図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(1999年11月16日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (5)

課題・解決手段

検出可能なように標識された受容体介在性細胞関連化合物が、哺乳動物における標的部位診断のためのイメージングにおける用途のために提供される。細胞関連性化合物は、直接標識、またキレート形成化合物を介して標識されてコンジュゲートを形成してもよい。このような細胞関連性化合物は、腫瘍部位および感染部位などの標的部位をイメージングするために特に有用である。

概要

背景

概要

検出可能なように標識された受容体介在性細胞関連化合物が、哺乳動物における標的部位診断のためのイメージングにおける用途のために提供される。細胞関連性化合物は、直接標識、またキレート形成化合物を介して標識されてコンジュゲートを形成してもよい。このような細胞関連性化合物は、腫瘍部位および感染部位などの標的部位をイメージングするために特に有用である。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
2件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

哺乳動物における標的部位イメージングにおける用途のための検出可能な標識と結び付けられた受容体介在性細胞関連化合物であって、該化合物が、該標識と結び付けられた後もその本来の立体配置を本質的に保持している化合物。

請求項2

ペプチドである、請求項1記載の化合物。

請求項3

微生物結合性化合物である、請求項1記載の化合物。

請求項4

該標識が、キレーターを介して該化合物と結合している、請求項1記載の化合物。

請求項5

該標識が、テクネチウム−99m、またはその窒化物もしくは酸化物である、請求項4記載の化合物。

請求項6

検出可能な標識と結び付けられた受容体非介在性細胞関連性化合物であって、該化合物が、マガイニンペプチド、およびその機能的に同等なアナログからなる群より選択される化合物。

請求項7

マガイニン−1である、請求項6記載の化合物。

請求項8

該標識が、キレーターを介して該化合物と結合している、請求項6記載の化合物。

請求項9

該キレーターが、ジメチルグリシンセリンシステイン(Acm)である、請求項8記載の化合物。

請求項10

該キレーターが、リンカーを介して該化合物と結合している、請求項8記載の化合

請求項11

該リンカーが、ペプチドである、請求項10記載の化合物。

請求項12

該リンカーが、グリシンアスパラギン−グリシン、および1〜5のβ−アラニン残基からなるリンカーからなる群より選択される、請求項11記載の化合物。

請求項13

ジメチル−G−S−C(Acm)−βA−βA−βA−G−I−G−K−F−L−H−S−A−G−K−F−G−K−A−F−V−G−E−I−M−K−Sである化合物。

請求項14

請求項1記載の化合物を薬学的に許容しうる水性担体と混合して含む診断用組成物

請求項15

請求項6記載の化合物を薬学的に許容しうる水性担体と混合して含む診断用組成物。

請求項16

哺乳動物における標的部位をイメージングする方法であって、請求項15記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程と、該哺乳動物に蓄積された放射能の部位を検出する工程を含む方法。

請求項17

該組成物を、70kg当たり1〜100mCiの範囲の投与量で投与する、請求項16記載の方法。

請求項18

該標的部位が、感染部位である、請求項16記載の方法。

請求項19

該標的部位が、腫瘍である、請求項16記載の方法。

請求項20

キレーターと結合してコンジュゲートを形成した受容体非介在性細胞関連性化合物;還元剤緩衝剤;そしてトランスキレート形成剤を含むキット

--

0001

発明の分野
本発明は、イメージングに関する。詳細には、本発明は、標的部位受容体
介在性イメージングに関する。

背景技術

0002

広範囲の標的部位、なかでも例えば炎症/感染症腫瘍、および血栓の部位を
イメージングする放射性医薬品が、開発されてきた。このような放射性医薬品の
イメージング活性は、放射性医薬品と標的との間の標的部位における受容体の相
互作用に基づく。この種の受容体介在性イメージングは、受容体の分布相違
より、標的部位と非標的部位とを区別することにおいて特異性をもたらすと考え
られている。

0003

しかし、受容体介在性イメージングには、欠点も存在することが認められてい
る。例えば、in vivo では内因性受容体リガンドが存在するため、放射標識
容体リガンドまたは受容体の活性部分、つまり放射性医薬品と内因性の受容体リ
ガンド間での競合の結果、かなりの量の内因性リガンドが標的の受容体部位で相
互作用した場合に、標的のイメージングが低下してしまう。イメージング溶液
かなりの量の非標識受容体リガンドを含んでいる場合にも、同様の問題が生じ得
る。標識リガンド非標識リガンド間での受容体部位に対する競合の結果、高濃
度の非標識リガンドが結合してしまうことも起こり得る。対象の標的上の受容体
部位の数は固定されているため、これによっても、イメージングの低下が起こり
得る。

0004

そこで、従来のイメージング法の欠点の少なくとも1つを解消した、標的部位
をイメージングするための有効な手段が求められている。
発明の概要

0005

本発明の目的は、標的部位をイメージングするための、受容体に基づかない手
段を提供することである。

0006

本発明の一面においては、検出可能なように標識された受容体非介在性細胞
連性(cell-associating)化合物が提供される。本発明の別の面においては、キ
レーター(chelator)と結合した、受容体非介在性細胞関連性化合物を含むコン
ジュゲート(conjugate)が提供される。

0007

本発明のそのほかの面は、上記で定義した、検出可能なように標識された化合
物またはコンジュゲートを含む診断用組成物、および哺乳動物において標的部位
をイメージングするためにこのような組成物を使用する方法を含む。

0008

もう1つの面においては、コンジュゲート;還元剤トランスキレート形成
transchelating)剤;および緩衝剤を含むキットが提供される。

0009

本発明のこれら、およびそのほかの面は、以下の図面と関連して記載する:

図面の簡単な説明

0010

図1は、本発明によるペプチドコンジュゲートアミノ酸配列(配列番号1)
を示し;

0011

図2は、合成ペプチドコンジュゲートのアミノ酸配列(配列番号2)を示し;

0012

図3は、分子モデルにより、図1ペプチド(A)およびそのコンジュゲート
した形(B)の細胞関連性成分の立体配置を図示し;そして

0013

図4は、分子モデルにより、図2のペプチド(A)およびそのコンジュゲート
した形(B)の細胞関連性成分の立体配置を図示している。
発明の詳細な説明

0014

本発明は、哺乳動物において標的部位をイメージングするのに有用な、検出可
能なように標識された受容体非介在性細胞関連性化合物を提供する。

0015

本明細書で使用するような「標的部位」の語は、異常細胞、例えば腫瘍細胞
たは病原性細胞(正常では、哺乳動物の体内に存在しないか、または正常では、
標的部位においてはその濃度もしくはその位置で存在しない)を有する哺乳動物
内における部位を示す。当業者であれば、病原性細胞は、細菌、ウイルス真菌
、および原虫などの原核および真核微生物を示すことは理解されよう。

