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解決手段

核内受容体TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤

効果

本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、エストロジェン依存的に発症あるいは進行する疾患に対する治療または予防剤となる。とりわけ本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、骨由来細胞において効果を発揮するものであるため、エストロジェンの作用により進行する骨疾患である骨肉腫、あるいは乳癌由来の骨転移癌等の、有効な治療または予防剤となるものである。

概要

背景

エストロジェンアンドロジェン等のステロイド骨格を有するリガンドや、レチノイン酸ビタミンDのような脂溶性の高いリガンドは、細胞核内局在する転写因子型の受容体、すなわち「核内受容体」を介することによって、これらリガンドの標的遺伝子発現誘導、あるいは抑制している(蛋白質核酸酵素Vol.41,No.8, p1265(1996)。すなわち核内受容体は、リガンド依存性の転写因子として機能しており、前記ステロイドビタミンのようなリガンドの結合により活性化された核内受容体は、リガンド特異的な標的遺伝子に結合し、該遺伝子の転写を誘導あるいは抑制している(加茂明著、核内レセプター情報伝達土社、1994年)。

これら核内受容体は一次構造上の相同性が高く、とりわけ核内受容体タンパクの中心に位置するDNA結合領域C領域とも呼ぶ)は、Znフィンガー構造と呼ばれる特徴的な構造を有しており、その相同性は、全ての核内受容体の間で50%以上にも及んでいる。このような、核内受容体に共通して見られる特徴的な構造及びその相同性から、これら核内受容体遺伝子群は、遺伝子スーパーファミリーを形成していると考えられている(加藤茂明著、核内レセプターと情報伝達、羊土社、1994年)。近年の遺伝子クローニング成果により、既知の核内受容体との高い相同性を利用して、構造上「核内受容体」と判断される因子の遺伝子が非常に数多くクローニングされてきた。これらのうちリガンドが未知、ないしは存在しないと考えられる因子については“オーファン受容体”と呼ばれている。これらオーファン受容体の生体内での機能は、未だ未知のものが多いが、遺伝子ノックアウトから機能が明らかにされた例(SF-1(steroidgenic factor-1))、生体内でのリガンドが同定されたために機能の推測が可能になった例(PPARα,PPARγ; LXR, FXR,RXR)等がある。

TR4は、TAK1とも呼ばれているものであり、2つのグループが同時期にクローニングに成功したオーファン受容体である(MOL. ENDO., Vol.8,No12,p1667-1680(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.91,p6040-6044(1994)、Gene,163,p239-242(1995))。現在のところリガンドは未知であり、また生体内での機能も不明である。しかし最近になって該TR4は、甲状腺ホルモン、レチノイン酸及びビタミンDの情報伝達を抑制するという作用を有することが明らかとなってきた。すなわち該TR4は、甲状腺ホルモン、レチノイン酸及びビタミンDの標的遺伝子に結合することで、これらリガンドの受容体が標的遺伝子に結合するのを拮抗阻害し、その結果、これらリガンドの情報伝達を抑制することが明らかとなってきた(Biochem.Biophys.Res.Commun.211,p83-91,1995)。一方、同文献中では、該TR4はエストロジェン標的遺伝子内のエストロジェン応答配列に対しては結合しないことが示されている。従って該TR4は、上記甲状腺ホルモン等に対する結果と異なり、エストロジェンの情報伝達は抑制しないことが示唆されている。

概要

核内受容体TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤

本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、エストロジェン依存的に発症あるいは進行する疾患に対する治療または予防剤となる。とりわけ本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、骨由来細胞において効果を発揮するものであるため、エストロジェンの作用により進行する骨疾患である骨肉腫、あるいは乳癌由来の骨転移癌等の、有効な治療または予防剤となるものである。

目的

本発明は、TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤を提供することを目的とする。すなわち本発明は、TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有し、骨肉腫、または乳癌由来の骨転移癌等の疾患を治療または予防することができる、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

