図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(1999年3月23日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (6)

課題

本発明の課題は、20塩基以上の長さのDNAプロ−ブを安定に固相化した液体の取り扱いの簡単なデバイスを提供することである。

解決手段

ガラス製で且つ円筒状のキャピラリィ4の内壁5に、流路に沿って状に種々のDNAプロ−ブ1a,1b,1c…がキャッピング剤光反応によって順次固相化されている。測定を行うには、試料をキャピラリィ4の注入用開口部2aから導入して、反応させた後、蛍光測定等する。

概要

背景

近年、ヒトゲノム計画と言われるようなプロジェクト世界的規模で進められており、人間の全遺伝子の塩基配列解析が試みられている。この作業は非常に多くの人手を要し、かつ煩雑な作業にもかかわらず、21世紀の初頭には解明が終了すると言われている。この塩基配列の解析(シ−ケンシング)は先に述べたように非常に煩雑なため、解析機器の改良、自動化やDNAチップと呼ばれる新規解析方法の提案がなされている。DNAチップとはシリコン等の基板半導体リソグラフィ技術を用いて多数の種類のDNAプロ−ブが決められた位置に配置されたものである。また、DNAプロ−ブとはDNAを構成する4種の塩基アデニン(A),グアニン(G),シトシン(C),チミン(T)が相補的に結合する性質を利用したもので、例えば塩基Aと塩基T、塩基Gと塩基Cがそれぞれ相補的に結合する。従って、AGCTT(5’→3’)という塩基配列のプロ−ブを用いるとAAGCTという塩基配列のDNAを選択的に捕らえることができる。

例えばDNAプロ−ブの固相化方法としては、Sience251:767−773(1991年2月発行)に示されているように、光反応を用いて実質的に平坦な基板上にDNAプロ−ブを構成する方法がある。この方法を図1に示す。シラン処理によりアミノ基を基板表面に形成し、光保護分子Xを結合させた表面の一部に紫外線照射し、目的の位置の保護基をはずしてアミノ基を露出させる(図1a)。次いで露出したアミノ基と光保護基の付いた4種のDNA塩基のうちの1種の塩基Aを選択し、反応させる(図1b)。その結果、光保護基Xの付いたDNA塩基Aと光保護基のみが付いた表面が形成される(図1c)。さらに、保護基のみが付いた表面の一部を選択し、その部分に光を照射して光保護基の付いたDNA塩基Bと反応させる(図1d)。その結果、光保護基の付いたDNA塩基Aと光保護基の付いたDNA塩基Bを含む表面が形成される(図1e)。これらの反応を2次元的な位置決めでDNA塩基Cと塩基Dについても同様に行うと4種の塩基全てを基板表面に固定することが出来る。さらに、任意の塩基と光保護基とが付いた部分に対して上述したプロセスを繰り返すことにより、3次元的に塩基の積み重ねが行われて(図1f)に示すように異なった塩基配列を有するDNAプロ−ブを特定の場所に特定の配列で形成することが出来る。従って、本技術を用いることにより例えば8種類の塩基から成るあらゆる塩基配列の組み合わせのDNAプロ−ブを基板上に構成する場合、32枚のマスクを用意してリソグラフィと光反応技術を32回繰り返せば全ての組み合わせのDNAプロ−ブを基板上に構成することが出来る。このように形成された基板はDNAチップと呼ばれ主に未知の塩基配列のDNAのシ−ケンシングに用いる事が出来、従来の電気泳動を利用したシ−ケンシング技術に比べ、高速で簡便にシ−ケンシングできるという利点がある。

また、国際出願特許公開WO93/09668号(特表平7−506561号)は、上記国際出願に記載されたシ−ケンシング技術の応用に関するものであり、複数のフロ−式チャネルに適用する方法が述べられている。予めシラン処理によりアミノ基を基板表面に形成した実質的に平坦な基板に対して複数のフロ−式チャネルを取り付けた後に、それぞれのチャネルの全長に亙って一種類の、しかしチャネル毎には異種の塩基配列からなるDNAプロ−ブが固定化される。また、本技術の好ましい態様では、即ち、アミノ基を有する基板を複数の平行に並んだチャネルブロック合接させた後に、選択されたDNAプロ−ブを含む処理液を特定のチャネルに流すことにより、目的のDNAプロ−ブの1つ目の塩基を固相化し、次に、基板とチャネルブロックとを互いに所定角度(例えば90度)相対的に回転させてから再び基板とチャネルブロックとを合接させた後に、2つ目の塩基に相当する塩基を固相化する工程を順次繰り返すことにより、所望の塩基配列からなるDNAプロ−ブを構成する方法が述べられている。この方法は光反応による方法と組み合わせることもでき、先に述べたDNAチップを一度に大量に製作することが出来るという利点がある。

概要

本発明の課題は、20塩基以上の長さのDNAプロ−ブを安定に固相化した液体の取り扱いの簡単なデバイスを提供することである。

ガラス製で且つ円筒状のキャピラリィ4の内壁5に、流路に沿って状に種々のDNAプロ−ブ1a,1b,1c…がキャッピング剤の光反応によって順次固相化されている。測定を行うには、試料をキャピラリィ4の注入用開口部2aから導入して、反応させた後、蛍光測定等する。

