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課題

タンパク質の代謝安定性を調節する方法を提供すること。

解決手段

タンパク質のアミノ末端を操作し、これによってタンパク質の代謝安定性および他の性質を制御する。

概要

背景

概要

タンパク質の代謝安定性を調節する方法を提供すること。

タンパク質のアミノ末端を操作し、これによってタンパク質の代謝安定性および他の性質を制御する。

目的

効果

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請求項1

所定のタンパク質又はポリペプチドを、真核宿主細胞内で、該タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端ユビキチンに融合されている融合タンパク質として発現させることから成り、該融合タンパク質は、ユビキチンのカルボキシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はポリペプチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異性エンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分解により切断可能であることを特徴とする、所定のアミノ末端アミノ酸残基を有するタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項2

融合タンパク質を真核宿主細胞内で切断して、所定のアミノ末端アミノ酸残基を有する所期のタンパク質又はポリペプチドを放出させる請求項1に記載の方法。

請求項3

a)所期のタンパク質又はポリペプチドを、融合タンパク質を切断しうるユビキチン特異性プロテアーゼ欠損している宿主細胞内で融合タンパク質として発現させ;b)次いで該融合タンパク質をin vitroでユビキチン特異性プロテアーゼと接触させることによって該融合タンパク質を切断し、所定のアミノ末端残基を有するタンパク質を放出させることを特徴とする、所定のアミノ末端アミノ酸残基を有する所期のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項4

所期のタンパク質又はポリペプチドに融合されたユビキチンを含んで成るユビキチン融合タンパク質をin vivoで製造することから成り、所期のタンパク質又はペプチドのアミノ末端アミノ酸残基がユビキチンのカルボキシ末端アミノ酸残基に結合されており、所期のタンパク質又はペプチドがそのアミノ末端にメチオニン以外の所定のアミノ酸残基を有し、該所定のアミノ末端残基が代謝的に安定化又は不安定化されていることを特徴とする、代謝安定性がアミノ末端アミノ酸残基の同定により決定される所期のタンパク質又はペプチドの代謝安定性の調節方法

請求項5

ユビキチン融合タンパク質が、ユビキチンのカルボキシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はペプチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異性エンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分解により切断可能である請求項4に記載の方法。

請求項6

所期のタンパク質又はポリペプチドに融合されたユビキチンを含んで成るユビキチン融合タンパク質をin vivoで製造することから成り、所期のタンパク質又はペプチドのアミノ末端アミノ酸残基がユビキチンのカルボキシ末端アミノ酸残基に結合されており、所期のタンパク質又はペプチドがそのアミノ末端にメチオニン以外の所定のアミノ酸残基を有し、該所定の残基がイソロイシングルタミン酸チロシングルタミンフエニルアラニンロイシンアスパラギンリシン及びアルギニンからなる群より選ばれることを特徴とする、代謝安定性がアミノ末端アミノ酸残基の同定により決定されるタンパク質又はペプチドを代謝的に不安定化する方法。

請求項7

ユビキチン融合タンパク質が、ユビキチンのカルボキシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はペプチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異性エンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分解により切断可能である請求項6に記載の方法。

背景技術

業者は認識するか、あるいは日常実験を用いて確証することができるように、ここに記載する本発明の特定の実施態様について、多くの同等の実施態様が可能である。このような同等の実施態様は、次の請求の範囲に包含されることを意図する。

0001

バクテリアおよび真核生物細胞において、半減期が細胞の世代時間近接するかあるいはそれを越える、比較的長く生きるタンパク質は、半減期が細胞の世代時間の1パーセントより短いことがあるタンパク質と共存する。細胞内タンパク質の分解(degradation)の速度は、細胞の生理学的状態関数であり、そして個々のタンパク質について差別的に制御されるように見える。とくに、損傷したおよびそうでなければ異常なタンパク質は生体内で代謝的に不安定である。選択的タンパク質の分解の特定の機能はほとんどの場合においてなお未知であるが、多くの調節タンパク質は生体内で極端に短い寿命を有する。このようなタンパク質の代謝的不安定性は、それらの合成または分解の速度の調節された変化によって、それらの細胞内濃度の急速な調節を可能とする。細胞内タンパク質の代謝的不安定性がその機能について必須であることが示された、わずかの場合は、バクテリオファージラムダのcIIタンパク質および酵母菌サッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のHOエンドヌクレアーゼを包含する。

0002

正常の代謝的条件下の細胞内タンパク質の選択的ターンオーバーのほとんどは、ATP依存性および(真核生物において)非リソソーム的である。最近の生化学および遺伝学証拠は、真核生物において、生存が短い細胞内タンパク質へのユビキチン(ubiquitin)の共有接合がそれらの選択的分解について必須であることを示す。所定のタンパク質が生体内で代謝的に安定であるかあるいは不安定であるかを決定するルールは、従来知られていない。

0003

本発明は、タンパク質のアミノ末端を操作し、これによってタンパク質の代謝的安定性および他の性質を制御する方法に関する。さらに、本発明は、タンパク質のアミノ末端において、20アミノ酸残基(またはそれらの類似体)のいずれかをもつタンパク質を生体内または生体外で生成する方法を提供する。本発明は、一部分、細胞内タンパク質の生体内の半減期がアミノ末端アミノ酸残基の関数であるという顕著な発見に基づき、そして生体内または生体外で特定したアミノ末端をもつタンパク質を発生させることを可能とする新規な(およびより一般的に応用可能な)技術に基づく。本発明は、また、新しく同定されたプロテアーゼ、ユビキチン特異的処理プロテアーゼに関し、前記プロテアーゼは、生体内または生体外で、問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ酸残基を露出することを可能とする性質を有する。

0004

細胞内タンパク質のアミノ末端において露出されたアミノ酸の性質は、タンパク質が生体内で長く生きるか、あるいは生存が短いかを特定する、1つの極めて重要な決定基であることを示した。個々のアミノ酸は、タンパク質のアミノ末端において露出されたとき、それらがタンパク質に与える半減期に関して、安定化または脱安定化のアミノ酸として分類することができる。脱安定化アミノ酸残基は、脱安定化アミノ酸のあるもについて数分までに少ない、短い半減期を与える。安定化アミノ酸残基は、多数時間の長い半減期を与える。この顕著な、新しく発見された、タンパク質の半減期のそのアミノ末端残基への依存性は、ここでN−末端ルールと呼ぶ。

0005

このN−末端ルールに基づき、タンパク質のアミノ末端は、こうして、タンパク質の細胞内の半減期を変化するように、設計または変更することができ、そして、このようにして、タンパク質の生体内の寿命および/または活性を調節することができる。この能力は、多くの異なる面において合理的なタンパク質の設計のために利用することができる。天然または野生型のタンパク質は、修飾して、それらを生体内の分解に対して多少抵抗性とすることができる。タンパク質の設計または変更は、タンパク質レベルまたは遺伝子(DNA)レベルで実施することができる。例えば、タンパク質はアミノ末端を化学的に変更または操作して、安定化または脱安定化クラスのアミノ酸残基のアミノ末端においてを露出することができる。遺伝子のレベルにおいて、タンパク質をエンコードする遺伝子は、所望のクラスのアミノ酸をアミノ末端においてをエンコードするようにして、発現されたタンパク質が、タンパク質分解のN−末端ルールの通路に関してタンパク質を代謝的に安定または不安定とする、前以て決定したアミノ末端構造を示すようにすることができる。さらに、タンパク質は操作したアミノ末端をマスキングする「マスキング」タンパク質配列に発現、融合させ、こうして、アンマスキング(unmasking)したとき、タンパク質がそのアミノ末端残基の性質に依存する所望の安定性または他の性質を示すようにすることができる。このような構成体において、例えば、2つのタンパク質配列の間の接合は、例えば、エンドヌクレアーゼによって特異的に切断するように設計することができる。融合した配列の内部のタンパク質分解は、問題のタンパク質の特異的に操作されたアミノ末端をアンマスキングし、そしてタンパク質をN−末端ルールによって支配される分解に付す。タンパク質のアミノ末端を操作する1つの特定の新しい方法は、本発明において、ユビキチン特異的処理プロテアーゼの同定およびその基質特異性の決定によって提供される。このプロテアーゼを使用して、ユビキチンと他のタンパク質との融合体は、生体内または生体外で特別に処理して、所望のアミノ末端残基をもつタンパク質を発生させることができる。

0006

生存が短いタンパク質を特別に操作する、異なる、かつまた、新しい方法は、本発明において、効率よく脱ユビキチンすることができる、ユビキチン−タンパク質融合体、例えば、ユビキチン−Pro−β−ガラクトシダーゼが代謝的に不安定であるという発見によって提供される。こうして、アミノ末端のユビキチン部分タンパク質に、その除去を不可能とするか、あるいは非効率的とする方法で、取り付けることによって、N−末端ルールに直接基づかない、明確な技術によって脱安定化することができる。

0007

さらに、変異型の細胞を発生させることができ、前記細胞は分解する生存が短いタンパク質を条件的または非条件的に停止する、「N−末端」分解性プロテアーゼ中に推定上の突然変異を含有する。これらの細胞を使用して、細胞内で通常生存が短いタンパク質を過度に生成することができる。

