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技術 膵外分泌機能診断剤

出願人 東京瓦斯株式会社
発明者 河野匡細井五三郎大嶋淳子伊藤あすか柴田邦彦
出願日 1999年9月17日 (20年5ヶ月経過) 出願番号 1999-263300
公開日 2000年6月13日 (19年8ヶ月経過) 公開番号 2000-159810
状態 特許登録済
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 糖類化合物 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 多糖類及びその誘導体
主要キーワード 濃度増加率 分岐状態 GM計数管 繰返し試験 標準検査 呼気テスト 標識位置 ベネキサート
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2000年6月13日)のものです。
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解決手段

13C-スターチを除く13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識包接錯体を含有する膵外分泌機能診断剤を提供する。U-13C-マルトース、13C-スターチ、1-13C-マルトテトラオースおよび1-13C-アミロースを除く13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、およびサイクロデキストリンまたはその修飾体ホスト分子とする13C−標識包接錯体またはその塩も提供される。

効果

本発明により、被験者への負担が小さく、かつ結果が即時に得られ、さらに、α−アミラーゼ分泌能に対する特異性の高い外分泌機能検査が可能になった。

概要

背景

外分泌機能検査慢性膵炎急性膵炎膵臓癌等の膵臓疾患診断に有用な検査法である。また、病態の把握や投薬管理、疾患の予後の評価にも有用な検査法である(総説Arvanitakis and Cooke. Gastroenterology 74:932 (1978)、Niederau and Grendell. Gastroenterology 88:1973 (1985)、Goldberg. Bull. Mol. Biol. Med. 15:1 (1990)、Lankisch. Int. J. Pancreatology 14:9 (1993)、Bank and Chow Gastroenterologist 2:224 (1994)、Steer et al. New Eng. J. Med. 332:1482 (1995))。

膵外分泌機能検査の標準検査法とされているのは、ゾンデを口から十二指腸まで挿入し十二指腸液採取する検査法で、現在ではセクレチン静脈内投与することにより膵液分泌誘起してから採取するセクレチン試験が一般的である。この方法は直接膵液の量や成分を分析することから正確度が高い。しかしながら、被験者の負担が非常に大きいため、繰返し試験スクリーニング試験として用いることのできる検査法ではない。また、験者にも技術的熟練が要求されるため、一部の医療機関でしか実施できない検査法である。さらに、X線透視下でゾンデの位置を確認しながら十二指腸液を採取するため、X線被曝の問題もある。

また、膵臓から血中に逸脱した膵外分泌性酵素を定量する検査が膵臓疾患のスクリーニングに臨床で利用されている(The Merck Manual 16th edition)。しかしながら、血中膵外分泌性酵素の上昇が見られるのは、急性膵炎の初期や慢性膵炎の再燃期などに限られ、膵外分泌性酵素の分泌能をかならずしも反映しない。さらに高脂血症を伴う膵炎では血清混濁のため、血中膵外分泌性酵素の上昇が検出できないことがある。かかる状況下、被験者への負担が小さく、かつ正確な結果が即時に得られるような簡易膵外分泌機能検査法の開発が望まれるところである。

近年、13C-標識スターチ投与する13C-呼気テストを膵外分泌機能検査に利用することが検討されている(Hiele et al. Gastroenterology 96:503 (1989)、Dewit et al. Pediatric Res. 32:45 (1992)、Z. Gastroenterol. 35:187 (1997))。スターチは腸管内で、膵臓から分泌されるα−アミラーゼによる内部の任意のα-1,4グルコシド結合の切断と、小腸粘膜上皮細胞α−グルコシダーゼマルターゼ)などの酵素の働きにより効率よくグルコースまで分解されて吸収される(Essentials of Human Metabolism 2nd ed. W.C.McMurray, Harper & Row Publlishers, NY)。13C-標識スターチを投与する13C-呼気テストは、13C-標識スターチが消化管内で分解された後に吸収されて、体内の代謝作用により脱炭酸され、13CO2を生じ呼気に排出される現象を利用するもので、安全で簡便な方法である。しかしながら、13C-標識スターチ以外の13C-標識オリゴ糖若しくは多糖については検討されていない。

また、上述のとおり、小腸粘膜上皮細胞には非還元末端α-1,4グルコシド結合を切断する酵素、α−グルコシダーゼ(マルターゼ)(Enzyme Handbook, Springer-Verlag, Berlin)が存在するので、スターチは、消化管内においてα−アミラーゼの作用を受けなくても、α−グルコシダーゼ(マルターゼ)等の酵素の働きのみによっても、非還元末端から順次グルコースに分解されて吸収される。つまり、膵外分泌性ではない小腸粘膜上皮細胞のα−グルコシダーゼ(マルターゼ)の影響を受けるため、13C-標識スターチ呼気テストは膵外分泌機能のみを反映しているわけではない。したがって、消化管内でα−アミラーゼに特異的な基質化合物を選択するのがより望ましい。

概要

13C-スターチを除く13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識包接錯体を含有する膵外分泌機能診断剤を提供する。U-13C-マルトース、13C-スターチ、1-13C-マルトテトラオースおよび1-13C-アミロースを除く13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、およびサイクロデキストリンまたはその修飾体ホスト分子とする13C−標識包接錯体またはその塩も提供される。

本発明により、被験者への負担が小さく、かつ結果が即時に得られ、さらに、α−アミラーゼの分泌能に対する特異性の高い膵外分泌機能検査が可能になった。

目的

従って、本発明は、被験者への負担が小さく、かつ結果が即時に得られ、膵外分泌機能検査を可能にする13C-スターチ以外の化合物を含む膵外分泌機能診断剤を提供することを目的とする。 また、α−アミラーゼの分泌能に対する特異性の高い膵外分泌機能診断剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、膵外分泌機能検査に利用できる新規な化合物を提供することも目的とする。

効果

実績

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牽制数
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請求項1

U-13C-マルトース、13C-スターチ、1-13C-マルトテトラオースおよび1-13C-アミロースを除く13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項2

α−アミラーゼにより加水分解される請求項1記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項3

α−グルコシダーゼにより加水分解されない請求項2記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項4

オリゴ糖または多糖を構成する少なくとも1個の糖分子が13Cで標識されている請求項1〜3のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項5

オリゴ糖または多糖を構成する少なくとも1個の糖分子が、13Cで標識された少なくとも1個の修飾基で修飾されている請求項1〜3のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項6

