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図面 (18)

課題

リボヌクレオチドと3’-デオキシリボヌクレオチドとの間、並びに異なる塩基を有するリボヌクレオチド間及び異なる塩基を有するデオキシリボヌクレオチド間での取り込みに対するバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供すること。

解決手段

対応する野性型RNAポリメラーゼ能力と比較して、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させるように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された野性型RNAポリメラーゼからなるRNAポリメラーゼ。例えば、野性型RNAポリメラーゼのヌクレオチド結合部位中に存在する少なくとも1つのアミノ酸、例えば、フェニルアラニンチロシン置換されているRNAポリメラーゼ。

概要

背景

ポリメラーゼ連鎖反応PCR)法は優れた方法であり、年々その利用範囲が広がっている[Randall K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。PCR 法では、1分子のDNA 断片を増幅することも可能である。PCR 法で増幅した生成物クローニングすることなくシークエンスする方法(ダイレクトシークエンス法)も有用な方法である[Corinne Wong et al. (1988) Nature, 330,384-386]。この方法はライブラリー作製やそのライブラリーのスクリーニングが不要であり、多くのサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法である。

しかるに、上記ダイレクト・シークエンス法には2つの大きな問題点がある。

一つは、取り込めなかったプライマー及び2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(2’dNTPs)が反応系中に残存し、これらがシークエンス反応を妨げることである。従って、従来法では、これら残存するプライマーと2’dNTPsは、シークエンスの前にPCR生成物から除去する必要があった。PCR生成物の精製方法には種々の方法があり、例えば、電気泳動による精製法エタノール沈殿法、ゲル濾過法HPLC精製法がある[例えば、DoritR.L et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, JohnWiley and Sons, New York, 15.2.1-15.2.11参照」。しかし、何れの方法でも煩雑である。

2つ目の問題は、PCR生成物の迅速な再生(renaturation) である。PCR生成物が2本鎖DNAに再生してしまうと、1本鎖のテンプレート鋳型)ではなくなり、プライマーと1本鎖テンプレートとの間のアニーリングを妨げる。再生を最小限にするための方法として、例えば変性後の急冷、1つのプライマーのビオレーション(biotilation)とストレプトアビジン被覆物へのPCR生成物の吸着エクソヌクレアーゼの使用、アシンメトリックPCR等が報告されている。例えば、Barbara Bachmannら、1990, Nucleic Acid Res.,18, 1309- に開示されている。しかし、これらの方法の殆どは、長い時間を必要とし、非常に面倒である。

そこでそれらを解決するための新しい方法として、本発明者は、PCR反応系中に残存する未反応のプライマー及び2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(2’dNTPs)を除去することなく、かつPCR反応生成物が迅速に再生する問題を回避するため、変性自体を全く行わないで良い、全く新しいDNA の塩基配列決定方法を提案した〔WO96/14434〕。この方法は、T7RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼRNA転写反応ターミネーター(例えば、3’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート、3’dNTPs)を用いるダイレクト転写シークエンス法である。この方法によれば、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅したDNA生成物の塩基配列を、プライマー及び2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(2’dNTPs)を除去する必要なしにそのままシークエンスに使用できる。さらに、変性自体を全く行わないため、PCR生成物が迅速に再生する問題も回避でき、極めて優れた方法である。

概要

リボヌクレオチドと3’-デオキシリボヌクレオチドとの間、並びに異なる塩基を有するリボヌクレオチド間及び異なる塩基を有するデオキシリボヌクレオチド間での取り込みに対するバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供すること。

対応する野性型RNAポリメラーゼの能力と比較して、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させるように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された野性型RNAポリメラーゼからなるRNAポリメラーゼ。例えば、野性型RNAポリメラーゼのヌクレオチド結合部位中に存在する少なくとも1つのアミノ酸、例えば、フェニルアラニンチロシン置換されているRNAポリメラーゼ。

目的

そこで、本発明の目的は、この取り込み能力に対してヌクレオチドの種類によるバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供することにある。

このような状況下、本発明者は、この取り込み能力に対してリボヌクレオチド及び3’-デオキシリボヌクレオチドの種類によるバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供することを目的として、新たなRNAポリメラーゼを独自に探索した。その結果、野性型RNAポリメラーゼのアミノ酸の一部を修飾することで、3’デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を取り込む能力を増加させたRNAポリメラーゼを見いだして本発明を完成した。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

対応する野性型RNAポリメラーゼ能力と比較して、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させるように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された野性型RNAポリメラーゼからなることを特徴とするRNAポリメラーゼ。

請求項2

野性型RNAポリメラーゼのヌクレオチド結合部位中に存在する少なくとも1つのアミノ酸が修飾されている請求項1記載のRNAポリメラーゼ。

請求項3

アミノ酸の修飾が、アミノ酸の置換、挿入または欠落である請求項2に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項4

野性型RNAポリメラーゼのヌクレオチド結合部位中に存在する少なくとも1つのアミノ酸がチロシンに置換されている請求項1〜3のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項5

置換されるアミノ酸がフェニルアラニンである請求項4に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項6

ヌクレオチド結合部位に存在するアミノ酸が、ヘリックスYとヘリックスZとの間のループ中のアミノ酸及び/又はヘリックスZとヘリックスAAとの間のループ中のアミノ酸である請求項2〜5のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項7

3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体に対する取り込み能力を、野性型の少なくとも2倍増加させるように修飾されている請求項1〜6のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項8

T7ファージ、T3ファージ、SP6ファージ、K11ファージに由来する請求項1〜7のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項9

T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基641-667に対応する領域から選択される領域中の少なくとも1つのアミノ酸が修飾されている野性型RNAポリメラーゼであることを特徴とするRNAポリメラーゼ。

請求項10

修飾されるべき野性型RNAポリメラーゼが、前記以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落を、さらに有する請求項1〜9のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項11

T7ファージ由来のRNAポリメラーゼであって、アミノ酸残基644または667においてチロシンを有するRNAポリメラーゼ。

請求項12

T7ファージ由来のRNAポリメラーゼがアミノ酸残基644及び667以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落をさらに有する請求項11に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項13

野性型T7RNAポリメラーゼの644番目アミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたことを特徴とするRNAポリメラーゼ。

請求項14

野性型T7RNAポリメラーゼの667番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されたことを特徴とするRNAポリメラーゼ。

請求項15

野性型T7RNAポリメラーゼの665番目のアミノ酸残基ロイシンプロリンに置換されている請求項13又は14に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項16

野性型T7RNAポリメラーゼの644番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換され、かつ667番目のアミノ酸残基フェニルアラニンがチロシンに置換されていることを特徴とするRNAポリメラーゼ。

請求項17

野性型T7RNAポリメラーゼの665番目のアミノ酸残基ロイシンがプロリンに置換されている請求項16に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項18

T3ファージ由来のRNAポリメラーゼであって、アミノ酸残基645または668においてチロシンを有するRNAポリメラーゼ。

請求項19

T3ファージ由来のRNAポリメラーゼがアミノ酸残基645及び668以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落をさらに有する請求項18に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項20

K11ファージ由来のRNAポリメラーゼであって、アミノ酸残基664〜669の間または690においてチロシンを有するRNAポリメラーゼ。

請求項21

K11ファージ由来のRNAポリメラーゼがアミノ酸残基664〜669の間または690以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落をさらに有する請求項20に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項22

SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼであって、アミノ酸残基633〜638の間または670においてチロシンを有するRNAポリメラーゼ。

請求項23

SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼがアミノ酸残基633〜638の間または670以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落をさらに有する請求項22に記載のRNAポリメラーゼ。

請求項24

請求項1〜18のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド

請求項25

請求項1〜24のいずれか1項に記載のRNAポリメラーゼを製造する方法であって、RNAポリメラーゼをコードする核酸分子を用意し、ヌクレオチド塩基配列内の1つまたはそれ以上の部位における1つまたはそれ以上の塩基を変更させるように該核酸分子に突然変異を起こさせ、次いで変異させた核酸分子により発現される修飾されたRNAポリメラーゼを回収することを含む方法。

技術分野

0001

本発明は、DNA の塩基配列決定法等に有用な変異型RNAポリメラーゼに関する。

背景技術

0002

ポリメラーゼ連鎖反応PCR)法は優れた方法であり、年々その利用範囲が広がっている[Randall K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。PCR 法では、1分子のDNA 断片を増幅することも可能である。PCR 法で増幅した生成物クローニングすることなくシークエンスする方法(ダイレクトシークエンス法)も有用な方法である[Corinne Wong et al. (1988) Nature, 330,384-386]。この方法はライブラリー作製やそのライブラリーのスクリーニングが不要であり、多くのサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法である。