0008

N−末端ルールを下に詳しく解説する。簡単に述べると、タンパク質の分解を支配するこのルールは、そのアミノ末端に種々のアミノ酸残基を有し、そしてユビキチンとの融合タンパク質として生成した、酵素β−ガラクトシダーゼの生体内の半減期を検査することによって明らかにされた。ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をエンコードするキメラ遺伝子を酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)(以後、S.cerevisiae)中で発現するとき、ユビキチンは発生期の融合タンパク質を切断して、脱ユビキチンされたβ−ガラクトシダーゼ(βgal)を生成する。1つの例外を除いて、この切断はユビキチン−βgal)の接合におけるβgalのアミノ酸残基の性質に無関係に起こり、これによって選択的に異なる残基をそうでなければ同一のβgalタンパク質のアミノ末端において露出することができる。そのように設計されたβgalタンパク質は、βgalのアミノ末端におけるアミノ酸の性質に依存して、20時間以上から3分より短い範囲の、顕著に異なる生体内の半減期を示した。こうして、アミノ酸は、そのアミノ末端に存在するとき、βgalにそれらが与える半減期に従って配列することができる。例えば、アミノ酸、メチオニンセリンアラニンスレオニンバリングリシンおよびシステインは20時間より長い半減期を与える。フェニルアラニンロイシンアスパルギンおよびリジンは約3分の半減期を与える。(アミノ酸の完全なリストおよび対応する半減期について下表1参照)。

0009

原核細胞および真核生物の両者からの長い半減期の非画分化細胞内タンパク質において、現在知られているアミノ末端残基は、事実上もっぱら、N−末端ルールによって正確に予測されるように、アミノ酸の安定化クラスに属する。この結果は、一般に細胞内タンパク質の選択的分解におけるN−末端ルールを強く説明する。

0010

適当なアミノ末端アミノ酸は、非画分化細胞内タンパク質の代謝的安定性に必須な(しかし、必ずしも十分ではない)要件であるように思われる。こうして、タンパク質が細胞内で比較的安定であるためには、安定化アミノ酸はアミノ末端に存在すべきである。タンパク質のアミノ末端における脱安定化残基の存在は、頻繁であるが、その生体内の代謝的脱安定化のために、常に十分であるということはない。このような脱安定化が比較的小さい程度に起こるとき、それ以上の分析は、アミノ末端の不十分な接近可能性あるいはアミノ末端付近における「許容性」配列の欠如、例えば、タンパク質のアミノ末端領域におけるセグメント移動性の欠如を示す。少なくともある場合におけるアミノ末端における安定化アミノ酸の存在(例えば、β−galについて観察されるような)は、安定性をタンパク質に与える。しかしながら、アミノ末端における安定化アミノ酸は、長い半減期を常に与えるというわけではない。なぜなら、他の分解的通路はタンパク質の究極の寿命の決定における含まれ得るからである。例えば、内部のタンパク質分解の切断(タンパク質の末端領域の外側の切断)は、切断の得られる生成物のアミノ末端において脱安定化アミノ酸を露出させることができ、次いでこれはN−末端ルールの通路を経て急速に分解する。安定化アミノ酸を使用するための適当な環境は、実験的に確証することができる。

0011

N−末端ルールは生体内の選択的タンパク質分解の他の面を包含する、より複雑な「半減期のルール」の唯一の成分(中央のものにかかわらず)であることができるが、N−末端ルールの通路によって天然の修飾されないタンパク質より分解に対して多少抵抗性であるタンパク質を生成するために、N−末端ルールはタンパク質構造を設計または変化させるための合理的な実施可能なアプローチを提供する。タンパク質は、タンパク質または遺伝子のレベルで設計または修飾して、安定化または脱安定化のクラスの所望のアミノ酸をそれらのアミノ末端において提供する。タンパク質の半減期を調節する能力は、タンパク質の細胞内の活性の変調を可能とする。

0012

その代謝的安定性を増加または減少するためにタンパク質を修飾する直接のアプローチは、タンパク質のアミノ末端をタンパク質レベルで直接操作することである。所望のアミノ末端アミノ酸を提供するために、問題のタンパク質のアミノ末端は、例えば、安定化または脱安定化のクラスのアミノ酸は、適当な化学を使用して、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端に付加することによって化学的に変更することができる。こうして、例えば、不安定なタンパク質は、安定化アミノ酸残基(例えば、メチオニン、セリン、アラニン、スレオニン、バリン、グリシンまたはシステイン)をタンパク質のアミノ末端に付加することによって、より安定性とすることができる。逆に、安定なタンパク質は脱安定化アミノ酸をアミノ末端に付加することによって脱安定化することができる。タンパク質のアミノ末端を修飾する1つの明確な方法は、タンパク質のアミノ末端への単一のアミノ酸の翻訳後の付加を触媒する、特異的酵素、アミノ酸−タンパク質のリガーゼを使用することである。同一のタイプの非遺伝子的変更のための他の方法は、当業者によって容易に確認することができる。

0013

あるタンパク質において、アミノ末端の末端はタンパク質のコンホメーション(すなわち、その第三または第4構造)の結果として観察される。これらの場合において、アミノ末端のより広範な変更はタンパク質をN−末端ルールの通路に付すために必要なことがある。例えば、接近不可能なアミノ末端のために、単一のアミノ末端残基の簡単な付加または置換は不十分である場合、いくつかのアミノ酸(リジン、基質のタンパク質へのユビキチンの接合の部位、を包含する)は、初期のアミノ末端に付加して、操作したアミノ末端の接近可能性および/またはセグメントの移動性を増加することができる。

0014

タンパク質の修飾または設計は、また、遺伝子レベルで達成することができる。分離したまたは合成した遺伝子の5’末端への適当なコドンの付加または置換のための部位特異的突然変異発生の普通の技術を使用して、エンコードしたタンパク質に所望のアミノ末端構造を提供することができる。例えば、発現されたタンパク質はそのアミノ末端に所望のアミノ酸を有するので、安定化アミノ酸のために適当なコドンを、タンパク質をエンコードする配列のアミノ末端に挿入するか、あるいは構成ことができる。

0015

同時に、発現されたタンパク質は翻訳後細胞内でしばしば自然に修飾される。これはアミノ末端の修飾を包含することができる。例えば、アミノ末端は、それからの1つまたは数個のアミノ酸を切断するアミノペプチダーゼによって、作用させることができる。アミノ酸は、また、翻訳後の処理によってアミノ末端に付加することができる。本発明は、アミノ末端のタンパク質の処理のなお明確にされないルールを「バイパス」して、成熟した処理されたタンパク質種のアミノ末端において所望のアミノ末端残基を正確にかつ特異的に露出する方法を提供する。問題のタンパク質のアミノ末端の究極の構造へのこのような翻訳後の事象の衝撃を最小にするために、アミノ末端に融合した「マスキング」タンパク質配列が問題のタンパク質のアミノ末端(所望の安定化または脱安定化の構造を有するように設計した)より先行する、特異的融合タンパク質を設計することができる。問題のマスキングタンパク質のアミノ末端へ融合したタンパク質配列が2つの間の接合における特異的切断に感受性であるように、融合タンパク質を設計する。こうして、タンパク質配列を除去すると、問題のタンパク質のアミノ末端はアンマスキングされ、こうして、解放された半減期は前以てアミノ末端によって支配される。融合タンパク質は、例えば、宿主細胞のエンドヌクレアーゼによって生体内の特異的切断のために、あるいは生成体(融合タンパク質を切断する能力を欠く)からの分離後、切断できる生体外系における特異的切断のため、設計することができる。

0016

ユビキチンは問題のタンパク質と融合したタンパク質の構成のための、広く有用な融合相手である:ユビキチンが融合されているタンパク質への依存性をほとんどまたは全くもたない、細胞質真核生物プロテアーゼによって、人工的ユビキチン−タンパク質融合体を正確に切断することができるという発見は、生体内または生体外の両者のタンパク質操作方法において応用することができ、そして本発明の主要な面である。例えば、ユビキチン−タンパク質融合方法を使用して、人工的手段によって生成されたタンパク質において、真性のアミノ末端を人工的に発生させることができる。こうして、天然の真核生物または原核生物のタンパク質のアミノ末端の特性は、原核生物の宿主において生成されたユビキチン−タンパク質融合体の生体外切断によって発生させることができる。

0017

ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を生成するための特別の方法を、下において詳述する。他のタンパク質をエンコードする遺伝子を、この方法においてLacZ(β−gal遺伝子)の代わりに使用することができる。

0018

一般に、ユビキチン融合タンパク質はキメラ遺伝子構成体によって発現され、前記遺伝子構成体は、5’から3’への向きにおいて、問題のタンパク質をエンコードする遺伝子に結合したユビキチン遺伝子からなる。問題のタンパク質のアミノ末端アミノ酸のためのコドンは、ユビキチン遺伝子の3’末端にすぐに隣接して位置する。融合した遺伝子生成物は、ユビキチンと問題のタンパク質との間の接合において生体内または生体外で内部タンパク質分解的に切断して(本発明において同定した純粋なまたは部分的に精製されたユビキチン−特異的プロテアーゼを使用して)、そのアミノ末端に所望のアミノ酸を有する問題のタンパク質を発生させることができる。タンパク質のアミノ末端を特異的に操作する記載する能力について、ある数の用途が存在する。1つのこのような用途は、解放されたタンパク質の細胞内の半減期がN−末端ルールの原理によって支配されるという事実によって確立される。ここに記載するタンパク質のアミノ末端を操作するための特定の方法の他の用途は、問題のタンパク質の所望の機能的性質の調節から、その抗原性の修飾、および再び、当業者によって容易に確証することができる他の用途の範囲である。