核内受容体TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、抗エストロジェン遺伝子治療剤

請求項2

エストロジェン標的遺伝子転写促進活性を抑制することを特徴とする、請求項1記載の抗エストロジェン遺伝子治療剤。

請求項3

由来細胞において特異的に作用することを特徴とする、請求項1または2記載の抗エストロジェン遺伝子治療剤。

請求項4

骨肉腫または乳癌由来の骨転移癌治療または予防することを特徴とする、請求項3記載の抗エストロジェン遺伝子治療剤。

技術分野

595

背景技術

0001

本発明は、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤に関する。さらに詳しくは、核内受容体TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有し、エストロジェンによるエストロジェン標的遺伝子転写促進活性を抑制することを特徴とする、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤に関する。本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、エストロジェン依存的に発症あるいは進行する疾患に対する治療または予防剤となる。とりわけ本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、骨由来細胞において効果を発揮するため、エストロジェンの作用により進行する骨疾患、すなわち骨肉腫、あるいは乳癌由来の骨転移癌等の、有効な治療または予防剤となるものである。

0002

エストロジェン・アンドロジェン等のステロイド骨格を有するリガンドや、レチノイン酸ビタミンDのような脂溶性の高いリガンドは、細胞核内局在する転写因子型の受容体、すなわち「核内受容体」を介することによって、これらリガンドの標的遺伝子の発現誘導、あるいは抑制している(蛋白質核酸酵素Vol.41,No.8, p1265(1996)。すなわち核内受容体は、リガンド依存性の転写因子として機能しており、前記ステロイドビタミンのようなリガンドの結合により活性化された核内受容体は、リガンド特異的な標的遺伝子に結合し、該遺伝子の転写を誘導あるいは抑制している(加茂明著、核内レセプター情報伝達土社、1994年)。

0003

これら核内受容体は一次構造上の相同性が高く、とりわけ核内受容体タンパクの中心に位置するDNA結合領域C領域とも呼ぶ)は、Znフィンガー構造と呼ばれる特徴的な構造を有しており、その相同性は、全ての核内受容体の間で50%以上にも及んでいる。このような、核内受容体に共通して見られる特徴的な構造及びその相同性から、これら核内受容体遺伝子群は、遺伝子スーパーファミリーを形成していると考えられている(加藤茂明著、核内レセプターと情報伝達、羊土社、1994年)。近年の遺伝子クローニング成果により、既知の核内受容体との高い相同性を利用して、構造上「核内受容体」と判断される因子の遺伝子が非常に数多くクローニングされてきた。これらのうちリガンドが未知、ないしは存在しないと考えられる因子については“オーファン受容体”と呼ばれている。これらオーファン受容体の生体内での機能は、未だ未知のものが多いが、遺伝子ノックアウトから機能が明らかにされた例(SF-1(steroidgenic factor-1))、生体内でのリガンドが同定されたために機能の推測が可能になった例(PPARα,PPARγ; LXR, FXR,RXR)等がある。

発明が解決しようとする課題

0004

TR4は、TAK1とも呼ばれているものであり、2つのグループが同時期にクローニングに成功したオーファン受容体である(MOL. ENDO., Vol.8,No12,p1667-1680(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.91,p6040-6044(1994)、Gene,163,p239-242(1995))。現在のところリガンドは未知であり、また生体内での機能も不明である。しかし最近になって該TR4は、甲状腺ホルモン、レチノイン酸及びビタミンDの情報伝達を抑制するという作用を有することが明らかとなってきた。すなわち該TR4は、甲状腺ホルモン、レチノイン酸及びビタミンDの標的遺伝子に結合することで、これらリガンドの受容体が標的遺伝子に結合するのを拮抗阻害し、その結果、これらリガンドの情報伝達を抑制することが明らかとなってきた(Biochem.Biophys.Res.Commun.211,p83-91,1995)。一方、同文献中では、該TR4はエストロジェン標的遺伝子内のエストロジェン応答配列に対しては結合しないことが示されている。従って該TR4は、上記甲状腺ホルモン等に対する結果と異なり、エストロジェンの情報伝達は抑制しないことが示唆されている。

課題を解決するための手段

0005

本発明は、TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤を提供することを目的とする。すなわち本発明は、TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有し、骨肉腫、または乳癌由来の骨転移癌等の疾患を治療または予防することができる、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤を提供することを目的とする。