0016

「細胞関連性化合物」の語は、本明細書では標的細胞を認識し、結び付く化合
物を示すために用いている。この意味から、「受容体非介在性細胞関連性化合物
」は、可逆的または非可逆的に、受容体非介在性の様式で、同じ標的に結合する
バックグラウンドと比較した場合に統計学的に有意な程度に、標的細胞と相互作
用するものである。「受容体非介在性」の語は、標的細胞の特定の受容体との相
互作用を含まない、化合物の標的細胞との関連を示す。このような受容体非介在
性の細胞との関連は、例えばフィルター分離アッセーを用いて測定することがで
きる。このアッセーを用いると、受容体介在性の細胞との関連は、飽和可能であ
る一方、受容体非介在性の細胞との関連は、飽和可能ではない。この方法で、2
つの型の細胞との関連を、容易に区別することができる。

0017

本発明の細胞関連性化合物をイメージング剤としての性能において有効に機能
させるためには、本化合物を、イメージングに用いる形、つまり標識され、そし
て/またはコンジュゲートした形に調製する際には、本化合物の本来の、細胞関
連性の立体配置を保持していることが必須である。ここに詳細に記載するように
、細胞関連性化合物は、直接標識されても、あるいは本化合物が一次コンジュゲ
ートするキレーターを介して間接的に標識されてもよい。したがって、キレータ
ーとコンジュゲートすると、そして/または放射性核種金属で標識すると、細胞
関連性化合物の二次構造架橋結合、α−らせん構造、およびβ−シートなど)
は、その本来の状態の少なくとも約50%、好ましくはその本来の状態の少なく
とも約65%まで保持されていなければならない(例えば、円偏光二色性試験
用いて測定)。

0018

本発明による受容体非介在性細胞関連性化合物の例としては、抗生物質性ペプ
チド(セクロピンデフェンシンタキプレシンおよびマガイニン(マガイニン
−1、マガイニン−2、マガイニンA−G、およびそのほかのマガイニン関連ペ
プチドを含む)など)、昆虫およびlepidoptera larvaeおよびpupaeの血リンパ
カブトガニ(horseshoe crab)の血リンパ、ミツバチ毒由来のペプチド、両生
類の皮膚および胃分泌物由来のペプチド、粘膜表面およびそのほかの胃腸
泌物または白血球由来の哺乳動物関連同等物、ならびに上述の受容体非介在性細
胞関連性化合物またはそのほかの適当な細胞関連性化合物の1つから誘導される
機能的に同等なアナログが挙げられる。好ましい細胞関連性化合物は、微生物
合ペプチドであり、より好ましくは抗生活性を示すペプチドである。本発明によ
るそのほかの好ましい化合物は、ε−らせん構造の少なくとも一部を含むペプチ
ドである。マガイニンファミリーのペプチドと、その機能的同等物が、本明細書
に記載する特に好ましいイメージング用化合物である。

0019

受容体非介在性細胞関連性化合物の機能的に同等なアナログは、標的部位をイ
メージングするのに適当であり、その非誘導型と本質的に同じ方法で機能する所
与の細胞関連性化合物の誘導体を含む。このような機能的に同等なアナログの例
は、望ましくない攻撃から末端を保護するために機能するN−またはC−末端修
飾を有するアナログであるが、これに限定されるものではない。「望ましくない
攻撃」は、標的部位をイメージングする化合物の機能に影響を及ぼすであろう、
化合物の末端におけるあらゆる型の酵素的化学的または生化学破壊を意味す
る。より大きい安定性を有するペプチドの調製においては、特にin vivo におけ
る使用のために、ペプチドのN−およびC−末端を修飾することは、当業界にお
いては通常実施されている。このような修飾としては、有機合成の分野において
通例使用されている保護基などの保護基を加えることが挙げられる。適当なN−
末端保護基としては、例えば式R−C(O)−(ここで、Rは、1〜5の炭素原
子を含む直鎖または分岐鎖状の低級アルキル鎖である)の低級アルカノイル基
挙げられる。本発明化合物のN−末端基を保護するための好ましい基は、アセチ
ル基、CH3C(O)である。望ましくない攻撃からN−末端を保護するために
有用なそのほかの基は、α−アミノ官能基を欠いたアミノ酸アナログである。適
当なC−末端保護基としては、C−末端カルボキシル炭素原子ケトンもしく
アミドを形成する基、またはカルボキシルの酸素原子エステルを形成する基
が挙げられる。ケトンおよびエステル形成基は、アルキル基、特に分岐もしくは
非分岐の、1〜5の炭素原子を含む低級アルキル基(例えば、メチルエチル
およびプロピル基)を含むが、一方、アミド形成基は、第一級アミン(−NH2
)などのアミノ官能基、またはアルキルアミノ官能基(例えば、メチルアミノ
エチルアミノジメチルアミノジエチルアミノメチルエチルアミノなどのモ
ノアキルアミノおよびジアルキルアミノ基)を含む。アミノ酸アナログもまた
、本発明化合物のC−末端を保護するために適当である(例えば、アグマチン
どの脱カルボキシル化アミノ酸アナログ)。もちろん、本化合物の細胞関連性活
性が、その取り込みによって悪影響を受けない限りは、化合物のN−およびC−
末端を攻撃から保護するために、替わりにより構造の複雑なN−およびC−保護
基を取り入れてもよい。

0020

機能的に同等なアナログもまた、化合物がその標的と関連する活性に悪影響を
及ぼさないアミノ酸置換欠失、もしくは付加を取り入れた化合物を含む。例
えば、天然ではL−型で存在する、化合物のアミノ酸の1つ以上が、そのD−型
で置換されていてもよい。替わりに、アミノ酸の1つ以上が、側鎖部分で誘導体
化、あるいは異なるアミノ酸で完全に置換されていてもよい。例えば、側鎖部分
誘導体化は、酸化による損傷、つまり放射性核種標識剤または標識操作と関連
するそのほかの試薬に曝されることによってペプチドが受ける損傷を避けるため
に必要であろう。ジスルフィド架橋などの架橋は、このような酸化による損傷に
特に感受性を有するため、アミド含有橋によって置換することができる。別の例
では、化合物が本来有する二次構造を保持することが重要であるため、化合物の
立体配置の安定性には寄与していない化合物内の残基を、立体配置の安定性を増
強する残基で置換することが望ましい。したがって、らせん傾向の小さい、化合
物のε−らせん構造内の残基を、らせん傾向のより大きい残基と置換してもよい
。例えばマガイニンペプチドの場合、8位のセリン、13位のグリシン、および
18位のグリシンではそれぞれのらせん傾向が小さい。したがって、このような
残基を、アラニン残基などのよりらせん傾向の大きい残基で置換するのが望まし
い。