0019

問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ酸残基を発生させるこの方法は、2つの新規は成分を包含する:一方、ユビキチン−タンパク質融合体の使用、および他方、同定されたユビキチン特異的処理プロテアーゼ。そして、この研究において、それらの顕著な基質の要件が発見された。ユビキチン特異的プロテアーゼの初期の同定は生体内でなされたが、この酵素は、また、生体外(抽出液中)で比較的安定であり、そして当業者に知られた技術によって等質性に容易に精製することができる。さらに、ユビキチン特異的処理プロテアーゼの基質の特異性は、進化において保存され、酵母菌および動物において同一である。この酵素は、粗製の抽出物から、当業者に知られた方法のなかでも、ホスホセルロースDEAEセルロースおよびSHセファロースの順次のクロマトグラフィーによって精製することができる。あるいは、このプロテアーゼのための遺伝子は当業者によってクローニングすることができる。クローニングされたプロテアーゼ遺伝子は生体内で使用することができるか、あるいは遺伝子は適当な宿主中で過度に発現することができ、過度に発現されたユビキチン特異的プロテアーゼを精製し、そして同一または同様な目的に生体外で使用することができる。ここににおけるこの酵素の発見およびその基質特異性の詳細な特性は、この酵素の生体外および生体内の使用を提供する。

0020

問題のタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ酸残基の発生を可能とするユビキチン−タンパク質融合体の使用は、生成体の細胞からのこのようなタンパク質の精製を促進するために拡張することができる。前述のユビキチン−タンパク質融合体に結合した、便利なマーカータンパク質、例えば、ストレプトアビジン、をエンコードする遺伝子は容易に構成することができる。得られる(マーカータンパク質)−ユビキチン−タンパク質融合体は、生成体細胞から、マーカータンパク質の前以て選択した性質、例えば、ビオチンカラム親和クロマトグラフィーによって分離可能であるストレプトアビジンの既知能力を使用することによって分離することができる。こうして、精製された(マーカータンパク質)−ユビキチン−タンパク質融合体は、次いで、本発明において記載するユビキチン特異的プロテアーゼによって特異的に切断して最終生成物、そのアミノ末端に所望のアミノ酸残基を有する問題のタンパク質、を発生することができる。

0021

例えば、この分野において現在標準の部位特異的突然変異発生技術よる、所望のアミノ酸のアミノ末端アミノ酸のコドン。問題のタンパク質をエンコードする遺伝子が合成遺伝子である場合、適当な5’コドンを合成方法の間に構成することができる。あるいは、特異的コドンのためのヌクレオチドは遺伝子の5’(アミノ末端のエンコーディングド)末端に適当なDNA配列結合することによって、分離または合成された遺伝子に付加することができる。

0022

ユビキチン特異的プロテアーゼによって切断されうるユビキチン用融合相手は、また、使用することができる。さらに、問題のタンパク質のアミノ末端をマスキングするためのユビキチン以外の融合相手を使用することができる。適当な場合において、融合タンパク質は、十分に狭い特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのためのタンパク質分解切断部位を含有するように設計し、こうして唯一の標的部位が融合タンパク質において切断されるようにすることができる。このようなプロテアーゼの極めて重要な性質は、切断部位カルボキシ末端部位にりんせつするアミノ酸残基について十分に緩和された要件でなくてはならない。商業的に入手可能なプロテアーゼ、補体因子Xa、はこれらの性質を示し、こうしてそれらのアミノ末端の究極的位置において前以て決定したアミノ酸残基をもつタンパク質を直接発生させることができる[K.ノグチおよびH.C.トゲソン(Thogersen)、ネイチャー(Nature)、309:810(1984)]。エンドプロテアーゼのための認識部位を、マスキングタンパク質の配列と問題のタンパク質のアミノ末端をエンコードする3’領域との間の接合中に操作することができる。

0023

生存が短いタンパク質を操作する異なる明確な方法は、本発明において、効率よく脱ユビキチンできないユビキチン−タンパク質融合体、例えば、ユビキチン−Pro−β−ガラクトシダーゼ融合体(表1)が代謝的に不安定であるという発見によって提供される。こうして、アミノ末端ユビキチン部分をタンパク質に、その除去が不可能であるか、あるいは非効率的になされるような方法で、取り付けることによって、N−末端ルールの要件に従ってタンパク質の所望のアミノ末端を発生される方法と定性的に区別される、明確な技術によって、タンパク質を脱安定化することができる。ユビキチン−タンパク質融合体の効率よく脱ユビキチンの防止は、いくつかの方法において、例えば、表1に示すようなユビキチン−タンパク質の接合においてプロリン残基を使用することによって、あるいはユビキチン部分がもはやユビキチン特異的処理プロテアーゼによって認識されないが、なお分解的通路の残部によって認識されうるような方法で、ユビキチンのアミノ酸配列をそのカルボキシル末端近くで変化させることによって、達成することができる。ユビキチン−タンパク質融合体の脱ユビキチン速度を減少するこれらおよび他の方法は、当業者によって容易に確証できる。

0024

本発明の方法は、なかでも、タンパク質の半減期を細胞内で調節するために使用できる。この可能性が使用である多くの場合が存在する。例えば、遺伝子を細胞中にその中の発現のために導入するとき、発現された生成物は特定の要求に依存して長い半減期または短い半減期について設計することができる。

0025

一般に、短い半減期をもつ脱ユビキチンしたタンパク質は、タンパク質の細胞内レベルの調節をいっそうよく受けることができる。タンパク質の細胞内レベルおよび活性を微細に調節する能力は、治療または生体外細胞培養物を使用する研究において有用であることがある。例えば、遺伝子の治療において、遺伝子を細胞中に導入して、遺伝子の欠乏または異常を補正することができる。遺伝子は誘発性プロモーターの制御下に挿入することができる。誘導は遺伝子生成物の増大した発現および結局、細胞内のより高いレベルを生ずる。遺伝子を不安定なタンパク質をエンコードするように設計する場合、発現されたタンパク質の細胞内濃度は、細胞内で持続しないので、その合成速度の後の減少に対していっそう急速に応答的である。このようにして、挿入された遺伝子によってエンコードされたタンパク質の細胞内レベルおよび/または活性は、いっそう微細に調節調節することができる。

0026

本発明の方法は、また、マーカーに関する表現型に必要な時間を短縮することによって、選択可能なマーカーの使用を拡張するために使用できる。この目的に対して、マーカー遺伝子によってエンコードされる生成物は、N−末端ルールに従いそのアミノ末端を変更することによって脱安定化することができる。このようにして、ネガティブ表現型についての選択は促進することができる。なぜなら、マーカーをエンコードする機能が消滅した後、マーカーの生成物はより急速に絶滅するであろうからである。1つの例はチミジンキナーゼ(tk)遺伝子である。tk遺伝子は、アミノ末端において適当な脱安定化アミノ酸を導入することによって、安定性が低い酵素をエンコードするように操作することができる。tk-表現型を生ずる遺伝子の突然変異は、残留するtkがより急速に分解するので、細胞によっていっそう急速に現れるであろう。これは、tk-型への形質転換前に合成されたtkを「希釈」するためにより多くの時間が要求される場合、増殖の遅い細胞においてことに有用である。

0027

N−末端ルールに基づくタンパク質の修飾の原理は、また、細胞毒素の設計において使用できる。タンパク質の細胞毒素はN−末端ルールの通路によって分解可能な不安定なタンパク質として設計することができるので、それらの毒性作用標的細胞上で発揮された後、それらは持続しない。毒素の寿命を減少すると、非標的細胞殺す可能性は減少する。 分解のN−末端ルールの通路の発見は、N−末端ルールの通路の必須成分をエンコードする遺伝子中に突然変異体を有する突然変異体細胞の発生を可能とする。例えば、そうでなければ生存が短いタンパク質を効率よく分解することが永久にあるいは条件的に不可能である、細胞を生成することができる。これらの細胞は、通常細胞内で不安定である所望のタンパク質を生成するために使用できる。

0028

本発明をN−末端ルールの解釈の次の詳細な説明によってさらに例示する。

0029

方法
タンパク質の配列決定
ub−Met−βgal(第3A図)をエンコードする、pUB23を有するS.cerevisiae細胞を、後述するように、[35S]メチオニンで標識し、次いで抽出調製し、βgalを免疫沈澱し、そして電気泳動する。湿ったポリアクリルアミドゲルオートラジオグラフィーにかけ、βgalの帯びを切除し、そして電気溶離したβgalをエドマン(Edman)分解による6サイクル放射線化学の配列決定にかけた。配列決定はハーバード大学の微生物化学設備(Micro Chem Facilty)においてW.レン(Lane)によって実施された。