0003

しかるに、上記ダイレクト・シークエンス法には2つの大きな問題点がある。

0004

一つは、取り込めなかったプライマー及び2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(2’dNTPs)が反応系中に残存し、これらがシークエンス反応を妨げることである。従って、従来法では、これら残存するプライマーと2’dNTPsは、シークエンスの前にPCR生成物から除去する必要があった。PCR生成物の精製方法には種々の方法があり、例えば、電気泳動による精製法エタノール沈殿法、ゲル濾過法HPLC精製法がある[例えば、DoritR.L et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 11, JohnWiley and Sons, New York, 15.2.1-15.2.11参照」。しかし、何れの方法でも煩雑である。

0005

2つ目の問題は、PCR生成物の迅速な再生(renaturation) である。PCR生成物が2本鎖DNAに再生してしまうと、1本鎖のテンプレート鋳型)ではなくなり、プライマーと1本鎖テンプレートとの間のアニーリングを妨げる。再生を最小限にするための方法として、例えば変性後の急冷、1つのプライマーのビオレーション(biotilation)とストレプトアビジン被覆物へのPCR生成物の吸着エクソヌクレアーゼの使用、アシンメトリックPCR等が報告されている。例えば、Barbara Bachmannら、1990, Nucleic Acid Res.,18, 1309- に開示されている。しかし、これらの方法の殆どは、長い時間を必要とし、非常に面倒である。

0006

そこでそれらを解決するための新しい方法として、本発明者は、PCR反応系中に残存する未反応のプライマー及び2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(2’dNTPs)を除去することなく、かつPCR反応生成物が迅速に再生する問題を回避するため、変性自体を全く行わないで良い、全く新しいDNA の塩基配列決定方法を提案した〔WO96/14434〕。この方法は、T7RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼとRNA転写反応ターミネーター(例えば、3’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート、3’dNTPs)を用いるダイレクト転写シークエンス法である。この方法によれば、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅したDNA生成物の塩基配列を、プライマー及び2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(2’dNTPs)を除去する必要なしにそのままシークエンスに使用できる。さらに、変性自体を全く行わないため、PCR生成物が迅速に再生する問題も回避でき、極めて優れた方法である。

発明が解決しようとする課題

0007

ところが、上記方法について本発明者がさらに研究を行ったところ、より正確な塩基配列データを得るためには、さらに解決すべき課題があることを見出した。上記塩基配列決定法において、T7RNAポリメラーゼ等の RNAポリメラーゼは、ATPGTP、CTP及びUTP 又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5’トリフォスフェート類並びに3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体からなる少なくとも1種の3’デオキシリボヌクレオチドの混合物中で反応させる。この反応において、鋳型の配列に相応した塩基を有するリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが、リボヌクレオチド配列中に逐次取り込まれることで、ポリリボヌクレオチドが合成される。

0008

ところが、リボヌクレオチドに比べて、対応する3’-デオキシリボヌクレオチドやその誘導体は、上記配列に取り込まれにくいこと、さらに、リボヌクレオチドの中及び3’-デオキシリボヌクレオチドの中でもそれぞれ塩基の種類により、配列への取り込まれ方に差があることが判明した。このようにリボヌクレオチドと3’-デオキシリボヌクレオチドとの間、並びに異なる塩基を有するリボヌクレオチド間及び異なる塩基を有するデオキシリボヌクレオチド間でのバイアスが存在するため、転写生成物は得られるものの、得られる転写生成物は短鎖であったり、標識されたリボヌクレオチドからのシグナルバラツキがあったりして、正確なシークエンスデータを得ることは難しかった。

0009

そこで、本発明の目的は、この取り込み能力に対してヌクレオチドの種類によるバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供することにある。

0010

尚、本発明の説明中において、アミノ酸残基は、慣例により使用されている一文字表記法を用いる。本文中に出てくるアミノ酸のみ、理解のために記述すると、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、プロリン(P)、ロイシン(L)、ヒスチジン(H)である。また、ポリメラーゼ蛋白質N末端からの番号を記し、例えばF667というように表す。これは、このポリメラーゼの667番目のアミノ酸残基がFであることを示し、F667Yの記述は、667番目のアミノ酸残基FをYに置換させたことを意味する。

0011

ところで、DNAポリメラーゼについても、ヌクレオチドの種類により取り込みに差異があることが知られており、さらにこのような取り込みの差異を解消した変異型のDNA ポリメラーゼが知られている〔特開平8−205874号、Proc.Natl. Acid. Sci. USA, 92:6339-6345, 1995)〕。

0012

そこには、T7DNAポリメラーゼを用いたシークエンス反応におけるヌクレオチドの取り込みに対する均一性は、このポリメラーゼ中の526番目のアミノ酸が生み出しているということが記載されている。さらに、この酵素とその他のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列相同性に基づいて、他のDNAポリメラーゼの相同部位のアミノ酸を変えることにより、取り込みのバイアスが低下すると記載されている。即ち、T7 DNAポリメラーゼのY(チロシン)526が、2’-dNTPと2’,3’-ddNTPの取り込み効率のバイアスが少ない原因である。更に、大腸菌DNAポリメラーゼIのF(フェニルアラニン)762、及びThermus aquaticus DNAポリメラーゼ(TaqDNA ポリメラーゼと一般には呼ばれている)のF(フェニルアラニン)667が、T7 DNAポリメラーゼのY526の相同なアミノ酸残基であり、このアミノ酸残基を各々、F762Y(チロシン)およびF667Y(チロシン)に変化させることで取り込みバイアスが低下すると記載している。

0013

さらに、このようなDNAポリメラーゼに関するデータに基づいて、T7RNAポリメラーゼについても、DNAポリメラーゼで議論されている領域と相同な領域、即ち残基631-640に対する修飾はdNTPに対するその特異性を変化させるであろうことを示唆している、と記載している。しかるに、RNAポリメラーゼについては、これまでシークエンス法に使用されることはなく、リボヌクレオチドの取り込みに差異があること自体問題にならなかった。さらに、このような状況下、当然のことながら、取り込みの差異を解消した変異型のRNA ポリメラーゼは知られていなかった。事実、上記特開平8−205874号公報には、T7 RNAポリメラーゼを修飾した実例は記載されていない。

0014

さらに、T7RNAポリメラーゼのこの領域は、Protein Engineering, 3:461-467, 1990に示されているモチーフB 中の、DNAポリメラーゼのα型、I型及びDNA依存性RNAポリメラーゼ(T7RNAポリメラーゼはこの中に分類される)に特に保存されたアミノ酸KとYGに挟まれた9〜10アミノ酸残基からなる領域に相当すると考えられる。先にDNAポリメラーゼで議論された大腸菌DNAポリメラーゼのアミノ酸残基762あるいはTaqDNAポリメラーゼのアミノ酸残基667のF(フェニルアラニン)は、I型に分類されているDNAポリメラーゼの多くに観察される。しかるに、驚いたことに、DNAポリメラーゼと極めて相同性が高いにも係わらず、T7RNAポリメラーゼでは、上記領域に相当する残基631-640にはF(フェニルアラニン)は存在せず、上記公報の示唆をそのまま実行することはできないことが判明した。

0015

加えて、本発明者は、大腸菌DNAポリメラーゼIのF762の位置は、フィンガーサブドメインヘリックスOに存在し、T7 RNAポリメラーゼにおいて、この領域に相当する領域におけるアミノ酸の修飾を検討した。ところがSousa et al.の文献(Nature, 364:593-599, 1993)で示された立体構造上からの、大腸菌DNAポリメラーゼIのヘリックスOに相当するT7 RNA ポリメラーゼ中のヘリックスZにもF(フェニルアラニン)がなかった。

0016

このような状況下、本発明者は、この取り込み能力に対してリボヌクレオチド及び3’-デオキシリボヌクレオチドの種類によるバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供することを目的として、新たなRNAポリメラーゼを独自に探索した。その結果、野性型RNAポリメラーゼのアミノ酸の一部を修飾することで、3’デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体を取り込む能力を増加させたRNAポリメラーゼを見いだして本発明を完成した。

0017

尚、後述の説明から明らかになるが、本発明のRNAポリメラーゼ、特にそのアミノ酸修飾位置は、上記特開平8-205874号には全く示唆も教示もされていない部位であり、今回、全く新らたに見いだされたものである。

課題を解決するための手段

0018

本発明は、対応する野性型RNAポリメラーゼの能力と比較して、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させるように、少なくとも1つのアミノ酸が修飾された野性型RNAポリメラーゼからなることを特徴とするRNAポリメラーゼに関する。