0006

本発明者らは、核内受容体TR4の機能を解明するために、まずウサギ心臓cDNAライブラリーを、核内受容体間で非常に相同性の高いDNA結合領域部分をプローブに用いてスクリーニングしたところ、従来報告されているラットマウスおよびヒト型TR4との相同性から、ウサギTR4のcDNAのクローニングに成功し、該タンパク質をTR4−0と命名した。さらに本発明者らは、C末側に位置するリガンド結合領域欠如したTR4−0のアイソフォームをもクローニングし、該タンパク質をTR4−1と命名した。これらTR4−0(TR−4)及びTR4−1(TR−4変異体)のcDNAを用いてエストロジェンに対する作用を検討したところ、予想外にも、該TR4−0及びTR4−1がエストロジェンの情報伝達を抑制すること、すなわちエストロジェン受容体を介して該エストロジェンが標的遺伝子の転写を促進する活性を、TR4またはその変異体が抑制することを、本発明者らは初めて見出した。さらに該抑制作用は、骨由来の細胞(骨肉腫由来細胞)おいては見られるが、腎臓由来の細胞においては見られないことも、本発明者らは明らかにした。

0007

ところでエストロジェンは、脂肪代謝骨代謝において、女性で特に重要な役割を果たしており、とりわけ老年期婦人に多い骨粗鬆症がエストロジェンの欠乏によることが判明して以来、骨粗鬆症の治療薬として頻用されている薬剤である(Bilezikian,JPら著、Principles of Bone Biology,Academic Press,p507-520,1996)。しかしながら一方で、該エストロジェンは、乳癌・子宮癌の発ガンリスクを上昇させる原因因子としても知られている(本俊夫、中利孝編、骨粗鬆症、羊土社、p162-163,1995)。また乳ガンはエストロジェン受容体数が多く、エストロジェン依存的に増殖する癌であることが、ヒト乳癌由来の細胞株を用いた研究により明らかにされている( Ann.New York Acad.Sci.761,Edited by Henderson,D etal 1995)。さらに乳癌は、骨に転移する確率が非常に高いことも知られており、このような乳癌由来の骨転移癌も、エストロジェン依存的に増殖すると考えられている(Yoneda,T.etal,Breast Cancer Res. Treat.32,73-84,1994 )。また、閉経期以前の血中エストロジェン濃度の高い女性では骨肉腫の増殖が助長される傾向にあることから、このような骨肉腫の増殖も、エストロジェン依存的であるものと予想されている( Yoneda,T.etal,Breast Cancer Res. Treat.32,73-84,1994 )。

0008

従って、上記TR4またはその変異体をコードするDNAを、抗エストロジェン遺伝子治療剤として用いることにより、上記乳癌、子宮癌、乳癌由来の骨転移癌、あるいは骨肉腫等の、エストロジェン依存的に発症あるいは進行する疾患に対する有効な治療または予防薬となる。とりわけTR4及びTR4変異体は、骨由来の細胞においてエストロジェンの情報伝達を抑制することが、本発明においてはじめて明らかとなった。従って本発明の遺伝子治療剤は、上記疾患のうちでも特に乳癌由来の骨転移癌、あるいは骨肉腫に対する有効な治療又は予防薬となる。

0009

ちなみに、骨肉腫の治療には、現在、アンチエストロジェンが用いられているが、全身性作用を引き起こすため、血中ホルモン濃度への影響など他臓器への悪影響が懸念されている(Ann.New York Acad.Sci.761,Edited by Henderson,D etal 1995)。その点、本発明のTR4あるいはその変異体は骨への特異性が高いため、他臓器への悪影響が少ない状態で、骨肉腫を治療することが期待できる。本発明は、以上のような知見にもとづき完成するに至ったものである。

発明を実施するための最良の形態

0010

すなわち本発明の要旨は、
1)核内受容体TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、抗エストロジェン遺伝子治療剤、
2) エストロジェン標的遺伝子の転写促進活性を抑制することを特徴とする、前記1)記載の抗エストロジェン遺伝子治療剤、
3) 骨由来の細胞において特異的に作用することを特徴とする、前記1)または2)記載の抗エストロジェン遺伝子治療剤、並びに
4)骨肉腫または乳癌由来の骨転移癌を治療または予防することを特徴とする、前記3)記載の抗エストロジェン遺伝子治療剤、に関する。

0011

本発明においてTR4とは、TAK1とも呼ばれるものであり、例えばウサギ、ラット、マウス、あるいはヒトのTR4を挙げることができる(MOL. ENDO.,Vol.8,No12,p1667-1680(1994)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.91,p6040-6044(1994)、Gene,163,p239-242(1995)。これら本発明のTR4は、前記文献等において開示された塩基配列よりTR4特異的なプライマーあるいはプローブを作製し、該プライマーあるいはプローブを用いてヒトの視床下部前立腺、あるいは精巣由来のcDNAライブラリー等をスクリーニングすることにより、容易にクローニングすることができる。これらクローニングの方法は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に詳しく述べられており、具体的には、ハイブリダイゼーションを用いる方法、あるいはPCRを用いる方法等が挙げられる。

