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技術 核酸系物質の製造法

出願人 味の素株式会社
発明者 佐藤勝明臼田佳弘
出願日 1998年6月12日 (22年0ヶ月経過) 出願番号 1998-165704
公開日 1999年12月21日 (20年6ヶ月経過) 公開番号 1999-346778
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 部分切断 アテニュエーション 次亜硫酸ナトリウム アデニン要求性 ヌクレオシダーゼ 化学薬剤 ピリミジン生合成 ガラス棒
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1999年12月21日)のものです。
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図面 (4)

課題

効率よく核酸物質を製造する方法を提供する。

解決手段

プリンオペロンリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物、好ましくは該タンパク質をコードする染色体上の遺伝子(purR)が破壊された株を培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取する。

概要

背景

従来、発酵法によるイノシングアノシン等の核酸及びそれらの塩基ヒポキサンチングアニン等)等の核酸系物質の製造においては、培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、アデニン要求性及び核酸アナログ耐性を付与した変異株特公昭55−2956号公報、特公昭55−45199号公報)が用いられている。

通常の変異処理により得られる変異株は、目的の遺伝子以外にも変異が導入されることが多く、また、核酸系物質の生合成経路には複雑な制御機構が存在するために、核酸系物質を著量生産する微生物を得ることは困難である。したがって、従来の菌株育種法によって得られた変異株は、必ずしも満足できるものではなかった。

一方、プリン生合成系関与する酵素群をコードする遺伝子(プリンオペロン)の発現に関与する配列を改変してプリンオペロンの発現を高めたバチルス属細菌を用いて、イノシンまたはグアノシンを製造する方法が開示されている(特開平3−164185号公報)。この方法は、プリンオペロンのプロモーター又はオペレーターを改変し、該オペロンの発現量を高め、それによってイノシン又はグアノシンの生産量を高めるというものである。

バチルスサチリス(Bacillus subtilis)のプリンオペロン(purEKBC(ORF)QLFMNHD:ORFは機能が未知オープンリーディングフレーム)の発現は、過剰量のアデニンによって抑制され、また、グアニンによるアテニュエーションによっても調節を受けている。さらに、プリンオペロンの5’フランキング領域に結合するリプレッサータンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子(purR)が単離されており、purR遺伝子を破壊されたバチルス・サチリスは、プリンオペロンに組み込まれたpurC−lacZ融合遺伝子の発現のアデニンによる抑制が、約1/10に低減されたことが示されている(Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 92, 7455-7549 (1995))。

バチルス・サチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、アデニンの生合成に関与するpurA遺伝子やピリミジン生合成に関与するピリミジンオペロンの遺伝子群の発現を調節することが知られている(1997, J. Bacteriol. 179, 7394-7402, H. Zalkin等)。

一方、エシェリヒアコリ(Escherichia coli)では、プリンオペロンリプレッサーは、プリンオペロンの遺伝子群の他に、5’−IMP(イノシン酸)生合成の基質となるグリシンの生合成に関与するglyA遺伝子の発現(1990, J. Bacteriol. 172, 3799-3803, H. Zalkin等)、及びグリシンから供給されるC1やCO2の生成に関与するgcvオペロン遺伝子群の発現にも影響することが報告されている(1993, J. Bacteriol. 175, 5129-5134, G. V. Stauffer 等)。

前述のように、プリンオペロンとイノシン又はグアノシンの生産との関係については一部報告されている。しかし、purR遺伝子が関与する生合成系は多岐にわたっている。また、バチルス・サチリスのプリンオペロンは10個の酵素をコードしており、多くの反応に関与している。このように、核酸系物質の生合成系は非常に複雑であり、purR遺伝子と核酸系物質の蓄積との関係についてはほとんど知られていない。

概要

効率よく核酸系物質を製造する方法を提供する。

プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物、好ましくは該タンパク質をコードする染色体上の遺伝子(purR)が破壊された株を培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取する。

目的

本発明は、核酸系物質の産業上の重要性から、従来の方法よりもさらに有利に核酸系物質を製造する方法を提供することを課題とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

プリンオペロンリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物培地で培養し、培地中に核酸物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とする核酸系物質の製造法