オリゴ糖または多糖が直鎖状または分岐状である請求項1〜5のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項7

オリゴ糖または多糖が環状である請求項1〜5のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項8

非還元末端が修飾されている請求項6記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項9

13C−標識オリゴ糖若しくは多糖が13C−サイクロデキストリンまたはβ-ガラクトシル−13C−マルトオリゴ糖である請求項1記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

請求項10

請求項1〜9のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩の誘導体

請求項11

サイクロデキストリンまたはその修飾体ホスト分子とする13C−標識包接錯体またはその塩。

請求項12

ホスト分子が13Cで標識されている請求項11記載の包接錯体またはその塩。

請求項13

ゲスト分子が13Cで標識されている請求項11記載の包接錯体またはその塩。

請求項14

ゲスト分子が、オリゴ糖、アミノ酸ペプチド有機酸脂肪酸脂肪酸グリセリドビタミン類カテキン類カロチノイドフラボノイドおよびコレステロールからなる群より選択される請求項11〜13のいずれかに記載の包接錯体またはその塩。

請求項15

ゲスト分子が、13C‐フェニルアラニンベンゾイルフェニルアラニル−13C−ロイシンおよびベンゾイルフェニルアラニル−13C−ロイシンメチルエステルからなる群より選択される請求項14記載の包接錯体またはその塩。

請求項16

13C-スターチを除く、13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、またはその誘導体を含有する膵外分泌機能診断剤

請求項17

13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、またはその誘導体がα−アミラーゼにより加水分解される請求項16記載の膵外分泌機能診断剤。

請求項18

13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、またはその誘導体がα−グルコシダーゼにより加水分解されない請求項17記載の膵外分泌機能診断剤。

請求項19

13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖が、直鎖状または分岐状オリゴ糖または多糖である請求項16〜18のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。

請求項20

13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖の非還元末端が修飾されている請求項19記載の膵外分泌機能診断剤。

請求項21

13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖が、環状オリゴ糖または多糖である請求項16〜18のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。

請求項22

サイクロデキストリンまたはその修飾体をホスト分子とする13C−若しくは14C−標識包接錯体またはその塩を含有する膵外分泌機能診断剤。

請求項23

診断すべき外分泌機能が膵臓からのα−アミラーゼの分泌能である請求項16〜22のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。

請求項24

診断すべき膵外分泌機能が膵臓からのα−アミラーゼおよびα−アミラーゼ以外の1つ以上の膵外分泌酵素の分泌能である請求項16〜22のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。

技術分野

0001

本発明は、膵外分泌機能診断剤として有用な新規化合物およびその用途に関する。

背景技術

0002

外分泌機能検査慢性膵炎急性膵炎膵臓癌等の膵臓疾患診断に有用な検査法である。また、病態の把握や投薬管理、疾患の予後の評価にも有用な検査法である(総説Arvanitakis and Cooke. Gastroenterology 74:932 (1978)、Niederau and Grendell. Gastroenterology 88:1973 (1985)、Goldberg. Bull. Mol. Biol. Med. 15:1 (1990)、Lankisch. Int. J. Pancreatology 14:9 (1993)、Bank and Chow Gastroenterologist 2:224 (1994)、Steer et al. New Eng. J. Med. 332:1482 (1995))。

0003

膵外分泌機能検査の標準検査法とされているのは、ゾンデを口から十二指腸まで挿入し十二指腸液採取する検査法で、現在ではセクレチン静脈内投与することにより膵液分泌誘起してから採取するセクレチン試験が一般的である。この方法は直接膵液の量や成分を分析することから正確度が高い。しかしながら、被験者の負担が非常に大きいため、繰返し試験スクリーニング試験として用いることのできる検査法ではない。また、験者にも技術的熟練が要求されるため、一部の医療機関でしか実施できない検査法である。さらに、X線透視下でゾンデの位置を確認しながら十二指腸液を採取するため、X線被曝の問題もある。

0004

また、膵臓から血中に逸脱した膵外分泌性酵素を定量する検査が膵臓疾患のスクリーニングに臨床で利用されている(The Merck Manual 16th edition)。しかしながら、血中膵外分泌性酵素の上昇が見られるのは、急性膵炎の初期や慢性膵炎の再燃期などに限られ、膵外分泌性酵素の分泌能をかならずしも反映しない。さらに高脂血症を伴う膵炎では血清混濁のため、血中膵外分泌性酵素の上昇が検出できないことがある。かかる状況下、被験者への負担が小さく、かつ正確な結果が即時に得られるような簡易膵外分泌機能検査法の開発が望まれるところである。

0005

近年、13C-標識スターチ投与する13C-呼気テストを膵外分泌機能検査に利用することが検討されている(Hiele et al. Gastroenterology 96:503 (1989)、Dewit et al. Pediatric Res. 32:45 (1992)、Z. Gastroenterol. 35:187 (1997))。スターチは腸管内で、膵臓から分泌されるα−アミラーゼによる内部の任意のα-1,4グルコシド結合の切断と、小腸粘膜上皮細胞α−グルコシダーゼマルターゼ)などの酵素の働きにより効率よくグルコースまで分解されて吸収される(Essentials of Human Metabolism 2nd ed. W.C.McMurray, Harper & Row Publlishers, NY)。13C-標識スターチを投与する13C-呼気テストは、13C-標識スターチが消化管内で分解された後に吸収されて、体内の代謝作用により脱炭酸され、13CO2を生じ呼気に排出される現象を利用するもので、安全で簡便な方法である。しかしながら、13C-標識スターチ以外の13C-標識オリゴ糖若しくは多糖については検討されていない。

0006

また、上述のとおり、小腸粘膜上皮細胞には非還元末端α-1,4グルコシド結合を切断する酵素、α−グルコシダーゼ(マルターゼ)(Enzyme Handbook, Springer-Verlag, Berlin)が存在するので、スターチは、消化管内においてα−アミラーゼの作用を受けなくても、α−グルコシダーゼ(マルターゼ)等の酵素の働きのみによっても、非還元末端から順次グルコースに分解されて吸収される。つまり、膵外分泌性ではない小腸粘膜上皮細胞のα−グルコシダーゼ(マルターゼ)の影響を受けるため、13C-標識スターチ呼気テストは膵外分泌機能のみを反映しているわけではない。したがって、消化管内でα−アミラーゼに特異的な基質化合物を選択するのがより望ましい。