0021

替わりに、機能的に同等なアナログを、1つ以上の適当な化合物(場合により
、細胞関連性ではない化合物に由来する領域を含む)から合成により誘導しても
よい。この方法では、それぞれの化合物に由来する望ましい特性を、1つのハイ
ブリッド化合物に取り込ませることができる。したがって、本発明により適当に
合成により誘導されたアナログは、化合物の細胞関連性領域のみを単独に含むこ
ともでき、また別の関係していない化合物に由来する領域と組み合わせて含むこ
ともできる。

0022

本発明の細胞関連性化合物は、ペプチドであることができる。その機能的な同
等物を包含するこのようなペプチド化合物は、Stewart et al.が Solid Phase
Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,Pierce Chemical Company,Rockfor,
Illinois に、そして Bodanszky and Bodanszky が The Practice of Peptide S
ynthesis,1984,Springer-Verlag,New York に記載したような固相ペプチド
合成(SPPS)の標準的な、よく確立された技術により容易に調製することが
できる。最初に適当に保護されたアミノ酸を、そのカルボキシル基を介して、誘
導体化された、不溶性ポリマー性支持体架橋ポリスチレンまたはポリアミド
樹脂など)に結合させる。「適当に保護された」は、アミノ酸のε−アミノ基、
およびいかなる側鎖官能基の両方に保護基が存在することを意味する。側鎖保護
基は、一般的には合成に際して使用する溶媒、試薬、および反応条件に安定であ
り、最終的なペプチド生成物に影響を及ぼさない条件下で除去しうる。ペプチド
の一工程ごとの合成を、最初のアミノ酸からN−保護基を除去し、そこにオリゴ
ペプチドの配列で次のアミノ酸のカルボキシル末端を結合させることによって行
う。このアミノ酸もまた、適当に保護されている。到来するアミノ酸のカルボ
シルを活性化させて、カルボジイミド、非対称酸無水物の形成のような反応性基
の形成、またはヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニル
エステルなどの「活性エステル」基の形成により、結合したアミノ酸のN−末端
と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法としては、ε−アミノ
保護基として tert−ブチルオキシカルボニルを用いたBOC法、およびアミノ
酸残基のε−アミノを保護するために9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
を用いたFMOC法が含まれ、このいずれの方法も当業界においてはよく知られ
ている。

0023

組換え技術もまた、本発明のペプチド細胞関連性化合物を調製するために使用
することができる。これは一般的に、所望のペプチドをコードするヘテロマー
NA分子をそこに発現可能なように取り込んだ、遺伝子操作された細胞源からの
発現を伴う。各種宿主生物における産生を可能とする組換えDNA発現系、培養
媒質および培養プロトコールは、当業界において確立されており、これらのシス
テムは、所望の化合物を製造する特定の目的のための通例の方法で用いることが
できる。異種DNAが発現可能なように取り込まれている細胞性宿主を培養する
ことによって、本化合物を製造する。発現後、標準的な回収法を用いて、精製の
ために培養ブロスから生成物を回収する。

0024

ペプチドをコードするDNAを得るには、各種の確立された技術を適用するこ
とができる。例えば、所望の化合物をコードするDNAは、市販のヒトcDNA
ライブラリーからcDNAとして単離してもよい。しかし、所望のDNAに到達
するためのより迅速な方法は、遺伝子合成の分野における標準的な方法によるデ
ノボ合成(これは、自動化されたDNA合成機における適当に保護されたヌクレ
オチド試薬の3’の5’との連続的な結合と、脱保護されたポリヌクレオチド
ゲル精製による回収を含む)であることができる。オーバーハングコンプレメン
タリティ(overhang complementarity)により、長さ約80ヌクレオチドまでの
オリゴヌクレオチド対の「ブロック」を調製し、正確に連続して結紮するブロッ
ク結紮(block ligation)法(例えば、Wosnick et al が Gene,1989,76: 153
に記載している)を用いてもよい。この「ブロック」法は、長さが約100ヌク
レオチドを超えるオリゴヌクレオチドの合成に特に有用である。替わりに、Barn
ett et al.が Nucl.AcidsRes.,1990,18(10): 3094 に記載した方法を用いて
、所望のDNAを全体として合成し、次に複製連鎖反応PCR)により増幅
てもよい。

0025

所望の細胞関連性化合物は、天然源から、当業界において良く確立された方法
を用いて、単離により得ることもできる。例えば、本発明によるイメージングに
適当である細胞関連性化合物の多くは、両生類または昆虫源に由来するものであ
り、このような源から容易に得ることができる。多数のそのほかの適当な化合物
は、哺乳動物相対化合物(mammalian counterpart compound)であり、したがっ
て容易に入手可能な哺乳動物源から単離することができる。

0026

ペプチド化合物は、単離、または化学的もしくは組換え技術のいずれかにより
合成されたら精製する必要がある。精製のためには、利用可能な多くの標準的な
方法があり、C4−、C8−またはC18−シリカなどのアルキル化シリカカラム
用いた、逆相高速液体クロマトグラフィーHPLC)が挙げられる。精製を行
うには、有機含有率を上昇させた勾配移動相を一般に使用し、例えば、通常は少
量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液中のアセトニトリルが挙げられる。
イオン交換クロマトグラフィーもまた、その電荷によりペプチドを分離するため
に使用することができる。

0027

上述の技術のいずれかを用いて得られたペプチドが、本発明の組成物における
使用のための所望のペプチドであることを確認するために、ペプチド組成物の分
析を行う。このような組成物分析は、ペプチドの分子量を測定するための高分解
質量分析法を用いて行うことができる。替わりに、ペプチドのアミノ酸含有量
は、水性酸中でペプチドを加水分解し、そして混合物の成分をHPLC、または
アミノ酸分析機を用いて分離、同定、定量することによって確認することができ
る。逐次的にペプチドを分解し、アミノ酸を順番に同定するタンパク質シーケネ
ーター(sequenators)もまた、ペプチドの配列を明らかに決定するために使用
することができる。

0028

いったん調製した、選択された細胞関連性化合物、またはその機能的同等物を
、検出可能なように標識する、つまりその化合物を、診断イメージングの分野に
おいて認められている多数の技術のいずれかによって、in vivo で検出すること
ができるように標識する。本発明による化合物を検出可能なように標識するため
に使用することのできる放射性核種金属は多数存在する。これらとしては、ガン
放射体および陽電子放射体の両者がある。このような放射性核種の例は、フッ
素−18、銅−64、銅−65、ガリウム−67、ガリウム−68、臭素−77
ルテニウム−95、ルテニウム−97、ルテニウム−103、ルテニウム−1
05、テクネチウム−99m(99mTc)、水銀−107、水銀−203、ヨ
ウ素−123、ヨウ素−125、ヨウ素−126、ヨウ素−131、ヨウ素−1
33、インジウム−111、インジウム−113m、レニウム−99m、レニウ
ム−105、レニウム−101、レニウム−186、およびレニウム−188、
テルリウム−121m、テルリウム−122m、テルリウム−125m、ツリウ
ム−165、ツリウム−167、ツリウム−168、ならびにそれらから誘導さ
れる窒化物または酸化物であるが、これらに限定されるわけではない。標準的な
シンチグラフィー技術が、放射性核種により放射される放射能の検出にまず用い
られるが、この目的に使用される装置は、用いる放射性核種、およびイメージ
グする標的の特性に応じてまちまちであることができる。ガンマカメラおよびレ
チリニアスキャナー(rectilinear scanner)はそれぞれ、単一平面におけ
る放射能を検出するのに有用である装置を示す。SPECT(Single Photon Em
ission Computed Tomography)およびPET(Positron Emission Tomography)
装置は、1を超える次元における放射能を検出することのできる装置を示す。