発明を実施するための最良の形態

0019

本発明において、「野性型RNAポリメラーゼ」とは、天然に存在する全てのRNAポリメラーゼを意味する。さらに、「野性型RNAポリメラーゼ」は、野性型RNAポリメラーゼであって、対応する野性型RNAポリメラーゼの能力と比較して、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させることを目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落を、さらに有するものであることもできる。即ち、野性型RNAポリメラーゼを人為的に上記以外の目的で修飾したRNAポリメラーゼも、上記「野性型RNAポリメラーゼ」に含まれる。但し、そのようなアミノ酸の置換、挿入または欠落は、RNAポリメラーゼとしての活性を維持する範囲で、行われたものであることが適当である。

0020

「野性型RNAポリメラーゼ」としては、例えば、T7ファージ、T3ファージ、SP6ファージ、K11ファージに由来するRNAポリメラーゼを挙げることができる。但し、これらのRNAポリメラーゼに限定されるものではない。

0021

また、本発明において「野性型RNAポリメラーゼ」は、天然に存在する耐熱性のRNAポリメラーゼ、及び天然に存在するRNAポリメラーゼを耐熱性を有するように人為的に修飾した(即ち、アミノ酸の置換、挿入または欠落を行った)ものも包含する。但し、耐熱性を付与するための修飾は、RNAポリメラーゼとしての活性を維持する範囲で、行われたものであることが適当である。「野性型RNAポリメラーゼ」として耐熱性のRNAポリメラーゼを用いた本発明の変異型RNAポリメラーゼも耐熱性となる。その結果、例えば、PCR法に併用して、PCR産物を鋳型としてその場で、即ち、PCRと並行して、シークエンス用のRNAフラグメントを合成することも可能である。

0022

T7RNAポリメラーゼは、極めて特異性の高いプロモーター特異的RNAポリメラーゼとして知られている。T7 RNAポリメラーゼの塩基配列と生産法に関してはDavanloo et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 81:2035-2039 (1984)に記載されている。さらに大量生産に関しては、Zawadzki et al., Nucl. AcidsRes., 19:1948(1991)に既に記載されている。このファージ由来の RNAポリメラーゼは、大腸菌や高等生物のRNAポリメラーゼと異なり、単一のポリペプチドのみで転写反応を行うことが出来る(Chamberlin et al., Nature, 228:227-231,1970)。そのため、転写メカニズム解析する格好の材料となり、沢山の突然変異体が分離され、報告されている。さらにSousa et al., Nature, 364:593-599,1993に結晶解析結果が記載されている。

0023

さらに、その他極めて特異性の高いプロモーター特異的RNAポリメラーゼとして大腸菌に感染するT3ファージ、サルモネラ菌に感染するSP6ファージ及びKlebsiella pneumoniae に感染するK11ファージ由来のRNAポリメラーゼの3つがよく知られている。尚、上記4種のRNAポリメラーゼは、後述するように、アミノ酸の一次構造、プロモーターの配列等、極めて類似している。

0024

本発明のRNAポリメラーゼは、対応する野性型RNAポリメラーゼの能力と比較して、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を増加させたものである。前述のように、野性型RNAポリメラーゼでは、リボヌクレオチドに比べて3’デオキシリボヌクレオチドの取り込みが悪く、塩基配列決定法に用いる妨げとなっていた。それに対して、本発明のRNAポリメラーゼは、3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体に対する取り込み能力を、好ましくは野性型の少なくとも2倍増加させるように修飾されている。3’デオキシリボヌクレオチドの取り込みは、3’デオキシリボヌクレオチドに蛍光標識を付した3’デオキシリボヌクレオチド誘導体を用いた場合に特に低下する傾向があるが、本発明のRNAポリメラーゼは、このような3’デオキシリボヌクレオチド誘導体の取り込みも改善できる。尚、ここで、リボヌクレオチドとは、ATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5’トリフォスフェート類を意味し、3’デオキシリボヌクレオチドは、3’dATP、3’dGTP、3’dCTP及び3’dUTPを意味し、その誘導体は、これら3’デオキシリボヌクレオチドに例えば、蛍光標識を付した化合物を意味する。

0025

本発明のRNAポリメラーゼは、対応する野性型RNAポリメラーゼの少なくとも1つのアミノ酸が修飾されたものである。この点について以下に詳細に説明する。

0026

本発明者は、前述のようなT7 RNAポリメラーゼに関する種々の報告を踏まえた上で、T7 RNA ポリメラーゼにおけるリボヌクレオチド等の種類により取り込み効率にバイアスが少ない或いは全くないRNAポリメラーゼ変異体構築することを検討した。特に、野性型RNAポリメラーゼ上のどのアミノ酸を変異させるのか、さらに、変異として置換を行う場合、どのようなアミノ酸に置換させればよいかについて実際に、種々の変異体を作成して検討し、野性型RNAポリメラーゼの少なくとも1つのアミノ酸を修飾することで3’デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの誘導体を取り込む能力を改善することができることを見出して、本発明の変異型RNAポリメラーゼを完成した。

0027

本発明者は、まず、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を挿入した発現プラスミドpT7Rを構築し、次に、この発現プラスミドpT7RをベースにしてT7 RNA ポリメラーゼの変異体を構築した。即ち、T7 RNA ポリメラーゼのF(フェニルアラニン)残基をY(チロシン)残基に変化させた変異型T7RNAポリメラーゼであるF644Y,F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Yを構築し、これらの変異体について取り込み能力の比較を行った。さらに、文献(Sousa.,EMBO J., 14:4609-4621(1995))には、T7 DNA ポリメラーゼのY526に相当する位置であるT7 RNA ポリメラーゼのY639F変異体性質を記述している。特に、特開平8-205874号に記載されたdNTPに対するその特異性を変化させるであろうことを示唆した残基631-640に含まれるY639F変異体も構築した。

0028

本明細書において、野性型T7RNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、遺伝子配列データベースであるGeneBankより、accession No. V01148 J02518 X00411のT7ファージDNA配列(39,937塩基対)の塩基番号3171-5822にコードされている配列(図1及び2参照)を基礎としている。図1及び2に示す配列の上段は、塩基配列、下段はその配列に対応するアミノ酸配列である。右端の数字は、塩基配列の場合、GeneBankに登録されているT7ファージゲノム(Locus T7CG, 39,937塩基対)の番号を示し、アミノ酸の番号は、T7 RNAポリメラーゼき最初のM(メチオニン)を1として、全長883アミノ酸残基からなっていることを示す。尚、このアミノ配列は、上記Moffatt et al., J.Mol.Biol., 173(2):265-269,1984に報告されているアミノ酸配列と同一である。

0029

従って、本明細書における野性型T7RNAポリメラーゼ遺伝子のアミノ酸配列及び各アミノ酸に付された番号は、この図1及び2に示される配列及び番号である。さらに、前述のように、上記野性型T7RNAポリメラーゼは、本発明で目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落を、さらに有するものであることもできる。従って、本発明の目的に基づいて変異を導入すべき野性型RNAポリメラーゼが、野性型T7 RNAポリメラーゼに別の変異を導入したものである場合、特に、そのような変異が、アミノ酸の挿入または欠落である場合、そのような挿入または欠落に応じて、上記アミノ酸番号は変動し、アミノ酸番号が図1及び2に示す番号とは異なったとしても、T7 RNAポリメラーゼ活性を維持している限り、そのようなに挿入または欠落を有するT7 RNAポリメラーゼも本発明において本発明の目的とする変異を導入する野生型T7 RNAポリメラーゼの範疇に含まれる。

0030

T7RNAポリメラーゼ以外のRNAポリメラーゼについてのアミノ酸配列の番号は、図3及び4に示す配列表に基づき決定される。さらに、本発明で目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落を、さらに有するものであることもできる。従って、これらのアミノ酸配列及びその番号に付いても、T7 RNAポリメラーゼの場合と同様であり、アミノ酸の挿入または欠落による変異がある場合、そのような挿入または欠落に応じて、上記アミノ酸番号は変動するが、そのような一部に変異を有する野性型のRNAポリメラーゼも本発明において本発明の目的とする変異を導入する野生型T7 RNAポリメラーゼの範疇に含まれる。

0031

T7 RNAポリメラーゼ遺伝子は、T7ファージDNAを精製後、T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子のN末端アミノ酸領域上流に特異的なプライマー(T7Rpol-N : 5'-ATATTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACACGA TTA ACA TCG CTA AG -3’)、及びC末端アミノ酸領域下流に特異的なプライマー( T7Rpol-C : 5'-ATATTTTAG CCA TGG TAT AGTGAG TCG TAT TGA TTT GGCG -3’ )を合成し、PCRを用いて増幅、発現ベクターpT7Rを構築することができる(実施例1参照)。この発現ベクターを用い、大腸菌DH5αに形質転換し、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTG)を添加すると、T7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を大量に発現する。