目的

従来技術は、DNA配列のシ−ケンシングを行うという目的では有力な方法と考えられるが、最近ではポストゲノムの観点から、得られたDNA情報を如何に利用するかということが今後の課題である。例えば、DNAがどのように発現するかを研究するために細胞内で発現するmRNAパタ−ンを解析することが行われるようになってきている。同じ遺伝子を持ちながら臓器の違いによるmRNA発現の違いや同一の細胞でも時間的な発現の変化を研究することは遺伝子治療医薬品開発、農業畜産など多くの分野に応用する事が出来、今後の発展が期待されている。そのような発現パタ−ンを調べるにはmRNA、またはmRNAから転換したcDNAに対応する複数のDNAプロ−ブを準備し、目的の細胞に含まれるmRNA、またはmRNAから転換したcDNAとDNAプロ−ブを反応させる方法が考えられる。このような測定においては測定対象のmRNA、またはmRNAから転換したcDNAの塩基配列はある程度既知のものであり、また測定の正確さ、効率性を考慮すると20〜60塩基程度、好ましくは40塩基付近の長さのDNAプロ−ブが用いられる。先に述べたDNAチップでこのようなプロ−ブを構成するには80〜240枚のマスクを準備してリソグラフィと光反応による塩基の合成を80〜240回繰り返す必要がある。従って、DNAプロ−ブの長さが長くなるにつれ多大な労力が必要になるという問題がある。さらに、合成の収率を考慮すると、長さが40塩基に揃ったDNAプロ−ブを基板上に直接合成することは実用上不可能といえるが、長さが揃っていないと測定が不正確になってしまうので好ましくない。

以上のように、本発明はこの点に着目し、20塩基以上の長さのDNAプロ−ブを安定に固相化した液体の取り扱いの簡単なデバイスを提供することを目的とする。また、本発明は、余剰量の各種処理用液体を必要とせず、固相化されたDNAプロ−ブの利用面積が増大されたデバイスを提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
5件
牽制数
12件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

光透過性流路内壁に複数のDNAプロ−ブが各々独立して配置されていることを特徴とするDNAキャピラリィ

請求項2

前記流路の末端部が、開放された中空状のキャピラリィであることを特徴とする請求項1記載のDNAキャピラリィ。

請求項3

前記流路が、円筒形状であることを特徴とする請求項2記載のDNAキャピラリィ。

請求項4

前記流路が、複数個で且つ一体に配置されていることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。

請求項5

前記複数個の流路の全てが、少なくとも一つの末端部付近合流路と連通していることを特徴とする請求項4記載のDNAキャピラリィ。

請求項6

複数のDNAプロ−ブが、前記流路に沿って直列した配置であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。

請求項7

前記流路が、ガラスまたはシリコン基板上にエッチング加工されて形成されていることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。

請求項8

DNAプロ−ブが光反応を用いて固定されることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のDNAキャピラリィ。

技術分野

0001

本発明は、複数のDNAプロ−ブを用いてそのDNAプロ−ブと相補的に反応するタ−ゲットDNAやmRNAを検出するためのデバイスに関する。

背景技術

0002

近年、ヒトゲノム計画と言われるようなプロジェクト世界的規模で進められており、人間の全遺伝子の塩基配列解析が試みられている。この作業は非常に多くの人手を要し、かつ煩雑な作業にもかかわらず、21世紀の初頭には解明が終了すると言われている。この塩基配列の解析(シ−ケンシング)は先に述べたように非常に煩雑なため、解析機器の改良、自動化やDNAチップと呼ばれる新規解析方法の提案がなされている。DNAチップとはシリコン等の基板半導体リソグラフィ技術を用いて多数の種類のDNAプロ−ブが決められた位置に配置されたものである。また、DNAプロ−ブとはDNAを構成する4種の塩基アデニン(A),グアニン(G),シトシン(C),チミン(T)が相補的に結合する性質を利用したもので、例えば塩基Aと塩基T、塩基Gと塩基Cがそれぞれ相補的に結合する。従って、AGCTT(5’→3’)という塩基配列のプロ−ブを用いるとAAGCTという塩基配列のDNAを選択的に捕らえることができる。