0029

本発明による化合物を検出可能なように標識するために使用する最も好ましい
放射性核種は、99mTcである。この放射性核種は、約6時間の望ましい半減
期を有するため、注射後の速やかなイメージングが可能であるなど望ましい特徴
を多数呈する。またこれは比較的安全であるため、30mCiを超える量を注射す
ることができるが、患者放射線被爆量は低い。また、これは、99Mo−99
mTc発生機から好都合入手できる。

0030

99mTcなどの放射性核種の使用においては、標識する細胞関連性化合物に
金属を結合させてコンジュゲートを形成するためには、金属キレーター化合物が
必要である。この点で、このようなコンジュゲートを当初に調製し、次に放射性
核種金属で標識することができ、あるいは替わりの方法では、金属標識キレータ
ーを調製し、次いで選択した細胞関連性化合物と結合させることができることも
理解されよう。

0031

診断イメージングの目的のためには、キレーターは、放射性核種による標識の
ための反応性官能基を有し、そして放射性核種金属と結合すると、生理学的条件
下で安定である錯体を形成する化合物である。多くのキレーター化合物が、この
目的のために開発されてきた。通常使用されているキレート形成剤は、例えば、
TPA(ジエチレントリアミン五酢酸)およびエチレンジアミン四酢酸(ED
TA)を含む。放射性核種金属標識を本発明による化合物に結合させるために適
当であるそのほかのキレーターは、Advanced Inorganic Chemistry,4thedition
,1980,F.A.Cotton and G.Wilkinson,John Wiley & Sons などの標準的な教
科書に記載されている。しかし、当業者によって認められているように、最も適
当な金属キレート形成剤は、キレート形成する金属により、例えばその特定の配
位に応じていろいろである。

0032

99mTcを本発明の細胞関連性化合物に結合させるのに特に適当であるキレ
ーターは、金属配位立体配置としては、4個の窒素および硫黄の金属配位性原子
の組み合わせである。例としては、N4、N3S、およびN2S2立体配置を有する
化合物がある。しかしこのようなキレーターは、酸素リンおよびセレンを含む
そのほかの金属配位性原子を含んでいてもよい。本発明の実施態様の1つにおい
ては、係属中の米国特許出願第08/171,737、
08/279,155および08/299,636号(これらのそれぞれの内容
は、参考のために本明細書に取り入れる)に記載されているそれらのようなN3S
キレーターを、本発明のコンジュゲートを調製するために使用する。別の実施態
様においては、係属中の米国特許出願第08/116,504号(これも参考の
ために本明細書に取り入れる)に記載されているそれらのようなN2S4キレータ
ーを、本発明のコンジュゲートを調製するために使用する。本発明の特定の実施
態様において、そして本明細書の特定の実施例に記載しているように、ペプチド
コンジュゲートを調製するために使用するキレーターの1つは、ジメチルグリ
シン−セリン−システイン(Acm)である。このキレーターを取り入れた特定
のコンジュゲートのアミノ酸配列については、図1を参照。

0033

コンジュゲートは、細胞関連性化合物のN−末端残基を、カルボキシル基また
活性化エステルなどのキレーターの適当な官能基と反応させることによって形
成することができる。例えば、本発明によるコンジュゲートは、EDTAのエチ
レン鎖上のカルボキシル置換基と、選択した化合物のN−末端残基との間の結合
を介して、キレーター、EDTAを取り込んでいることができる。この型のED
TA誘導体の合成は、Arya et al.(Bioconjugate Chemistry 1991,2:323)に記
載されており、ここにはEDTAの4個の配位するカルボキシル基が、t−ブチ
ル基でそれぞれブロックされている一方、エチレン鎖上のカルボキシル置換基は
遊離しており、ペプチドのアミノ基と反応して、所望のコンジュゲートを形成
することができる。

0034

望ましくは、本コンジュゲートは、本来ペプチド性であるキレーターを取り込
んでいる。このため、細胞関連性化合物もまたペプチドである場合に、合成また
は組換え技術のいずれかを用いてインタクトなコンジュゲートを調製することが
できる。例えば、細胞関連性化合物およびキレーター化合物の持続的合成は、固
相ペプチド合成を用いて行うことができる。したがって、本化合物およびキレー
ターは、ペプチドのC−末端残基から出発して、キレーターのN−末端残基で終
了することによって完全に合成することができる。この型の完全合成は、本発明
によるマガイニンコンジュゲートおよびセクロピン−メリチンコンジュゲート合
成のための特定の実施例に詳細に記載されている。替わりに、コンジュゲートを
調製するための組換え技術を選択するのであれば、コンジュゲート全体をコード
するDNAを、上述のデノボ合成法を用いて調製することができ、次にDNAを
発現のための細胞源に導入することができる。

0035

コンジュゲートはさらに、細胞関連性化合物をキレーターと結び付けるのに役
立ちながらも、化合物の標的能またはキレーターの金属結合能には悪影響を及ぼ
さない結合基(linking group)を取り込んでいることができる。このような結
合基は、キレーターと細胞関連性化合物の間に存在することによって、キレータ
ーが、細胞関連性化合物の標的能に干渉しないことを確実にするのに有用である
。適当な結合基は、化合物およびキレーターの両方に結び付くための反応性基を
有するよう修飾されたペプチド鎖およびアルキル鎖を含む。実施態様の1つにお
いては、結合基は、1〜5のアミノ酸残基、特に1〜3の残基のペプチドである
。好ましい結合基は、−Gly−および−Gly−Asp−Gly−、ならびに
例えば1またはそれ以上の−φAla−残基の鎖を含む合成アミノ酸残基の鎖を
含む。選択した細胞関連性化合物およびキレーターがともに天然のペプチドであ
る場合は、ペプチド鎖が好ましい結合基である。この方法では、コンジュゲート
は、上述したように、固相または液相技術を用いて完全に合成することができる