請求項2

前記微生物が、染色体上の前記リプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質が正常に機能しないことを特徴とする請求項1記載の方法。

請求項3

前記微生物がバチルス属細菌である請求項1記載の方法。

請求項4

前記核酸系物質が核酸塩基ヌクレオシド又はヌクレオチドである請求項1記載の方法。

請求項5

前記核酸系物質が、ヒポキサンチンウラシルグアニンまたはアデニンから選ばれる請求項4記載の方法。

技術分野

275 280 285

背景技術

0001

本発明は、発酵法による核酸物質製造法に関する。核酸系物質は、調味料等の原料として産業上有用である。

0002

従来、発酵法によるイノシングアノシン等の核酸及びそれらの塩基ヒポキサンチングアニン等)等の核酸系物質の製造においては、培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、アデニン要求性及び核酸アナログ耐性を付与した変異株特公昭55−2956号公報、特公昭55−45199号公報)が用いられている。

0003

通常の変異処理により得られる変異株は、目的の遺伝子以外にも変異が導入されることが多く、また、核酸系物質の生合成経路には複雑な制御機構が存在するために、核酸系物質を著量生産する微生物を得ることは困難である。したがって、従来の菌株育種法によって得られた変異株は、必ずしも満足できるものではなかった。

0004

一方、プリン生合成系関与する酵素群をコードする遺伝子(プリンオペロン)の発現に関与する配列を改変してプリンオペロンの発現を高めたバチルス属細菌を用いて、イノシンまたはグアノシンを製造する方法が開示されている(特開平3−164185号公報)。この方法は、プリンオペロンのプロモーター又はオペレーターを改変し、該オペロンの発現量を高め、それによってイノシン又はグアノシンの生産量を高めるというものである。

0005

バチルスサチリス(Bacillus subtilis)のプリンオペロン(purEKBC(ORF)QLFMNHD:ORFは機能が未知オープンリーディングフレーム)の発現は、過剰量のアデニンによって抑制され、また、グアニンによるアテニュエーションによっても調節を受けている。さらに、プリンオペロンの5’フランキング領域に結合するリプレッサータンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子(purR)が単離されており、purR遺伝子を破壊されたバチルス・サチリスは、プリンオペロンに組み込まれたpurC−lacZ融合遺伝子の発現のアデニンによる抑制が、約1/10に低減されたことが示されている(Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 92, 7455-7549 (1995))。

0006

バチルス・サチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、アデニンの生合成に関与するpurA遺伝子やピリミジン生合成に関与するピリミジンオペロンの遺伝子群の発現を調節することが知られている(1997, J. Bacteriol. 179, 7394-7402, H. Zalkin等)。

0007

一方、エシェリヒアコリ(Escherichia coli)では、プリンオペロンリプレッサーは、プリンオペロンの遺伝子群の他に、5’−IMP(イノシン酸)生合成の基質となるグリシンの生合成に関与するglyA遺伝子の発現(1990, J. Bacteriol. 172, 3799-3803, H. Zalkin等)、及びグリシンから供給されるC1やCO2の生成に関与するgcvオペロン遺伝子群の発現にも影響することが報告されている(1993, J. Bacteriol. 175, 5129-5134, G. V. Stauffer 等)。

発明が解決しようとする課題

0008

前述のように、プリンオペロンとイノシン又はグアノシンの生産との関係については一部報告されている。しかし、purR遺伝子が関与する生合成系は多岐にわたっている。また、バチルス・サチリスのプリンオペロンは10個の酵素をコードしており、多くの反応に関与している。このように、核酸系物質の生合成系は非常に複雑であり、purR遺伝子と核酸系物質の蓄積との関係についてはほとんど知られていない。

課題を解決するための手段

0009

本発明は、核酸系物質の産業上の重要性から、従来の方法よりもさらに有利に核酸系物質を製造する方法を提供することを課題とする。

0010

本発明者等は、上記課題を解決するために、purR遺伝子の機能について鋭意検討を行い、その結果、purR遺伝子を破壊したバチルス・サチリスが核酸系物質を蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。