0003

例えばDNAプロ−ブの固相化方法としては、Sience251:767−773(1991年2月発行)に示されているように、光反応を用いて実質的に平坦な基板上にDNAプロ−ブを構成する方法がある。この方法を図1に示す。シラン処理によりアミノ基を基板表面に形成し、光保護分子Xを結合させた表面の一部に紫外線照射し、目的の位置の保護基をはずしてアミノ基を露出させる(図1a)。次いで露出したアミノ基と光保護基の付いた4種のDNA塩基のうちの1種の塩基Aを選択し、反応させる(図1b)。その結果、光保護基Xの付いたDNA塩基Aと光保護基のみが付いた表面が形成される(図1c)。さらに、保護基のみが付いた表面の一部を選択し、その部分に光を照射して光保護基の付いたDNA塩基Bと反応させる(図1d)。その結果、光保護基の付いたDNA塩基Aと光保護基の付いたDNA塩基Bを含む表面が形成される(図1e)。これらの反応を2次元的な位置決めでDNA塩基Cと塩基Dについても同様に行うと4種の塩基全てを基板表面に固定することが出来る。さらに、任意の塩基と光保護基とが付いた部分に対して上述したプロセスを繰り返すことにより、3次元的に塩基の積み重ねが行われて(図1f)に示すように異なった塩基配列を有するDNAプロ−ブを特定の場所に特定の配列で形成することが出来る。従って、本技術を用いることにより例えば8種類の塩基から成るあらゆる塩基配列の組み合わせのDNAプロ−ブを基板上に構成する場合、32枚のマスクを用意してリソグラフィと光反応技術を32回繰り返せば全ての組み合わせのDNAプロ−ブを基板上に構成することが出来る。このように形成された基板はDNAチップと呼ばれ主に未知の塩基配列のDNAのシ−ケンシングに用いる事が出来、従来の電気泳動を利用したシ−ケンシング技術に比べ、高速で簡便にシ−ケンシングできるという利点がある。

0004

また、国際出願特許公開WO93/09668号(特表平7−506561号)は、上記国際出願に記載されたシ−ケンシング技術の応用に関するものであり、複数のフロ−式チャネルに適用する方法が述べられている。予めシラン処理によりアミノ基を基板表面に形成した実質的に平坦な基板に対して複数のフロ−式チャネルを取り付けた後に、それぞれのチャネルの全長に亙って一種類の、しかしチャネル毎には異種の塩基配列からなるDNAプロ−ブが固定化される。また、本技術の好ましい態様では、即ち、アミノ基を有する基板を複数の平行に並んだチャネルブロック合接させた後に、選択されたDNAプロ−ブを含む処理液を特定のチャネルに流すことにより、目的のDNAプロ−ブの1つ目の塩基を固相化し、次に、基板とチャネルブロックとを互いに所定角度(例えば90度)相対的に回転させてから再び基板とチャネルブロックとを合接させた後に、2つ目の塩基に相当する塩基を固相化する工程を順次繰り返すことにより、所望の塩基配列からなるDNAプロ−ブを構成する方法が述べられている。この方法は光反応による方法と組み合わせることもでき、先に述べたDNAチップを一度に大量に製作することが出来るという利点がある。

発明が解決しようとする課題

0005

従来技術は、DNA配列のシ−ケンシングを行うという目的では有力な方法と考えられるが、最近ではポストゲノムの観点から、得られたDNA情報を如何に利用するかということが今後の課題である。例えば、DNAがどのように発現するかを研究するために細胞内で発現するmRNAのパタ−ンを解析することが行われるようになってきている。同じ遺伝子を持ちながら臓器の違いによるmRNA発現の違いや同一の細胞でも時間的な発現の変化を研究することは遺伝子治療医薬品開発、農業畜産など多くの分野に応用する事が出来、今後の発展が期待されている。そのような発現パタ−ンを調べるにはmRNA、またはmRNAから転換したcDNAに対応する複数のDNAプロ−ブを準備し、目的の細胞に含まれるmRNA、またはmRNAから転換したcDNAとDNAプロ−ブを反応させる方法が考えられる。このような測定においては測定対象のmRNA、またはmRNAから転換したcDNAの塩基配列はある程度既知のものであり、また測定の正確さ、効率性を考慮すると20〜60塩基程度、好ましくは40塩基付近の長さのDNAプロ−ブが用いられる。先に述べたDNAチップでこのようなプロ−ブを構成するには80〜240枚のマスクを準備してリソグラフィと光反応による塩基の合成を80〜240回繰り返す必要がある。従って、DNAプロ−ブの長さが長くなるにつれ多大な労力が必要になるという問題がある。さらに、合成の収率を考慮すると、長さが40塩基に揃ったDNAプロ−ブを基板上に直接合成することは実用上不可能といえるが、長さが揃っていないと測定が不正確になってしまうので好ましくない。

0006

また、一つの細胞では約10万個の遺伝子のうち2〜3万種のmRNAが発現していると考えられるが、それらのうち細胞特異的なものの割合は、数%(1〜3%程)程度であると推測されている。従って、測定対象のmRNA、またはmRNAから転換したcDNAの種類は数百〜千程度と考えられる。先に述べたDNAチップで8塩基の長さのプロ−ブは48 すなわち65,536種類形成できるが、測定対象のmRNA、またはmRNAから転換したcDNAの種類は最大で2〜3万程度、実際にはその1/10以下と想定されるのでこのように大量種類のプロ−ブを形成する必要はない。DNAプロ−ブと測定対象のmRNA或いはcDNAの断片とのハイブリダイゼ−ション熱安定性は一様ではない。また、測定装置ダイナミックレンジを考慮すると、処理濃度が大きく異なるmRNA或いはcDNA断片を同時に処理することは不可能である。したがって、同一測定条件の下にある大量種類のDNAプロ−ブの中で、有効な結果を与えるものは限られる。このことからも、大量種類のDNAプロ−ブを基板上に形成する必要が無いことが分かる。

