技術 培養容器

0001

本発明は、細胞非接着性の表面に、細胞接着領域の多数が所定の間隔で配列された基板を培養液内に配置した状態で、細胞の培養を行う培養容器に関する。

0002

従来、細胞非接着性の基板表面に形成された多数の細胞接着領域(細胞接着領域パターン)上で細胞の培養を行い、細胞を一つづつ、あるいは数個づつ分離した状態(細胞パターン)で培養を行う場合、底面に細胞接着性領域パターンが形成してある基板を設置した培養容器に細胞懸濁液を入れて一定の温度、湿度、ガス組成、明度に保たれた培養装置内に放置することによって行っていた。しかし、このような方法では培養容器内に基板を設置してから作業する必要があり、滅菌作業等の作業効率が悪い、あるいは多くの細胞が培養容器底部と基板との間に入り込んでしまい効率よく細胞のパターンが形成できない、という問題があった。

0003

例えば、図３に示すような培養容器１１の場合、図４に示すように底面と同じ１．５×２cmの細胞非接着性の基板１２上に図５に示すような細胞接着領域のパターン１３を形成した後に、基板１２を培養容器１１底面上に設置し、その後に培養を行っていた。しかし、このような方法の場合では滅菌を行う部品の数が多く、操作も煩雑である。また、培養容器１１側面と基板１２との間にわずかにすき間が生じるため、その部分に細胞が入り込んでしまい、効率よく細胞のパターンを形成することができなかった。

0004

また、図５に示されるような細胞非接着性の基板上に形成された細胞接着領域のパターン１３上に接着した細胞のパターンの螢光観察を行う際には、培養容器１１の材質が紫外線非透過性の材料で形成されていると観察が難しい、という問題があった。

0005

さらに、培養容器１１底面に接着した細胞を顕微鏡で観察する際には、培養容器１１の側壁により顕微鏡のワーキングディスタンスが制限されてしまい、観察を行いにくいという問題、あるいは培養容器１１底面に設置した細胞接着領域のパターンを形成した基板１２を培養容器１１から取り出して観察をしなければないと言う問題があった。

0006

以上の問題に関連する過去の特許出願または実用新案出願の遡及調査結果を以下に示す。まず、特開平７−３０８１８６号公報には「細胞の配列制御具および細胞の配列制御法」が開示されている。この特許は細胞の配列制御用具についての特許であるが、具体的な培養容器に関する特許ではない。また、特開平８−９９６０号公報には「細胞培養基板とその作製方法および細胞配列形成方法」が、特開平７−１８４６４４号公報には「血管内皮細胞の培養方法および血管内皮細胞用培地」が開示されているが培養容器についての発明ではない。特開平７−１３５９６１号公報には「血管内皮細胞培養用基材及びその製造方法」が開示されているが、細胞接着性物質に関する発明である。

0007

培養基材に関する発明は、特開平６−３３５３８２号公報に「細胞培養基材及び細胞培養方法」が開示されているが、培養容器についての発明ではない。培養担体に関する発明は、特開平７−２９８８７６号公報に「通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法および培養装置」、特開平７−６７６２６号公報に「動物細胞の培養担体と、この担体を用いる動物細胞の培養方法」が開示されているが、培養容器についての発明ではない。

0008

培養容器に関する発明には以下のものが出願されている。特願平８−７０８４７号公報に「細胞浮遊培養容器」が開示されているが、これは浮遊細胞の培養容器についての発明であり、接着性細胞に関する発明ではない。特願平３−３３６４５１号公報には「細胞培養容器」が開示されているが、多ウェルプレートのウェル内に挿入して使用する培養容器に関する特許である。特願平８−３０８５５号公報で開示されている「細胞培養容器」は、培養容器内に未ゲル化状態のコラーゲンの凍結層を形成している培養容器に関する発明で、細胞接着領域の多数が所定の間隔で配列されているものではない。

0009

特開平６−２３３６７１号公報で開示されている「培養容器」は培養フラスコにおいて培養後に蓋が取り外すことができるディスポーザブルの培養容器に関する発明であり、培養容器底部に細胞接着領域の多数を形成した培養容器に関する発明ではない。実願平６−３３４９９号公報で開示されている「培養用容器」は、底部に設置されるカバーグラスが培養液内で浮遊しないように押さえ具を設けた発明で、培養容器底部に細胞接着領域を形成する発明ではない。

