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この項目の情報は公開日時点(1999年9月21日)のものです。
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課題

経口投与により哺乳動物の免疫を増強することができる免疫増強剤を提供すること。

解決手段

ムラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量10,000以下のペプチドグリカンPG)を有効成分とする経口投与用免疫増強剤。

概要

背景

微生物を形成する細胞壁の主要構成物であるペプチドグリカン下等動物から高等動物に至る広い範囲において免疫賦活能を有することは既に周知となっており、水産養殖の分野においても種々の特許出願がなされている。例えば、特公平6−25067号公報には、3週令の子に、ペプチドグリカン(ムラミルジペプチド集合体)を反復して経口投与することを特徴とする子豚の離乳下痢感染防止方法が開示されている。しかしながら、実際に魚類などにムラミルジペプチド集合体を経口投与した場合に、その免疫賦活活性発現がはっきりしないとの問題が指摘されている。このうち、ムラミルジペプチド集合体の1員であり、免疫賦活活性を有することが公知である物質N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(ムラミルジペプチド、MDP分子量492)は、経口投与によりマクロファージ活性化するPriming 効果を有するものの、高価であり畜産用途への応用は期待できないとの問題がある。

概要

経口投与により哺乳動物の免疫を増強することができる免疫増強剤を提供すること。

ムラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量10,000以下のペプチドグリカン(PG)を有効成分とする経口投与用免疫増強剤。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
2件

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請求項1

ムラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量10,000以下のペプチドグリカンPG)を有効成分とする経口投与用免疫増強剤

請求項2

分子量10,000以下のペプチドグリカン(PG)を10重量%以上含有する請求項1記載の免疫増強剤。

背景技術

0001

本発明は、哺乳動物(人以外の動物が好ましい)、魚類及び甲殻類などの免疫を増強することができる経口投与用免疫増強剤に関するものである。

発明が解決しようとする課題

0001

微生物を形成する細胞壁の主要構成物であるペプチドグリカン下等動物から高等動物に至る広い範囲において免疫賦活能を有することは既に周知となっており、水産養殖の分野においても種々の特許出願がなされている。例えば、特公平6−25067号公報には、3週令の子に、ペプチドグリカン(ムラミルジペプチド集合体)を反復して経口投与することを特徴とする子豚の離乳下痢感染防止方法が開示されている。しかしながら、実際に魚類などにムラミルジペプチド集合体を経口投与した場合に、その免疫賦活活性発現がはっきりしないとの問題が指摘されている。このうち、ムラミルジペプチド集合体の1員であり、免疫賦活活性を有することが公知である物質N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(ムラミルジペプチド、MDP分子量492)は、経口投与によりマクロファージ活性化するPriming 効果を有するものの、高価であり畜産用途への応用は期待できないとの問題がある。

課題を解決するための手段

0002

発明を実施するための最良の形態

0003

本発明は、ペプチドグリカン、つまり、ムラミルジペプチド集合体を構成する各分子についてその分子量の違いが生物活性の発現に影響を及ぼすこと、すなわち、微生物細胞壁リゾチームプロテアーゼなどで酵素処理することにより得られたペプチドグリカンで分子量が10,000以下の画分のものが経口投与により優れた免疫増強作用を有するとの知見に基づいてなされたのである。すなわち、本発明は、ムラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量10,000以下のペプチドグリカン(PG)を有効成分とする経口投与用免疫増強剤を提供する。

0004

0005

0006

発明の効果

0007

0008

0009

実施例1
(1−1)菌体培養方法及び菌体獲得方法
下記の組成液体培地オートクレーブで殺菌(121℃で15分間)した後、Brevibacterium lactofermentumATCC13869 を植菌し、30℃で24時間振とう培養した。菌体の培養液を7000rpm で10分間遠心分離して培地を除去した。集めた菌体をさらに0.9%NaCl水溶液に懸濁し、再び7000rpm で10分間遠心分離して菌体を洗浄して菌体を得た。
1.0g/ccグルコース
1.0g/cc酵母抽出物(yeast extract)
1.0g/ccペプトン
0.5g/cc (NH4 )2 SO4
0.3g/cc K2 HPO4
0.1g/cc KH2 PO4
0.05g/cc MgSO4
残部蒸留水
pH 7(KOHにて調整)