0036

別の実施態様においては、結合基は、細胞関連性化合物のN−末端アミノ基を
、アルキル鎖上の第一の官能基(カルボキシル基または活性化エステルなど)と
反応させることによってコンジュゲートに取り込ませたアルキル鎖である。次に
アルキル鎖上の第二の官能基を、キレーター上の適当な基と反応させることによ
ってキレーターをアルキル鎖と結合させて、コンジュゲートの形成を完了する。
アルキル鎖上の第二の官能基は、キレーター上の官能基とは反応性であり、好ま
しくは本化合物のN−末端残基とは反応性ではない置換基から選択する。例えば
、キレーターが、カルボキシル基または活性化エステルなどの官能基を取り込ん
でいる場合、アルキル鎖結合基の第二の官能基は、望ましくはアミノ基である。
望ましくない生成物の形成を避けるために、コンジュゲートの形成には、存在す
る官能基の保護および脱保護が必要であるのは理解されよう。このような保護お
よび脱保護の技術の使用は、上述している。

0037

本発明の診断用組成物における使用に適当であるには、細胞関連性化合物また
はコンジュゲートは、「医薬品グレード」の純度を有して、標的部位をイメージ
ングする目的での哺乳動物への投与に適当でなければならない。したがって、細
胞関連性化合物は、均一かつ確実な組成、例えばペプチドの場合は均一かつ確実
アミノ酸組成を有していなければならず、異質物質を含有していてはならな
い。さらに、本化合物は、国が定めた医薬規制機関が規定する判断基準合致
していなければならない。

0038

細胞関連性化合物またはコンジュゲートの標識は、配位化学の分野で通常行わ
れている各種方法で行うことができる。ある例では、放射性核種は、本化合物に
直接取り込まれている。このような直接標識は、ヨウ素またはインジウムの放射
同位元素を用いた場合に行う。これについては、クロラミン−T反応が、選択
した化合物をヨウ素で標識するのに使用する標準的反応である一方、DTPAを
用いる反応が、一般的には選択した化合物をインジウムで標識するのに用いられ
る。コンジュゲートを標識する場合には、コンジュゲートを調製し、次に金属放
射性核種で標識することができることが、当業者には理解されよう。しかし、許
容できる替わりの方法では、キレーター自体を、選択した金属放射性核種で標識
し、次に細胞関連性化合物と結び付けて、標識されたコンジュゲートを形成する
こともでき、これは「前標識リガンド(prelabelled ligand)」法と称される方法
である。

0039

特定の実施態様においては、選択したコンジュゲートを放射性核種であるテク
ネチウム−99mで標識するために、以下の一般的操作を用いる。コンジュゲー
トをエタノールなどの水性アルコールに溶解することによって、コンジュゲート
溶液を調製する。この溶液を脱気して、酸素を除去する。コンジュゲートのキレ
ーターの金属錯体形成原子上の保護基を適当な試薬により除去する。標識の工程
においては、過テクネチウム酸ナトリウムを、過テクネチウム酸塩還元するの
に十分な量の還元剤(塩化第一スズなど)とともに、コンジュゲート溶液に加え
、溶液を加熱する。得られた標識されたコンジュゲートを次に反応混合物から、
例えばクロマトグラフィーにより単離する。

0040

替わりの方法では、トランスキレート形成(transchelation)反応を用いてコ
ンジュゲートを標識することができる。テクネチウム源は、コンジュゲートとの
リガンド交換を促進する置換活性リガンド錯体形成したテタネチウムの溶液で
ある。トランスキレート形成のための適当なこのような置換活性リガンドは、酒
石酸塩、クエン酸塩、およびグルコヘプトン酸塩を含む。

0041

本発明のコンジュゲートを標識するための別の方法は、係属中の米国特許出願
第08/152,680号に記載されており、その内容を参考のために本明細書
に取り入れる。要約すると、コンジュゲートを固相支持体に、支持体とキレータ
ー金属錯体形成原子の1つとの間で形成された結合を介して固定する。コンジュ
ゲートの開裂はしたがって、金属標識試薬による溶離によって達成され、標識さ
れたコンジュゲートが得られる。好ましくは、錯体形成硫黄原子を、マレイミド
などの硫黄保護基官能化された支持体に結び付ける。

0042

本発明による検出可能なように標識された細胞関連性化合物またはコンジュゲ
ートを含む診断用組成物を、哺乳動物における潜在的な標識部位(例えば、腫瘍
部位および感染部位を含む)のイメージングにおける使用のために調製する。本
明細書で使用する「感染」の語は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、およびそのほ
かの微生物を含む微生物による、宿主の身体組織への侵入および増殖を意味する
。本明細書で使用する「哺乳動物」の語は、ヒト;ネコイヌ、およびウマなど
の飼い慣らされた動物ウシブタヤギ、およびヒツジなどの家畜;ならびに
飼い慣らされていない哺乳動物を包含することを意味している。

0043

診断用組成物は、診断に有効な量の、検出可能なように標識された細胞関連性
化合物を、薬学的に許容しうる担体とともに含む。これに関連して、「薬学的に
許容しうる」の語は、薬学および獣医学の分野における使用が許容しうることを
意味し、つまり非毒性であり、化合物が標的部位をイメージングする機能におい
て化合物の活性に悪影響を及ぼさない担体を意味する。「診断に有効な量」の語
は、バックグラウンドのシグナルと比較した場合に、標的部位の検出を可能とす
るのに十分な、標識された細胞関連性化合物またはコンジュゲートの量を意味す
る。これに関し、標識された化合物が標的部位をイメージングする有効性を測定
するために、「関心領域(region of interest)」比を用いることができる。本発
明の目的のために、ROI比は、本発明による標識された化合物を投与した際の
、標的部位(感染部位など)とコントロール部位(炎症を起こしている、または

こしていない非感染部位など)間での、得られた放射能の計数比である。1を超
える、好ましくは2を超えるROI比により、標識された化合物の標的部位に対
する特異性が示される。望ましくは、本発明による所与標識化合物のROI比
は、少なくとも5であり、もっとも好ましくはROI比は、少なくとも10であ
る。標識された化合物の標的部位をイメージングする有効性に基づいて、つまり
、本明細書の特定の実施例に記載したラット動物モデルなどの適当なモデルを用
いて決定したROI比に基づいて、診断に有効な量を決定することができる。

0044

In vivo投与用組成物を調製するのに有用な薬学的に許容しうる担体は、ペプ
チドを基礎とする薬物の処方に用いる通例の担体(希釈剤賦形剤など)を含む
。薬物の処方についての一般的ガイダンスのためには、「Remington's Pharmace
utical Sciences」、17th Ed.,Mack Publihing Company,Easton,Penn.,1985
を参照。認められているように、本発明による組成物を調製するために使用す
薬学的担体は、罹患している哺乳動物の診断に用いる投与剤型に応じる。