0032

このT7RNAポリメラーゼ遺伝子の配列を、図1及び2に示すアミノ酸配列と比較したところ、両者完全に一致した。尚、図1及び2に示すアミノ酸配列とGrachev et al., Bioorg. Kim., 10:824-843, 1984に報告されているアミノ酸配列とは、図1及び2に示すアミノ酸配列における623番目のY及び665番目のLが、Grachev et al.の報告におけるアミノ酸配列では、それぞれH(623番目)及びP(665番目)である点で相違していた。上述のように、本発明の変異型RNAポリメラーゼのベースとなる野性型RNAポリメラーゼは、図1及び2に示す配列に対して、本発明で目的とする修飾以外のアミノ酸の置換、挿入または欠落を、さらに有するものであることもでき、上記Grachev et al.の報告している623番目及び665番目の残基がそれぞれH及び Pであるアミノ酸配列も、本発明の変異型RNAポリメラーゼのベースとなる野性型RNAポリメラーゼに含まれる。

0033

発現ベクターpT7Rを持つ大腸菌から精製したT7 RNAポリメラーゼは、インビトロでT7プロモーターを含んだDNA存在下で充分なRNA合成活性を有していた。この発現プラスミドpT7Rをベースにして変異型T7 RNA ポリメラーゼとして、前述のY639F, F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Yを構築し、これらの変異体について取り込み能力の比較を行った。

0034

尚、F644Y変異を持つ、変異型T7 RNAポリメラーゼについては、F644に対する変異以外に、F644の近傍のL665を前述のGrachev et al.の報告に従ってPとする変異も導入した。即ち、F644Y/L665Pとして変異を導入し、L665Pの影響を調べた。また、F667Y変異を持つ、変異型T7 RNA ポリメラーゼも、F667に対する変異以外に、F667の近傍のL665を前述のGrachev et al.の報告に従ってPとする変異も導入した。即ち、L665P/F667Yとして変異を導入した。さらに、F644Y/L665P/F667Y変異を導入した変異型T7 RNA ポリメラーゼも構築した。これらの変異体の取り込み能力の比較も行った。

0035

変異を導入したT7RNAポリメラーゼを精製し、プロモーター配列特異的なRNA合成とATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5’トリフォスフェート類並びに3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込み能力を野生型T7 RNAポリメラーゼと比較した。結果は後述の表1に示す。

0036

その結果、表1に示すように、F644Y、F644Y/L665P、L665P/F667Y及びF644Y/L665P/F667Yは、RNA合成活性を充分維持し、3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込みの大幅な改善が見られた。また、F644Y/L665P変異体の取り込み能力は、F644Y変異体と同等であった。この結果から、665のロイシンのプロリンへの置換は、3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込みに影響がないことが分かる。なお、表1には、L665P/F667Y変異体の結果のみを示すが、F667Y変異体も、L665P/F667Y変異体の取り込み能力と同等であった。さらに、F644Y/L665P/F667Y変異体の取り込み能力が最も高かった。また、表1には示していないが、F644Y/F667Y変異体の取り込み能力はF644Y/L665P/F667Y変異体のそれとほぼ同等であった。

0037

F782Y変異体は、RNA合成活性を保持しており、3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込み能力も若干改善された。F733Y変異体は、RNA合成活性が若干低下したものの、3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込みの若干の改善が見られた。F646Y変異体は、RNA合成活性を保持していたものの3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込み能力の改善は見られなかった。F882Yは、RNA合成活性が著しく低下していたので、表1には結果を示さなかった。さらに、T7 DNAポリメラーゼのY526に相当する位置であるT7 RNA ポリメラーゼのY639F変異体は、RNA合成活性を保持していたものの3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP或いはそれらの誘導体の取り込み能力の改善は見られなかった。

0038

以上の結果に基づいて、本発明のRNAポリメラーゼは、特に、ポリメラーゼの「ヌクレオチド結合部位」中に存在する少なくとも1つのアミノ酸が修飾されたRNAポリメラーゼであり、このような修飾により、対応するリボヌクレオチドに対して3’デオキシリボヌクレオチドまたは他のリボヌクレオチド類似体を取り込む能力を増加させることができる。

0039

また、上記「ヌクレオチド結合部位」に存在するアミノ酸は、例えば、野性型RNAポリメラーゼのヘリックスYとヘリックスZとの間のループ中のアミノ酸及び/又はヘリックスZとヘリックスAAとの間のループ中のアミノ酸であることができる。

0040

Sousa et al.の文献(Nature, 364:593-599,1993)に示されている立体構造から、鋳型DNAを包み込むポリメラーゼ分子中のクラフトの内側に面する、ヘリックスY(T7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸残基625から634に相当)とヘリックスZ(同アミノ酸残基649から658に相当)に挟まれたループ(同アミノ酸残基635から647に相当)及びヘリックスZとヘリックスAA(同アミノ酸残基685から699に相当)に挟まれたループ(同アミノ酸残基659から684に相当)は、極めてヌクレオチドに近いところに位置するリボヌクレオチド結合部位の一部であると考えられる。本発明では、実際に、このループに相当する領域の644、646、667に存在するF残基をY残基に置換した(図5参照)。

0041

また、733、782及び882の F残基は、ループに相当する領域以外の領域に存在し、ポリメラーゼ分子中のクラフトの内側に面すると考えられる。これらのF残基についても実際にY残基に置換した。

0042

さらに本発明は、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基641-667に対応する領域から選択される領域中のアミノ酸において修飾されているRNAポリメラーゼに関する。T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基641-667に対応する領域は、前述の「ヌクレオチド結合部位」に相当する。

0043

前記4種のRNAポリメラーゼは、アミノ酸の一次構造、プロモーターの配列等、極めて類似している。図3及び4に、上記4つのファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸配列を比較して示す。この比較より、T7、T3、K11由来のRNAポリメラーゼは、極めて類似していることが分かる。特に、図6及び7に示すように、T7とT3ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、極めて類似性が高い。T7とT3ファージは、共に大腸菌に感染するファージであり、その性質も極めて類似していることと符合する。更にこの2つのRNAポリメラーゼの認識するプロモーター配列も類似しているが、その認識特異性は極めて高いことが知られている。このようにT7 RNAポリメラーゼにおいて得られた結果を、アミノ酸配列の類似する他のRNAポリメラーゼに適応することは比較的容易にできる。

0044

このような高い相同性から、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼ以外のRNAポリメラーゼにおける、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼのアミノ酸残基641-667に対応する領域は、T3ファージ由来のRNAポリメラーゼについては、アミノ酸残基642-668であり、K11ファージ由来のRNAポリメラーゼについては、アミノ酸残基664-690であり、SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼについては、アミノ酸残基633-670である、と言える。前述のように、T7、T3、K11由来のRNAポリメラーゼは、極めて類似しており、T7 RNAポリメラーゼについての結果を、アミノ酸配列の類似する他の由来RNAポリメラーゼに適応することができる(図8参照)。

0045

上記RNAポリメラーゼとしては、例えば、T7ファージ由来のRNAポリメラーゼであって、アミノ酸残基644または667においてチロシンを有するRNAポリメラーゼを挙げることができる。また、T3ファージ由来のRNAポリメラーゼであって、アミノ酸残基645または668においてチロシンを有するRNAポリメラーゼを例示することもできる。さらに、K11ファージ由来のRNAポリメラーゼであってアミノ酸残基664〜669の間または690においてチロシンを有するRNAポリメラーゼを例示することもできる。さらにまた、さらに、SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼであってアミノ酸残基633〜638の間または670においてチロシンを有するRNAポリメラーゼを例示することもできる。

0046

このようなアミノ酸の修飾は、アミノ酸の変異のみならず、挿入または欠落であることができる。また、アミノ酸の変異は、例えば、天然に存在するアミノ酸の少なくとも1つをチロシンに置換することである。さらに、置換されるべき天然に存在するアミノ酸は、例えば、フェニルアラニンであることができる。但し、フェニルアラニンに限定されることはなく、対応するリボヌクレオチドに対して3’デオキシリボヌクレオチドまたは他のリボヌクレオチド類似体を取り込む能力を増加させることができるアミノ酸の置換であればよい。

0047

本発明の変異型RNAポリメラーゼにおいて、変異型T7RNAポリメラーゼF644Y、L665P/F667Y及びF644Y/L665P/F667Yは、RNA合成活性を充分保持し、さらに3’dNTPsの取り込み能力が大幅に改善し、野生型で観察された強いバイアスが著しく低下していた。このような優れた特性を有する、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y、L665P/F667Y 又はF644Y/L665P/F667Yを用いることにより、DNAポリメラーゼを用いる塩基配列決定法を超える実用レベルで、転写生成物による塩基配列決定法が可能になる。変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y、L665P/F667Yを生産する大腸菌pT7RF644Y(DH5α)及びpT7RL665P/F667Y(DH5α)は、生命国際寄託番号がそれぞれ5998号(FERM-BP-5998)及び5999号(FERM-BP-5999)として1997年7月2日に寄託済みである。さらに、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yを生産する大腸菌 pT7RF644Y/L665P/F667Y(DH5α)は、生命研国際寄託番号が6364 号(FERM-BP-6364)として1998年5月 20日に寄託済みである。

