタノール沈殿などの公知の方法により行うことができる。標識としてDIGを用いる場合には、例えば、DIG DNA labeling mixture(ベーリンガーマンハイム社製)を使用して標識DNAプローブを調製することができる。

0045

標識RNAプローブは化学的合成法などの公知の方法により調製することができるが、好ましくは、RNAポリメラーゼを用いて、本発明のcDNA又はこれを含むプラスミドから調製することができる。RNAポリメラーゼとしては、公知のポリメラーゼの中から適切なものを選択して使用することができるが、好ましくはT7又はT3RNAポリメラーゼを用いる。この場合には、本発明のcDNAを含有するプラスミドDNAを、標識用混合液を含む転写混合液中に添加し、転写を行う。標識としてDIGを用いる場合には、前記標識用混合液としては、例えば、RNA labeling kit(ベーリンガーマンハイム社製)を使用することができる。転写混合液及び反応条件などは、当業者であれば、適切に設定することができる。

0046

第二に、核酸試料中に含まれるJCVd2由来核酸と上記プローブとのハイブリダイゼーションを行う。上述のようにして被検植物から抽出した核酸試料を適切な条件下で変性させる(例えば、White B.A. and Bancroft F.C., J. Biol. Chem. 257, 8569-8572 (1982)参照)。該変性は、例えば、上記核酸試料にその3倍の容量の10×SSC(20%(w/v)のホルムアルデヒドを含む)を添加し、65℃で15分間加熱して上で冷却することにより行うことができる。該変性の後、必要であれば種々の濃度調整を行った後に、適切な膜にスポットする。このような膜としては公知のものを用いることができるが、好ましくはナイロン膜を使用する。膜にスポットした変性核酸試料は、適切な条件下で、例えば、80℃で2時間処理し、膜に核酸を固定する。次いで、膜に固定された核酸と標識プローブのハイブリダイゼーションを行う。これは公知の適切な方法を用いて行うことができるが、好ましくはM.E.N.Fonsecaら(上述)の方法に従って行う。この場合には、変性核酸試料が固定されている膜に対して、プローブを含まないハイブリダイゼーション溶液中でプレハイブリダイゼーションを行った後に、プローブを含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションを行う。

0047

このようなプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、例えば、次のようにして行うことができる。まず、上記の変性核酸試料固定化膜を、該膜100cm2当たり20mlのハイブリダイゼーション緩衝液(5×SSC、0.1%(w/v)M−ラウロイルサルコシン、0.02%(w/v)SDSを含み、必要に応じてDIG nucleic acid detection kit(ベーリンガーマンハイム社製)に含まれる1%(w/v)ブロッキング試薬を含む)とともに、68℃で1時間、プレハイブリダイズさせる。その後、100ng/mlのプローブを添加し、68℃で16時間、インキュベートする。この際、プローブは、予め95℃で3分間加熱した後に氷上で冷却することにより変性させておく。

0048

必要であれば、M.E.N.Fonsecaら(上述)の方法に改良を加えて行うことができ、このような改良は、当業者であれば容易に行うことができる。また、使用するプローブとしては、DNAであってもRNAであってもよいが、どちらを用いるかによって、上記の各条件の幾つかが異なることは当業者に理解されよう。このような異なる条件の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。

0049

最後に、核酸試料にハイブリダイズしたプローブを検出する。必要であれば、ハイブリダイゼーションの終わった膜を洗浄してから検出を行ってもよい。この洗浄処理は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。検出の方法としては、プローブに含有される標識を検出することができる方法であればよく、各種標識の検出は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、標識としてDIGを用いている場合には、DIG luminescent detection kit(ベーリンガーマンハイム社製)又はDIG nucleic acid detection kit(ベーリンガーマンハイム社製)などの市販のキットを用いて検出することができる。

0050

以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
〔実施例1〕JCVd2のRNAの調製
長崎県で採集した、カンキツウイロイド罹病の「不知火」((Citrus unshiu×C. sinensis)×C. reticulata)について、エトログシトロン系統アリゾナ861−S1(Citrus medica L. Var. Ethrog Engl.)を用いる木本検定及び電気泳動を行った。その結果としてJCVd2単独の保毒示唆されたものを用いて、ウイロイド純化(JCVd2のRNAの調製)を以下のようにして行った。

0051

罹病エトログシトロン系統アリゾナ861−S1の葉及び樹皮を合計30g採取し、これを70mlの抽出用緩衝液(0.13M Tris-Cl pH8.9、0.83%ドデシル硫酸ナトリウム、5%ポリビニルピロリドン、1M塩化リチウム、0.017MEDTApH7.0、1.4%2−メルカプトエタノール)中で磨砕した。次いで、水飽和フェノール・クロロホルム(1:1)抽出を2回行い、イソプロパノール沈澱によって濃縮した後、2M塩化リチウム10mlで処理して低分子核酸を抽出した。この抽出液にDNaseI2.5μl(2.5U)及びDNase緩衝液(0.05MTris-HCl, pH7.5、0.15MNaCl、0.005MMgCl2)を添加して、37℃で60分間インキュベートし、該抽出液中のDNAを分解した。その後、フェノール・クロロホルム(1:1)抽出及びエタノール沈澱によって、JCVd2のRNAを含む低分子RNAを得た。