0011

すなわち本発明は、(1)プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物を培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とする核酸系物質の製造法、(2)前記微生物が、染色体上の前記リプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質が正常に機能しないことを特徴とする(1)の方法、(3)前記微生物がバチルス属細菌である(1)の方法、(4)前記核酸系物質が核酸塩基ヌクレオシド又はヌクレオチドである(1)の方法、および(5)前記核酸系物質が、ヒポキサンチン、ウラシル、グアニンまたはアデニンから選ばれる(4)の方法、である。

0012

本発明において、プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しないとは、プリンオペロンの5’フランキング領域にリプレッサータンパク質が結合し、該オペロンの転写を抑制する機能が、通常に比べて低いか又は実質的に消失していることをいう。

発明を実施するための最良の形態

0013

本発明において核酸系物質とは、ヒポキサンチン、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンシトシン等の核酸塩基、イノシン、アデノシン、グアノシン、ウリジンチミジンシチジン等のヌクレオシド、イノシン酸、アデニル酸グアニル酸ウリジル酸チミジル酸シチジル酸等のヌクレオチド、又はこれらのヌクレオシドもしくはヌクレオチドのリボースデオキシリボース置換されたものをいう。これらの中では、核酸塩基が好ましい。本発明において、核酸系物質には、プリン系物質及びプリジン系物質のいずれもが含まれる。プリン系物質には、プリン塩基、及びプリン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれる。また、ピリミジン系物質には、ピリミジン塩基、及びピリミジン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれる。本発明において、プリン系物質としてはヒポキサンチン、アデニン及びグアニンが好ましい。また、ピリミジン系物質としてはウラシルが好ましい。

0014

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の方法に用いる微生物は、プリンオペロンのリプレッサータンパク質(以下、単に「リプレッサー」ともいう)が正常に機能しない微生物である。該微生物は、プリン系物質の生合成系酵素の遺伝子がオペロンを形成しており、該オペロンの調節に関与するリプレッサーをコードする遺伝子(purR)を有するものであれば特に制限されないが、具体的にはバチルス属等に属する細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等が挙げられる。

0015

リプレッサーが正常に機能しない微生物は、purR遺伝子が、該遺伝子産物であるリプレッサーの活性が低下又は消失するか、又はpurR遺伝子の転写が低下または消失するように、改変することによって得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法(Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. andMizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985))により、染色体上のpurR遺伝子を、正常に機能しないpurR遺伝子(以下、「破壊型purR遺伝子」ということがある)で置換することによって行うことができる。

0016

相同組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、破壊型purR遺伝子が染色体上の正常なpurR遺伝子と置換された菌株を取得することができる。

0017

このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖DNAを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたpurR遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、purR遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体DNA中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のpurR遺伝子配列と染色体上のpurR遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。

0018

遺伝子破壊に用いる破壊型purR遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるpurR遺伝子の一定領域の欠失、purR遺伝子への他のDNA断片(マーカー遺伝子等)の挿入、または部位特異的変異法(Kramer, W. and Frits, H. J., Methodsin Enzymology, 154, 350 (1987))や次亜硫酸ナトリウムヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理(Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978))によって、purR遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に1つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はpurR遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりpurR遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はpurR遺伝子へ他のDNA断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。

0019

purR遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体DNAから、公知のpurR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプライマーとするPCR法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体DNAライブラリーから、公知のpurR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、purR遺伝子を取得することができる。バチルス・サチリス168Marburg株では、purR遺伝子の塩基配列が報告されている(GenBankaccession No.D26185(コード領域は塩基番号118041〜118898)、DDBJAccession No.Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296))。尚、本発明においては、purR遺伝子は破壊型purR遺伝子の作製に用いるため、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。

0020

purR遺伝子の取得に用いる微生物は、該purR遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生物のpurR遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されないが、通常これらは同じ微生物を用いることが好ましい。

0021

PCRに用いるプライマーとしては、purR遺伝子を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号1及び配列番号2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

0022

また、マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。スペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルスジェネチックストックセンター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリECE101株から、プラスミドpDG1726を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。

0023

マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のpurR遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、purR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のpurR遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法により、染色体上のpurR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子が染色体DNAに組み込まれたことの確認は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅することができるプライマー(例えば配列番号3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド)を用いたPCRにより、行うことができる。