0048

本発明は、上記本発明のRNAポリメラーゼを製造する方法であって、RNAポリメラーゼをコードする核酸分子を用意し、ヌクレオチド塩基配列内の1つまたはそれ以上の部位における1つまたはそれ以上の塩基を変異させるように該核酸分子に突然変異を起こさせ、次いで変異させた核酸分子により発現される修飾されたRNAポリメラーゼを回収することを含む方法を包含する。RNAポリメラーゼをコードする核酸分子の用意、核酸分子への突然変異の導入、修飾されたRNAポリメラーゼの回収はいずれも、公知の手法を用いて行うことが出来る。

0049

変異型T7 RNAポリメラーゼは、例えば、以下の方法により構築することができる。T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子を挿入してある発現ベクターを鋳型にして T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子のC末端側に相当する制限酵素Hpa I, Nco I部位にはさまれる領域をPCR法を利用して変異を導入した発現プラスミドを構築する。次いで、この発現プラスミドを用い、大腸菌DH5αに形質転換し、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加すると、変異型T7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を大量に発現させることができる。

発明の効果

0050

本発明によれば、リボヌクレオチドに比べて、対応する3’-デオキシリボヌクレオチドやその誘導体がポリリボヌクレオチド配列に取り込まれにくかったり、リボヌクレオチドの中及び3’-デオキシリボヌクレオチドの中でもそれぞれ塩基の種類により、配列への取り込まれ方に差があるといった、リボヌクレオチド等の取り込み能力に対するバイアスが少ないか、或いは全くないRNAポリメラーゼを提供することができる。さらに、本発明のRNAポリメラーゼを用いることで、煩雑な操作もなく、DNAポリメラーゼを用いる塩基配列決定法以上の塩基配列決定を可能にする。また、耐熱性を有する本発明のRNAポリメラーゼは、例えば、WO96/14434に開示されたDNA の塩基配列決定方法において、PCR法に併用することで、より迅速にDNA の塩基配列の決定を行うことが可能になる。

0051

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1
野生型T7 RNAポリメラーゼ遺伝子のクローニングと発現プラスミドの構築
大腸菌を宿主とするT7ファージは、以下のように精製した。大腸菌C600をLB培地(Bacto tryptone 10g, Bacto yeast extract 5g, NaCl 5gを1リッターの水に溶かし、pH 7.5に調整したのち、オートクレーブにて滅菌した培地)200mlに植菌し、菌体濃度OD(600nm)=1.0に達した時点で、多重感染度約2で感染させ、その後ODを経時的に測定し、ODが急激に落ちた時点で遠心操作にて、菌体残査をのぞき、NaCl及びポリエチレングリコール6000をそれぞれ最終濃度、0.5M、及び10%になるように加え、よく撹拌後、一晩、4℃にて静置し、沈殿を形成させた。この沈殿を遠心操作で集め、SM緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgSO4, 50 mM NaCl, 0.01% gelatin)にて懸濁した。このT7 ファージの濃縮液を、次に遠心管に丁寧に重層した密度の異なるCsCl溶液上(下層から、CsCl濃度が、1.267g/ml, 0.817g/ml, 0.705g/mlである溶液)に重層し、22,000rpmで2時間、遠心することにより、ファージ層を形成させ、このファージの白いバンドを丁寧に分取し、TE緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mMEDTA)で透析し、CsCl成分を除去した。更にこのファージ溶液を、フェノール処理により、ファージ蛋白質を変性させ、T7 ファージのゲノムDNAを精製した。

0052

T7 RNAポリメラーゼ遺伝子はこのゲノムDNA、39,937塩基対の内、3171から5822番目にコードされている[T7ゲノム遺伝子全塩基配列については、Dunnらによって既に報告されている(1983, J. Mol. Biol., 166(4):477-535)。但し、若干の訂正がある(GeneBank、accession No. V01148 J02518 X00411のT7ファージDNA配列参照)]。このゲノムDNAを鋳型としてPCRを利用して増幅し、以下のように発現ベクターにクローニングした(図9参照)。すなわち、5’末端に制限酵素Nco I切断部位をそれぞれ含み、T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子のN末端アミノ酸領域上流に特異的なプライマー(T7Rpol-N 5'-ATATTTTAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACACGA TTA ACA TCG CTA AG -3’)、及びC末端アミノ酸領域下流に特異的なプライマー( T7Rpol-C 5'-ATA TTT TAG CCA TGGTATAGTGAG TCG TAT TGA TTTGCG -3’ )を用いて、この酵素遺伝子を PCR 法により増幅した。この DNAフラグメントを Nco I で消化し、1%アガロース電気泳動を行い、目的のDNAフラグメントをアガロースから切り出し、Gene Pure Kit(ニッポンジーン)を用いて精製した。 これをNco I で消化し脱リン酸化した発現ベクター pTrc99a (ファルマシアバイオテク) と連結することで T7 RNA ポリメラーゼ を高発現する pT7R を構築した。野生型T7 RNA ポリメラーゼを発現するプラスミドpT7Rは、大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリン耐性を示す大腸菌を、培養し、培養液中にIPTGを添加し、発現ベクターpT7Rに含まれるTrcプロモーターを稼働させた。IPTG添加2時間後、大腸菌を回収し、全蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析したところ、T7RNAポリメラーゼの分子量である99kDa付近に、IPTGを添加した時のみ蛋白質のバンドが検出された。この蛋白質を更に、Zawadzki, Vら、1991, Nucl. AcidsRes., 19:1948 に既に記載されている方法を一部改良した方法(詳しい方法は実施例3で例示されている変異型T7 RNA ポリメラーゼの精製法とほとんど同じ方法で行うことが出来る)で精製したところ、T7 プロモーター特異的に作用するRNAポリメラーゼの活性を有していた。

0053

実施例2
変異型T7RNAポリメラーゼを生産するための発現プラスミドの構築
(1)変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yを生産するための発現プラスミドの構築(図10参照)
野生型T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の挿入してある pT7R を鋳型にして、T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子のC末端側に相当する制限酵素Hpa I , Nco I 部位に挟まれる領域をPCR法を利用して変異を導入した。更に詳しく例示すると、変異を導入したい塩基を境界として、左右に分け、変異の導入してあるプライマーF646Y(+) (5'-GTTGAC GG A AGCCGT ACT CTT TGG AC-3’)、 F646Y(-)(5'-GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3’) とそれぞれの制限酵素切断部位を5'末端に持つ プライマーT7RNAP-HpaI-N (5'-CGC GCG GTT AAC TTG CTTCCT AG -3’) 、pTrc99a-PstI-C (5'-GCATGCCTG CAG GTC GAC TCT AG -3’)を用いて PCR によりそれぞれの DNAフラグメントを増幅した。これらの DNA フラグメントには相補する部分があり、これらを変性、アニール伸長反応を繰り返すことで目的の変異の導入された DNA フラグメントを作製した。この DNA フラグメントをアガロースゲル電気泳動により、目的の大きさの DNA フラグメントのみを切り出すことで精製し、これを鋳型としてプライマーT7RNAP-HpaI-NとpTrc99a-PstI-Cを用いて再増幅し、制限酵素Hpa I , Pst I で切断した。このDNAは1%アガロース電気泳動を行い、分離した後、目的のDNAフラグメントを切り出し、精製した。この DNA フラグメントを pT7R のHpa I , Pst I DNA フラグメントと置き換えることで変異を導入し,大腸菌DH5αに形質転換し、変異の導入されたプラスミドを選択し、最終的には塩基配列を確認することで目的の位置に変異が導入されているかどうかを確認した。そして、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yを生産するための発現プラスミドpT7RF644Yを得た。このプラスミドからの変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yの生産は、野生型T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、本プラスミドを含む大腸菌を培養し、IPTGを添加することにより、発現誘導可能であった。

0054

(2)変異型T7RNAポリメラーゼL665P/F677Yを生産するための発現プラスミドの構築(図11及び12参照)
変異型T7 RNAポリメラーゼL665P/F667Yの構築は、先のF644Yの構築同様、PCR法をベースにして以下のように行った。