0010

特開平７−３４１０６５号公報で開示されている「培養用容器」は、培養用容器の側壁を光を通さないようにし、かつ、培養用容器底部を光透過性の材質で形成することにより微小発光現象の観察を容易にする発明で、培養容器底部に細胞接着領域の多数を形成した培養容器に関する発明ではない。特願平６−４６８３１号公報には「細胞培養基材及びその製造方法」が開示されているが、培養容器を形成する材料に関する発明である。特願平６−２７７０３７号公報には「動物組織培養用キット」が開示されており、接着性細胞の培養容器に関する発明であるが、細胞を分離して培養するための培養容器に関する発明ではない。

0011

特表平９−５０１４８８公報には、「試験を行うための方法及び装置」が開示されているが、複数の容器からなる容器部材に関する発明であって、遠心分離器を使用することによって試料が顕微鏡スライドガラスに堆積することが可能である特徴をもつ。特願平５−２５０２５０号公報には「細胞配列培養装置およびその方法」が開示されているが、撹拌しながら培養を行い細胞の配列の精度を高くするための装置に関する発明である。

0012

毒性試験に関する発明には、以下のものが出願されている。特願平５−２７５３４６号公報で開示されている「毒性試験方法」は、配列された細胞により毒性試験を行うことに関する発明である。特開平３−１６２６６３号公報で開示されている「バイオセンサー装置」では、接着性細胞を用いたバイオセンサーが提示されているが、接着性細胞を透過するグルコース、乳酸、アンモニア、プロトンの濃度を測定することにより細胞活性の測定を行い、毒性試験に応用するものである。

0013

従来、細胞非接着性の基板表面に形成された多数の細胞接着領域（細胞接着領域パターン）上で細胞の培養を行う場合では、図３に示すような培養容器１１に図５に示すような形で細胞接着領域のパターン１３を形成してある基板１２を培養容器１１底面に設置することにより、図６あるいは図７に示すように、付着した細胞２１を有するパターンと細胞の付着しないパターンからなる細胞接着性領域２２を形成していた。

0014

しかし、このような方法では培養容器１１と細胞接着領域パターンを形成した基板１２とを用意し、それぞれに対して滅菌操作を行わなくてはならないため操作が煩雑であることから、雑菌による汚染をおこしやすいという問題、あるいは培養容器１１側面と細胞接着領域パターンが形成してある基板１２との間に隙間が生じ、細胞接着領域パターン上に効率よく細胞が接着しない、という課題があった。

0015

また、細胞非接着性の基板１２上に形成された細胞接着領域のパターン上に接着した細胞のパターンの螢光観察を行う際には、培養容器１１の材質が紫外線非透過性の材料で形成されていると観察が難しい、という課題があった。

0016

さらに、培養容器１１底面に接着した細胞を顕微鏡で観察する際には、培養容器１１の側壁により顕微鏡のワーキングディスタンスが制限されてしまい、観察を行いにくいという問題、あるいは培養容器１１底面に設置した細胞接着領域のパターンを形成した基板１２を培養容器１１から取り出して観察をしなければないと言う課題があった。

0017

上記課題を解決するために、本発明によると、細胞を少なくとも五つ以下の細胞群に分離した状態で培養を行う培養容器において、細胞非接着性物質によって形成された培養容器底面の上面に形成され、細胞群と接着する複数の細胞接着性領域を具備し、複数の細胞接着性領域は、細胞群のうちの１つのみ接着するために十分な大きさを持ち、各細胞接着性領域が接することのない所定の間隔を持って配列している ことを特徴とする培養容器を提供する。

0018

また、接着性細胞を一つあるいは数個づつ、少なくとも五つ以下の細胞群に分離した状態で接着性細胞の培養を行う培養容器において、培養容器の底面が細胞非接着性物質で形成され、培養容器底面に細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持つ細胞接着性領域の多数が所定の間隔で配列されていることを特徴とする培養容器を提供する。

0019

上記の培養容器において、培養容器底面は一部又は全部が取り外し可能であり、取り外された培養容器底面と培養容器との接合部分は培養液等の液体の漏出が無く、培養容器全体の滅菌が可能な接合手段を有することが可能である。

0020

また、上記の培養容器において、接合手段は、取り外された培養容器底面と培養容器との接合部分に液状シリコンゴムを用いて密着性を確保した封止手段からなることが可能である。

0021

さらに、上記の培養容器において、容器底面は、紫外線透過性物質によって形成されていてもよい。

0022

加えて、上記の培養容器において、紫外線透過物質が石英、または紫外線透過性の樹脂からなることが可能である。

0023

さらに加えて、上記の培養容器において、細胞接着性領域がコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着性蛋白質膜からなることが可能である。

0024

また、上記の培養容器において、培養を行う細胞群が肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨細胞のいずれかであることが可能である。