0030

部位特異的突然変異誘発
pUB23(第1図)を、順次に、AccI、polIのクレノー断片、およびBamHIで処理した。XhoI部位を含有する断片を精製し、そしてM13mp9ファージDNAの充填したHaeIII部位およびBAMHI部位の間に挿入した(J.メッシングおよびJ.ビエラ、遺伝子(Gene)19、263(1982))。部位特異的突然変異誘発[M.スミス、アニュアル・レウビューイン・ジェネティックス(Annu.Rev.Genet.)、19、423(1985)]を、クレイマー、W.ら、核酸の研究(Nucleic AcidsResearch)、12、9441(1984)によって記載されるように、βgalのMetコドンの5’側に10塩基および3’側に12塩基を含有する、合成25残基のオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して実施した。すべての4塩基を合成の間にもとのMetコドン位置において発生させた。一次のファージのプラークは、コドンの変化の領域にまたがる12残基のオリゴヌクレオチドプローブを使用して交雜し[ウッド、N.I.ら、PNAS、82、1585(1985)]、そしてもとの配列に交雜することによってスクリーニングした。期待したプラークのインサートを含有する非交雜プラークは、連鎖停止方法によって配列決定した。[サンガー、F.ら、PNAS、71、5463(1977)]。所望の構成体をpUB23バックグラウン中に移すために、突然変異ファージの複製形態のDNAをXhoIおよびBamHIで消化し、そしてプラスミドpLGS5−ATGの同一消化物に加えた[参照、第1図およびL.グアレンテ、メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods Enzymol.)、101、181(1983)]。結合した混合物を使用してE.coli菌株MC1061を形質転換した。[M.J.カサバンおよびS.N.コウヘン、ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー(J.Mol.Biol.)、138、179(1980)]。問題のプラスミドを含有するコロニー(ここでβgalのオープンリーディングフレーム修復されている)は、X−gal平板上でそれらの青色によって認識された。

0031

パルスチェース実験
問題のプラスミドで形質転換した[F.シャーマンら、メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス(Methodsin Yeast Genetics)、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー(Cold Spring Harbor Laboratory)ニューヨーク、1981]菌株BWG−9a−1(MAT his ura3 ade6)のS.cerevisiae細胞を、2%のガラクトース、アミノ酸を含まない0.67%の酵母菌窒素塩基(DIFCO)、アデニン(10μg/ml)およびメチオニンを含むアミノ酸の培地中で、30℃においてほぼ5のA600に増殖させた。典型的には、5mlの培養物ミリポア(Millipore)マイクロタイター濾過プレートウェルを通して濾過することによって収穫し、フィルター上でメチオニンを欠く同一培地で数回洗浄し、そして0.3mlの1%のガラクトース、50ミリモルリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)中に最懸濁させた。次いで、[35S]メチオニン(50〜100μCi)を30℃において5分間加えた;細胞を濾過によって集め、そして0.5mg/mlのシクロヘキシルイミドを含有する増殖培地の0.4ml上に最懸濁させた。試料(0.1ml)を示した時間に抜き出し、そして0.4mlのガラスに加えてビーズレウペプチン、ペプスタチンA、アンチペインアプロチニンおよびキモスタチンを含有する0.5mlの冷緩衝液A[シグマ(Sigma)]に添加した。その直後、細胞を4℃においてほぼ3分間渦形成することによって破壊した;抽出物を12,000gで3分間遠心し、そして上澄み液中酸不溶性35Sの放射能を決定した。等量の合計の酸不溶性35Sを含有する上澄み液アリコートを、galに対するモノクローナル抗体で免疫沈澱するために処理した。モル過剰量(少なくとも10倍)の抗体を含有する腹水を各アリコートに添加し、引き続いて4℃において2時間インキュベーションした;次いで、プロテインA−セファローズ(Sepharose)[ファーマシア(Pharmacia)]を添加、懸濁液を揺動しながら4℃において30分間インキュベーションし、そして12,000gで1分間遠心した。プロテインA−セファローズのペレットを0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する緩衝剤A(下を参照)中で3回洗浄し、ジチオスレイトール(DTT)含有電気泳動試料緩衝液中に再懸濁させ[U.K.ラエルミ、ネイチャー(Nature)、227、680(1970)]。100℃に3分間加熱し、そして12,000gで1分間遠心した。上澄み液の等しいアリコートを7%の不連続のポリアクリルアミド−SDSゲル(15×15×0.15cm)中で電気泳動させ、次いでフルオログラフィーにかけた。いくつかの実験において、上のプロトコルを使用せず、抽出物はSDSの存在下に直接細胞を沸騰させることによって調製し、本質的に同一の結果を得た。

0032

E.coli中で生成したub−βgalタンパク質の分析
プラスミドpUB23(第1図および第3図)をDS410、E. coli菌株を生成するミニ細胞、中に導入した。[N.ストウカーら、転写および翻訳:実際的アプローチ(Transcription and Translation:A practical Approach)、B.D.ハーンスおよびS.J.ヒギンス編、IRLプレス、オクスフォード、1984p.153]。上のN.ストウカーらの文献に記載されているように、ミニ細胞を調製し、そして[35S]メチオニン[600Ci/ミリモル、アマーシャム(Amersham)]で36℃において60分間標識した。

0033

標識したミニ細胞を遠心し、2%のSDS、10ミリモルのDTT、10ミリモルのNa−HEES(pH7.5)中に再懸濁させ、そして100℃で3分間加熱した。12,000gにおいて1分間遠心した後、上澄み液を20倍に緩衝液A(1%のトリトンX−100、0.1モルのNaCl、5ミリモルのNa−EDTA、50ミリモルのNa−HEPES、pH7.5)で希釈し、次いでフェニルメチルスルホニルフルオライドPMSF)およびN−エチルマレイミドを、それぞれ、0.5ミリモルおよび10ミリモルに添加した。4℃において4時間後、試料を0.5ミリモルのPMSFを含有する緩衝液Aに対して4℃において一夜透析し、そして免疫沈澱のために処理した(上の記載ように)。酵母菌中で生成したub−βgalタンパク質の分析
問題のプラスミドを有するS.cerevisiae細胞を800 mlのウラシル欠乏培地中で増殖させ、次いで収穫し、そしてレウペプチン、ペプスタチンA、アンチペイン、アプロチニンおよびクミスタチン(各々3μg/ml)を含有する緩衝液A中でガラスビーズで破壊した。抽出物を12,000gで3分間遠心した。飽和した硫酸アンモニウムを上澄み液に57%の最終濃度に添加した。4℃において一夜経過した後、沈澱したタンパク質を23,000gで30分間遠心することによって集めた。ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液A中に再溶解した。12,000gで3分間遠心後、腹水からのIgG分画(galに対するモノクローナル抗体を含有する)をAffi−Gel[バイオ−ラド(Bio−Rad)]に架橋することによって調製した親和カラムに試料を通過させた。架橋のために使用したIgG分画は、プロテインA−セファローズの親和クロマトグラフィーによって腹水から精製した。トリトンX−100を欠く緩衝液Aで洗浄後、抗体結合したタンパク質を0.25モルのグリシン−HCl(pH2.6)で溶離した。溶離液を直ちに1モルのNa−HEPES(pH8.5)でpH7.5に調節し、その後SDS中で0.1%にした。試料をセントリコン(Centricon)30[アミコン(Amicon)]中の限外濾過によって濃縮し、そして7%の不連続のポリアクリルアミド−SDSゲル中で電気泳動させた[U.K.ラエルミ、ネイチャー(Nature)(London)、227、680(1970)]。ニトロセルロースへのタンパク質の電気ブロッティング、およびユビキチンに対するペプチド仲介抗体を使用するイムノブロッティング分析を、P.S.スウェルロウ、D.フィンレイおよびA.バルシャウスキー、アナリティカル・バイオケミストリー(Analyt.Biochem.)、156、147(1986)に記載されているように実施した。A.ハースミルウォーキーのメディカルスクールの大学)から入手したユビキチンに対する異なる抗体を使用して、同一の結果を得た。

0034

図面の詳細な説明
第1図は、ユビキチン−lacZ遺伝子融合体の構成を示す。pUB2、pBR322に基づくゲノムDNAクローン[E.オズカイナク、ら、ネイチャー(Nature)、312、663(1984)は、フランキング領域ジグザグの線)と一緒に酵母菌ユビキチン解読配列の6つの反復(開いたボックス)を含有する。pUB2を、線図に示すように、最初のユビキチン反復から下流にBamHI部位の6塩基を配置することによって修飾した。これにより、単一のユビキチン反復と発現ベクターpLGSD5−ATGん;ゾーンゲノムとの間フレーム内融合するの構成(ヌクレオチドの配列決定によって確証された)が可能であった[G2と呼ばれる、L.グアレンテ、メソッズ・イン・エンジモロジー(MethodsEnzymol.)、101、181(1983)]。用語「2μm」は、2μmの円と呼ぶ酵母菌プラスミドの複製起源およびフランキング配列を含有するpLGSD−ATGの領域を意味する(上のL.グアレンテの文献を参照)。第3B図は、ユビキチン−βgal接合の付近における融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。