0007

さらに、先に述べたDNAチップでは光反応による合成を繰り返すため、光照射時のDNAプロ−ブの紫外線による劣化が問題となる可能性もあり20塩基以上の長さのプロ−ブを形成する方法としては適切ではない。また、DNAチップは実質的に平坦な基板上に形成されるが、固相化時には多数の試薬を交互に反応させたり、また測定時には試料との反応や洗浄を行うために液体を何度も作用させる必要がある。平坦な基板のDNAチップを用いて上記の処理を行うには反応液の入った容器にDNAチップを浸漬するか、DNAチップ表面を有して流路を形成するような治具を製作して液体処理をする必要がある。従って、これらの処理を円滑に行うためにはDNAチップ以外に液体処理をするための治具を必要とする。しかし、浸漬する方法では、固相化および試料の測定に当って余剰量の各種処理液を必要とする。また、流路を適用する方法では、DNAプロ−ブが固相化された面積が制限されてしまう。

0008

以上のように、本発明はこの点に着目し、20塩基以上の長さのDNAプロ−ブを安定に固相化した液体の取り扱いの簡単なデバイスを提供することを目的とする。また、本発明は、余剰量の各種処理用液体を必要とせず、固相化されたDNAプロ−ブの利用面積が増大されたデバイスを提供することを目的とする。

0009

上記課題を解決するために、本発明は、光透過性の流路の内壁に複数のDNAプロ−ブが各々独立して配置されていることを特徴とするDNAキャピラリィである。ここで、前記流路の末端部が、開放された中空状のキャピラリィであることが好ましい。また、前記流路は、筒形状のキャピラリィであることが一層好ましい。前記流路が、複数個で且つ一体に配置されていれば、処理能力が向上する。特に、複数個の流路の全てが、少なくとも一つの末端部付近で合流路と連通していれば、DNAプロ−ブの固定化処理や該DNAプロ−ブによる試料の測定等に際して、合流路を通じて各種処理用液体が一括して導入されるか或いは回収される。

0010

また、複数のDNAプロ−ブが、前記流路に沿って直列した配置である場合には、流路に沿って処理用の液体(場合によっては、乾燥その他の目的のための気体)を流路に沿って流すことにより、それぞれのDNAプロ−ブが次々に処理される。

0011

また、前記流路が、ガラスまたはシリコン基板上にエッチング加工されて形成されていれば、DNAプロ−ブの固定が容易になる。しかも、好ましい態様においては、DNAプロ−ブが光反応を用いて固定されることで、本発明のDNAキャピラリィを好適に製造することができる。

発明を実施するための最良の形態

0012

図2に本発明のDNAキャピラリィの第一の実施の形態を示す。この発明の実施の形態は次のように構成されている。図2は、種々のDNAプロ−ブ1a,1b,1c…が、注入用開口部2aおよび排出用開口部2bを両端に有する光透過性の円筒状キャピラリィ4の内壁5に状に固定されている状態を示している。キャピラリィのサイズは内径が0.1mmから数mmまで種々のサイズが用いられるが、取り扱いの容易さから0.5mmから1mm程度のものが好適である。キャピラリィ4の内径や流路長は、測定する試料の容量や液体の流動し易さに応じて決定される。

0013

キャピラリィ4の内部に固定するDNAプロ−ブは、予め所望の塩基配列からなる20塩基以上、好ましくは20〜60塩基、特に40塩基付近(例えば、35〜45塩基)のものであって、その種類は目的によって異なり、測定対象となるmRNA、またはmRNAから転換したcDNAの数に依存するが、1種類から数千種類までを対象とする。本発明の第一の目的であるmRNAの発現パタ−ンを解析するためには数千種類のDNAプロ−ブを固定する必要があるが、例えば感染症などの検査を目的とする場合には1から数種類のDNAプロ−ブで十分である。各DNAプロ−ブ1a,1b,1c…の間隔は、測定対象の数が多い場合には密にすればよい。測定対象の数が少ない場合にはその間隔を広く取ることができ、そうすることにより測定し易さが増す。実際には、20〜60塩基程度のDNAプロ−ブを複数種類直列的に配置するために、1μmから数mm程度まで種々の間隔で各DNAプロ−ブ1a,1b,1c…を配置することができる。必要ならば、同種のDNAプロ−ブを複数固定化したり、対照用タンパクを固定化することにより、測定の多様性を加えてもよい。