0055

先ず、野生型T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターpT7R中のT7RNAポリメラーゼ遺伝子領域内に、変異導入操作を容易にするため制限酵素XhoI (CTCGAG)を導入した。更に具体的に述べるとプライマーApaF1 (5'-CATCTGGTCGCATTG GGT CAC-3’)とプライマーXho-R (5'-CCA AGTGTTCTC GAG TGG AGA-3’)の組み合わせで、また、Xho-F (5'-CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG-3’)とプライマーAflII-R (5'-CAG CCA GCAGCT TAG CAG CAG-3’)の組み合わせで、各々鋳型として発現ベクターpT7Rを用いて、PCRを行った。増幅した前者のDNAフラグメントは制限酵素ApaIとXhoIで、後者の増幅したDNAフラグメントは制限酵素AflIIとXhoIでそれぞれ反応し、さらに発現ベクターpT7Rを予めApaIとAflIIで処理して、全てをT4 DNAライゲースを用いて結合させた。この反応物を大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子領域内に制限酵素XhoI部位が生まれたプラスミドpT7R-Xhoを得た(図10参照)。このXhoI部位は、制限酵素XhoIで処理することによって、切断されること及びDNAの塩基配列決定を行い、その存在を確認可能である。このプラスミドpT7R-Xhoを鋳型として、プライマーXho-Rとプライマー667R (5'-GCT GAGTGTACA TCG GACCCT-3’)の組み合わせとプライマー667F (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3’)とプライマーAflIIRの組み合わせで各々PCRを行った。このPCR産物を直接鋳型として、DNAの塩基配列を決定し、プライマー667Rおよび667Fの配列を確認し後、それぞれを2%アガロース電気泳動(アガロースはニッポンジーン製のアガロースXを使用)を行い、目的の大きさのDNAフラグメントを切り出し、Gene Pure Kitを用いて、このDNAフラグメントを精製した。この精製した2つのDNAを混合し、鋳型としてプライマーXhoF及びAflIIRを用いてPCRを行い、増幅したDNAフラグメントを制限酵素マッピングDNA塩基配列の解析により目的のフラグメントであることを確認後、制限酵素XhoIとAflIIを用いて酵素反応を行い、これを予め制限酵素XhoIおよびAflIIで処理したプラスミドpT7R-XhoにT4 DNA ライゲースを用いて結合させた。この反応物を大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、目的の変異が導入されているかをDNA塩基配列の決定を行い、確認し、最終的に目的の変異型T7RNAポリメラーゼL665P/F667Yを生産するための発現プラスミドpT7RL665P/F667Yを構築した(図12参照)。このプラスミドからの変異型T7 RNAポリメラーゼL665P/F667Yの生産は、野生型T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、本プラスミドを含む大腸菌を培養し、IPTGを添加することにより、発現誘導可能であった。

0056

実施例3
変異型T7 RNAポリメラーゼの精製
大腸菌に導入した変異型T7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を精製した。尚、本蛋白質の野生型については既にChamberlin, M et al. Nature, 228:227-231(1970), Davanloo et al., Proc.Natl. Acad. Sci.USA., 81:2035-2039(1984)に記載されている。さらに大量生産に関しては、Zawadzki, V et al., Nucl.AcidsRes., 19:1948(1991)に報告されている。

0057

変異型T7 RNAポリメラーゼは基本的に全て同じ方法で精製できる。変異部位の違いにより、その発現量、カラムクロマトグラフィ挙動が若干異なることもある。以下、変異型T7RNAポリメラーゼF644Yの精製法を例示する。F644Yの発現ベクターpT7RF644Yを大腸菌DH5αに導入、抗生物質アンピシリンを含んだLB培地にて、先ず、試験管培養にてOD(600nm) = 0.4〜0.6になったとき、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度0.4mMになるように加え、更に8時間培養する。このとき遠心分離により、大腸菌菌体を集め、典型的には2リッターの培養液より10gの湿重量の大腸菌が得られる。この大腸菌菌体を直ぐに使用しない時は、-20℃以下の冷凍庫で保存が可能である。この段階以降の酵素の精製の全ての行程は、特記しない限り、室温以下の温度、好ましくは0〜5℃にて実施する。この大腸菌は、このとき菌体重量の10倍の洗浄緩衝液(20mM Tris-HCl,pH 8.1, 130 mM NaCl, 2mMEDTANa2 at 25℃)で洗い、再び遠心分離(5,000xg、4℃にて10分間)し、10倍量のソニケーション緩衝液[50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTANa2, 5 mMジチオスレイトール(DTT)、0.1 mMベンザミジン, 30μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、10μg/ml、バシトラシン] に懸濁し、ソニファイヤー450(ブランソン社)を用い、80W、15分間超音波処理を行い菌体を破砕、粘度を低下させる。続いて、12,000xg、4℃にて10分間遠心分離し、細胞残査を除いた。得られた上清を撹拌しながら、10%硫酸ストレプトマイシンをゆっくりと滴下し、終濃度2.0%とした後、更に30分間撹拌を続けた。12,000xg。4℃にて10分間遠心分離し、沈殿を除去し、粉末硫安をゆっくり添加しながら撹拌し、沈殿を形成させる。この場合、最初に30%飽和硫安で沈殿を集め(30%硫安沈殿)、上清は更に60%飽和硫安になるように硫安を撹拌しながら添加し、再び沈殿を形成させ(30-60%硫安沈殿)、更に上清を90%飽和硫安になるように粉末硫安を加え、4℃にて1時間撹拌し、遠心し回収した。この3つの硫安画分の一部をSDS-アクリルアミドゲル電気泳動を行い、蛋白質を分析したところ、目的の変異型T7 RNA ポリメラーゼのほとんどは、30-60%硫安画分に存在し、以後この画分を用いて精製を進めた。30-60%硫安画分は少量のカラム緩衝液(20 mM KPO4, pH7.7, 100 mM NaCl, 1mM DTT, 30μg/ml PMSF)に懸濁し、同じ緩衝液500mlにて、16時間透析し、脱塩した。この透析液を、カラム体積5mlのヘパリン-セファロース(ファルマシア・バイオテク)に付加する。次いで、このカラムを同緩衝液で、280nmの紫外線吸収物質が検出されなくなるまで洗浄し、カラム体積の約40倍の体積の同一緩衝液中の0.1M〜0.64M NaClの直線濃度勾配溶出する。溶出液は、適当量試験管分画して集め、直ぐにSDS-アクリルアミドゲル電気泳動を行い、蛋白質を分析し、目的の変異型T7 RNA ポリメラーゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を検査する。典型的な例では0.4M のNaCl付近に見いだされるはずである。この蛋白質を含む分画を集め、約1リッターのカラム緩衝液(20 mM KPO4, pH7.7, 100 mM NaCl, 1mM DTT, 30μg/ml PMSF)に対して16時間透析し、脱塩操作を行った。この透析脱塩した分画を、同緩衝液で予め平衡化した5ml のカラム体積のQ-セファロース(Q-sepharose, ファルマシア・バイオテク)に付加し、同緩衝液で、280nmの紫外線吸収物質が検出されなくなるまで洗浄し、カラム体積の約40倍の体積の同一緩衝液中の0.1M〜0.64M NaClの直線濃度勾配で溶出する。溶出液は、適当量を試験管に分画して集め、直ぐにSDS-アクリルアミドゲル電気泳動行い、蛋白質を分析し、目的の変異型T7 RNA ポリメラーゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を検査する。典型的な例では0.24M のNaCl付近に見いだされるはずである。この蛋白質を含む分画を集め、500mlの保存用緩衝液(50% glycerol, 20 mM KPO4, pH7.7, 100 mM NaCl, 1mM DTT, 30μg/ml PMSF) に対して16時間透析し、使用まで-20℃にて保存する。この状態で、イン・ビトロのRNA合成活性、或いは混入しているリボヌクレアーゼ活性について試験する。ここでこの方法を例示すると、イン・ビトロRNA合成活性については、T7プロモーターを含むプラスミドを鋳型として用い、野生型T7 RNA ポリメラーゼの市販品(BRLギブコ社)を標準品として酵素希釈法を用いて、RNA合成反応を行い、合成したRNAをアガロース電気泳動する事により、おおよその力価推定した。このとき、合成されたRNAの分解の程度も観察されるため、同時に混入リボヌクレアーゼに関しての、簡単な検定も可能である。典型的な例として、以上のような工程を踏まえた精製法で、1リッターの培養液から2,500,000単位の変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Y蛋白質が精製され、この標品にはほとんどRNaseの混入は認められない。