0035

第2図は、galの生体内で半減期がそのアミノ末端残基の関数であることを示す。(レーンa)pUB23、最初のub−lacZ融合、を有するE.coli菌株から分離したミニ細胞(第1図および第3図)を[35S]メチオニンで36℃で60分間標識し、次いで記載するようにβgalを分析した。galの免疫沈澱前に、標識したミニ細胞SDS抽出物を標識しない酵母菌SDS抽出物と一緒にしたとき、同一の結果が得られた。(レーンb)ub−Met−βgal(第3B図)をエンコードするpUB23を有するS.cerevisiae細胞(第1図)を、[35S]メチオニンで30℃において5分間標識し、次いでβgalを分析した。1〜30分の[35S]メチオニン標識期間の長さ、およびプロテアーゼ阻害剤の存在下の細胞の機械的破壊によって、あるいはSDS含有緩衝液中細胞を直接沸騰することによって生成された酵母菌抽出物を使用して、同一の結果が得られた。(レーンc)レーンaと同一であるが、galをエンコードする対照プラスミドpLGSD5(G1と呼ぶ、L.グアレンテの上の文献)E.coli細胞を使用した。(レーンd〜g)ub−Met−βgal(第3A図)をエンコードするpUB23を有するS.cerevisiae細胞(第1図)を30℃において5分間[35S]メチオニンで標識し、次いでシクロヘキシイミドの存在下に10、30および60分間チェースし(レーンえ〜g)、抽出し、免疫沈澱し、そしてβgalを分析した。(レーンh〜j)レーンd〜fと同一であるが、ub−Ile−βgalを使用した(参照、第3A図)。(レーンk〜m)レーンh〜jと同一であるが、ub−Gln−βgalを使用した。(レーンn〜q)レーンd〜gと同一であるが、ub−Leu−βgalを使用した。(レーンr〜u)レーンd〜gと同一であるが、ub−Arg−βgalを使用した。表示:ori;分離ゲル由来;ub、ユビキチン;βgal、特定したアミノ末端残基を含有するβgalタンパク質の電気泳動の帯び;この用語において、ub−Met−βgalのMet−βgal部分はβgalと表示する。矢印はβgalの代謝的に安定な、約90kDの消化生成物を示し、これはある比率の生存が短いβgal代謝的に部分、例えば、Leu−βgalおよびArg−βgalの生体内で内部タンパク質分解的切断の結果として明らかに形成する(レーンn〜u)。

0036

第3図は、ユビキチン−gal接合におけるgalの変化するアミノ酸残基を示す。(A)ub−Met−βgalをエンコードする、最初のプラスミド、pUB23(第1図)を、上に記載するように、突然変異誘発して、ub−βgal接合におけるもとのMetコドンATGをMet以外の19アミノ酸を特定するコドンに転化した。(第3図中に示す突然変異誘発のもとのラウンドは19のうちから15の可能な置換を生成した。残りの4つの置換は後に生成した(参照、表1))。矢印は、ub−Pro−galを除外した融合タンパク質のすべてを用いて起こる、発生期の融合タンパク質における脱ユビキチン生体内で切断の部位を示す(参照、テキスト)。示した構成体のすべては、第2gal残基としてHisをエンコードする。さらに、構成体のあるもの(ub−Met−His−Gly−βgal、ub−Met−Gln−Gly−βgal、およびub−Met−Gln−His−Gly−βgal、最後のものは挿入突然変異によって生成した、参照、表2)において、HisあるいはGlnはub−βgal接合においてMetより後に存在し、対応するgalタンパク質の代謝的安定性について区別不可能な結果を与えた。(B)ub−Met−βgalのアミノ酸配列(単一の文字略号)、初期の融合タンパク質(第1図)、ub−βgal接合付近。単一の文字のアミノ酸の略号:A、Ala;C、Cys;D、Asp;E、Glu;F、Phe;G、Gly;H、His;I、Ile;K、Lys;L、Leu;M、Met;N、Asn;P、Pro;Q、Gln;R、Arg;S、Ser;T、Thr;V、Val;W、Trp;Y、Tyr。

0037

第4図は、脱ユビキチンしない場合、ユビキチン−galが生存が短いことを示す。(レーンa〜g)Xが各レーンの上部に示す残基である、ub−X−βgal融合タンパク質をエンコードするプラスミドを有するS.cerevisiae細胞を、30℃において5分間標識し、抽出し、免疫沈澱させ、そしてβgalを分析した。これらのレーンについてのフルオログラフィーの露出は、第2図における同様なパターンをもつものより数倍長く、生存が短いβgalタンパク質の多数のユビキチン化を明らかにした。(レーンh、i)パルス−チェース露出における多数のユビキチン化Leu−βgalタンパク質の「ラダー(ladder)」を明らかにするために、第2図においてレーンn、oのフルオログラフィーの過度の露出(それぞれ、0および10分のチェース)。(レーンj)レーンa〜gと同一であるが、ub−Pro−βgalを使用した。(レーンk)レーンjと同一であるが、ub−Gln−βgalを使用した。(レーンl)レーンjと同一である。(レーンm〜p)ub−Pro−βgalをエンコードするプラスミドを有するS.cerevisiae細胞を30℃において5分間[35S]メチオニンで標識し(レーンm)、次いでシクロヘキシイミドの存在下に10、30および60分間チェースした(レーンn〜p)。レーンpの右への上の小さい矢印は、ub−Pro−βgalを示し、その小さい比率は1時間のチェース後なお存在する。下の小さい矢印は、チェースの間ゆっくり蓄積し、そして代謝的に安定である、明らかに脱ユビキチンされたPro−βgalを示す。レーンmの左への点は、使用した抗体によってある実験において沈澱した、内因性酵母菌タンパク質を示す。正方形のカッコは多数のユビキチン化βgal種を意味する(参照、第5図)。他の表示は第2図における通りである。

0038

第5図は、ユビキチンを含有する「ラダー」gel種を示す。(レーンa)ub−Gln−βgalをエンコードするプラスミドを有するS.cerevisiae細胞を、増殖し、そして破壊し、そしてβgalに対する固定化した抗体を有するカラムの親和クロマトグラフィーによって、抽出物をβgalタンパク質の分離のために処理した。このようにして得られたβgalタンパク質をポリアクリルアミド−SDSゲル中で電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、そしてユビキチンに対する抗体でプロービングした。(レーンb)レーンaと同一であるが、ub−Pro−βgalを使用した。(レーンc)bと同一であるが、より長いオートラジオグラフィーの露出。(レーンc)ub−Leu−βgalをエンコードするプラスミドを有するS.cerevisiae細胞を[35S]メチオニンで5分間標識し、次いで抽出し、免疫沈澱し、そしてβgalの電気泳動させた(第4図、レーンfと同一の試料)。正方形のカッコは、ユビキチンに対する抗体で検出された多数のユビキチン化Gln−βgal種を示す。矢印はub−Pro−βgalの帯び、レーンbおよびcにおいて見られる初期の融合タンパク質を示す。矢印の頭は、ub−Gln−βgal融合タンパク質から誘導された脱ユビキチンしたβgal[クーマッシー(Coomassie)の着色または代謝的に標識つけによるが、ユビキチンに対する抗体を使用しないで検出可能である]の帯の位置を示す。

0039

第6図は、原核細胞および真核生物の両者の長く生きる細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端において安定化アミノ酸残基を有するが、これに対して分泌されたタンパク質が相補的バイアスを示すことを示す。

0040

(A)原核細胞(77のタンパク質)および真核生物(131のタンパク質)の両者からのブロッキングされないアミノ末端をもつ208の長く生きる、直接に配列決定した、細胞内(非画分化)タンパク質を、N−末端ルールによって定められた、それらのアミノ末端残基の性質に従って、3つの群に分配した。検査した細胞内タンパク質のすべては、広範に安定化性の残基をそれらのアミノ末端において有する。パネルB〜Dにおいて、類似の線図が243の分泌された真核生物のタンパク質(B)について、37の免疫グロブリン軽鎖および重鎖(C)について、および94の分泌された真核生物のトキシン(D)について表されている。CおよびDにおけるエントリーはBにおけるエントリーのサブセットである。B〜Dにおけるタンパク質について、集めたアミノ末端は、割り当てが可能であるときはいつでも、分泌する細胞内にない位置するタンパク質の最も処理された形態に相当する。A〜Dにおけるデータは、1981年以前に入手可能であった完全なタンパク質配列の全体組みから相互に集めた。同一の結論は、現在のナシナル・バイオメディカル・リサーチファンデンションデータベースを使用して、いっそう詳細なかつ広範な、コンピュータに助けられるタンパク質のアミノ末端の表作成後に、最近到達された。Asn、Cys、HisおよびTrpのアミノ末端残基残基は、対応するgalタンパク質の生体内半減期がまだ未知であるので、収集から排除した(しかしながら、表1の凡例を参照)。同一のタイプの最近の収集中への残基(表1)の包含は、もとの結論を変化させなかった。アミノ末端Proは、また、収集から排除したが、Proは、長く生きる非画分化タンパク質のアミノ末端におけるProの頻繁な存在と一致するβgalについて安定化残基であるように思われる(表1)。