0052

さらに、該低分子RNAをシークエンシャルポリアクリルアミドゲル電気泳動法(sPAGE,Roistacherら、Graft-transmissible diseases of citrus: Handbook for detection and diagnosis,FAO, Rome, 286pp, 1991)により、JCVd2の環状分子のみを分画した。すなわち、該低分子RNAを5%未変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ウイロイド画分を切り出し、8M尿素変性ポリアクリルアミドゲル上層して電気泳動した。次いで、このゲルをSYBR II RNA Gel Stain (Takara)を用いて染色した。分画したJCVd2の環状分子を単離するために、これを含むゲル片から電気溶出法(Roistacherら、上掲)を用いて溶出した。すなわち、ゲル片を透析膜中に入れて緩衝液(8mMTris、4mM酢酸ナトリウム、0.2mMEDTA、pH7.2)中で通電後、該ゲル片から透析膜中に溶出したRNAを回収した。最後に、エタノール沈澱を行って、JCVd2のRNAを単離した。

0053

〔実施例2〕cDNAの合成及び塩基配列の決定
得られたJCVd2のRNAからのランダムプライマーによるcDNA合成、プライマーによる増幅、プラスミドベクターへの組み込み、及び塩基配列の一部決定を行った。すなわち、まずJCVd2のRNA1μgにPrimer-R及びPrimer-AS(10μM:ともにサワディー社製)各1μlを加え、さらに水を加えて計10μlとし、80℃で10分間インキュベートした後に4℃で急冷することにより熱変性を行った。この混合物に5×ExpRB4μl、100mMDTT2μl、20mMdNTP2μl、Expand Reverse(50U/μl)1μl、及びRNaseInhibitor(10U/μl)0.5μl(これらは全てベーリンガーマンハイム社製)を添加し、30℃で10分間、42℃で1時間及び80℃で10分間の逆転写反応により、一本鎖cDNAを合成した。この一本鎖cDNA1μlにPrimer(25μM:サワディー社製)0.5μlとSuper Taq Premix(サワディー社製)48.5μlを添加して、PCRを行った。該PCRの条件は、90℃で1分間を1サイクル、95℃で30秒間(熱変性)−55℃で30秒間(アニーリング)−68℃で1分間(伸長)を30サイクル、及び72℃で30分間を1サイクルとした。得られたPCR増幅産物を、TA-cloning Kit(プロメガ社製)を用いてpGEMT Vector中にクローニングした。次いで、該ベクターに添付のT7及びSP6 primerを用いて、ABI377シークエンサーを使用して行うダイターミネーター法により塩基配列を解析した。

0054

得られた配列を基に、2組のプライマーセット:
(プライマーセット1);
CB2-CP:5'-CGTCGACGAAGGCTCCTCAGTC-3'(配列番号3)
CB2-CM:5'-ACGACCGCTCAGTCTCCTCT-3' (配列番号4)
(プライマーセット2);
CB2-TP:5'-TTCTTGTGGTTCCTGTGGTG-3' (配列番号5)
CB2-TM:5'-GTCTCCGAGGAGCCCTCAGG-3' (配列番号6)
を合成し、JCVd2のRNAを鋳型として、初めにRNA-PCRキット(宝酒造社製)を用いて、説明書に従ってランダムプライマーによりcDNAの合成を行った。さらに、合成した2組のプライマーセットを用い、得られたcDNAを鋳型とし、Takara Taq(宝酒造社製)を使用して、説明書に従ってPCRを行った。該PCRは、94℃で5分間-55℃で10秒間-72℃で5秒間を1サイクル、94℃で30秒間(変性)-55℃で10秒間(アニーリング)-72℃で5秒間(伸長)を35サイクル、そして72℃で5分間-15℃で5分間を1サイクルの条件で行った。得られた2種の増幅産物は、各々の増幅に用いたプライマーセットを用いて各々両方向からダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定した。すなわち、上記増幅産物100ngに、上記プライマー4pmolになるように添加し、ABI377シークエンサーを使用して行うダイターミネーター法によって塩基配列を解析した。これらの塩基配列を比較し、JCVd2のRNAの全塩基配列(配列番号1)を決定した。