0014

通常、DNAキャピラリィを用いた測定は、測定対象が微量である場合を考慮して、蛍光化学発光を利用した光増感方式を採用するのが好ましい。キャピラリィ4に固定化された各DNAプロ−ブ1a,1b,1c…の間隔が密であるとき、蛍光顕微鏡等のように高い分解能を有する測定手段を用いて複数の反応パタ−ンを個別に読み取る必要があるが、数mmの粗い間隔であればトランスイルミネ−タを用いることにより、肉眼でも観察が可能である。このような光測定をし易くするためには、光透過性のよい任意の部材(プラスチック類シリカ、ガラス、ポリマ−等)からなるDNAキャピラリィを使用するべきであり、特に後述するシラン処理による製造方法を行うにはガラス或いはシリコンが好適である。必要ならば、部分的に光反射性または遮光性であってもよい。市販のガラスキャピラリィを利用すると安価にDNAキャピラリィを製作することができる。

0015

次にDNAキャピラリィの製作方法について説明する。図3は、種々のDNAプロ−ブ1a,1b,1c…をガラスキャピラリィの内壁5に固定化する方法を示している。以下に示す各製造プロセスにおける各種処理用液体の導入は、キャピラリィ4の注入用開口部2aから適宜の分注手段によって行なわれ、処理後の液体の排出は、排出用開口部2bから適宜の吸引手段によって行なわれる。まず、内壁5をシランカップリング剤を含む溶液をキャピラリィ4中に導入して、アミノ基(NH2)7をその表面に形成する(S1)。次に、特定の波長の光、好ましくは紫外線で光分解を起こすキャッピング剤7を含む溶液をキャピラリィ4中に導入して、内壁5全体をアミノ基で覆う(S2)。次に、内壁5の固定化したい領域に紫外線照射して、その領域のみのアミノ基6を露出させる(S3)。ここで、特定の場所のみに紫外線8を照射するためには、半導体のリソグラフィ技術で用いられているマスク部材で特定の場所以外に光が当たらないようにするか、光をレンズ等で照射範囲絞り込めばよい。また、キャピラリィ4が円筒形状であるから、キャピラリィ側面をほぼ直角に入射する角度であれば、任意の方向から光照射して構わない。また、キャピラリィ4全体が光透過性であるために、キャピラリィ4の内壁5は、紫外線照射された領域のみがリング状に脱保護された状態になる。

0016

次に、アミノ基と反応して結合する結合性部分分子の一端に、アミノ基もしくはチオ−ル基と反応して結合する結合性部分を分子の他端に有するリンカ−分子9を含む液体をキャピラリィ4中に導入する(S4)。このとき、リンカ−分子9の一端の結合性部分のみが内壁5上のアミノ基6と結合し、他端の結合性部分はフリ−の状態となる。次に、末端部にアミノ基或いはチオ−ル基を形成させたDNAプロ−ブ10を含む液体をキャピラリィ4中に導入して、リンカ−分子9にDNAプロ−ブ10を結合させる(S5)。なお、適宜の洗浄液を適量導入してキャピラリィ4内を洗浄するプロセスを介して、上記(S3)、(S4)、(S5)の固定化プロセスを所要の間隔だけ離間させた別の場所に変えて繰り返すことにより、図2に示すような目的の場所に目的のDNAプロ−ブ1a,1b,1c…を各々リング状に独立して固相化したDNAキャピラリィを製作することができる。ここで、本発明においてリング状または環状とは、中空状流路の断面形状に応じて円形多角形楕円形等の種々の形を含んでいる。また、流路とは、少なくとも所要量の処理用液体が流れることのできる幅と高さを有している。この流路は、好ましくは毛管力による流動促進作用を有するように選ばれる。したがって、単に、凹凸隆起が形成された表面は、流路とは呼ばない。

0017

なお、(S1)で用いられるシランカップリング剤としては、例えばアミノエチルアミノピロピルトリメトキシシラン等が用いられるが、これに限定されるものではなくアミノ基を表面に形成できるようなものであれば、アミノエチルアミノピロピルメチルジメトキシシシラン等のアミノシラン類利用可能である。(S2)で用いられるキャッピング剤としては、4,5−Dimethoxy−2−nitrobenzyl chloroformate、6−Nitroveratryl chloroformate、4−Nitrobenzyl chloroformate、o−Nitrobenzyl−p−nitrophynylcarbonate等が用いられるが、この限りでなく紫外線または可視光によりアミノ基との結合が外れるような分子内開裂を示す物質が用いられる。

0018

(S3)で用いられる光は通常350nm前後の光が用いられるが、キャッピング剤や用いる溶媒の種類に依存して最適な光分解性が得られるような波長帯の光が選択される。また、紫外線のような特定光の照射のための光学装置は、市販のものでよい。

0019

(S4)リンカ−分子としては、Disuccinimidyl suberate等のhomobifunctional N−hydroxysuccinimidyl(NHS)estersグル−プ分子やDimethyladipimidate−2−HCL等のhomobifunctional imidoestersグル−プ分子が用いられる。また、本実施の形態で用いたリンカ−分子は分子の両末端にアミノ基と反応するスクイミド基を有しているが、片方は例えばチオ−ル基やカルボキシル基と反応するようなヘテロ反応基を有するリンカ−分子を用いることも可能である。