発明が解決しようとする課題

0007

従って、本発明は、被験者への負担が小さく、かつ結果が即時に得られ、膵外分泌機能検査を可能にする13C-スターチ以外の化合物を含む膵外分泌機能診断剤を提供することを目的とする。 また、α−アミラーゼの分泌能に対する特異性の高い膵外分泌機能診断剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、膵外分泌機能検査に利用できる新規な化合物を提供することも目的とする。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、13C−標識オリゴ糖および13C−標識包接錯体慢性膵炎ラット経口投与し、投与後の呼気CO2中の13C濃度を測定することにより、膵外分泌機能検査を行うことができることを見出し、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、U-13C-マルトース、13C-スターチ、1-13C-マルトテトラオースおよび1-13C-アミロースを除く13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−標識包接錯体を提供する。また、本発明は、13C−標識スターチを除く13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識包接錯体を含有する膵外分泌機能診断剤を提供する。また、さらにα−アミラーゼにより分解されるが、α−グルコシダーゼによっては分解されない化合物を用いて、膵外分泌機能検査を行うことができる膵外分泌機能診断剤を提供する。本発明の要旨は以下の通りである。

0009

(1) U-13C-マルトース、13C-スターチ、1-13C-マルトテトラオースおよび1-13C-アミロースを除く13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。
(2)α−アミラーゼにより加水分解される(1)記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

0010

(3)α−グルコシダーゼにより加水分解されない(2)記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。
(4)オリゴ糖または多糖を構成する少なくとも1個の糖分子が13Cで標識されている(1)〜(3)のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

0011

(5)オリゴ糖または多糖を構成する少なくとも1個の糖分子が、13Cで標識された少なくとも1個の修飾基で修飾されている(1)〜(3)のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。
(6) オリゴ糖または多糖が直鎖状または分岐状である(1)〜(5)のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

0012

(7)オリゴ糖または多糖が環状である(1)〜(5)のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。
(8)非還元末端が修飾されている(6)記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。

0013

(9) 13C−標識オリゴ糖若しくは多糖が13C−サイクロデキストリンまたはβ-ガラクトシル−13C−マルトオリゴ糖である(1)記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩。
(10) (1)〜(9)のいずれかに記載の13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩の誘導体。

0014

(11)サイクロデキストリンまたはその修飾体ホスト分子とする13C−標識包接錯体またはその塩。
(12) ホスト分子が13Cで標識されている(11)記載の包接錯体またはその塩。

0015

(13)ゲスト分子が13Cで標識されている(11)記載の包接錯体またはその塩。
(14) ゲスト分子が、オリゴ糖、アミノ酸ペプチド有機酸脂肪酸脂肪酸グリセリドビタミン類カテキン類カロチノイドフラボノイドおよびコレステロールからなる群より選択される(11)〜(13)のいずれかに記載の包接錯体またはその塩。

0016

(15)ゲスト分子が、13C‐フェニルアラニンベンゾイルフェニルアラニル−13C−ロイシンおよびベンゾイルフェニルアラニル−13C−ロイシンメチルエステルからなる群より選択される(14)記載の包接錯体またはその塩。
(16) 13C-スターチを除く、13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、またはその誘導体を含有する膵外分泌機能診断剤。

0017

(17) 13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、またはその誘導体がα−アミラーゼにより加水分解される(16)記載の膵外分泌機能診断剤。
(18) 13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、またはその誘導体がα−グルコシダーゼにより加水分解されない(17)記載の膵外分泌機能診断剤。

0018

(19) 13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖が、直鎖状または分岐状オリゴ糖または多糖である(16)〜(18)のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。
(20) 13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖の非還元末端が修飾されている(19)記載の膵外分泌機能診断剤。

0019

(21) 13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖が、環状オリゴ糖または多糖である(16)〜(18)のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。
(22)サイクロデキストリンまたはその修飾体をホスト分子とする13C−若しくは14C−標識包接錯体またはその塩を含有する膵外分泌機能診断剤。

0020

(23)診断すべき膵外分泌機能が膵臓からのα−アミラーゼの分泌能である(16)〜(22)のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。
(24) 診断すべき膵外分泌機能が膵臓からのα−アミラーゼおよびα−アミラーゼ以外の1つ以上の膵外分泌酵素の分泌能である(16)〜(22)のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。

0021

「オリゴ糖」とは、二個ないし十数個単糖類重合した糖質をいい、オリゴ糖を構成する単糖類が修飾されていてもよい。「多糖」とは、単糖類が重合度10以上で重合した糖質をいい、多糖を構成する単糖類が修飾されていてもよい。「オリゴ糖若しくは多糖またはその塩の誘導体」とは、オリゴ糖若しくは多糖またはその塩の一部に置換、または付加があるものをいう。

0022

「直鎖状オリゴ糖または多糖」とは、直鎖状構造を持つオリゴ糖または多糖をいい、マルトトリオースマルトテラオース、などのマルトオリゴ糖やアミロースなどの多糖をいう。「分岐状オリゴ糖または多糖」とは、分岐状態構造を持つオリゴ糖または多糖をいい、アミロペクチングリコーゲンなどを含む。

0023

「環状オリゴ糖または多糖」とは、環状構造をもつオリゴ糖または多糖のことをいい、サイクロデキストリンなどがこれに含まれる。「非還元末端」とは、オリゴ糖または多糖などの糖鎖末端のうち、糖残基の1位の炭素が糖鎖の結合に関与している側の末端をいう。以下、本発明を詳細に説明する。

発明を実施するための最良の形態

0024

本発明は、U-13C-マルトース、13C-スターチ、1-13C-マルトテトラオースおよび1-13C-アミロースを除く13C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−標識サイクロデキストリン包接錯体を包含する。また、本発明の膵外分泌機能診断剤は、13C−標識スターチを除く13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識包接錯体を含有する膵外分泌機能診断剤を包含する。また、より望ましくは、非還元末端が修飾された、あるいは環状の13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、それらの誘導体を包含する。上記の13C−または14C−標識化合物薬剤学的許容できるものであるとよい。