0025

本発明の実施の形態を図を参照して説明する。図１は、本発明の培養装置１の概要を示す図である。細胞非接着性物質により形成された培養容器底面２には、図５に示されるように細胞接着因子からなる細胞接着領域のパターン１３が所定の位置に配列されている。本実施例では細胞接着因子としてコラーゲンを用いている。他にフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等を用いてもよい。

0026

また、この培養容器底面２は図２に示すように着脱可能である。本実施例では、培養容器底面２全面の着脱可能な構造を示しているが、培養容器底面２の所定の一部のみ着脱可能な構造でもよい。

0027

次に、本発明の培養容器の使用例について説明する。本発明においては、まず培養容器底面２の所定位置に細胞接着性蛋白質膜としてコラーゲンにより形成される細胞接着性領域のパターンが設けられる。このコラーゲンにより形成される細胞接着性領域（コラーゲンパターン）の形状、及び配列としては、試験操作を良好かつ簡便に行うのに必要な、たとえば図５に示すような一定間隔で配列された円形ドット状パターンからなる細胞接着領域のパターン１３を好適なものとして挙げることができる。さらに、細胞接着領域のパターン１３の形状として、楕円あるいは多角形等のパターン形状も利用可能である。

0028

細胞接着領域を配列するための培養容器底面２を形成する材料については、毒性成分の非存在下においても細胞の付着や接着がなく、あるいは容易に洗浄除去できる程度に付着や接着が弱い細胞非接着性の表面を形成でき、かつ紫外線透過性であり、良好な毒性試験操作を達成できるものであればよく、例えば、石英、各種紫外線透過性の樹脂等からなる材料を使用することができる。

0029

培養容器側面３と取り外し可能な培養容器底面２との接合部分は密着性が充分に確保され、かつ培養液の漏出が無く、滅菌可能な接合方法であればよく、例えば液状シリコンゴムなどで封止しておけばよい。

0030

以下に本発明の培養容器を用いて発明者の細胞培養の実施例を示す。培養細胞として血管内皮細胞を用い、培養方法は良く知られた方法を用いている。本発明による培養容器１内に血管内皮細胞を１×１０４cells/mlに調整した細胞懸濁液を注入し、一昼夜培養を行った。培養後に培養容器底面を観察すると、細胞のパターンが図６、あるいは図７に示されるように、細胞接着領域のみに細胞懸濁液中に含まれる血管内皮細胞が付着していた。このことから、本実施例に示される本発明による培養容器１は実用性が十分あることが示された。

0031

培養後に細胞の螢光染色を行い、培養容器底面を図２に示すように培養容器から取り外し、紫外線励起の螢光顕微鏡で観察を行ったところ、十分に観察が行えることが示された。また、培養容器底面が培養容器から取り外すことができるため、たとえばワーキングディスタンスの小さい反射型の顕微鏡を用いる場合でも十分に螢光観察を行うことができる。

0032

また、本実施例では培養細胞に血管内皮細胞を用いているが、他に肝細胞、繊維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨細胞のいずれかを培養細胞として用いることも可能である。

0033

本発明による効果は、培養容器底部に基板を設置する必要がないため、滅菌作業等の作業効率の向上が可能である。また、培養容器底面に直接細胞が付着し培養を行うことが可能であるので、従来の培養容器における培養容器底部と基板との間に細胞が入り込むことがなく、効率よく細胞の培養が可能である。さらに、培養容器底面の一部または全部が取り外し可能であることから、培養した細胞の観察に用いる顕微鏡に関して、ワーキングディスタンスの小さい顕微鏡を用いても十分に観察が可能である。加えて、培養容器が紫外線透過性物質によって形成されていることから、蛍光観察等の紫外線を透過させる観察手法の適用が可能である。

0034

図１本発明による培養容器の斜視図である。
図２本発明による培養容器から培養容器底面を取り外した様子を示す模式図である。
図３従来の培養容器の形状を示す斜視図である。
図４従来の培養容器底面に基板を設置して行う方法の模式図である。
図５基板面への細胞接着因子のドットパターンの配列を示す図である。
図６基板面上に設けられたコラーゲンのドットパターンにおける血管内皮細胞の接着状態を示す図である。
図７基板面上に設けられたコラーゲンのドットパターンにおける血管内皮細胞の接着状態を示す図である。

0035

１ 本実施例による培養容器
２ 培養容器底面
３ 培養容器側面
１１ 従来例による培養容器
１２基板
１３細胞接着領域のパターン
２１ 付着した細胞
２２ 細胞接着領域