0045

本発明の実施態様の1つによると、検出可能なように標識された化合物は、静
脈内注射による投与用に処方され、そのため、無菌発熱性物質非含有の形の、
場合により緩衝等張とした水溶液として提供される。したがって、本化合物は
蒸留水、またはより望ましくは食塩水もしくは5%デキストロース溶液として
投与することができる。本発明化合物の水に対する溶解度は、所望であれば、溶
解性増強剤セチルトリメチルアンモニウムブロミドもしくはクロリドなど)を
組成物に配合することによって、またはその酸付加塩を調製することによって増
大させることができる。マンニトールスクロースまたはラクトースなどのリオ
プロテクタント(lyoprotectants)、ならびに酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸
塩などの緩衝系が、処方に含めてもよいそのほかの成分であり、血清アルブミン
などの増量剤(bulking agent)も同様である。放射性分解による損傷を予防する
、または最小限にとどめるために安定剤もまた、本処方に加えることができ、こ
のような化合物としては、アスコルビン酸ゲンチシン酸、またはそのほかの適
当な抗酸化剤などの化合物が含まれる。

0046

診断における使用のためには、本化合物またはコンジュゲートの正確な投与量
は、適度に制御された臨床試験において確立され、正常組織で得られたバック
ラウンドシグナルと比較して標的部位の組織を検出するのに十分な量(耐えられ
ない副作用惹起せず、許容しえない放射能被爆がない)の、検出可能なように
標識された細胞関連性化合物に対応する。診断のための有効な処置としては、1
mCi〜100mCI/70kg(ヒトの平均体重)の範囲の量の静脈内投与が包含され
ると予想される。しかし、所望の診断効果を得るのに必要とされる正確な投与量
は、処置を行う特定の個体、つまり年齢性別、および一般的な健康状態、なら
びに標識として使用する放射性核種金属によって異なる。この点について、70
kg 当たり5mCi〜40mCi の範囲の投与量が、テタネチウム標識診断薬としては
代表的であることを記載する。

0047

本発明の特定の実施態様においては、図1に示す標識された細胞関連性化合物
を、感染とは関連していない炎症部位に対して感染部位を、特異的に診断するた
めに使用した。上述したように、「感染」の語は、その範囲内に、細菌、ウイル
ス、真菌、原虫、およびそのほかの微生物による身体の侵入を包含する。一方、
「炎症」の語は、例えば感染性微生物自己免疫過程極端な温度、電気もし
くは化学的刺激、または機械的な外傷のいずれかによって惹起される傷害によっ
て誘導される防衛反応を意味する。特定の実施例に記載するように、図1の標識
されたペプチドは、各種微生物細胞に結合することが認められた。そこで、感染
部位または非感染性の炎症部位のいずれかを有する動物に、図1の標識された細
胞関連性化合物を注射するin vivo実験を行った。注射後適当な時間間隔で、こ
れらの部位のそれぞれに蓄積された放射能を測定した。この実験の結果、本ペプ
チドが、非感染性炎症部位に対して感染部位を特異的にイメージングするために
、診断的意味で有用であることが証明された。この標識されたペプチドはまた、
腫瘍細胞にも結合することが認められ、腫瘍と関連した状態の診断および/また
治療におけるその用途が示された。

0048

本発明の別の面においては、コンジュゲート;還元剤;緩衝剤;そしてトラン
スキレート形成剤を含むキットが提供される。本キットは、本発明による診断的
用途のための検出可能なように標識された化合物を調製するのに必要である全成
分を含む(臨床部位で発生させるのが望ましい検出可能な標識を除く)。本キッ
トの成分は、上述したような水性溶媒による再構築により注射可能な溶液に容易
に調製される粉末剤型で提供することができる。次にこの溶液を、適当な量の検
出可能な標識、つまり用いるイメージング技術に適当である放射性核種金属と混
合し、速やかに標的部位をイメージングするために用いることができる。

0049

本発明の実施態様を、以下の特定の実施例を参考にさらに記載するが、制限す
るものではないと解釈される。
実施例1−コンジュゲートの合成

0050

そのアミノ酸配列を図1に示すコンジュゲートを、古典的な9−フルオレニル
メチルオキシカルボニル(FMOC)合成を用いて調製した。この場合、FMO
C−セリンをプレロードしておいた2−メトキシ−4−アルコキシベンジル
ルコール樹脂を、Applied Biosystems 433A peptide synthesizer で用いた。

0051

カラムからの樹脂−ペプチドの開裂、および引き続いての樹脂からのペプチド
の開裂を、図2のペプチドコンジュゲートの合成のための実施例5に記載のもの
などの標準的技術を用いて行った。コンジュゲートの単離および精製もまた、実
施例5に記載するものなどの標準的技術を用いて行った。
実施例2−コンジュゲートの99mTcによる標識

0052

実施例1に記載したコンジュゲートを、以下のようにトランスキレート形成剤
として使用するグルコン酸塩とのトランスキレート形成反応を用いて標識した。

0053

コンジュゲートの溶液(溶液A)を食塩水(2mg/mL)で調製した。溶液20
0μL を3mLのバキュテーナー(vacutainer)に注入した。セプタを有する空の3
mLのバキュテーナーに、グルコン酸ナトリウム(10mg/mL)1mL を加えた。塩
化第一スズ溶液(20mg/mL)20μLをグルコン酸塩に直接注入し、この溶液(
溶液B)を緩やかに振とうして、混合した。溶液Cは、食塩水100μL 中のT
c99m過テクネチウム酸ナトリウム(Mallinckrodt より入手)であった。

0054

溶液Aを含有するバキュテーナーを、換気のための小孔を有する特別製の鉛の
ポットに入れた。この溶液Aに溶液Cと次に溶液B100μL を加えた。このA
/B/C混合物に0.1M水酸化ナトリウム20μL を加えて、標識のための最
適なpHに調整し、次に緩やかに渦巻くように短時間かき混ぜて混合した。この
時点で、反応物の容量は、400μL であった。反応混合物を、沸騰水浴中
10分間加熱し、次に室温で約1分間冷却した。

0055

HPLCを、標識したコンジュゲートを精製するために使用した。純度は、検
出された放射活性全体100%に対する、標識されたコンジュゲートの放射ピー
クの面積の%として測定した。コロイド形成は、分析においては考慮しなかった

0056

BeckmanHPLCシステムを、System Gold Software、112溶媒ポンプ、1
71放射性同位元素デテクター改変*300μL固形シンチレーターカートリッ
ジおよび50μLインジェクションループ装備)とともに使用した。用いたカ
ラムは、Vydac Protein and Peptide C18逆相カラムであった。用いた溶媒系
、アセトニトリルと0.1%TFA(溶媒A)および水と0.1%TFA(溶媒
B)であった。カラムは、溶媒B100%で平衡し、標識されたコンジュゲート
の注入後、溶媒ランプを、25分間での0〜100%のAで、流速2mL/分に設
定した。ほぼ40〜50%のアセトニトリルで、コンジュゲートが溶離した。