0025

本明細書において、「13C−または14C−標識」とは、化合物中の任意の炭素が13Cまたは14Cに置換されていることにより、化合物中の13Cまたは14Cの存在比天然存在比より高くなっていることを言い、その製法は問わない。「非還元末端が修飾されているオリゴ糖若しくは多糖」とは、非還元末端のグルコシル基の炭素が修飾されているオリゴ糖若しくは多糖である。グルコピラノース以外の修飾基としては、例えば、ガラクトシル基、ジガラクトシル基などのオリゴ糖からなる修飾基、アルキル基アルコキシ基メトキシ基ベンジルオキシ基など)、カルバモイル基ピリジルアミノ基などが挙げられ、非還元末端のグルコシル基の2個所の炭素にまたがった修飾であるエチリデン化、ベンジリデン化なども含まれる。

0026

オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、それらの誘導体の具体例として、パラニトロフェニル−6−0−ベンジルマルトペンタオシド、4−ニトロフェニル マルトヘキサオシド 4,6−エチリデングルコシド、4,6−ベンジリデンα−0−4−ニトロフェニル−マルトペンタオシド、0−6−デオキシピリジルアミノ−α−マルトペンタオシド、パラニトロフェニル−4,6−ジ−0−(N−エチル)4−カルバモイル−マルトペンタオシドなどが挙げられる。

0027

上記の化合物は各々文献(Carbohydrate Research ,176(1988),107−115、特開平3−91496、US Patent 4649108、Journal of Chromatography ,336(1984),368−373、特開平8−291)に記載された方法で合成することができる。その際、例えば、市販の13C−または14C−標識マルトオリゴ糖、または公知の方法で得られる13C−または14C−標識マルトオリゴ糖を原料として用いることにより、13C−または14C−標識された上記の化合物を合成することができる。

0028

例えば、非還元末端が修飾されたオリゴ糖の一つであるガラクトシルオリゴ糖は、オリゴ糖に、乳糖を加えてラクターゼを作用させ、反応混合物からカラムクロマトグラフィーにより分取することにより得ることができる(特開平4-209277公報, 特開平8-196289公報,特開平10-316697公報)。この際、例えば、13C−または14C−標識されたオリゴ糖を用いることにより、13C−または14C−標識ガラクトシルオリゴ糖を得ることができる。また、13C−または14C−ガラクトシル標識乳糖を使用すれば、ガラクトシル基が13C−または14C−標識されたガラクトシルオリゴ糖がえられる。

0029

「サイクロデキストリン」とは、グルコピラノース単位からなるα-1,4結合の環状オリゴ糖である。環を形成するグルコースの数は任意であり、グルコースの数が6〜8のα−、β−、およびγ−サイクロデキストリンが市販されている。サイクロデキストリンの糖が分枝を有する場合、水酸基が修飾されている場合もあり、このような修飾基を有するサイクロデキストリンを「サイクロデキストリンの修飾体」ということとする。具体的には、アルキル化メチル化など)、ヒドロキシアルキル化ヒドロキシプロピル化など)、エステル化アセチル化サクシニル化など)、グルコシル化カルボキシメチルエーテル化リン酸エステル化スルホブチルエーテル化、カルボキシメチル化などを挙げることができ、これらの修飾体は、Loftssonet al. J. Pharmaceu. Sci. 85:1017(1996)、Stellaet al. Pharmaceutical Res.14:556(1997)、「シクロデキストリン」戸田不二雄 監修産業図書刊に記載されている。

0030

たとえば13C−または14C−標識サイクロデキストリンは、トウモロコシ等のC4植物由来天然の13C濃縮スターチや市販の13C−または14C−標識スターチにシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させ、反応混合物からカラムクロマトグラフィーにより分取することにより得ることができる。

0031

さらに、この13C−または14C−標識サイクロデキストリン混合液ブロモベンゼンを加え、10℃で一晩攪拌遠心分離により13C−または14C−標識β−およびγ−サイクロデキストリンの沈殿物を得ることができる。これをブロモベンゼン飽和氷水洗浄後、水蒸気蒸留により濃縮放置後13C−または14C−標識β−サイクロデキストリンが得られる。母液グルコアミラーゼ処理した後、シクロヘキサンを加え、その上清を濃縮しn−プロパノールを加えることにより13C−または14C−標識γ−サイクロデキストリンを得ることができる。

0032

サイクロデキストリンの修飾体は、以下のようにして製造することができる。たとえば、β−サイクロデキストリン水溶液水酸化カリウムを加え、アルカリ性にした後、70〜80℃に加温し2−クロロエタノールもしくは3−クロプロパノールを加える。その後、室温に冷却し中和した後、活性炭を加え濾過した濾液を濃縮、乾燥させる。残渣にDMFを加え不溶物を除いた後、アセトンを加えるとヒドロキシエチルもしくはヒドロキシプロピルサイクロデキストリンが得られる(Irieet al. Pharmaceutical Res.5:713(1988))。この際に13C−または14C−標識サイクロデキストリンを用いることにより、13C−または14C−標識ヒドロキシエチルサイクロデキストリンまたはヒドロキシプロピルサイクロデキストリンが得られる。

0033

「サイクロデキストリン包接錯体」とは、サイクロデキストリンやサイクロデキストリン修飾体の環状の分子内空隙に任意の化合物が包接されたものをいう。包接される化合物としては、アミノ酸、脂肪酸、有機酸、カテキン類、ビタミン類、カロチノイド、フラボノイド、およびコレステロール、それらの修飾体などが挙げられる。その他にもオリゴ糖、ペプチド、脂肪酸グリセリドおよびそれらの修飾体などが挙げられる。

0034

13C−または14C−標識サイクロデキストリン包接錯体としては、包接された化合物中の任意の炭素が、13Cまたは14Cに置換されていることにより、サイクロデキストリン包接錯体中の13Cまたは14Cの存在比が天然存在比より高くなっているものであってもよく、また、サイクロデキストリンやサイクロデキストリンの修飾体が13C−または14C−標識されていてもよく、その製法は問わない。

0035

これまでに報告されているサイクロデキストリン包接錯体の具体例を以下に挙げる。ホスト分子は以下に例示する化合物に限られるものではない。
フェニルアラニン/β−サイクロデキストリン包接錯体
トリプトファン/α−サイクロデキストリン包接錯体
ヒスチジン/α−サイクロデキストリン包接錯体
シンナリジン/β−サイクロデキストリン包接錯体
フェルラ酸/β−サイクロデキストリン包接錯体
フェニルアラニルロイシン/β−サイクロデキストリン包接錯体