0012

本発明において「TR4変異体」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質、あるいは生体内に存在するTR4のアイソフォーム等のうち、本発明において見出されたエストロジェンの情報伝達抑制作用、すなわちエストロジェンによるエストロジェン標的遺伝子の転写促進性に対する抑制作用、を有するものを指す。該変異体をコードするDNAは、例えば部位特異的突然変異誘発(Methodsin Enzymology, 100, 448-(1983))やPCR法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edt.,15章, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、PCRA Practical Approach, IRL Press 200-210(1991))等の手法により、当業者ならば容易に作製することができる。又、生体内に存在するアイソフォームの場合は、上記の如くTR4特異的なプライマーあるいはプローブを用い、ヒトの精巣、あるいは心臓等のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。

0013

TR4変異体の具体例として、例えば配列番号:2のTR4のアミノ酸配列のうち、第236位から246位までがフレームシフトのため異なったアミノ酸置換され、かつ第247位以降が欠失したTR4のアイソフォームが挙げられる。核内受容体は、その構造上の特徴から、A領域〜F領域より構成されており、そのうちA/B領域は転写促進に、C領域はDNA結合に、そしてE領域はリガンドとの結合に関与することが判明している。上記TR4アイソフォームは、E/F領域の一部が異なったアミノ酸に置換しており、また該置換部位以降のアミノ酸が欠失したものである。該アイソフォームには、エストロジェンの情報伝達抑制作用の存することが判明していることから、該アイソフォームをもとにして、より活性の強いTR4変異体を作製することも可能である。これ以外にも、たとえばC領域のみを保持するTR4変異体、あるいはA/B領域のみを保持するTR4変異体等に、上記抑制作用の存することが考えられる。

0014

本発明において「エストロジェン標的遺伝子」とは、公知のエストロジェン標的遺伝子、すなわちPS2、カテプシンDストレシン3、IGF−1、IGFBP3、クレアチンキナーゼビテロジェニンIL−6、プロゲステロン受容体あるいはオボアルブミンなどの遺伝子が挙げられ、より好ましくは、PS2、カテプシンD、及びストレメシン3が挙げられる。すなわちPS2は、ヒト乳癌由来のMCF−7細胞より単離されたものであり、その発現はエストロジェン依存的であり、現在、悪性癌の1つのマーカー遺伝子として使われている。また、プロテアーゼであるカテプシンDは、癌細胞浸潤に重要であることが示唆されている。そしてストレメシン3は、エストロジェン依存的な悪性乳癌にのみ発現していることが知られている(加藤茂明著、核内レセプターと情報伝達、羊土社、1994年)。このように、これらPS2、カテプシンD及びストレメシン3は、いずれもエストロジェン依存的な癌において特異的に作用することが考えられており、本発明の遺伝子治療剤はこれらの標的遺伝子の転写を抑制するのであるから、これらの癌に対する有効な治療または予防剤となる。

0015

本発明におけるTR4あるいはその変異体の作用、すなわちエストロジェンによるエストロジェン標的遺伝子の転写促進活性に対する抑制作用は、例えばCAT酵素活性指標にした以下の手法により測定することができる。

0016

すなわちまず、細胞導入用のDNAとして、1)エストロジェン受容体発現ベクター、2)エストロジェン応答配列−CATレポータープラスミド、3)TR4あるいはTR4変異体発現ベクター、を用意する。ここでエストロジェン受容体発現ベクターは、既報のエストロジェン受容体cDNA配列(Nature 320,134-139 1986;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,5925-5930 1996)をもとに適当なプライマーを作製し、PCR等の方法により該cDNAをクローニングし、しかる後に、例えばpSG5(ストラタジーン社)等の発現ベクターに連結して構築が可能である。また、エストロジェン応答配列−CATレポータープラスミドは、例えばエストロジェンの標的遺伝子の一つであるアフリカツメガエルビテロジェニン遺伝子内に存在するエストロジェン応答配列にCATレポーター遺伝子を結合したプラスミドが挙げられ、このようなビテロジェニン遺伝子エストロジェン応答配列−CATレポータープラスミドは、既報のビテロジェニン遺伝子内エストロジェン応答配列(Nucl.Acids.Res. 12 8611-8626 1984;Cell 46 1053-1061 1986)をCATレポータープラスミド(プロメガ社)の上流に組み込むこと等により作製できる。また、被験サンプルであるTR4あるいはTR4発現ベクターは、上記のようにしてクローニング、あるいは改変されたTR4あるいはTR4変異体をコードするDNAを、例えばpSG5(ストラタジーン社)等の発現ベクターに連結することにより作製できる。以上のような導入用のDNAに加え、導入効率補正用に、β−ガラクトシダーゼ発現ベクター(PCH110;ファルマシア社製)をも導入することが好ましい。