0057

*Tc−グルコヘプトナートによるケイ酸イットリウム固体シンチラントへの
結合のため、カラムを改変する必要があった。これは、HPLC溶離剤シンチ
ラントとの接触を、透明なプラスチックチュビングにより避けることによって
行った。この改変されたシンチレーションカートリッジにより、1000〜10
,000,000DPMの間で直線的な応答が得られ、このため標識純度を測定
することが適当となった。
実施例3−標識されたコンジュゲートの結合試験

0058

図1の標識されたコンジュゲートの結合活性を、3種類の微生物、つまりS.a
ureus(ATCC25923)、E.coli(ATCC 25922)およびC.Albicans(ATCC 14053)に対
して検討した。実験の前日、S.aureusおよびE.coli をトリプシンイブロス
(Difco)20ml 中、37℃で一晩インキュベートし、C.Albicans は、YMブ
ロス(Difco)中、30℃で一晩インキュベートした。

0059

微生物懸濁液をインキュベーターからそれぞれ取り出し、それぞれの懸濁液の
光学密度を測定した。光学密度の読み取り値に基づいて、S.aureusおよびE.co
li懸濁液については0.85、C.Albicans については3.75の吸光度を示す
のに十分な量を、それぞれの懸濁液から取り出し、新鮮培養物を最終容量10
mlに接種するために用いた。

0060

HL60腫瘍細胞(ATCC#CCL 240)を数日間生育させた。実験の当日細胞懸
濁液を円錐状の遠心分離管に入れ、ほぼ1200rpm で15分間遠心分離した。
上清廃棄し、ペレットを、フェノールレッド(GibcoBRL)を含むHBSS(
ハンクスの平衡塩類溶液、Gibcoより入手)1ml で洗浄した。それぞれの試験管
を別のHBSS少量で濯ぎ、次に洗浄に用いたHBSSを十分量のHBSSと合
わせて10ml とした。この懸濁液を上述したように回転させ、洗浄し、そして
回転させた。3回目の回転の後、HBSS3ml を、ペレットを再懸濁するのに
使用した。HL60懸濁液10μl を、細胞計数溶液(cell counting solution
)(クリスタルバイオレット中の1%酢酸)990θl に加えた。HL60懸濁
液3ml 中の1ml 当たりの細胞数を測定するために、血球計数器を用いた。次に
10×106個の細胞を含む量のHL60細胞懸濁液を、HBSSを含む10ml
エーレンマイヤーフラスコに移して、最終量を10ml とした。

0061

図1の標識されたペプチドコンジュゲート(上記の実施例2に記載したように
調製し、HPLC−溶離型として使用)を含む溶液20θl の放射能を、Cobra
IIAuto-Gamma Counter(Canberra Packard)を用いて測定し、1分当たり106
カウントを示すのに必要な溶液の量を算出した。算出した量のペプチド溶液
20θl)を、接種培養物およびHL60細胞懸濁液のいずれかを含むフラスコ
に加え、フラスコを緩やかにピペッティングしながら、そしてフラスコを渦巻き
を起こさせながら混合した。

0062

フラスコを、37℃、振とう速度2.9に設定したNew Brunswick Reciprocal
Water Bath Shaker(Moldel R76)に入れた。それぞれのフラスコから、0、30
、60、120および240分目で試料三重(それぞれ200θl)に採取
た。試料をミリポアフィルター(GSWP 025 00)で濾過した。濾過は、Millipore
1225 Sampling Manifold(XX27 025 50)を用いて行った。フィルターを、0.9
塩化ナトリウム1ml を用いて洗浄した。約30秒間真空を維持してから、フ
ィルターを取り出した。ガンマカウンターで計数するために、回収したフィルタ
ーを試験管に入れた。試料を採取するために使用したピペットチップも、液体
料と同じ方法で計数するために回収した。

0063

この実験の結果を、以下の表に示すが、濾過しなかった試料の1分当たりの計
数値からバックグラウンド値を引いた値に対する%として示した。示されている
ように、試験した微生物および腫瘍細胞に対する標識されたペプチドコンジュゲ
ートの結合が見られる。
実施例4−感染部位のイメージング

0064

体重250〜350gの雄性Sprague-Dawley 系ラットは、Charles River,Ca
nada より供給された。これらは使用前に少なくとも2日間慣らさせ、12時間
明暗周期の標準的条件で保持し、飼料と水は任意に摂取させた。

0065

感染物質であるE.coli(ATCC25922)およびS.aureus(ATCC 25923)を、トリ
シンソイブロス(TSB)中で一晩生育させ、感染物質であるC.albicans(ATCC
14053)は、YM中一晩生育させて、それぞれ、生育曲線で求めると108〜10
9CFU/ml の間の濃度を示す光学密度となるようにした。次に微生物を、上述した
ような適当な培地中で希釈して、0.2ml当たり108CFUの濃度とした。

0066

非感染性炎症惹起薬は、以下のように調製した。カラゲナンは、暖めた食塩水
撹拌しながらπ−カラゲナン(Sigma C3889)(10ml 当たり200mg)を加え
ることによって調製した。均一な懸濁液が得られるまで撹拌を続けた。ザイモ
ンA(Sigma Z4250)を食塩水中、渦巻きを起こすように撹拌しながら、100m
g/mlの濃度で懸濁した。

0067

ラットには、ペントバルビトンナトリウム(Somnotol、30mg/kg)の腹腔
投与によって麻酔をかけた。それぞれの動物には、右脚に、以下に示す量の単一
の感染または炎症惹起物質筋肉内注射した:
E.coli 108CFUを含有するTSB0.2ml
S.aureus 108CFUを含有するTSB0.2ml
C.albicans 108CFUを含有するTSB0.2ml
ザイモサン20mgを含有する食塩水0.2ml
カラゲナン食塩水中の2%カラゲナン0.2ml(4mg)

0068

感染または非感染物質のこのような投与量は、組織の重量(浮腫を表わす)お
よびMPO含有量好中球浸潤を反映する)に基づいて起こった炎症性応答
定量した、あらかじめ実施しておいた実験に基づいて選択した。示した投与量は
、同等の炎症応答をもたらした。

0069

注射後、ラットは、そのケージに戻した。24時間後にイメージングを行った
。イメージングの直前、上述したようにまずラットにペントバルビトンナトリウ
ムで麻酔をかけた。実施例2に記載したように調製し、非HPLC溶離型で用い
た、370MBq(100θci)99mTc−ペプチドコンジュゲート(図1)を
尾静脈を介して静脈内注射した。標識されたペプチドの注射後0、30分、1
時間、2時間および4時間目に、高解像度コリメーターを備えたSiemensLF0V D
igitracガンマカメラを用いて5分間にわたる静止像を得た。Siemens MicroDelt
a7.2ソフトウエアを用いて、炎症を起こしている脚およびコントロールであ
る注射を行っていない脚の周辺で関心領域(Regions of Interest)(ROI)を
引き出した(draw)。ROIは、同一の箇所の7.5%以内とするように配慮し、
ROI比は、全ピクセル(pixel)を用いて算出した。