0041

結果および説明
発生期のユビキチン−βgal融合タンパク質の急速な生体内脱ユビキチン
ユビキチン部分のカルボキシル末端のグリシンがイソペプチド結合を経てタンパク質中の内部のリジン残基のε−アミノ基へ結合する、枝分かれしたユビキチン接合体は、明らかに、真核生物の細胞中の多くのユビキチン接合体からなる。標的タンパク質のアミノ末端α−アミノ基へユビキチンを接合して、線状のユビキチン接合体を生成することは、また、化学的に可能である。参照、A.ヘルコら、PNAS USA、81:7021(1984)。線状ユビキチン−タンパク質融合体がユビキチンのタンパク質のアミノ末端への翻訳後の酵素的接合によって生体内で実際に合成されるか否かにかかわらず、このようなタンパク質は、また、適当なキメラ遺伝子を構成し、そしてそれらを生体内で発現させることによって生成することができる。Escherichia coliのgalへ結合した酵母菌ユビキチンをエンコードする、1つのこのような遺伝子の構成は、第1図にしめされている。

0042

この遺伝子がE.coli中で発現されるとき、得られるβgal含有タンパク質は見掛け分子質量を有し、これは対照βgalのそれより大きく、ほぼ6kDであり、キメラ遺伝子によってエンコードされるタンパク質中のユビキチンの存在と一致する値である。対照的に、同一遺伝子を酵母菌中で発現するとき、対応するβgalタンパク質は対照βgalと電気泳動的区別可能である。この結果は、[35S]メチオニン標識期間(1〜30分)に対して独立である。さらに、生体内標識したゲル精製βgalのエドマン分解による、推定のMet−βgal(半減期、t1/2 20時間)におけるアミノ末端残基の決定(第2図、レーンd)は、そのアミノ末端における期待するMet残基の存在(第3A図および表1)を確証した。ユビキチンが融合タンパク質を切断するという独立の証拠は、ユビキチンの最後のGly残基が下に存在した直後に、起こる。酵母菌において、ユビキチンは発生期のユビキチン−融合タンパク質を効率よく切断して、脱ユビキチンされたβgalを生成すると、われわれは結論する。[E.coli中の脱ユビキチン反応の不存在は、原核細胞がユビキチンおよびユビキチン特異的酵素の両者を欠くことをしめす他の証拠と一致する]。

0043

キメラ遺伝子、Gly−Metによってエンコードされるユビキチン−β−gal接合(第1図および第3B図)は、成熟ユビキチン中に効率よく処理される、ポリユビキチン前駆体タンパク質中の隣接する反復の間の接合と同一である。こうして、まだ生化学的に特性づけられないが、同一のプロテアーゼは、成熟ユビキチンへのポリユビキチンの転化、および発生期のユビキチン−βgalタンパク質の脱ユビキチンのための原因となるように思われる。そうである場合、ユビキチン−βgalの生体内脱ユビキチンを阻害する(これによってβgalへの安定なユビキチンの結合の代謝的結果の分析を可能とする)1つの潜在的方法は、ユビキチン−βgal接合におけるβgalのMet残基(第3B図)を他のアミノ酸残基(第3A図)に転化することである。このようなアプローチの予期されない結果は下に説明する。

0044

βgalの生体内半減期はそのアミノ末端残基の関数である。ユビキチン接合におけるgalのもとのMet残基を特定するATGコドン(第3B図)を、部位特異的突然変異誘発によって、19の他のアミノ酸を特定するコドンに転化した(参照、第3A図および表1)。これらの構成体は、もっぱらユビキチン接合におけるβgalの第1コドンにおいて異なる(第3A図)。このように設計された16プラスミドの各々が酵母菌中に導入された後、生体内でパルス標識された対応するgalタンパク質の分析は、次の結果に導いた(第2図、第4図および表1):
1)1つの例外(下を参照)を除いて、発生期のユビキチン−βgalの効率よい脱ユビキチンは、ユビキチン−βgal接合におけるβgalのアミノ酸残基の性質に無関係に起こる。こうして、もとのユビキチン−βgalタンパク質をGly−Met接合において切断する、明らかにユビキチン特異的のプロテアーゼは、一般に、接合におけるβgalの第1残基の性質に無関係である(第3A図および表1)。この結果は、事実、生体内で生成されたそうでなければ同一のβgalタンパク質のアミノ末端において、異なるアミノ酸残基を露出することを可能とする。

0045

2)こうして設計されたβgalタンパク質の生体内の半減期は、βgalのアミノ末端において露出されたアミノ酸残基の性質に依存して、20時間以上から3分より小に変化する(第2図、第4図および表1)。詳しくは、アミノ末端にMet、Ser、Ala、Thr、Val、CysまたはGlyをもつ脱ユビキチンされたβgalタンパク質は、遺伝子がユビキチンのそれに融合されていない対照の半減期に類似して、20時間の比較的長い生体内半減期を有する(第2図、レーンd〜g、および表1)。顕著に対照的に、アミノ末端にArg、Lys、Phe、Leu、AspまたはTrpをもつβgalタンパク質は、Arg−βgalについてほぼ2分およびLys−βgal、Phe−βgal、Leu−βgal、Asp−βgal、Asn−βgalおよびTrp−βgalについてほぼ3分の間の非常に短い半減期を有する(第2図、レーンn〜u、および表1)。Gln、HisまたはTyrのアミノ末端残基をもつβgalタンパク質の半減期はほぼ10分であり(第2図、レーンk〜m、および表1)、これに対してアミノ末端のIleまたはGluはβgalにほぼ10分の半減期を与える(第2図、レーンh〜j、および表1)。パルス−チェースおよび連続的標識技術の両者を、これらの実験において使用し、そして同様な結果を得た。

0046

個々のアミノ酸の組みを、それらがそのアミノ末端において露出されるときgalに与える半減期に関して配列することができる。得られるルール(表1)を「N−末端ルール」と呼ぶ。

0047

0048

表1に対する凡例
N−末端ルール。酵母菌S.cerevisiae中のβgalタンパク質の生体内半減期は、パルス−チェース技術(短い半減期のgalについて;下を参照)によって、あるいは粗製抽出物中のgalの酵素活性を測定によって決定した。βgalの活性を測定するため、ガラクトース含有培地中で増殖する細胞を、ガラクトースを欠かつ10%のグルコースを含有する、そうでなければ同一の培地に移した。30℃において少なくとも5時間さらに増殖させた後、グルコースへのシフトの前および後の細胞当たりのβgal活性の比を、βgalタンパク質の各々について決定した。[融合遺伝子のGALプロモーター推進発現(第1図および第2図)はグルコース培地中で再び発現させる]。生存が短い(t1/2<1時間)βgalタンパク質について、パルス−チェース技術を同様によく使用された(第2図および第4図)。パルス−チェース実験において[35S]メチオニンで標識されたβgalタンパク質の電気泳動の帯びを第2図および第4図のそれらと同様にシンチラント含浸乾燥ゲルから切り取り、そして帯び中の35Sを決定した。生存が短いgalの生体内の崩壊は一次の動力学から誘導し、ここで分解の速度はチェースのより遅い(1時間)時間の期間において測定するとき低く、より遅い速度はシクロヘキシイミドの時間依存性の毒性作用あるいは生体内分解過程固有の特性を反映する。[翻訳の抑制はS.cerevisiae中の効率よい短時間のチェースのために必要である。なぜなら、アミノ酸プール平衡化の問題はこの有機体中で液胞の存在に関係するからである]。下に列挙する半減期の値は、チェースの最初の10分の間に決定した。いくつかの証拠(参照、第4図および第6図の説明)は、Proが安定化残基であることを示唆する。列挙したアミノ酸の旋回半径はM.レビット、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、104:59(1976)からのものである。

0049

アミノ酸のアミノ末端の位置はgalの半減期へのその作用について必須である
部位特異的突然変異誘発を用いて、「安定化」アミノ酸(この実験において、Met残基)を特定するコドンを、ユビキチン−βgal接合におけるβgalの最初のコドンの前に挿入した(表2)。他の安定化残基(Thr)あるいはユビキチン−βgal接合における種々の脱安定化残基(Gln、LysおよびArg)の前における安定化残基(Met)の挿入は、長く生きる脱ユビキチンされたβgalを必ず生ずる(表2)。さらに、生存が短いばかりでなく、かつまた脱ユビキチンに対して抵抗性であるユビキチン−Pro−βgal(第4図、レーンj〜p、および表1)と対照的に、ユビキチン−Met−Pro−βgalは生体内で効率よく脱ユビキチンされて長く生きるMet−Pro−βgalを生成する(表2)。これらの結果が示すように、アミノ酸残基の同一性およびそのアミノ末端の位置(多分遊離a−アミノ基の存在)の両者はβgalの半減期へのその作用について必須である。さらに、これらの結果が支持するように、融合タンパク質の切断はユビキチンの最後Gly残基の直後に起こる(第3A図)。