0036

他にも、ゲスト分子として、フェノールヒドロキシ安息香酸ベンズアルデヒドメチルスルホキシド、安息香酸アニリンアミノ安息香酸メチル安息香酸ニトロフェノールピリジン酢酸エタノール、プロパノール、ブタンジオールなどのアルコール類、プロスタディン塩酸ベネキサートニトロブセリン、塩酸セファチアム、ヘキセチルピロキシカムリコロストなどが挙げられる。これらは「シクロデキストリン」戸田不二雄監修産業図書刊に記載されている。

0037

サイクロデキストリン包接錯体は、包接錯体中のホスト・ゲスト比に応じて、例えば1:1で包接されている場合には当モル比になるようにホスト化合物ゲスト化合物精製水に加え、12時間程度撹拌したのち、スプレードライ法によって得られる。この際、例えば、ゲスト分子として13C−標識化合物を用いれば13C−標識サイクロデキストリン包接錯体を得ることができる。

0038

上記の13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはサイクロデキストリン包接錯体は、塩の形で得ることもできる。塩としては、塩酸、硫酸リン酸などの無機酸との塩;蟻酸、酢酸、プロピオン酸グリコール酸コハク酸リンゴ酸酒石酸クエン酸トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩;ナトリウムカリウムなどのアルカリ金属との塩;カルシウムなどのアルカリ土類金属との塩;アンモニウムエタノールアミントリエチルアミンジシクロヘキシルアミンなどの有機アミンとの塩などを挙げることができる。

0039

本発明の膵外分泌機能診断剤は、13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識サイクロデキストリン包接錯体を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、経口剤錠剤カプセル剤散剤顆粒剤液剤等)に製剤化されたものであるとよい。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。また、凍結乾燥製剤として用いたりすることもできる。

0040

13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識サイクロデキストリン包接錯体の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100 重量%、好ましくは50〜100重量%である。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、13C−または14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、またはサイクロデキストリン包接錯体の製剤中における含量は、約10〜100 重量%、好ましくは50〜100 重量%であり、残部は担体である。

0041

本発明の膵外分泌機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の13CO2または14CO2の増加を確認できる量が必要であり、患者年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば1回当たりの投与量は成人の場合、1〜2000mg/kg体重程度である。

0042

本発明の膵外分泌機能診断剤を用いる検査は、13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識サイクロデキストリン包接錯体を被験者に投与することにより行う。投与後の血中、尿中、便中の13C−若しくは14C−標識化合物濃度を測定する検査も可能であるが、投与後の呼気CO2 中の13C濃度あるいは14C濃度の増加を測定する呼気テストが望ましい。13C−または14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、またはサイクロデキストリン包接錯体を被験者に投与する前に、試験食等を投与して、膵酵素の分泌を誘起しておいてもよく、試験食等とともに投与してもよい。また、複数種の13C−または14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、またはサイクロデキストリン包接錯体を組み合わせて使用してもよい。13Cの場合は具体的には、投与後の呼気CO2 中の13C濃度を測定し、投与後一定時間(例えば5分、10分、15分)経過後における呼気CO2 中の13C濃度の増加率(Δ13C(‰))、あるいは投与後一定時間までの呼気CO2 中の13C濃度の増加率(Δ13C(‰))の積算または経時変化立ち上がりの傾き、傾きの変化ピークの時間等)のデータから膵外分泌機能の診断を行う。14Cの場合は具体的には、投与後の呼気CO2 中の14C濃度すなわち放射能を測定し、投与後一定時間(例えば5 分、10分、15分)経過後における呼気CO2中の放射能量、あるいは投与後一定時間までの呼気CO2 中の放射能量の増加率の積算または経時変化(立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等)のデータから膵外分泌機能の診断を行う。このような検査法は、13C−または14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または包接錯体を被験者に投与すると、この化合物が膵外分泌性のα-アミラーゼの作用を受けて分解された後に消化管から吸収されて、体内の代謝作用により脱炭酸され、13CO2または14CO2を生じ呼気に排出される現象を利用するものである。

0043

また、オリゴ糖、ペプチド、脂肪酸グリセリドおよびそれらの修飾体が包接されたサイクロデキストリン包接錯体を用いる場合は、分解の最初の反応はα−アミラーゼによるサイクロデキストリンの切断であり、切断に伴って放出されたオリゴ糖、ペプチド、脂肪酸グリセリドおよびそれらの修飾体が、さらに膵外分泌性のα−アミラーゼ、プロテアーゼリパーゼなどの作用を受けて分解され消化管から吸収された後、体内の代謝作用により脱炭酸され、13CO2または14CO2を生じ呼気に排出される現象を利用するものである。

0044

ここで、呼気CO2 中の13C濃度の測定は、ガスクロマトグラフ質量分析法GC-MS)、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、NMR核磁気共鳴)法等で行うことができる。また、呼気CO2 中の14C濃度すなわち放射能の測定は、呼気を直接あるいは溶媒等にCO2 をトラップした後、GM計数管液体シンチレーションカウンター固体シンチレーションカウンターオートラジオグラフィー電離箱法などで行うことができる。本発明の膵外分泌機能診断剤は、膵外分泌機能のうち、特に膵臓からのα−アミラーゼの分泌能を診断するのに効果的である。

0045

以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
〔実施例1〕13C−標識サイクロデキストリンの製造
13C−標識スターチ(クロレラ工業製、Algal Starch (water-soluble), LotNo. 8031,S, U-13C:98.6 atom %, Starch Content: 93.5%)を 5 % (w/v)の濃度で 50 mM酢酸緩衝液pH 5.4 に溶解し、これにシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ(林原製)を100 Unit加え40℃で24時間反応させた。100℃で15分間処理し酵素を失活させた後に、グルコアミラーゼを添加し40℃で1時間反応させて、13C−標識サイクロデキストリン以外の成分をグルコースに分解した。反応終了後100℃で15分間処理しグルコアミラーゼを失活させた。

0046

カーボンカラム(2.5 cm x 25 cm)にこの溶液アプライし、水 500mlで洗浄し、15 %エタノール溶液、40 %エタノール溶液を順次通し、40 %エタノール溶液溶出画分に13C−標識サイクロデキストリンを回収した。得られた13C−標識サイクロデキストリン溶液の溶媒を留去し、少量の水に溶解して凍結乾燥した。パラニトロフェノールと混合し、波長450 nm の吸収の増大からサイクロデキストリンであることを確認した。13Cの標識位置は13C-NMRで行った(図1)。