0070

以下のような結果が得られた:

0071

図1のペプチドが、炎症部位に対して感染部位をイメージングする特異性を求
めるために、各実験(#1および#2)における感染部位対炎症部位のROI比
の比を、1時間の読み取り値で算出した。E.coli 感染部位対ザイモサン炎症部
位のROI比の比は、2.22(実験#1)であったが、一方、E.coli 感染部
位対ザイモサン炎症部位のROI比の比は、1.24(実験#2)、そして対カ
ラゲナン炎症部位では1.34(実験#2)であった。S.aureus 感染部位対ザ
イモサン炎症部位のROI比の比は、1.79(実験#1)であったが、一方、
S.aureus 感染部位対ザイモサン炎症部位の間のROI比の比は、2.19(実
験#2)であり、そして対カラゲナン炎症部位では2.38(実験#2)であっ
た。C.albicans感染部位対ザイモサン炎症部位のROI比の間の比は、2.08
であった。

0072

観察されるように、炎症部位ROI比対感染部位ROI比の比率は、いずれの
場合でも1を超えており、多数の例では、2を超えていた。これらの結果により
図1の化合物は、ザイモサンおよびカラゲナン剤によって惹起される炎症の一
般的部位と対照的に、感染の標的部位に特異性を有していることが示された。
実施例5−合成コンジュゲートの合成

0073

Applied Biosystems 433Aペプチドシンセサイザーを用いたFMOC−ロイシ
ンプレロード2−メトキシ−4−アルコキシ−ベンジルアルコール樹脂によるF
MOC化学を用いて、図2のペプチドコンジュゲートを、0.25mmol のスケ
ールで合成した。ペプチドコンジュゲートのN−末端の、ジメチルを保護したグ
リシン、およびAcm−保護システイン残基(つまり、キレーター部分)を、合
成の過程で、保護した形で加えた。

0074

シンセサイザーからペプチド−樹脂を取り出し、真空中で1時間乾燥した。樹
脂からの開裂、および保護基の除去には、トリフルオロ酢酸(TFA)10mL、
フェノール0.75g、1,2−エタンジオール0.25mL、チオアニソール
.5mL、および水0.5mL の冷溶液を、キレーター−ペプチド−樹脂と室温で
2.5時間混合することを含めた。濾過により樹脂を除去し、TFA3ml で洗
浄して、透明な黄色の溶液8ml を得た。この溶液を、50ml の円錐状ポリプ
ピレン遠心分離管中、tert−ブチルメチルエーテル35ml に0℃でゆっくりと
滴下して、無色の沈殿を形成させた。

0075

沈殿を4,500rpm、−5℃で15分間遠心分離(SorvallRT6000,Dupont)
し、デカンテーションし、t−ブチルメチルエーテルで2回洗浄した。次に沈殿
を真空下で乾燥し、水(2ml)に溶解し、−78℃(アセトンドライアイス
凍結し、20時間凍結乾燥して、粗ペプチド(530mg)を得た。粗ペプチド
(24mg)を水(4mL)に溶解し、0.45θmシリンジフィルター(Gelman Acrodi
scLCPVDF)で濾過し、水中の0.1%TFAを緩衝液Aとして、そしてアセト
トリル中の0.1%TFAを緩衝液Bとして使用するC18カラム(WatersRCM
8x10)を用いた逆相HPLC(Beckman System Gold)で精製した。カラムを5
0:50緩衝液A:緩衝液Bで10分間平衡化し、ペプチドを100%緩衝液B
までの直線勾配を用いて、2ml/分で25分溶離した。画分をHPLCで再分析
し、適合する特性に応じて貯蔵した。純粋な画分を−78℃(アセトン−ドライ
アイス)で凍結し、20時間凍結乾燥して、純粋なペプチドを無色の粉末として
得た(12mg)。

0076

このペプチドコンジュゲートを、実施例2に上述した方法で、99mTcで標
識した。
実施例6−合成コンジュゲートによる結合試験

0077

本実験は、図2の合成コンジュゲートを用いて、実施例3に詳細に記載したよ
うに行い、得られた結果は、以下の表に示す:

0078

結果により、図2の合成コンジュゲートの微生物および腫瘍細胞の両者への結
合が示された。
実施例7−合成コンジュゲートによるイメージング

0079

この実験は、図2の合成コンジュゲートを用いて、実施例4に詳細に記載した
ように行い、得られた結果は、以下の表に示す:

0080

合成コンジュゲートの感染部位をイメージングする特異性を求めるために、炎
症部位対感染部位をイメージングすることによって得られたROI比の比を算出
した。これらの比は、各実験について1時間の読み取り値で算出した。E.coli
感染部位対ザイモサンおよびカラゲナン炎症部位のROI比の比は、それぞれ0
.97および1.08であった。S.aureus 感染部位については、比は、ザイモ
サンおよびカラゲナン炎症部位との比較に基づいて1.05および1.16であ
った。

0081

この場合の結果により、得られていた(そして上記の実施例6で得られた)in
vitro での結合データにもかかわらず、図2の標識された合成ペプチドコンジ
ュゲートは、感染部位と炎症部位をin vivo では有効に区別しないことが示され
た。本ペプチドは、in vitro では多数の感染性物質に対して特異的な結合を
示したという事実のため、これらの結果は、特に予想外であった。得られた in
vivo での結果を理解するために、図2の合成ペプチドおよびそのコンジュゲー
ト型の細胞関連性成分のコンピューターによってシミュレートしたモデルを、図
1のペプチドおよびそのコンジュゲート型の細胞関連性成分の同様のモデルと比
較した。図1のコンジュゲートは、感染部位を特異的にイメージングすることが
認められているからである。

0082

図3には、in vitro および in vivo結合試験に用いた、図1の細胞関連性成
分とそれから調製したコンジュゲートを図示している。細胞関連性成分は、顕著
なε−らせん立体配置を有しており、それから調製したコンジュゲートは、本質
的にこのε−らせん立体配置を保持しているため、コンジュゲートが、in vitro
および in vivo結合試験の両方で示されているように、標的認識および結合活性
を保持することを可能としている。

0083

図4には、in vitro および in vivo結合試験で使用した、図2の細胞関連性
成分およびそれから調製したコンジュゲートを図示している。この場合、細胞関
連性成分のε−らせん立体配置は、図1のペプチドのそれよりは弱いものであり
、コンジュゲートの形成後は保持されていない。したがって、in vitro では起
きたある程度は特異的な標的との結合にもかかわらず、コンジュゲートが立体配
置を失ったことにより、in vivo での特異的結合活性が失われた。したがって、
これらの結果より、感染部位の特異的イメージングにおける有効な使用のために
は、ペプチドがそのコンジュゲート型においても本来の細胞関連性立体配置を保
持していることの意義が確立された。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