0058

実施例4
3’dNTP誘導体の取り込み率の改善
精製された変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y及びL665P/F667Yを用いて3’dNTPの取り込み効率を野生型T7 RNA ポリメラーゼと以下のように比較した。イン・ビトロでの転写反応は、例えば、Melton, D.A, [Nucleic AcidsRes., 12: 7035-7056(1984)]によって示された方法を一部改良して行った。さらに具体的に述べると、T7プロモーターを有するプラスミドベクターpBluescriptKS(+) (ストラタジーン社)を、制限酵素PvuIIあるいはScaIで反応し、線状にしたものを鋳型として用い、3’dNTPの誘導体として、WO96/14434に記載された方法を参照して合成したダイ・ターミネーターである5-カルボキシ-X-ローダミン標識 3’-デオキシシチジン-5’-トリフォスフェートを150μM, さらに500μMGTP,UTP及び250μMATP, CTP、8mM MgCl2、2mM spermidine-(HCl)3、5mM DTT、40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL,ギブコ社)の条件下に、野生型T7 RNA ポリメラーゼ(BRL,ギブコ社あるいはニッポンジーン製)、変異型T7 RNA ポリメラーゼF644YあるいはL665P/F667Y 25単位を加えて、合計反応体積10μlとして、37℃で1時間反応を行った。次に反応産物中に残存している未反応のダイ・ターミネーターを除去するため、セファデックスG-50カラム(ファルマシア・バイオテク)を用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、精製産物遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固した。上記5-カルボキシ-X-ローダミン標識 3’-デオキシシチジン-5’-トリフォスフェートは、以下の化学式で示される化合物である。

0059

0060

乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマージャパンABIPRISM377 DNASequencing System取り扱い説明書Ver.1.0に従い、ホルムアミド/EDTA/Bluedextran loading buffer 6μlに溶解し、そのうち2μlを、6M尿素/4%ロングレンジャーTMアクリルアミド溶液(FMC)を含むシークエンス解析用変性ゲルを用い、ABI 377 DNA Sequencer及び解析プログラムにより解析した。その結果を図13にゲル・イメージとして示す。変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yは野生型T7 RNA ポリメラーゼに較べて、約3倍のシークエンスラダーが得られることが判明し、約700塩基の転写産物も確認された。

0061

更に図14及び図15に、それぞれF644Y及びL665P/F667Yを用いて得られたシークエンスラダーのピーク強度を野生型T7 RNAポリメラーゼを用いて得られたピーク強度と対比して示す。この対比から、変異型酵素ピークの高さは、野生型と較べてバラツキが少なく、さらに強いシグナルをもつピークが得られた。これは、F644YあるいはL665P/F667Yの変異によって、この場合、3’dCTP誘導体の取り込み率が改善されたことを示し、さらに、この変異型T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応が、既に存在するDNAポリメラーゼによる塩基配列決定法のデータ生産力匹敵するラダー伸長反応特性を持っていることを示している。

0062

実施例5
変異型T7 RNAポリメラーゼを用いたダイ・ターミネーター法によるシークエンス反応例
ダイ・ターミネーター法によるシークエンス反応を、精製された変異型T7RNAポリメラーゼF644Y及びL665P/F667Yと野生型T7 RNA ポリメラーゼについて以下のように比較した。イン・ビトロでの転写反応は、実施例4で例示した、Melton, D.A. (1984, Nucleic AcidsRes., 12: 7035-7056)によって示された方法を用いた。さらに具体的に述べると、T7プロモーターを有するプラスミドベクターpBluescriptKS(+)を、制限酵素PvuIIあるいはScaIで反応し、線状にしたものを鋳型として用い、3’dNTPの誘導体として、WO96/14434に記載された方法を参照して合成したダイ・ターミネーター、5-カルボキシローダミン6G標識 3’-デオキシアデノン-5’-トリフォスフェート, 5-カルボキシローダミン110標識 3’-デオキシグアノシン-5’-トリフォスフェート, 5-カルボキシ-X-ローダミン標識 3’-デオキシシチジン-5’-トリフォスフェート, 5-カルボキシテトラメチルローダミン標識 3’-デオキシウリジン-5’-トリフォスフェート, さらに500μMGTP,UTP及び250μMATP, CTP、8mM MgCl2、2mM spermidine-(HCl)3、5mM DTT、40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL,ギブコ社)の条件下に、野生型T7 RNA ポリメラーゼ(BRL, ギブコ社あるいはニッポンジーン製)あるいは変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Y 25単位を加えて、合計反応体積10μlとして、37℃で1時間反応を行った。次に反応産物中に残存している未反応のダイ・ターミネーターを除去するため、セファデックスG-50カラム(ファルマシア・バイオテク製)を用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固した。上記5-カルボキシ-X-ローダミン標識 3’-デオキシシチジン-5’-トリフォスフェートは、実施例4で使用したものと同一の化合物である。また、5-カルボキシローダミン6G標識 3’-デオキシアデノン-5’-トリフォスフェート, 5-カルボキシローダミン110標識 3’-デオキシグアノシン-5’-トリフォスフェート,及び5-カルボキシテトラメチルローダミン標識 3’-デオキシウリジン-5’-トリフォスフェートは以下の化学式で示される化合物である。

0063

ID=000003HE=040 WI=102 LX=0540 LY=0800
5-カルボキシローダミン6G標識 3’-デオキシアデノン-5’-トリフォスフェート

0064

ID=000004HE=035 WI=094 LX=0580 LY=1300
5-カルボキシローダミン110標識 3’-デオキシグアノシン-5’-トリフォスフェート

0065

ID=000005HE=040 WI=102 LX=0540 LY=1750
5-カルボキシテトラメチルローダミン標識 3’-デオキシウリジン-5’-トリフォスフェート

0066

乾燥させた反応物を株式会社パーキンエルマージャパンのABIPRISM377 DNASequencing System取り扱い説明書Ver.1.0に従い、ホルムアミド/EDTA/Bluedextran loading buffer 6μlに溶解し、そのうち2μlを、6M尿素/4%ロングレンジャーTMアクリルアミド溶液(FMC)を含むシークエンス解析用変性ゲルを用い、ABI 377 DNA Sequencer及び解析プログラムにより解析した。その結果、図16提示したが、変異型T7 RNAポリメラーゼF644YあるいはL665P/F667Yは野生型T7 RNA ポリメラーゼに比べて、ピーク強度が高く、更にバラツキが少なく、シークエンス読みとりが可能であることが判明した。ここで野生型T7RNAポリメラーゼを用いた場合、ほとんどシークエンスは不可能であった。

0067

実施例6
変異型T7RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yを生産するための発現プラスミドの構築(図面17参照)
変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yの構築は、先に構築した変異型T7 RNAポリメラーゼL665P/F667Yを生産する発現プラスミド構築方法(実施例2参照)と同様に、PCRをベースにして以下のように行った。

0068

変異型T7RNAポリメラーゼL665P/F667Yを生産する発現プラスミドを鋳型として、プライマーXho-FとプライマーT7-DOUBLE-R (21mer:5'-CTCTTTGGACCCGTAAGCCAG-3')の組み合わせとプライマーT7-DOUBLE-F(29mer: 5'-TTACGGGTCCAAAGAGTACGGCTTCCGTC-3')とプライマーAflII-R の組み合わせで各々PCRを行った。このPCR産物を直接鋳型として、DNAの塩基配列を決定し、プライマーT7-DOUBLE-RおよびT7-DOUBLE-Fの配列を確認後、それぞれを2%アガロース電気泳動を行い、目的の大きさのDNAフラグメントを精製した。この精製した2つのDNAを混合し、鋳型としてプライマーXho-FおよびAflII-R用いてPCRを行い、増幅したDNAフラグメントを制限酵素マッピング、DNA塩基配列の解析により目的のフラグメントであることを確認後、制限酵素XhoIおよびAflIIを用いて酵素反応を行い、これを予め制限酵素XhoIおよびAflIIで処理したプラスミドpT7RL665P/F667YにT4 DNAライゲースを用いて結合させた。この反応物を大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、目的の変異が導入されているかをDNA塩基配列の決定を行い、確認し、最終的に目的の変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yを生産するための発現プラスミドpT7RF644Y/L665P/F667Yを構築した(図17参照)。このプラスミドからの変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yの生産は、野生型T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、本プラスミドを含む大腸菌を培養し、IPTGを添加することにより発現誘導可能であった。

0069

実施例7
変異型T7RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yの精製
変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yは、実施例3に記載の方法と同じ方法で精製可能であった。典型的な例として、1リッターの培養液から1,000,000単位の変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Y蛋白質が精製された。得られたRNAポリメラーゼは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、ほぼ単一バンドであり、この標品からRNaseは検出されなかった。

0070

実施例8
3'dNTP誘導体の取り込み率の改善
実施例7で精製した変異型T7RNAポリメラーゼのリボヌクレオチド(NTP)と3'デオキシヌクレオチド(3'dNTP)の取り込み率を以下のように測定した。転写反応の鋳型は、プラスミドpBluescript(KS+)(ストラタジーン社)を制限酵素、PvuIIで反応し、線状としたものを用い、ATP, CTP,GTP,UTPをそれぞれ250uM、2mM spermidine-(HCl)3、5mM DTT、40mM Tris/HCl pH 8.0、 0.1ulの[alpha-32P]UTP (3000Ci/mmole)の条件下、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yを25単位、反応に用いた。そして、2種類の反応液(3'dATPの無添加又は添加(終濃度100μM))を用意して、37℃、60分反応させた。そして、この反応物全量をDE81 paper (ワットマン社)にスポットし、リン酸緩衝液で3回洗浄、乾燥させ、DE81 paperをシンチレーションバイアルに入れて、シンチレーションカウンターベックマン)を用いて、それぞれの放射活性を測定した。これにより得られた放射活性より、3'-dATPの添加、無添加時の値と比較することによってどれだけ[alpha-32P]UTPの取り込みが阻害されるかを算出した。算出値を、野性型T7 RNAポリメラーゼの阻害度1.000と比較して得られる相対活性を表1に示す。