0024

上記のようにして得られるリプレッサーが正常に機能しない微生物を好適な培地で培養することによって、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめることができる。

0025

本発明に用いる培地としては、炭素源窒素源無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。

0026

炭素源としてはグルコースグリセロールフラクトースシュークロースマルトースマンノースガラクトースでんぷん加水分解物糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

0028

有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトンカザミノ酸酵母エキス大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。

0029

無機塩類としてはリン酸塩マグネシウム塩カルシウム塩鉄塩マンガン塩等が使用される。培養条件は、用いる微生物の種類によるが、例えばバチルス・サチリスでは、発酵温度20〜50℃、pHを4〜9に制御しつつ通気培養を行う。培養中にpHが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリ中和する。かくして40時間〜3日間程度培養することにより、培養液中に核酸系物質が蓄積される。

0030

培養終了後、培養液中に蓄積された核酸系物質を採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。

0031

また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又アデニンやグアニンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。

0032

さらに、本発明の方法により製造された核酸塩基に、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、該塩基に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドが得られる。

0033

以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。

0034

<1>purR遺伝子のクローニング
バチルス・サチリス168 Marburg株(ATCC6051)のpurR遺伝子を含むDNA断片を、該細菌の染色体DNAを鋳型としたPCRにより取得した。

0035

染色体DNAは、次のようにして調製した。バチルス・サチリスATCC6051株を50mlのLB培地接種し、37℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム1mg/mlを含む溶菌液溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりDNAを沈殿させた。生じたDNAの沈殿は、ガラス棒巻き付け回収した後、洗浄し、PCRに用いた。

0036

PCR用のプライマーには、バチルス・サチリス168 Marburg株の既知のpurR遺伝子の塩基配列(GenBankaccession No.D26185(コード領域は塩基番号118041〜118898)、DDBJAccession No.Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296))に基づいて設計した配列番号1及び2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(日本バイオサービス(株)に委託して合成した)を用いた。これらのプライマーの5’末端付近及び3’末端付近には、それぞれHindIII及びPstIの制限酵素認識配列を有する。

0037

前記染色体DNA 6ng/μl及びプライマー各3μMを含む0.1mlのPCR反応液を用いて、変性:94℃、1分、アニーリング:45℃、1分、伸長反応:72℃、1分からなる反応サイクルを、30サイクルの条件でPCRを行なった。

0038

上記反応産物及びプラスミドpHSG398(宝酒造(株))を、HindIII及びPstIで消化し、ライゲーションキット(宝酒造(株))を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109を形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール(Cm)30μg/ml及びX−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)を含むLB寒天培地で培養し、クロラムフェニコール耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを、pHSG398BSPRと命名した(図1)。

0039

<2>破壊型purR(ΔpurR)を含むプラスミドの作製
バチルスジェネチックストックセンター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリECE101株から、プラスミドpDG1726を調製した。該プラスミドは、スペクチノマイシン耐性(Spr)遺伝子をカセットで取り出すことができる。

0040

pDG1726及び<1>で得たpHSG398BSPRを、各々HincII及びEcoRVの制限酵素で完全切断(図2)及び部分切断した後、フェノール処理した。各DNAをライゲーション・キットで連結した後、該ライゲーション溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/ml及びスペクチノマイシン100μg/mlを含むLB寒天培地で培養した。得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、purR遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入によって破壊されたプラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprを得た(図3)。

0041

<3>purR遺伝子破壊株の取得
上記<2>で得たプラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprを用いて、バチルス・サチリスSB112(BGSC 1A227)を形質転換した。形質転換は、Ishiwaらの方法(Ishiwa H. et al., 1986, Jpn.J, Genet. 61 515-528)に従って、コンピテントセルを調製して行なった。プラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprは、バチルス・サチリスの細胞中ではDNA複製ができない。しかし、該プラスミドはスペクチノマイシン耐性遺伝子の5’側及び3’側に、染色体purRと相同な領域を有するため、染色体purR遺伝子と2重交差組み換えにより、遺伝子置換を行うことができる。