0020

(S5)で用いられるDNAプロ−ブ10は、DNAプロ−ブ合成時にDNAの5’末端にアミノ基或いはチオ−ル基を付与したものが用いられる。アミノ基或いはチオ−ル基の付与は、市販のDNAシンセサイザ−の専用キットを用いて容易に得られる。DNAプロ−ブに用いる塩基配列は、遺伝学的、生化学的または免疫学的病理学的に有意義な任意の生物学的材料に関するものが選択される。

0021

キャピラリィ4の内壁5に対する(S1)、(S2)、(S3)、(S4)および(S5)の各プロセスでの処理条件は、キャピラリィの材質、形状、サイズやDNAプロ−ブの種類に応じて適宜設定すればよい。

0022

製作したDNAキャピラリィを用いて測定を行うには、注入用開口部2aおよび排出用開口部2bを通じて、試料や試薬等の処理用液体の注入および排出を行えばよい。ここで、排出用開口部2bからの排出時機を種々変更することによって、所望の反応時間を得ることが可能となる。例えば、試料をキャピラリィ4の一端の開口から導入し、TM値から10〜15度低い温度で反応させ、キャピラリィ洗浄のため洗浄液による洗浄操作を行った後、蛍光測定等に用いられる。ここで使用する洗浄液は、使用温度組成を適宜変えることにより、ストリンジェンシ−を調節したものが望ましい。試料の測定に関与するプロセスが、固定化したDNAに対するハイブリダイゼ−ション反応を含む場合には、試料中のDNAはハイブリダイゼ−ション可能な状態に調製された上で、DNAキャピラリィに適用される。試料は、生物学的材料がそれ自体液状であるか適宜の溶液に溶解または懸濁された液状のものをいう。従って、試料の種類は、任意である。

0023

また、本実施の形態では1本のキャピラリィを用いて行った例を示したが、複数本並列させるか束状にして同時に処理することも可能である。複数のキャピラリィの配置は任意であるが、測定に関与する一部または全部のプロセスにとって都合良い配置とするのが好ましい。

0024

図4に本発明のDNAキャピラリィの第二の実施の形態を示す。これは複数のDNAキャピラリィを効率よく製作するに適した形態を示している。図4(a)は全体像、図4(b)は上面から見た図を示している。ガラス又はシリコン等の材料からなる下側基板16aおよび上側基板16bとを接着させた基板16には、下側基板16a上に図示するようなパタ−ンの溝が設けられており、これによって複数のDNAキャピラリィ13a,13b,13c…が形成されている。図4(b)に示すように各々のDNAキャピラリィ13a,13b,13c…の一端は個別出入口14a,14b,14c…の真下まで延在して、各個別出入口14a,14b,14c…を通じて外気に開放されており、他端は合流路としての連結流路17で一本に連結され、共通出入口15の真下まで延在して、この共通出入口15を通じて外気に開放されている。個別出入口14a,14b,14c…および共通出入口15は、例えばスクリ−ン印刷技術を利用して接着剤を所定の位置に薄膜状に形成して接着することにより取り付けることが出来る。DNAプローブ12a,12b,12c…は、図示するように各々のDNAキャピラリィ13a,13b,13c…の流路に沿って流体の流れる方向とは直角な方向に直線上に配置されている。

0025

DNAプローブの固相化プロセスは、第一の実施の形態で述べた光反応を利用した方法が適用できる。第二の実施の形態においてはDNAプローブの固相化に用いる固相化用処理液は共通出入口15から連結流路17を介し、各々のDNAキャピラリィに同時に供給できるとともに、それら処理液の排出もまた共通出入口15を通じて一括して吸引排液が行なわれる。また、紫外線による露光プロセスは、適宜の紫外線照射手段を上方でXY方向に移動可能にし、DNAキャピラリィ13a,13b,13c…に対して直交するライン状にスキャニングしながら照射することにより、一度に全てのDNAキャピラリィ13a,13b,13c…の特定の場所にDNAプロ−ブ12aを形成することが出来る。本実施形態では、下側基板16aが光透過性を有していなくとも、上側基板16bが光透過性であれば、下側基板16aおよび上側基板16bの両壁面が露光されて、環状の固相化が達成される。

0026

次に、ライン状に照射する位置をDNAキャピラリィ13a,13b,13c…平行に所定間隔分だけ移動し、同様のスキャニング照射を行った後にDNAプロ−ブ12bによる固相化を行う。このような操作を繰り返すことにより、図4に示すように独立して配置したDNAプロ−ブ12a,12b,12c…を形成することが出来る。なお、上述した露光プロセスにおいて、スキャニングの軌跡上で露光したくないDNAキャピラリィが有る場合には、例えば紫外線照射手段による照射の有無を適当なスイッチ回路により選択的に切り替えるようにして、スキャニングの際に紫外線が照射されないようにすることにより、各DNAキャピラリィ毎に多様なDNAプロ−ブの組合せで固相化することができる。このことは、多項目の測定対象を測定する上で、必要最小限の項目での測定を可能とするとともに、余分なDNAの固相化を省くのに有効である。各DNAキャピラリィに同種のDNAプロ−ブの組合せを固相化すれば、最大キャピラリィと同数の試料に関する測定を同時に実施できる。