0017

次に、上記の導入用DNA混合物を細胞内に導入する。細胞としては、例えば骨肉腫由来の細胞であるUMR-106(大日本製薬社)が挙げられる。その他にも、例えば乳癌由来の細胞であるMCF−7(大日本製薬社)が挙げられる。細胞へのDNAの導入法としては、例えばリン酸カルシウム法(横田崇・新井賢一編、遺伝子導入と発現・解析法、羊土社、1994)が挙げられる。導入後、適当な時間をおいて、培地中にエストロジェンを添加する。該エストロジェンとしては、例えば17β-エストラジオール(Sigma)が用いられる。その後、適当な時間をおいて、CAT酵素活性を測定する。該CAT酵素活性は即ち、エストロジェンが細胞内でエストロジェン受容体と結合し、該結合体が先のエストロジェン応答配列に結合することで、該応答配列に連結されたCATレポーター遺伝子の転写が促進され、CAT酵素活性が検出されるというメカニズム基くものである。このCAT酵素活性の測定法としては、例えば加藤らの方法(Cell, 68, 731-743, 1992)が挙げられる。以上の測定法に、種々作製したTR4変異体をコードするDNAを供することにより、エストロジェン標的遺伝子の転写促進活性を抑制する、本発明のTR4変異体を容易に選択することができる。

0018

本発明のTR4またはその変異体は、上記のように、エストロジェン標的遺伝子の転写促進活性に対し抑制作用を有するものである。従って、該TR4またはその変異体をコードするDNAを医薬の有効成分とすることにより、抗エストロジェン作用を有する遺伝子治療剤を調製することができる。このような抗エストロジェン遺伝子治療剤を投与すると、細胞内でTR4またはその変異体が高発現し、該細胞内におけるエストロジェンの作用を抑制することが考えられる。従って本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、前記もしたように、エストロジェン依存的に発症あるいは進行する疾患である、乳癌、子宮癌、乳癌由来の骨転移癌、あるいは骨肉腫等の、治療又は予防剤となる。とりわけ本発明のTR4またはその変異体は、骨由来の細胞においてエストロジェンの作用を抑制したことから、上記乳癌由来の骨転移癌、あるいは骨肉腫等の、有効な治療又は予防薬となる。

0019

本発明の遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法(日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、実験医学増刊,12(15)(1994)、実験医学別冊遺伝子治療基礎技術」,羊土社(1996))のいずれの方法も適用することができる。

0020

ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルスアデノウイルスアデノ関連ウイルスヘルペスウイルスワクシニアウイルスポックスウイルスポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス、又はRNAウイルスに、TR4あるいは変異TR4をコードするDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。

0021

また本発明の遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、DNAを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でDNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある(日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48(1994)、実験医学増刊,12(15)(1994))。in vivo法がより好ましい。

0022

in vivo法により投与される場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルスHVJ)−リポソーム等)の形態にした場合は、懸濁剤凍結剤遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。

0023

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

0024

参考例1
ウサギTR4cDNAのクローニング
TR4の全長cDNAは、ウサギ心臓cDNAライブラリー(λZAPII)(ストラタジーン社)を、核内受容体全般において保存されているDNA結合領域内のオリゴヌクレオチドプライマー(5-GAA(G/A)AA(G/A)CC(C/T)TT(G/A)CA(G/A)CC(C/T)TC(G/CA-3)をプローブとするプラークハイブリダイゼーションにより取得した。ハイブリダイゼーションは42℃、18時間、6×SSC(1×SSC=0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、1×デンハルト液(=0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン、0.02%フィコール400)、0.1%SDS、100μg/ml変性サケ精子DNAの液中、及び2×106cpm/mlの32Pで標識した上記プローブ(T4ポリヌクレオチドキナーゼによる5末端標識)を用いて行なった。ハイブリダイゼーション後、室温で2回、6×SSC、0.1%SDS中で10分間洗浄した後、更に、室温で1回、4×SSC、0.1%SDS中、10分間洗浄を行なった。ポジティブクローンは、インビボエクサション法(野島博編、遺伝子ライブラリー作製法、羊土社、1994)によりpBluescriptベクター(ストラタジーン社製)に変換後、ABIDNAシークエンサーにより塩基配列を決定した。