0010

(1−2)菌体細胞壁成分の酵素処理
上記(1−1)の方法により得た菌体を蒸留水に懸濁し、超音波処理を行った(超音波破砕機:UR−200P型トミー精工(株)製;発振周波数20kHz、200Wで30分)。この懸濁液を3000gで30分の条件で遠心分離し、未破砕細胞を除去後、上清を18,000rpm、30分の条件で遠心分離を行った。得られた沈殿は4%SDS水溶液に懸濁後、100℃で40分の加熱処理を行った。室温まで冷却した後に再び18,000rpm、30分、25℃の条件で遠心分離を行った。この遠心分離の操作を更にもう一度繰り返して得られた沈殿物凍結乾燥後卵白リゾチーム0.01%(シグマ社製)及びアクロモペプチターゼ0.01%(シグマ社製)で72時間処理後、遠心上清回収し、ペプチドグリカンを主成分とする細胞壁可溶画分を得た。
(2−1)分子量10、000以下画分の分離
(1−2)で得た細胞壁可溶画分を適量の蒸留水に溶解しポリスルホン膜よりできた分子量10,000の限外濾過フィルターに通して分画した。

0011

(2−2)マウス経口投与によるTNF−α誘導作用の評価
ICRマウス(平均体重20g)に(1−2)で得た分子量10,000以上と分子量10,000以下の菌体細胞壁可溶画分を経口投与した3時間後に市販の免疫賦活剤であるOK−432(中外製薬)を静脈内投与し、2時間後の血清中のTNF−α活性を測定した。対照サンプルとして蒸留水、免疫賦活作用効果を検定するための標準物質としてムラミルジペプチド(シグマ;MDP)を用いた。ペプチドグリカンに特有であるアミノ酸であるジアミノピペリン酸指標に定量し、分子量10,000以上の画分と分子量10,000以下の画分に存在するペプチドグリカン量を等しくし、血中におけるTNF産生のPriming 効果の大きさを表−1に示す方法で評価した。結果を表−2に示す。

0012

表−1(投与サンプル投与量)

評価サンプル投与量
蒸留水1.0mg/頭
分子量10,000以上の画分 1.0mg/頭
分子量10,000以上の画分 2.0mg/頭
分子量10,000以下の画分 0.5mg/頭
分子量10,000以下の画分 1.0mg/頭
MDP0.1mg/頭

0013

表−2(結果)

TNF産生のPriming
蒸留水(1.0mg/頭) −
分子量10,000以上の画分(1.0mg/頭) −
分子量10,000以上の画分(2.0mg/頭) −
分子量10,000以下の画分(0.5mg/頭) +
分子量10,000以下の画分(1.0mg/頭) ++
MDP(0.1mg/頭) ++

0014

0015

実施例2
免疫賦活能を有する低分子画分を含む微生物菌体酵素処理物最適投与量の検討
実施例1の(1−1)の方法に従いバチルス属バチラス・サチラス(Bacillus subtilis:ATCC13952)及びブレビバクテリウム属ブレビバクテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 )の菌体を調製した。得られた菌体を蒸留水に懸濁し、超音波処理を行った(超音波破砕機:UR−200P型、トミー精工(株)製;発振周波数20kHz、200Wで30分)。この懸濁液の遠心沈殿を回収し、未破砕細胞を除去後、更に上清を18,000rpm、30分の条件で遠心分離を行った。得られた沈殿は4%SDS水溶液に懸濁後、100℃、40分の加熱処理を行った。室温まで冷却した後に再び18,000rpm、30分、25℃の条件で遠心分離を行った。この遠心分離の操作を更にもう一度繰り返して得られた沈殿物を凍結乾燥後、リゾチーム0.01%及びアクロモペプチターゼ0.01%で酵素処理を行った。反応時間はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムについては8時間と72時間、バチラス・サチラスについては48時間とした。酵素処理後、遠心上清を回収し、それぞれの細胞壁可溶画分を得た。

0016

0017

表−3 (結果)

サンプル 処理PG含量 PG中分子量PO Priming( 血中)

0018

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