0027

上記の固相化プロセスにおいて、共通出入口15を通じてDNAキャピラリィ13a,13b,13c…に導入された固相化用処理液のうち、特に、DNAプロ−ブを含む液体(図3のS5参照)及びそれに続く洗浄のための洗浄液については個別出入口14a,14b,14c…から排出するようにすれば、異なった液を複数用いる際に起きるコンタミネーションの影響も極力避けることが出来る。また、測定の際には個別出入口14a,14b,14c…から試料等を注入して測定を行うことにより、異なった試料間で各液とが完全に分離された状態で流動させることが出来るので、測定精度が向上する。

0028

DNAキャピラリィのサイズは用途に合わせ種々の大きさに加工することが出来るが、実用的には幅が10μm〜数mm、深さ1μm〜500μm、長さが数mm〜100mm、DNAキャピラリィ間隔10μm〜数mm程度で十分である。但し、反応の効率性を考えると測定対象となるmRNA、またはmRNAから転換したcDNAの拡散速度は毎秒で数μと遅いのでDNAキャピラリィ断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。

0029

DNAキャピラリィ13a,13b,13c…の溝部分の物理的な加工方法としては、エキシマレ−ザエッチングフォトリソグラフィによるエッチング等様々な方法が考えられ、本発明においてはその加工方法を限定するものではないが、以下に、半導体加工技術を用いて溝加工する方法を例にして図5に従って説明する。また、説明の都合上、図4aにおける下側基板16aと上側基板16bとを別々にしてシラン処理したときの場合を例にして説明する。まず、図5aのように、シリコンウエハ−基板20に酸化膜19を5000Å程度形成し、さらにレジスト膜18を形成する。次に、図5bのように、シリコンウエハ−基板20上の溝パタ−ンに応じたマスクを製作し、アライナ−を用いてレジスト露光を行って現像する。次に、図5cのように、パタ−ニングされたレジスト膜18を用いて、酸化膜19のエッチングを行う。エッチングにはフッ酸とフッ化アンモニウムを1:9程度に混合した溶液を用いる。次に、図5dのように、レジスト膜18を除去する。除去には硫酸過酸化水素溶液混合液酸素プラズマによる方法が用いられる。次に、図5eのように、パタ−ニングされた酸化膜19を用いてシリコンウエハ−基板20のエッチングを行う。エッチング方法としては等方性、異方性ウエットエッチングプラズマを用いたドライエッチングなど既存の様々の方法が適用可能である。次に、図5fのように、酸化膜19を除去する。この場合は単に除去するだけであるので、例えばフッ酸溶液を純水で50%に希釈した溶液に浸すことにより行えばよい。次に、図5gのように、エッチングされた溝部分も含めシリコンウエハ−基板20の周囲をシリコン酸化膜21で覆う。

0030

以上で溝の物理的な加工は終了するが、さらに、図5hに示すように、光透過性の蓋23を接合すれば、図4で示したような個別出入口14a,14b,14c…および共通出入口15を設けたDNAキャピラリィのアレイを形成することが出来る。図4aで示された基板16は図5hでは酸化膜21で覆われたシリコンウエハ−基板20に相当する。なお、蓋23の接合は陽極接合法を用いることが出来る。陽極接合法とは500℃程度に加熱しながらシリコンウエハ−基板20と蓋23に1000Vの電圧印加して基板同士を接合する方法で、このために蓋23にはシリコンと熱膨張率のほぼ等しいパイレックスガラス等を用いる必要がある。また、この方法では、必ずしも、蓋23を同様のシラン処理する必要はなく、この場合には、シリコンウエハ−基板20の溝部分のみに光反応によるDNAプロ−ブの固相化が行われて、U字状の固相領域が得られる。しかし、蓋23も同様のシラン処理を行うようにすれば、図4で示したのと同様に環状にDNAプロ−ブを固相化されるので、固相効率および反応感度上有利である。

0031

前記溝加工においてはシリコンウエハー基板20を用いたが、石英やパイレックスガラスなどのガラス基板を用いることもできる。その場合には基板のエッチングマスクを酸化膜19の代わりに金などの金属マスクを用いる。また、接合もそのまま陽極接合法を用いることは出来ないが、間にシリコン薄膜を形成することにより可能となる。シリコンウエハ−基板20のエッチングマスクに用いた酸化膜19もこれに限定されることなく、窒化シリコン膜アルミナ等の膜が利用できる。

0032

このように形成されたDNAキャピラリィアレイには次のような作用効果がある。一度に大量のDNAキャピラリィが形成できるため、コストを低価格にすることが出来る。また、キャピラリィが形成する流路に対して紫外線照射による脱保護を行うので、DNAプロ−ブをキャピラリィの内壁に効率良く固定化でき、試料の測定感度が向上する。また、多くの試料を測定する際にもDNAキャピラリィが集積化されているため、例えば、個別出入口14a,14b,14c…からそれぞれ異なる試料を導入して、所要時間インキュ−ベションして生物学的反応をさせた後に、共通出入口15から一括して試料を回収除去し、以後、適宜、洗浄液や測定用試薬を同様の流れで処理できるから、自動化し易くひいては測定処理能力の高い装置を構成することが出来る。