0047

13C-NMR(DMSO-d6, 300MHz)
38.5-40.2 ppmジメチルスルホキシド
59.5-60.1 ppmグルコース残基6位
71.4-73.1 ppm グルコース残基3,4,5位
80.9-82.5 ppm グルコース残基2位
101.5-102.1 ppm グルコース残基1位
また、得られた13C−標識サイクロデキストリンはHPLC分析(Shodex Asahipak GS-220 HQ)の結果、α-サイクロデキストリンが 45 %、β-サイクロデキストリンが 45 %、γ-サイクロデキストリンが 10 % の混合物であった。

0048

〔実施例2〕13C−標識サイクロデキストリン呼気テスト
慢性膵炎ラットと対照ラットに実施例1で得られた13C−標識サイクロデキストリンを経口投与し、投与後の呼気CO2中の13C濃度の経時変化を測定する13C−標識サイクロデキストリン呼気テストを行った。慢性膵炎ラットの作成はMundlosらの方法(Mundlos et al.Pancreas 1:29 (1986))に従い、5週齢の Wistar 系雄性ラット膵管オレイン酸注入し、3週間飼育した。また、腹部正中切開したラット対照とした。

0049

一晩絶食した8週齢の慢性膵炎ラット、および対照ラットを、無麻酔のままマイクロ照射装置用ラットホルダー内に固定した。ストロークポンプ[バリアブル・ストロークポンプ VS-500、(株)柴田科学工業] を用いて呼気を約 100〜300ml/minの速度で吸引し、そのまま13CO2アナライザーEX-130S [(株)日本分光] のフローセルに導入し、13C atom %、炭酸ガス濃度連続測定した。ラットホルダーとストロークポンプの間にはパーマピュアドライヤー( MD-050-12P、Perma Pure INC. )を設置して呼気中の水蒸気を除去した。炭酸ガス濃度が安定した状態でいったんラットホルダーからラットを出し、13C−標識サイクロデキストリン水溶液(75 mg/kg, 5 ml/kg)を、経口投与用ゾンデを用いて胃内に投与した。尚、Δ13C(‰)は各時点の呼気CO2中の13C濃度 (13C tmin)とCO2標準ガスの13C濃度(13C std)から下式により算出した。

0050

Δ13C(‰)={(13C tmin-13C 0min)/13C std}×1000

0051

対照ラット、慢性膵炎ラットともに、30分までΔ13C(‰)値が増加を続けたが、慢性膵炎ラットのΔ13C(‰)値の増加は対照ラットよりも小さかった(図2)。15分のΔ13C(‰)値は慢性膵炎ラットで12.88±4.25‰、対照ラットで30.39±5.29‰であり、慢性膵炎ラットでは対照ラットに比べ有意に(p<0.05,ANOVAwith FischerLSD)低かった。

0052

〔実施例3〕13C−標識ガラクトシルマルトヘキサオースの製造
13C−標識スターチ(クロレラ工業製、Algal Starch (water-soluble), LotNo. 8031,S, U-13C:98.6 atom %, Starch Content: 93.5%、4.65 g)を 0.5 % (w/v)の濃度で 50 mM酢酸緩衝液pH 5.4 に溶解し、これにシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ(林原製)を186 Unit加え40℃で2時間20分間反応させた。95℃で15分間処理し酵素を失活させ、Sephadex G-25により精製した。この操作を4回繰り返し、13C−α−サイクロデキストリン4.39 g(収率23.6%)を得た。

0053

得られた13C−α−サイクロデキストリン4.39 gにピリジン(200 mL)を加え氷冷した。これに、無水酢酸(100 mL)を加えた。30分後に氷浴からはずして、その後室温で36時間攪拌した。減圧濃縮し得られた残さにトルエンを加えて共沸する操作を3回繰り返した。残さに酢酸エチルと水を加えて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥後にろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し過アセチル13C−α−サイクロデキストリン5.1 gを得た。

0054

過アセチル13C−α−サイクロデキストリン3.25 gを無水酢酸(49.8 mL)と硫酸(1.02 mL)に溶解し、55℃で加熱攪拌した。5時間後に氷冷しピリジン(5.1 mL)を加えた。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残さにトルエンを加えて共沸する操作を3回繰り返した。残さにクロロホルムと水を加えて抽出した。有機層を合わせ無水硫酸マグネシウムで乾燥後にろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。同操作を2回行い、回収した原料を用いて再び開環反応を行い、計6.50 gの原料から過アセチル13C−マルトヘキサオース4.80 gを得た。

0055

過アセチル13C−マルトヘキサオース3.76 gを乾燥メタノール1500 mLに溶解し、氷冷した。これに5.18 Mナトリウムメトキシドメタノール溶液(776 μL)を加え、30分後に室温に移し攪拌した。20時間後に5.18 Mナトリウムメトキシドのメタノール溶液(388 μL)を追加した。3時間半後にアンバーリスト15(16g)を加えて中和し、ろ過した。樹脂をメタノールおよび水で洗浄し、ろ液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残さをHPLC(TSK−Gel Amide−80 column)により精製し、13C−マルトヘキサオース1.78 gを得た。同操作を2回さらに繰り返して計2.03 gの13C-マルトヘキサオースを得た。

0056

13C−マルトヘキサオース2.03 gおよびラクトース一水和物(710 mg)に20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0, 6.50 mL)を加え、40℃で溶解した。Biolacta(大和化成)0.87 mgの20 mMリン酸カリウム緩衝液(20μL)を加え、40℃で静置した。9時間半後に反応混合物を95℃で15分間加熱した。この酵素反応溶液をHPLC(TSK-Gel Amide-80 column)により精製し、ガラクトシル13C−マルトヘキサオース239 mgを得た。ピリジルアミノ化したガラクトシル13C−マルトヘキサオースのHPLC(TSK-Gel Amide-80 column)分析によると、上記合成で得られたガラクトシル13C−マルトヘキサオースは、主成分がβ−1,4−ガラクトシル13C−マルトヘキサオースであり、9%以下のβ−1,6−ガラクトシル13C−マルトヘキサオースを含んでいた。