0042

上記形質転換株をスペクチノマイシン100μg/mlを含むLB寒天培地で培養し、生育する株を選択することにより、染色体purR遺伝子がΔBSPR:Spr遺伝子により置換された株を取得した。目的どおりの遺伝子置換が生じていることは、候補株の染色体DNAを鋳型とし、前記purR遺伝子用プライマー(配列番号1及び2)、及び、配列番号3及び4に示す塩基配列を有するSpr遺伝子用プライマー(日本バイオサービス(株)に委託合成した。)を用いたPCRを行い、ΔpurR:Spr部分の大きさとスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入により確認した。こうして得られた遺伝子置換株の1つを、バチルス・サチリスSB112Kと名づけた。

0043

<4>purR欠損株による核酸の生産
上記<3>で作製したバチルス・サチリスSB112K株、及び親株のバチルス・サチリスSB112を、スペクチノマイシン100μg/mlを含むLB及びLB寒天培地で37℃1晩培養した後、表1に示した生産培地20mlに、各3白金耳を接種し、32℃で72時間培養した。

0044

表1発酵培地組成
───────────────────────
培地成分濃度
───────────────────────
グルコース100g/L
NH4Cl 20g/L
KH2PO4 0.5g/L
MgSO4・7H2O 0.4g/L
FeSO4・7H2O 2ppm
MnSO4・5H2O 2ppm
L−トリプトファン300mg/L
L−フェニルアラニン300mg/L
L−グルタミン酸15.0g/L
DL−メチオニン0.3g/L
濃縮液(T−N) 1.5g/L
消泡剤GD−113) 0.05ml/L
PH調整(KOH) 7.2g/L
───────────────────────

0045

培養終了後、培養液中のヒポキサンチン、ウラシル、グアノシン、グアニン、アデノシン、アデニンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィーで測定した。その結果を表2に示す。purR欠損株、SB112Kは、約600mg/Lという著量のヒポキサンチンを蓄積し、親株に比べて約20倍の蓄積量の増加を示した。また、ウラシルは親株に比べて5倍以上蓄積量が増加した。さらに、親株では蓄積が認められなかったアデニン及びグアニンも、purR欠損株では蓄積が認められた。

発明の効果

0046

表2発酵成績
───────────────────────────
生産物(mg/L)
菌 株 ──────────────────
ヒホ゜キサンチンウラシルク゛アニン アテ゛ニン
───────────────────────────
SB112K 585 166 20 127
SB112(親株) 30 30 0 0
───────────────────────────

0047

本発明により、核酸系物質又はその原料を効率よく製造することができる。

0048

配列番号:1
配列の長さ:28
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
CTCAAGCTTG AAGTTGCGAT GATCAAAA 28

0049

配列番号:2
配列の長さ:28
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
CTCCTGCAGACATATTGTTGACGATAAT 28

0050

配列番号:3
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
GTGAGGAGGATATATTTGAA T 21

0051

配列番号:4
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成DNA
配列
TTATAATTTT TTTAATCTGTT 21