0050

0051

アミノ酸のアミノ末端の位置は、βgalのその作用について必須である。挿入突然変異体は本質的に突然変異体の初期の組みについて記載したように得たが、ただしMetコドンの背後に挿入された不明瞭のコドンの5’側に14塩基および32−残基をを含有する、32−塩基のオリゴヌクレオチド、5’−CCCGGGATCCGTGC(G/C/T/)(G/T)CATACCACCTCTTAGを使用した。カッコ内の塩基は、配列中の位置16および17における不明瞭を意味する。対応するβgalタンパク質の半減期は、表1に対する凡例中に記載ように決定した。

0052

galの長く生きる切断生成物は、生存が短いβgalタンパク質の崩壊の間に形成される。

0053

生存が短い(長く生きるものでない)の電気泳動のパターンは、βgalの特異的な、約90kDの切断生成物を必ず含有し(第2図、レーンn〜u)、この生成物は、親のβgal種と異なり、標識後(チェース)期間の間に蓄積する(第4図、レーンm〜p)。90kDのβgal断片は、比較的小さい比率の初期量のパルス標識されたβgalを構成する。それにもかかわらず、その存在は、生体内の電気泳動的切断がその生存が短い親のタンパク質の代謝的寿命からタンパク質断片救済する。単一のタンパク質種内の多数の半減期の得られる可能性が天然の生存が短いタンパク質の設計において利用されるかどうかについての理解が残る。

0054

ユビキチン−βgalは、脱ユビキチンされないとき、生存が短い。

0055

ユビキチン−Pro−βgal、生体内で脱ユビキチンされない唯一のユビキチン−βgal(第4図、レーンj〜p)は、代謝的に安定なβgalタンパク質の半減期(表1)の1%より短い、ほぼ7分の半減期(表1)を有する。この結果の1つの解釈は、タンパク質のアミノ末端への代謝的に安定なユビキチンの結合が需要体タンパク質の分解のシグナルを与えるために十分であるということである。この解釈は、哺乳動物の細胞における生存が短いタンパク質のユビキチン化がそれらの分解に必須であるという、早期の生化学的および遺伝学的証拠と一致する。同時に、ユビキチン−Pro−βgal以外のすべてのユビキチン−βgal融合タンパク質は生体内で急速に脱ユビキチンされる。(表1)。こうして、タンパク質の翻訳後のアミノ末端ユビキチン化は、生体内の分解のためのタンパク質を表示する、初期の認識またはコミットメント(commitment)工程において含まれないことがある。翻訳後のアミノ末端のユビキチン化(それが生体内で実際に起こる場合)が分解通路の後の段階のために必須であるかどうかは、まだ、決定することができない。早期の生体内の実験により、タンパク質分解の基質のアミノ末端の優先的化学的修飾は生体内ユビキチン依存性のタンパク質分解系におけるそれらの分解を阻止することが示された。これらのデータに基づき、タンパク質のアミノ末端のユビキチン化はそれらの分解のために必須であることが提案された。同一の結果の別の解釈は、タンパク質のアミノ末端の化学的ブロッキングが、その初期の段階が必ずしもユビキチン依存性でない、「N−末端ルール」によって、それらのアミノ末端の認識を防止するということである。

0056

生存が短いβgalタンパク質は生体内で多数的にユビキチン化される。

0057

パルス−チェースのフルオログラムの過剰露出(第2図)は、脱ユビキチンされた、生存が短いβgalタンパク質の主要な帯びが、4〜7kDの間隔で不規則的に間隔をもって位置する帯びを含有する、大きい分子量のβgalの「ラダー」と共存することを明らかにする(第4図、レーンc〜g)。長く生きるβgalタンパク質のフルオログラムを同様に過度に露出するとき、このような大きい種は現れない。βgalに対する抗体およびユビキチンに対する抗体の両者を使用する免疫学的分析は、「ラダー」βgal種がユビキチンを含有することを立証する(第5図)。

0058

選択的分解の通路のためのモデル
天然のまたは操作したユビキチン融合タンパク質(第1図および表1)を除外して、発生期のタンパク質はユビキチン部分を明らかに欠く。発生期の非画分化タンパク質の生体内アミノ末端処理は、その基質特異性が部分的に特性づけられる、アミノ末端ペプチダーゼの作用を経て、それらの成熟アミノ末端を発生させる。[参照、ツナサワ、S.ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、260、5382(1985);ボイセル、J.P.ら、PNAS USA、82、8448(1985)]。こうして発生したアミノ末端は、「N−末端の読み」によって認識されることを、われわれは示唆する。1つの特定のモデルは、タンパク質分子を分解するコミットメントを、酵素を確率的に操作することによって、そのアミノ末端残基を認識する結果としてなされるものであり、その標的アミノ末端における「クランピング」の確立はN−末端ルールによって決定される(表1)。いったんコミットメントがなされると、標的タンパク質の高度に処理されやすいユビキチン化が起こり、これはβgalの場合において、galの分子当たり15より多いユビキチン部分に接合する(第4図、レーンc〜g、および第5図)。次いで、多数でユビキチン化された「下流」の酵素(1)によって分解され、そのために標的のユビキチン部分は、認識シグナルまたは変性アンフォルディング(unfolding)]装置として、あるいは両者として働く。

0059

ユビキチン含有「ラダー」βgal種(第4図、レーンc〜l、および第5図)は、βgalにおいて内部リジン残基のε−アミノ基に接合した、明らかに枝分かれのユビキチン部分から成る。驚くべきことには、ユビキチン−Pro−βgalから誘導した「ラダー」βgal種は、βgalの類似の種から電気泳動的に区別可能であり、その類似の種のアミノ末端ユビキチンは発生期の融合タンパク質を切断する(第4図、レーンj〜l、および第5図)。電気泳動的に区別可能なユビキチン化したβgal種が、事実、構造的相同性である場合、これらの結果は別の2つのモデルと適合し、ここで、第1のユビキチンがβgalに枝分かれ接合した直後に、枝分かれユビキチン化−Pro−βgalはアミノ末端の脱ユビキチン化するか、あるいはアミノ末端ユビキチン部分を欠く類似のβgal種はそれを再び獲得する。この不明瞭されの実験的解明は、タンパク質の翻訳後のアミノ末端のユビキチン化(それが生体内で起こる場合)選択的タンパク質のターンオーバーにおいてある役割を演ずるかどうかに拘らず、達成することができる。

0060

原核細胞および真核生物の両者はN−末端ルールに従うように思われるが(下を参照)、バクテリアは明らかにユビキチン系を欠く。こうして、仮定のN−末端認識タンパク質が、選択的分解通路の残部であるより、原核細胞および真核生物の間でいっそう強く保存されることが可能である。興味あることには、その存在が生体外のユビキチン接合酵素によるタンパク質分解基質のユビキチン化のために要求される、哺乳動物のタンパク質E3の性質は、N−末端認識タンパク質の1成分であるということと一致する。

0061

N−末端ルールおよび細胞内タンパク質の既知のアミノ末端
原核細胞および真核生物の両者からの代謝的に安定な、非画分化タンパク質における、ブロッキングされないアミノ末端残基は、安定化クラス(Met、Ser、Ala、Gly、Thr、Val)、すなわち、galに生体内の長く生きる与えるクラス、から排除される(第6A図)。それについての成熟アミノ末端が知られている、1つの生存が短い細胞内タンパク質は、ファージラムダのcIIタンパク質であり、これはλが溶菌的に増殖するか、あるいは感染した細胞を溶原菌化するかどうかを決定するトリガー中央成分である。[Y.S.HO、D.ウルフ、M.ロウゼンバーグ、遺伝子の発現の調節(Regulationof Gene Expression)、I.ブースおよびC.ヒギンス編(ケンブリッジ大学、プレス、ロンドン、1986)、p.79;F.バヌエット、M.A.、ホイト、L.マクファーレン、H.エコールス、I.ヘルスウィッツ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、187、213(1986);H.エコールス、細胞(Cell)、31、565(1982);K.ナスミス、ネイチャー(Nature)(London)、320、670(1983)]。ラムダ感染したE.coliにおけるcIIの半減期は、3分より短い。顕著には、cIIの成熟アミノ末端はArgで開始し[ホウ、Y.W.ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、9123(1982)]、この残基はN−末端ルールにおける最も脱安定化残基である(表1)。

0062

脱安定化アミノ酸は疎水性であり、帯電しない親水性であるか、あるいは帯電していことができるが、それらはMetを除外する安定化アミノ酸のいずれよりも大きい旋回半径を有するという性質を共有する。

0063

画分化タンパク質におけるアミノ末端残基は大部分脱安定化クラスである。

0064

第6図は、長く生きる非画分化細胞内タンパク質(A)および分泌されたタンパク質(B)の間のアミノ末端残基の選択における顕著な差を示し、分泌されたタンパク質の多くはそれらのそれぞれの細胞外画分において長く生きる。この発見の1つの解釈は、N−末端ルールに従って操作する、単一の細胞内分解の通路が細胞内タンパク質の生体内半減期の多様性および細胞内空間中に異常に導入される、画分化タンパク質の選択的分解の両者について原因となりうるということである。ある誤って画分化されたタンパク質は他のものよりも細胞に有害であり得る。したがって、分泌された真核生物トキシンは、分泌されたタンパク質の一般の集団よりも頻繁に、それらのアミノ末端に、強く脱安定化性の残基(Arg、Lys、Leu、Phe、Asp)を含有するということは、興味あることである(第6図、パネルB〜D)。