0025

その結果、一つのcDNAクローンが、596アミノ酸からなる新規なタンパク質をコードしていた。ホモロジー検索により、この新規なタンパク質はウサギのTR−4であることが判明し、該TR−4をTR4−0と命名した。配列決定された塩基配列を配列番号:1に、またアミノ酸配列を配列番号:2に記載する。さらに、前記配列番号:2のアミノ酸配列の第236位から246位までが、フレームシフトのために、Asp-Ala-Cys-Glu-His-Pro-Ala-Ala-Phe-Asp-Thrに置換され、かつ第247位以降が欠失した別のcDNAクローンも単離され、TR4−1と命名した。該TR4−1は、DNAレベルでは、配列番号:1の第705位〜第727位の部分の欠失のみ見られ、その他は全く相同なことから、TR4のアイソフォームであると判断された。

0026

参考例2
発現ベクターの構築
上記でクローニングされたTR4−0及びTR4−1の発現ベクターは、動物細胞発現ベクターであるpSG5(ストラタジーン社)を用いて構築した。すなわち、TR4−0及びTR4−1の全長のcDNAをpSG5のEcoRIイトに挿入するために、N末端側とC末端側にEcoRIサイトをPCR反応により付加した。その際、開始コドンのATGの直前にKozak配列を導入し、翻訳効率を上げるようにした。構築されたプラスミドはDNAシークエンサーにより塩基配列を確認後、塩化セシウム密度勾配法で超遠心することにより、大量調製した。

0027

実施例1
TR4−0及びTR4−1の、エストロジェン作用抑制率の測定
遺伝子導入用細胞であるラット骨肉腫由来のUMR-106細胞(大日本製薬社製)およびサル腎由来のCOS-1細胞(大日本製薬社製)は、デキストランをコートしたチャコ-ル処理済みの牛胎児血清(GIBCO)を5%含むフェノ-ルレッド不含DMEM培地(COSMO BIO社製)で培養した。UMR-106細胞への導入DNA混合物として、0.5μgエストロジェン受容体αあるいはβ発現ベクタ−(発明の実施の形態参照)、1μgアフリカツメガエルビテロジェニンエストロジェン応答配列−CATレポ-タ-プラスミド(発明の実施の形態参照)、4.5μg β-ガラクトシダ-ゼ発現ベクタ- (PCH110;ファルマシア社製)、及び、先の参考例2で作製した0.5μgTR4−0発現ベクターあるいは25μgTR4−1発現ベクターあるいはこれら両方の発現ベクター、を混合した。またコントロールとして、前記TR4発現ベクターを含まないDNA混合物も作製した。これらのDNA混合物に、pBluscribeM13+プラスミド(ストラタジーン社製)を加えて各デイッシュ当たりのDNA量が計31.5μgになるようにそろえた後、先のUMR-106細胞が9cmペトリデイッシュで40-60%コンフルエントになった時点で、リン酸カルシウム法により先のDNA混合物を導入した。

0028

一方COS-1細胞においては、0.2μgエストロジェン受容体発現ベクタ-、0.4μgアフリカツメガエルビテロジェニンエストロジェン応答配列-CATレポ-タ-プラスミド、1.5μg β-ガラクトシダ-ゼ発現ベクタ-、及び、先の参考例2で作製した0.2μgTR4−0発現ベクターあるいは10μgTR4−1発現ベクターあるいはこれら両方の発現ベクター、を混合した。またコントロールとして、前記TR4発現ベクターを含まないDNA混合物も作製した。これらのDNA混合物に、pBluscribeM13+プラスミド(ストラタジーン社製)を加えて各デイッシュ当たりのDNA量が計12.5μgになるようにそろえた後、先のCOS-1細胞が6cmペトリデイッシュで40-60%コンフルエントになった時点で、リン酸カルシウム法により先のDNA混合物を導入した。