0057

構造の確認は、13C−NMRおよびマススペクトルで行った(図3)。
13C−NMR(D2O, 270MHz)
60.3-61.6 ppmグルコース6残基6位
67.4 ppm 1,4-ジオキサン
70.7-79.6 ppm グルコース6残基2,3,4,5位
92.4-96.9 ppm還元末端グルコース1位
100.1-101.5 ppm グルコース5残基1位
マススペクトル(ESI−MS) m/z 1211.3 (M++Na)

0058

〔実施例4〕ガラクトシル−13C−マルトヘキサオース呼気テスト
実施例2と同様に、慢性膵炎ラットと対照ラットに実施例3で得られたガラクトシル13C−マルトヘキサオースを経口投与し(75 mg/kg)、投与後の呼気CO2中の13C濃度の経時変化を測定するガラクトシル13C−マルトヘキサオース呼気テストを行った。

0059

対照ラット、慢性膵炎ラットともに、測定を終了した30分までΔ13C(‰)値が増加を続けたが、慢性膵炎ラットのΔ13C(‰)値の増加は対照ラットよりも小さかった(図4)。投与後10分のΔ13C(‰)値は慢性膵炎ラットで18.89±17.01‰、対照ラットで95.57±42.40‰であり慢性膵炎ラットでは対照ラットに比べ有意に(p<0.05,ANOVAwith FischerLSD)低かった。

0060

〔実施例5〕[1−13C]−フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン包接錯体溶液の製造
[1−13C]−フェニルアラニン 299 mgとヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン 1818 mg(モル比1:1)を5mlの蒸留水に加え、85℃に加温して溶解した。フェニルアラニンの溶解度は25℃で148 mg/5 mlであるが、上記の溶液を25℃まで自然冷却し、フェニルアラニンの析出が見られない[1−13C]−フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン包接錯体溶液を調製した。一方、[1−13C]−フェニルアラニン 299 mgのみを5mlの蒸留水に加え、85℃に加温して溶解した場合、25℃まで自然冷却したのちにフェニルアラニンの析出が見られた。ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン共存下のフェニルアラニンの溶解度上昇から、[1−13C]−フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン包接錯体の形成が確認された。

0061

〔実施例6〕[1−13C]−フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン包接錯体呼気テスト
実施例2と同様に、慢性膵炎ラットと対照ラットに実施例5で得られた[1−13C]−フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン包接錯体を経口投与し([1−13C]−フェニルアラニンとして59.76 mg/kg)、投与後の呼気CO2中の13C濃度の経時変化を測定する[1−13C]−フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン包接錯体呼気テストを行った。

0062

慢性膵炎ラットとして19週齢のWBN/kob系雄性ラット(Japan SLC, Inc.) を用いた。また、19週齢のWistar系雄性ラットを対照とした。対照ラット、慢性膵炎ラットともに、30分間を通じて慢性膵炎ラットのΔ13C(‰)値は対照ラットよりも小さかった(図5)。投与後5分のΔ13C(‰)値は慢性膵炎ラットで38.18±17.46‰、対照ラットで132.60±26.79‰であり、慢性膵炎ラットでは対照ラットに比べ有意に(p<0.005,ANOVAwith FischerLSD)低かった。

0063

〔実施例7〕ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン包接錯体の製造
1-13C-L-ロイシン1g(Masstrace社)を塩化水素/メタノールに溶解後還流し、得られた13C-L-ロイシンメチルエステルをジクロロメタン50mlに懸濁後氷冷撹拌下トリエチルアミン1.08mlを滴下した。さらに、N-ベンゾイル-DL-フェニルアラニン2.0g、HOBt ( 1-Hydroxy-1H-benzotriazole・H2O )2.34g及びジクロロメタンを50ml添加した。次に、WSC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide・HCl)1.49gをジクロロメタン100mlに溶解した溶液を加え、氷冷下で1時間撹拌その後室温で一晩撹拌した。反応の終了は、展開溶媒にクロロホルム:メタノール(95:5)を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認した。濃縮した後酢酸エチルで抽出し、1N-塩酸、5%NaHCO3、水で洗浄後硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮乾固後ベンゾイルフェニルアラニル〔1-13C〕−ロイシンメチルエステル 2.32gを得た。

0064

ベンゾイルフェニルアラニル〔1-13C〕−ロイシンメチルエステル2.32gをメタノール100mlに溶解後氷冷撹拌下で1N-NaOHを6.4ml滴下し、その後70℃で2.5時間加熱撹拌した。反応の終了は、展開溶媒にクロロホルム:メタノール(95:5)を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認した。反応終了後1N-HClで中性とした後、濃縮し5%NaHCO3 に溶解した。酢酸エチルで洗浄後5%-NaHCO3を1N-HClで酸性とし酢酸エチルで抽出した。水洗後硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮乾固後ベンゾイルフェニルアラニル〔1-13C〕−ロイシン1.93gを得、酢酸エチルで再結晶した。

0065

構造の確認と13Cの標識位置は、13C−NMRとマススペクトルで行った。
13C−NMR(重メタノール、300Mz、) 175.8 ppm(13COOH)
マススペクトル m/z383(M+)、365、224、131、105、77
LC−MS m/z384 (M++H) 、252、224、105
ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンはγ−サイクロデキストリンとの重量比が1:4(モル比1:1)になるように調製した。γ−サイクロデキストリンを少量の精製水に、ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンはエタノールにそれぞれ溶解し、両者を混合しスターラー(500 rpm)で12時間攪拌しつづけた後、スプレードライ法により調製した。スプレードライはヤマト科学Pulvis minispray GA-31を使用し、入口温度100℃、出口温度50℃、乾燥空気流量0.45m3/min,噴霧圧力1.5 kg/cm2、流速5 ml/minの条件で行った。得られた試料を更に24時間減圧乾燥した後、18号(850μm)ふるいを通過し、50号(300μm)ふるい上に残留した粉末としてベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン包接錯体を得た。

0066

構造の確認は粉末X線回折により行った。Geigerflex Model 2013 diffractometer(理学電機(株))を使用し、Niフィルター、Cu-Kα線(30 kV, 20 mA)、走査速度1°/minの条件で測定した。ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン包接錯体はベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン固有回折ピーク、γ−サイクロデキストリン固有の回折ピークが認められずハロー曲線が観察された(図6)。