0065

上の考察が、また、示唆するように、細胞の位相的外側、例えば、内質網状構造内腔およびゴルジ、および細胞外空間がN−末端ルールの通路に類似する分解通路を有する場合、それらはN−末端ルールの「逆転した」型に基づくことができ、ここで細胞の内側で脱安定化されるアミノ末端残基は、今度は、安定化残基であるか、あるいはその逆である。こうして、本発明の方法は、また、分泌されたものを包含する、画分化タンパク質の代謝的安定性および他の性質の操作に有用であろう。

0066

長く生きるタンパク質のターンオーバーにおけるN−末端ルールの通路の可能な役割。

0067

脱安定化(表1)終わりから2番目の残基をもつ長く生きる細胞内タンパク質は、それらの初期のアミノ末端メチオニン残基を一般に保持する。アミノ末端の処理を行わない、長く生きる細胞内タンパク質におけるアミノ末端残基は、必ず安定化クラスに属する(表1)。長く生きるタンパク質ターンオーバーにおけるN−末端ルールの通路を包含するであろう興味ある可能性は、長く生きるタンパク質の生体内分解における速度制限段階が脱安定化残基を露出する、遅いアミノペプチダーゼ切断および引き続くN−末端ルールの通路を経る急速な分解であることができるということである。分解速度の微細な調整は、この場合において、N−末端ルールに従う残基の脱安定化能力の機能であるよりはむしろ、脱安定化残基を露出するアミノペプチダーゼ切断の速度の機能であることに注意すべきである。

0068

N−末端ルールおよび生存が短い損傷されたタンパク質の選択的分解
生体内の選択的分解のためのそうでなければ長く生きるが、損傷されたタンパク質を標的する、ポリペプチド鎖の折り畳みパターンまたは局所化学的特徴の認識は、N−末端ルールの通路によって直接仲介されるように思われる。その代わり、特異的プロテアーゼ(機能がDNAにおける特異的障害を認識するヌクレアーゼに類似する)は、標的されたタンパク質を切断して、切断の2つの生成物の一方のアミノ末端において脱安定化残基を露出することを、われわれは示唆する。このモデルの1つの試験可能な予測は、分解通路の初期の切断生成物がそれらのN−末端に脱安定化残基をを有することでである。初期のタンパク質の切断の生成物のアミノ末端における脱安定化残基の優先的露出は、含まれるプロテアーゼの固有の特異性のためであるか、あるいはアミノ酸の大部分が脱安定化クラスに属する(表1)という単なる事実のためであろう。さらに、タンパク質の初期の切断は、そのもとのコンホメーションの面を脱安定化市、こうしてそれ以上の内部の切断の可能性を増加することが期待されるであろう。タンパク質の初期の切断生成物が、もっぱらN−末端ルールの通路を経て分解するか、あるいは追加の内部の切断によってさらに処理されなければならなかどうかは、いくつかの因子、例えば、初期の切断生成物のアミノ末端における脱安定化残基の露出、および内部の切断の導入に依存するであろう。このモデルにおいて、N−末端ルールの通路は、化学的に損傷され、永久に停止され、不適切に折り畳まれ、そして誤って画分化されたものから、天然のマルチサブユニット凝集体アセンブリング不可能なものに、および最後に生体内で生存が短いそうでなければ正常のものに及ぶ、代謝的に不安定なタンパク質の大部分の分解のために必須であろう。こうして、タンパク質の代謝的不安定性は、そのアミノ末端における脱安定化残基の露出によってばかりでなく、かつまた切断生成物のアミノ末端において脱安定化残基を露出するタンパク質分解的切断を生ずる、そのポリペプチド鎖のコンホメーションのおよび化学的特徴によって仲介されることができる。

0069

いずれの所定のタンパク質についても、N−末端ルールに加えて種々の因子は一緒になってその生体内の半減期を変調することができる。このような因子の例は、次のとおりである:タンパク質のアミノ末端の柔軟性および接近可能性[トルトン、J.M.およびシバンダ、B.L.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、167、443(1983)]、アミノ末端基を化学的にブロッキングする基、例えば、アセチル基の存在、アミノ末端付近におけるユビキチン化可能なリジンの分布、および他の変数、例えば、カルボキシル末端の構造。マルチサブユニットのタンパク質のアミノ末端領域は普通にサブユニットの界面に含まれる[トルントン、J.M.およびシバンダ、B.L.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、167、443(1983)]ので、タンパク質の第4構造は、生体内のタンパク質の半減期へのN−末端ルールの通路の衝撃を変調することが期待される、なお他のパラメーターである。さらに、上に示唆したように、N−末端ルールの通路は、また、その分解のための標的として初期の認識がそれらのアミノ末端における構造に対して独立である、タンパク質の分解に必須である。

0070

タンパク質のアミノ末端へのアミノ酸の翻訳後の付加の機能的意味
バクテリアおよび真核生物の両者において、生体外の受容体成熟アミノ末端への特異的アミノ酸の翻訳後の接合を触媒する、酵素の異常なクラス、アミノアシル転移DNA−タンパク質トランスフェラーゼが存在することが、多年にわたって、知られている[R.L.ソファートランスファー、RNA:バイオロジカル・アスペクツ(Transfer RNA:Bilogical Aspects)、D.ソル、J.N.アベルソン、P.R.シムメル編(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー、ニューヨーク、1980)、p493;C.デウチ、メソッズ・イン・エンジモロジー(MethodsEnzymol.)、106、198(1984):A.カジ、H.カジ、G.D.ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、240、1185(1965)]。生体内のタンパク質へのアミノ酸の翻訳後付加は、抑圧されたまたは再生組織、例えば、神経細胞軸索への物理的損傷後の組織、において劇的に促進する[S.シネ−アスワル、R.V.リッシオ、G.チャクラルティ、N.A.インゴリアサイエンス(Science)、231、603(1986);N.A.インゴリア、ジャーナル・オブ・ネウロサイエンス(j.Neurosci)、3、2463(1983)]。N−末端ルールは、この現象についてのせつめいを提供する。細胞の変化した生理学的状態によって要求される、そうでなければ損傷されない、長く生きるタンパク質の代謝的安定性が、生体内で標的タンパク質のアミノ末端への脱安定化アミノ酸の翻訳後の付加によって発生することを、われわれは示唆する。顕著には、タンパク質へのアミノ酸の既知の翻訳後の付加[R.L.ソファー、RNA:バイオロジカル・アスペクツ(Transfer RNA:Bilogical Aspects)、D.ソル、J.N.アベルソン、P.R.シムメル編(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー、ニューヨーク、1980)、p493;C.デウチ、メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods Enzymol.)、106、198(1984):A.カジ、H.カジ、G.D.ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、240、1185(1965);S.シネ−アスワル、R.V.リッシオ、G.チャクラボルティ、N.A.インゴリア、サイエンス(Science)、231、603(1986);N.A.インゴリア、ジャーナル・オブ・ネウロサイエンス(j.Neurosci)、3、2463(1983)]は、N−末端ルールに従って脱安定化される、ほとんどのアミノ酸(Arg、Lys、Leu、Phe、およびTyr)を包含する。タンパク質への脱安定化アミノ酸の付加が起こることが期待される生理学的状態は、前以て存在する、そうでなければ長く生きる細胞内タンパク質のある比率が選択的に分解される、細胞サイクルへの出入り、化学的または物理学ストレスへの応答、および特定の分化の事象、例えば、赤血球の分化および精子形成を包含する。

0071

哺乳動物の赤血球からのユビキチン依存性系におけるあるタンパク質分解的基質の生体内の分解は、最近、ある種のアミノアシル−tRNAの存在に依存することが示された[フェルバー、S.およびクレチャノバー、A.、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、261、3128(1986)]。この現象は、また、タンパク質分解の基質のアミノ末端への特定の脱安定化アミノ酸の翻訳後の付加のための要件を反映することを、われわれは示唆する。問題の初期のタンパク質分解の基質は、AspまたはGluのアミノ酸残基を有し、それらの両者はN−末端ルールに従って脱安定化可能である(表1)。これは、タンパク質中のある種のアミノ末端残基がそのままで直接脱安定化されないで、他の脱安定化残基へ接合するそれらの能力によってのみ脱安定化されうるという、興味あるかつ試験可能な可能性を発生させる。

図面の簡単な説明

0072

同等の実施態様

0073

図1ユビキチン−lacZ遺伝子融合体の構築を示す図である。
図2操作したβ−galタンパク質の半減期を直接測定する実験結果を示す図である。
図3ユビキチン特異的処理プロテアーゼの新しく発見された性質を使用するβ−gal接合におけるアミノ酸残基(A)および前記接合付近におけるアミノ酸配列(B)の変化を示す図である。
図4代謝的に不安定なβ−galタンパク質における多数のユビキチン部分の存在を示す図である。
図5代謝的に不安定なタンパク質におけるユビキチン含有β−gal種の1系列を示す図である。
図6原核細胞および真核生物の両者の長く生きる細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端に安定化アミノ酸残基を有し、これに対して分泌されたタンパク質が補体のバイアスを示すことを示すグラフである。

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