0033

なお、本発明のDNAキャピラリィは、上述した実施の形態にとらわれることなく様々な変形が可能である。例えば、上述した各実施の形態では、その製造および試料測定に当って、いずれも互いに異なる開口部を用いて注入と排出とを行っているので、各々の液体については必ず一方向の流れが存在するが、場合によっては注入時の開口部と同じ開口部から排液するようにて、注入時の流れとは反対方向に戻すようにしてもよい。また、第一の実施形態では、キャピラリィ4への固相化処理用液体および試料測定用液体の注入を、ピペッタ−のような吐出手段を利用するように説明したが、所要量の固相化処理用液体または試料測定用液体を各々収容している容器に直接キャピラリィ4の先端(注入用開口部2a)を漬けるだけで毛管力で自然注入できるし、排液についても、特別な吸引装置を利用しなくとも高吸水性材料スポンジ高吸水性ポリマ−等)に先端(排出用開口部2b)を接触させるだけで自然排液できるので、用手法・自動化ともに扱い易い。また、第一の実施形態のキャピラリィ4は、横に寝せた状態でも縦向きに立てて使用しても同様の作用効果が得られる。縦向きにする場合には、注入用開口部2a側を上側にした姿勢のまま、上方からの注入を行うとともに排出用開口部2bを通じて下方からの排液を行うようにすることもできる。

0034

また、第二の実施形態では、各々のDNAキャピラリィ13a,13b,13c…の一端を連結流路17で連結しているが、各DNAキャピラリィ13a,13b,13c…を放射状に配置して一端部をいずれも中心付近で連結することで、各流路が合流する部分のみからなる合流路とし、他端部を同心円上に配置することも可能である。また、複数のDNAキャピラリィ13a,13b,13c…を連結流路17で連結せずに、各々独立した流路で構成するようにすれば、複数の試料を効率良く処理する集積化アレイを提供できる。

0035

また、本発明のDNAキャピラリィは、試料測定以外にも、DNAまたはmRNAの分離・精製にも利用可能である。また、本発明のDNAキャピラリィに固相化する対象は、抗原抗体反応に関与するタンパクを構成するものであっても構わない。また、試料測定に当っては、本件出願前に公知であるDNAプロ−ブを用いた任意の反応原理から適宜選択すればよい。このとき、測定に必要な種々の試薬、例えば蛍光、化学発光物質発色物質等の標識試薬は公知の化学分析技術にしたがって利用してよい。必要ならば、選択した反応原理に適した市販の分析装置によって、自動測定することも可能である。

0036

上述した実施形態に述べたように、本発明のDNAキャピラリィは、それ自体が液体を流す流路を形成しているため、上述した固相化、測定、分離等の各種反応や洗浄操作も容易に行え、液体処理装置のような種々の液体を連続的に処理するような装置に接続するだけで容易に一連の操作を行わせることが出来る。また、予め所望の塩基配列からなるDNAプロ−ブを用いることにより、1回の光照射でDNAプロ−ブを固相化できるため、DNAプロ−ブへのダメ−ジをきわめて少なくすることが出来、良好な固相化状態を保てるという利点がある。また、光反応を利用することで、複数のDNAプロ−ブが流路に沿って直列して環状に且つ縞状に配置されているので、試料を流路中に導入するだけで複数のDNAプロ−ブと同時に且つ効率良く結合反応させることができる。さらに、DNAプロ−ブを固相化した表面はキャピラリィの内面に保護されるため、汚染の影響も少なくより一層のハンドリングの容易さが期待できる。

発明の効果

0037

20塩基以上の長さのDNAプローブを安定に固相化することができる。また、固相化されたDNAプローブを用いた測定を行う際にも、必要な各処理用の流体、例えば試料や洗浄液のような各種液体の取り扱いが簡単である。また、合流路を複数の流路と連結させれば、この合流路を通じて各種処理用液体が一括して導入されるか或いは回収されるので、処理能力が高まる。また、光透過性の流路に光反応を適用することで、流路内の固相化面積を増大させることができから、微量の試料でもって効率良い測定等を実行できる。

図面の簡単な説明

0038

図1従来のDNAプローブの固相化方法を説明するための図。
図2本発明のDNAキャピラリィの第一の実施の形態を示す図。
図3DNAプロ−ブをキャピラリィの内壁に固定化する方法を説明するための図。
図4本発明のDNAキャピラリィの第二の実施の形態を示す図。
図5本発明のDNAキャピラリィにおいて半導体加工技術を用いて溝加工する方法を説明するための断面図。

--

0039

1 DNAプロ−ブ
2a注入用開口部
2b排出用開口部
4キャピラリィ
5内壁
13 DNAキャピラリィ
14 個別出入口
15 共通出入口
16基板
17 連結流路

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