0029

両細胞とも遺伝子導入後24時間培養し、培地交換を行った後、最終濃度が10-9Mとなるように17ベ-タ-エストラジオ-ル(Sigma社製)を添加した。ここで17ベ-タ-エストラジオ-ルはエタノールに溶解し、最終濃度が0.1%エタノールとなるようにした。また薬剤を含まないコントロールも0.1%エタノールとなるように調製した。さらに24時間培養後、細胞をかきとり、常法によりβ-ガラクトシダ-ゼ活性を測定してDNAの細胞導入効率を確認した後、エストロジェン受容体の活性化に伴うCAT酵素の活性を調べた。すなわち、加藤らの方法(Cell, 68 731-743, 1992)に従って、細胞抽出液1単位(UMR-106の場合)または30単位(COS-1の場合)を用いて、アセチルCoA(Sigma社製)および14C−クロラムフェニコール(Amersham社製)を反応させ、シリカゲル薄層クロマトグラフィー上で分離されたアセチル14C−クロラムフェニコールおよび14C−クロラムフェニコールのスポット放射能活性を、イメージアナライザー(BAS-2000; 富士写真フィルム社製)により定量し、アセチル14C−クロラムフェニコールの生成率を計算した。その際、リガンドとして0.1%エタノールのみを含む培地を用いて実験した結果をコントロール値とし、これに対する相対比により、TR4−0及びTR4−1のエストロジェン作用抑制率を測定した。

0030

結果を表1及び表2に示す。表中、ERα(β)はエストロジェン受容体α(β)発現ベクターを、ERE−CATはアフリカツメガエルビテロジェニンエストロジェン応答配列−CAT レポ-タ-プラスミドを、PCH110はβ-ガラクトシダ-ゼ発現ベクタ-を、BSMはpBluscribeM13+プラスミドを、TR4−0はTR4−0発現ベクターを、TR4−1はTR4−1発現ベクターを、それぞれ指す。表1及び表2により、COS−1細胞においては、TR4−0あるいはTR4−1によるエストロジェン作用抑制効果は見られなかったが、UMR−106細胞においては、TR4−0あるいはTR4−1は、エストロジェンの作用を抑制することが判明した。

0031

発明の効果

0032

0033

本発明により、核内受容体TR4またはその変異体をコードするDNAを有効成分として含有する、新規な抗エストロジェン遺伝子治療剤が提供される。本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、エストロジェン依存的に発症あるいは進行する疾患に対する治療または予防剤となる。とりわけ本発明の抗エストロジェン遺伝子治療剤は、骨由来の細胞において効果を発揮するものであるため、エストロジェンの作用により進行する骨疾患である骨肉腫、あるいは乳癌由来の骨転移癌等の、有効な治療または予防剤となるものである。