0052

配列番号:5
配列の長さ:1200
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:バチルス・サチリス
株名: 168
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:259..1116
特徴を決定した方法:
配列
ATATGCATCC TGAAGTTGCG ATGATCAAAAACCAGATGAAACGCTTTGGTGCAGATGCCG60
TGTTAATGAG CGGGAGCGGC CCGACAGTGT TTGGACTGGT TCAGTATGAG TCGAAGGTGC 120
AGAGAATTTA TAACGGGTTA AGAGGCTTCT GCGATCAAGT TTATGCGGTG AGAATGATCG 180
GCGAACAGAA CGCTCTTGAT TAAATCCGTA TGTTAAGTTA TATTGATCTT AAAATATTCG 240
GATTTTGGGG GTGAGTTC ATG AAG TTT CGT CGC AGC GGC AGA TTG GTG GAC 291
Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp
1 5 10
TTA ACA AAT TAT TTG TTA ACCCATCCG CAC GAG TTA ATA CCG CTA ACC 339
Leu Thr Asn Tyr Leu Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr
15 20 25
TTT TTC TCT GAG CGG TAT GAA TCT GCA AAA TCA TCG ATC AGT GAA GAT 387
Phe Phe Ser Glu Arg Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp
30 35 40
TTA ACA ATT ATT AAA CAA ACC TTT GAA CAG CAG GGG ATT GGT ACT TTG 435
Leu Thr Ile Ile Lys Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu
45 50 55
CTT ACT GTT CCC GGA GCT GCC GGA GGC GTT AAA TAT ATT CCG AAA ATG 483
Leu Thr Val Pro Gly Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met
60 65 70 75
AAG CAG GCT GAA GCT GAA GAG TTT GTG CAG ACA CTT GGA CAG TCG CTG 531
Lys Gln Ala Glu Ala Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu
80 85 90
GCA AATCCTGAG CGT ATC CTT CCG GGC GGT TAT GTA TAT TTA ACG GAT 579
Ala Asn Pro Glu Arg Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp
95 100 105
ATC TTA GGA AAG CCA TCT GTA CTC TCC AAG GTA GGG AAG CTG TTT GCT 627
Ile Leu Gly Lys Pro Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala
110 115 120
TCC GTG TTT GCA GAG CGC GAA ATT GAT GTT GTC ATG ACC GTT GCC ACG 675
Ser Val Phe Ala Glu Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr
125 130 135
AAA GGC ATC CCT CTT GCG TAC GCA GCT GCA AGC TAT TTG AAT GTG CCT 723
Lys Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro
140 145 150 155
GTT GTG ATC GTT CGT AAA GAC AAT AAG GTA ACA GAG GGC TCC ACA GTC 771
Val Val Ile Val Arg Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val
160 165 170
AGC ATT AAT TAC GTT TCA GGC TCC TCA AAC CGC ATT CAA ACA ATG TCA 819
Ser Ile Asn Tyr Val Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser
175 180 185
CTT GCG AAA AGA AGC ATG AAA ACG GGT TCA AAC GTA CTC ATT ATT GAT 867
Leu Ala Lys Arg Ser Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp
190 195 200
GAC TTT ATG AAA GCA GGC GGC ACC ATT AAT GGT ATG ATT AAC CTG TTG 915
Asp Phe Met Lys Ala Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu
205 210 215
GAT GAG TTT AAC GCA AAT GTG GCG GGA ATC GGC GTC TTA GTT GAA GCC 963
Asp Glu Phe Asn Ala Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala
220 225 230 235
GAA GGA GTA GAT GAA CGT CTT GTT GAC GAA TAT ATG TCA CTT CTT ACT 1011
Glu Gly Val Asp Glu Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr
240 245 250
CTT TCA ACC ATC AAC ATG AAA GAG AAG TCC ATT GAA ATT CAG AAT GGC 1059
Leu Ser Thr Ile Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly
255 260 265
AAT TTT CTG CGT TTT TTT AAA GAC AAT CTT TTA AAG AAT GGA GAG ACA 1107
Asn Phe Leu Arg Phe Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr
270 275 280
GAA TCA TGACAAAAGC AGTCCACACA AAACATGCCC CAGCGGCAAT CGGGCCTTAT 1163
Glu Ser
285
TCACAAGGGA TTATCGTCAA CAATATGTTT TACAGCT 1200

図面の簡単な説明

0053

配列番号:6
配列の長さ:285
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg
20 25 30
Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys
35 40 45
Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly
50 55 60
Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala
65 70 75 80
Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg
85 90 95
Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro
100 105 110
Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu
115 120 125
Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu
130 135 140
Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg
145 150 155 160
Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val
165 170 175
Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser
180 185 190
Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala
195 200 205
Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala
210 215 220
Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu
225 230 235 240
Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn
245 250 255
Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe
260 265 270
Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser

0054

図1プラスミドpHSG398BSPRの構造を示す図。太線はバチルス・サチリスSB112由来のpurR遺伝子を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の最初を1としたときの位置を示す。細線はプラスミッドpHSG398である。
図2pHSG398BSPRをHincII及びEcoRVで完全切断して得た断片を示す図。
図3purR遺伝子破壊用プラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprの構造を示す図。太線はバチルス・サチリスSB112の破壊型purR遺伝子(ΔpurR)を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の最初を1としたときの位置を示す。細線はスペクチノマイシン耐性遺伝子、点線はプラスミドpHSG398である。

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