0071

上記F644Y/L665P/F667Y変異体に代えて、野性型T7RNAポリメラーゼ、実施例3で得た変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y若しくはL665P/F667Y、又は実施例2及び3と同様の方法で構築精製した変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P、F782Y、F733Y、F646Y若しくはY639Fを反応に用いて、阻害結果を得た。相対活性を表1に示す。表1の結果は、数値が大きいほど、その変異型酵素が、3'-dATPを取り込みやすくなっている変異であることを示している。例えば、この場合、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yは、野性型酵素より、5.58倍、3'-dATPを取り込みやすい酵素であることを意味する。F644Y/L665P/F667Y変異体は、今回、作製した変異型酵素の中で、もっとも3'-dNTPを取り込むバイアスの少ない変異型酵素であることを示している。

0072

0073

実施例9
変異型T7RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yを用いたシークエンス反応例
シークエンス反応の鋳型として用いた鋳型は以下のようにPCRにより作製した。PCRの鋳型としてhuman thyroid-stimulating hormone (hTSH-β)cDNAをT7プロモーターを有するBS750由来のプラスミドにサブクローニングしたものを用いた。このhTSH-βをもつプラスミド、100fgを用い、クローニング部位を挟む形で存在するL220プライマー(5'-TAA CAATTTCAC ACA GGA AAC A-3')及び1211プライマー(5'-ACGTTG TAA AAC GACGGCCAG T-3')で反応液量20μlでPCR[(94℃ 2分)1回、(94℃ 1分、55℃ 1分、72℃ 1.5分)30回、72℃ 5分]を行った。このPCRで出来たPCR産物の1211プライマーの下流にT7プロモーターが存在する。

0074

シークエンス転写反応は、Melton,D.A [Nucleic AcidsRes., 12:7035-7036(1984)]に示されている方法を用いて行った。上記PCR産物の内1μl(約10ng)をシークエンス反応に用いた。反応は、3'dNTPの誘導体として、実施例5で用いたと同様のダイ・ターミネーター4μMR6G-3'dATP[5-カルボキシローダミン6G標識3'-デオキシアデノシン-5-トリフォスフェート(n=4)]、4μM R110-3'dGTP[5-カルボキシローダミン110標識3'-デオキシグアノシン-5-トリフォスフェート(n=4)]、80μM XR-3'dCTP[5-カルボキシ-X-ローダミン標識3'-デオキシシチジン-5-トリフォスフェート(n=4)]、20μMTMR-3'dUTP[5-カルボキシテトラメチルローダミン標識3'-デオキシウリジン-5-トリフォスフェート(n=4)]を用いた。さらに500μM UTP、250μM ATP、200μM CTP、500μM GTP、2mMスペルミジン-(HCI)3、5mM DTT、40mM Tris/HCl pH8.0 (BRL、ギブコ社)の条件下、変異型T7RNAポリメラーゼF644Y/L665P/F667Y 25単位を加えて、合計反応体積10μlとして、37℃で一時間反応を行った。

0075

次に反応産物中に残存している未反応のダイ・ターミネーターを除去するため、セファデックスG-50カラム(ファルマシア・バイオテク製)を用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固した。この乾燥させた反応物を株式会社パーケンエルマージャパンのABIPRISM377DNA sequencing System取り扱い説明書Ver.1.0に従い、ホルムアミド/EDTA/Bluedextran loading buffer 6μlに溶解し、そのうちの2μlを、6M尿素/4%ロングレンジャーTMアクリルアミド溶液(FMC社)を含むシークエンス解析用変性ゲルを用い、ABI 377 DNA sequencer及び解析プログラム(Sequencing Analysis Ver.3.0)により解析し、エレクトロフェログラムを得た。図18にその結果を示す。このように良好なシークエンス解析が可能である。

図面の簡単な説明

0076

図1 T7ファージゲノム上のT7 RNAポリメラーゼ遺伝子とコードされているT7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列(前半)。上段は、塩基配列、下段はその配列に対応するアミノ酸配列を示した。右端の数字は、塩基配列の場合、DNA配列データベースGeneBankに登録されているT7 ファージゲノム(Locus T7CG, 39,937塩基対)の番号を示し、アミノ酸の番号は、T7 RNA ポリメラーゼき最初のM(メチオニン)を1として、全長883アミノ酸残基からなっていることを示す。
図2T7 ファージゲノム上のT7 RNA ポリメラーゼ遺伝子とコードされているT7 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列(後半)。上段は、塩基配列、下段はその配列に対応するアミノ酸配列を示した。右端の数字は、塩基配列の場合、DNA配列データベースGeneBankに登録されているT7 ファージゲノム(Locus T7CG, 39,937塩基対)の番号を示し、アミノ酸の番号は、T7 RNA ポリメラーゼき最初のM(メチオニン)を1として、全長883アミノ酸残基からなっていることを示す。
図3現在報告されているファージ由来RNAポリメラーゼのアミノ酸配列の比較(前半)。最上段のT7 RNA ポリメラーゼを基準として、・はT7 RNA ポリメラーゼと同一のアミノ酸、−は欠損最下段の*はすべてのポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを示す。
図4現在報告されているファージ由来RNAポリメラーゼのアミノ酸配列の比較(後半)。最上段のT7 RNA ポリメラーゼを基準として、・はT7 RNA ポリメラーゼと同一のアミノ酸、−は欠損、最下段の*はすべてのポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを示す。
図5T7 RNA ポリメラーゼの変異部位導入部位の詳細図。白ぬき文字は、変異導入されたアミノ酸であることを示している。
図6T7 RNA ポリメラーゼとT3 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列の比較(前半)。 最上段のT7 RNA ポリメラーゼを基準として、・は同一のアミノ酸、−は欠損、最下段の*は2つのポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを示す。
図7T7 RNA ポリメラーゼとT3 RNA ポリメラーゼのアミノ酸配列の比較(後半)。 最上段のT7 RNA ポリメラーゼを基準として、・は同一のアミノ酸、−は欠損、最下段の*は2つのポリメラーゼに共通しているアミノ酸であることを示す。
図8T7 RNA ポリメラーゼの残基641−667の前後の配列と、それに対応する領域のT3RNA ポリメラーゼ、K11RNA ポリメラーゼ、及びSP6RNA ポリメラーゼアミノ酸配列を示す。T7RNAポリメラーゼについては、残基を全て示したが、対応するT3, K11, SP6についてはT7と同じ残基については・(ドット)で示した。
図9野生型T7 RNAポリメラーゼを発現するプラスミド、pT7Rの構築図。
図10変異型T7RNA ポリメラーゼF644Yを発現するプラスミド、pT7RF644Yの構築図。
図11T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子中に制限酵素XhoI部位を持つ、pT7Rの改良型プラスミド、pT7R-Xhoの構築図。
図12変異型T7RNA ポリメラーゼL665P/F667Yを発現するプラスミド、pT7RL665P/F667Yの構築図。
図13変異型T7 RNA ポリメラーゼによるダイ・ターミネーターの取り込み率の改善。野生型T7 RNA ポリメラーゼ(WT)、変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Y(F644Y)、変異型T7 RNA ポリメラーゼL665P/F667Y(F667Y)。
図14変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Yによるダイ・ターミネーターの取り込み率の改善。エレクトログラムとして表示した。野生型T7 RNA ポリメラーゼ(WT)、変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Y(F644Y)。
図15変異型T7 RNA ポリメラーゼL665P/F667Yによるダイ・ターミネーターの取り込み率の改善。エレクトログラムとして表示した。野生型T7 RNA ポリメラーゼ(WT)、変異型T7 RNA ポリメラーゼL665P/F667Y(F667Y)。
図16シークエンス反応例 野生型T7 RNA ポリメラーゼ(WT)、変異型T7RNA ポリメラーゼF644Y(F644Y)、変異型T7 RNA ポリメラーゼL665P/F667Y(F667Y)を用いて反応した。何れも同じ領域のシークエンスパターンを示した。
図17変異型T7RNA ポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yを発現するプラスミド、pT7R F644Y/L665P/F667Yの構築図。
図18変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Y/L665P/F667Yによるダイ・ターミネーターの取り込み率の改善結果をエレクトログラムとして表示した。

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