0055

〔実施例3〕樹木のJCVd2感染についての遺伝子診断
JCVd2に感染している可能性のあるエトログシトロンを対象として、RT−PCRによるJCVd2の検出を行った。対照区では、健全エトログシトロンを対象として上記検出を行った。検定すべきカンキツ樹の新梢部分を0.05〜0.1g採集し、この新梢部分試料から、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用い、説明書に従って全RNAを抽出した。この全RNA抽出液1μl(全RNA約1μgに相当)を95℃で5分間インキュベートした後に急冷することにより熱変性を行い、RNAの2次構造を解消した。この溶液を用い、First-StrandcDNASynthesis Kit(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用い、添付のランダムヘキサマーを使用して、説明書に従ってcDNAを合成した。

0056

次いで、そのcDNAを鋳型として用い、以下の塩基配列:
CB2-CP:5'-CGTCGACGAAGGCTCCTCAGTC-3'(配列番号3)
CB2-CM:5'-ACGACCGCTCAGTCTCCTCT-3' (配列番号4)
からなるプライマーセット及びTakara Taq(宝酒造社製)を用い、説明書に従ってPCRを行った。このPCRは、DNAサーマルサイクラー480型(PerkinElmer社)を使用し、94℃で5分間-55℃で10秒間-72℃で5秒間を1サイクル、94℃で30秒間(変性)-55℃で10秒間(アニーリング)-72℃で5秒間(伸長)を35サイクル、そして72℃で5分間-15℃で5分間を1サイクルの反応を行った。

0057

以上のようにして得られたPCR産物をDNAサイズマーカーとともに6%ポリアクリルアミドゲルにローディングし、80Vで1時間45分電気泳動した後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電気泳動写真図1に示した。図1中のレーンMはDNAサイズマーカー、レーン1〜13は各供試サンプル由来の増幅産物、及びレーンHは健全(JCVd2無感染サンプル由来の増幅産物をそれぞれ示す。図1において、約330塩基の特異的断片の有無を確認することにより、JCVd2を検出することができた。

発明の効果

0058

本発明により、JCVd2ゲノムRNAの全塩基配列が明らかとなり、これにより、他のカンキツウイロイドとの類縁関係を明らかにすることが可能となる。さらに、JCVd2ゲノムRNAの塩基配列に基づいて設計した核酸プローブや核酸プライマーを用いることにより、JCVd2の選択的な遺伝子検出が可能となる。これにより、JCVd2に感染したカンキツ樹の早期診断や迅速な幼苗検定が可能となり、ウイロイドフリーのカンキツ苗木供給に大きな効果を発揮する。

0059

SEQUENCE LISTING

<110> Tohru Maotani, Director-General of National Institute of Fruit
Tree Science, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries

<120> JapaneseCitrus Viroid 2 Gene

<130> P98-0409

<160> 7

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1
<211> 327
<212> RNA
<213> Japanese Citrus Viroid 2

<400> 1
cggagacuuc uugugguucc uguggugaca ccccucagcc cuaccugcga aagaaaaaag 60
ucauuagaag gcgccagagg agacugagcg gucgucgucg acgaaggcuc cucagucgca 120
gagcgccgcu ggaucgacug gccuccggug gaaaacgaag auucgucuuc aauuucugua 180
accggaccgg ucuccuucgg ccgccgagcg cugguugccg cuagucgagc ggacuuccgu 240
cucuacccuc ccgaggcgcu uuucucacug accgacuucc guagcagcgg ggagagggug 300
aagcccugug aaccccugag ggcuccu 327

<210> 2
<211> 327
<212> DNA
<213> Japanese Citrus Viroid 2

<400> 2
cggagacttc ttgtggttcc tgtggtgaca cccctcagcc ctacctgcga aagaaaaaag 60
tcattagaag gcgccagagg agactgagcg gtcgtcgtcg acgaaggctc ctcagtcgca 120
gagcgccgct ggatcgactg gcctccggtg gaaaacgaag attcgtcttc aatttctgta 180
accggaccgg tctccttcgg ccgccgagcg ctggttgccg ctagtcgagc ggacttccgt 240
ctctaccctc ccgaggcgct tttctcactg accgacttcc gtagcagcgg ggagagggtg 300
aagccctgtg aacccctgag ggctcct 327

<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Japanese
Citrus Viroid 2 gene

<400> 3
cgtcgacgaa ggctcctcag tc 22

<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Japanese
Citrus Viroid 2 gene

<400> 4
acgaccgctc agtctcctct 20

<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Japanese
Citrus Viroid 2 gene

<400> 5
ttcttgtggt tcctgtggtg 20

<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Japanese
Citrus Viroid 2 gene

<400> 6
gtctccgagg agccctcagg 20

<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Designed
oligonucleotide based on the sequence of Japanese
Citrus Viroid 2 gene

<400> 7
ggcaactctt ctcagaatcc agc 23

0060

日本カンキツウイロイド2遺伝子の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。

図面の簡単な説明

0061

図1RT−PCRによるJCVd2の検出結果を示す電気泳動写真である。

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