0067

〔実施例8〕ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン包接錯体呼気テスト
実施例2と同様に、慢性膵炎ラットと対照ラットに実施例7で得られたベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン包接錯体を経口投与し(0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウムCMC-Na)溶液に懸濁、ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンとして100 mg/kg)、投与後の呼気CO2中の13C濃度の経時変化を測定するベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン包接錯体呼気テストを行った。40分まで常に慢性膵炎ラットのΔ13C(‰)値は対照ラットに比べ低かった(図7)。投与後10分のΔ13C(‰)値は慢性膵炎ラットで0.03±1.73‰、対照ラットで7.43±4.42‰であり、慢性膵炎ラットでは対照ラットに比べ低かった。

0068

〔実施例9〕ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン包接錯体の製造
実施例7の製造過程で得られたベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステルはγ−サイクロデキストリンとの重量比が1:4(モル比1:1)になるように調製した。γ−サイクロデキストリンを少量の精製水に、ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステルはエタノールにそれぞれ溶解し、両者を混合しスターラー(500 rpm)で12時間攪拌しつづけた後、実施例7と同様の操作でベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン包接錯体を得た。

0069

構造の確認も実施例7と同様に行った。ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン包接錯体はベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル固有の回折ピーク、γ−サイクロデキストリン固有の回折ピークが認められず、ハロー曲線が観察された(図8)。

0070

〔実施例10〕ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン包接錯体呼気テスト
実施例2と同様に、慢性膵炎ラットと対照ラットに実施例9で得られたベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン包接錯体を経口投与し(0.5%CMC-Na溶液に懸濁、ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステルとして70 mg/kg, 5 ml/kg)、投与後の呼気CO2中の13C濃度の経時変化を測定するベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン包接錯体呼気テストを行った。

0071

40分まで常に慢性膵炎ラットのΔ13C(‰)値は対照ラットに比べ低かった(図9)。投与後10分のΔ13C(‰)値は慢性膵炎ラットで2.24±1.32‰、対照ラットで6.73±2.06‰であり慢性膵炎ラットでは対照ラットに比べ有意に(p<0.05,ANOVAwith FischerLSD)低かった。

0072

〔製剤例1〕 (内服液剤
13C−標識サイクロデキストリン1.5重量部に対し、精製水を加え全量を100重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。

0073

〔製剤例2〕 (内服液剤)
13C−標識サイクロデキストリンと非標識サイクロデキストリンを1対1に混合し、これの3重量部に対し、精製水を加え全量を100重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。

発明の効果

0074

本発明により、被験者への負担が小さく、かつ正確な結果が即時に得られるような13C−スターチ以外の13C−若しくは14C−標識オリゴ糖若しくは多糖またはその塩、その誘導体、または13C−若しくは14C−標識包接錯体を用いた簡易膵外分泌機能検査法が可能になった。

0075

中でも、サイクロデキストリンや非還元末端修飾オリゴ糖または多糖はスターチと異なり、α-グルコシダーゼ(マルターゼ)に分解されず、消化管内においてα−アミラーゼに特異的な基質であることから、α−アミラーゼの分泌能を評価するための基質として優れている。また、消化管内におけるα−アミラーゼに特異的な基質であるサイクロキストリをホスト分子とする包接錯体は包接される分子を選ぶことによって、より総合的で、病態特異的な検査を行う基質を供する。これらの方法は十二指腸液検査と比べて被験者、験者ともに負担がはるかに小さい。

0076

この検査法は、集団検診や人間ドッグでの膵炎のスクリーニング検査、さらに、慢性膵炎の重症度の判定、未だに死亡率の高い(30%)劇症膵炎の重症予知、膵炎の成因の診断、膵臓癌の早期診断にも利用される可能性がある。また、一般外来患者診察において、膵炎を否定する診断法としても有用である可能性が高い。

図面の簡単な説明

0077

図113C−標識サイクロデキストリンの13C-NMRスペクトルを示す。
図213C−標識サイクロデキストリン投与後の呼気CO2中の13C濃度増加率(Δ13C(‰))の経時変化。0分で慢性膵炎ラット(n=2,●)、および対照ラット(n=4,○)に13C−標識サイクロデキストリン(75mg/kg)を経口投与した。バーはSDを示す。
図313C−標識ガラクトシルマルトヘキサオースの13C-NMRスペクトルを示す。
図413C−標識ガラクトシルマルトヘキサオース投与後の呼気CO2中の13C濃度増加率(Δ13C(‰))の経時変化。0分で慢性膵炎ラット(n=3,●)、および対照ラット(n=4,○)に13C−標識ガラクトシルマルトヘキサオース(75mg/kg)を経口投与した。バーはSDを示す。
図513C−標識フェニルアラニン/ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン(1-13C-Phe/hp-β-CD)包接錯体投与後の呼気CO2中の13C濃度増加率(Δ13C(‰))の経時変化。0分で慢性膵炎ラット(n=4,●)、および対照ラット(n=4,○)に1-13C-Phe/hp-β-CD包接錯体(1-13C-Pheとして59.76 mg/kg)を経口投与した。バーはSDを示す。
図6ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン(Bz-Phe-(13C-Leu)/γ-CD)包接錯体の粉末X線回折スペクトル
図7ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシン/γ−サイクロデキストリン(Bz-Phe-(13C-Leu)/γ-CD)包接錯体投与後の呼気CO2中の13C濃度増加率(Δ13C(‰))の経時変化。0分で慢性膵炎ラット(n=2,●)、および対照ラット(n=2,○)にBz-Phe-(13C-Leu)/γ-CD(Bz-Phe-(13C-Leu)として100 mg/kg)を経口投与した。バーはSDを示す。
図8ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン(Bz-Phe-(13C-Leu)Me/γ-CD)包接錯体の粉末X線回折スペクトル。
図9ベンゾイルフェニルアラニル[1−13C]−ロイシンメチルエステル/γ−サイクロデキストリン(Bz-Phe-(13C-Leu)Me/γ-CD)包接錯体投与後の呼気CO2中の13C濃度増加率(Δ13C(‰))の経時変化。0分で慢性膵炎ラット(n=4,●)、および対照ラット(n=4,○)にBz-Phe-(13C-Leu)Me/γ-CD(Bz-Phe-(13C-Leu)Meとして70 mg/kg)を経口投与した。バーはSDを示す。

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