0034

配列番号:1
配列の長さ:1791
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の特徴
特徴を決定した方法:E
配列
ATGACCAGCCCC TCC CCGCGCATCCAG ATC ATC TCC ACC GAC TCCACG48
Met Thr Ser Pro Ser Pro Arg Ile Gln Ile Ile Ser Thr Asp Ser Thr
5 10 15
GTA GCC TCTCCTCAG CGC ATT CAG ATT GTG ACT GAC CAG CAG ACA GGA 96
Val Ala Ser Pro Gln Arg Ile Gln Ile Val Thr Asp Gln Gln Thr Gly
20 25 30
CAG AAG ATA CAG ATA GTC ACA GCT GTG GAC GCC TCC GGA TCC CCC AAA 144
Gln Lys Ile Gln Ile Val Thr Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Pro Lys
35 40 45
CAG CAGTTCATT CTG ACC GGT CCA GAT GGG GCT GGA ACC GGG AAG GTG 192
Gln Gln Phe Ile Leu Thr Gly Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Lys Val
50 55 60
ATC CTG GCT TCT CCA GAG ACA ACC AGC GCC AAG CAG CTC ATA TTC ACC 240
Ile Leu Ala Ser Pro Glu Thr Thr Ser Ala Lys Gln Leu Ile Phe Thr
65 70 75 80
ACC TCA GAC AAC CTT GTC CCT GGC AGG ATC CAG ATC GTC ACG GAT TCT 288
Thr Ser Asp Asn Leu Val Pro Gly Arg Ile Gln Ile Val Thr Asp Ser
85 90 95
GCT TCT GTG GAG CGA TTG CTG GGC AAG GCG GAC GTG CAG CGG CCC CAG 336
Ala Ser Val Glu Arg Leu Leu Gly Lys Ala Asp Val Gln Arg Pro Gln
100 105 110
GTG GTG GAG TACTGTGTG GTCTGCGGC GAC AAA GCC TCT GGC CGT CAC 384
Val Val Glu Tyr Cys Val Val Cys Gly Asp Lys Ala Ser Gly Arg His
115 120 125
TATGGG GCT GTC AGT TGT GAA GGT TGC AAA GGT TTC TTC AAA AGG AGC 432
Tyr Gly Ala Val Ser Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Ser
130 135 140
GTG AGG AAA AAT CTG ACC TAC AGC TGC CGG AGC AAC CAA GAC TGC ATC 480
Val Arg Lys Asn Leu Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Asn Gln Asp Cys Ile
145 150 155 160
ATC AAT AAACATCAC CGC AAT CGC TGT CAGTTTTGC CGG CTG AAA AAA 528
Ile Asn Lys His His Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg Leu Lys Lys
165 170 175
TGC TTG GAG ATG GGC ATG AAA ATG GAA TCT GTG CAG AGT GAA CGG AAG 576
Cys Leu Glu Met Gly Met Lys Met Glu Ser Val Gln Ser Glu Arg Lys
180 185 190
CCC TTT GAC GTG CAG CGG GAG AAA CCA AGC AAT TGT GCCGCATCA ACT 624
Pro Phe Asp Val Gln Arg Glu Lys Pro Ser Asn Cys Ala Ala Ser Thr
195 200 205
GAG AAA ATC TAT ATC CGG AAG GAC CTG AGG AGT CCT CTG ATA GCC ACC 672
Glu Lys Ile Tyr Ile Arg Lys Asp Leu Arg Ser Pro Leu Ile Ala Thr
210 215 220
CCC ACC TTT GTG GCA GAC AAA GAT GGA GCA AGA CAA ACA GGT CTT CTT 720
Pro Thr Phe Val Ala Asp Lys Asp Gly Ala Arg Gln Thr Gly Leu Leu
225 230 235 240
GAT CCA GGG ATG CTT GTG AAC ATC CAG CAG CCT TTG ATA CGT GAG GAT 768
Asp Pro Gly Met Leu Val Asn Ile Gln Gln Pro Leu Ile Arg Glu Asp
245 250 255
GGT ACGGTTCTC CTG GCC ACG GAT TCC AAG GCA GAA ACA AGC CAG GGA 816
Gly Thr Val Leu Leu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Glu Thr Ser Gln Gly
260 265 270
GCT CTG GGC ACA CTG GCA AAC GTA GTG ACC TCC CTT GCC AAC CTG AGT 864
Ala Leu Gly Thr Leu Ala Asn Val Val Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ser
275 280 285
GAG TCC TTG AAC AAC GGT GAC ACT TCA GAG ATC CAG CCA GAG GAC CAA 912
Glu Ser Leu Asn Asn Gly Asp Thr Ser Glu Ile Gln Pro Glu Asp Gln
290 295 300
TCT GCA AGC GAG ATT ACA CGG GCA TTT GAT ACC TTA GCT AAA GCA CTT 960
Ser Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ala Phe Asp Thr Leu Ala Lys Ala Leu
305 310 315 320
AAT ACC ACA GAC AGC TCC TCG CCT CCA AGC CTG GCC GAC GGG ATA GAC 1008
Asn Thr Thr Asp Ser Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ala Asp Gly Ile Asp
325 330 335
GCC AGT GGA GGG GGC AGC ATC CAC GTC ATC AGC AGA GAC CAG TCG ACA 1056
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Ile His Val Ile Ser Arg Asp Gln Ser Thr
340 345 350
CCC ATC ATT GAG GTT GAA GGC CCT CTC CTT TCA GAC ACA CAC GTC ACA 1104
Pro Ile Ile Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu Ser Asp Thr His Val Thr
355 360 365
TTT AAG CTG ACA ATG CCC AGC CCG ATG CCG GAA TAC CTC AAC GTG CAC 1152
Phe Lys Leu Thr Met Pro Ser Pro Met Pro Glu Tyr Leu Asn Val His
370 375 380
TAC ATC TGC GAG TCT GCG TCC CGC CTG CTC TTC CTC TCC ATG CAC TGG 1200
Tyr Ile Cys Glu Ser Ala Ser Arg Leu Leu Phe Leu Ser Met His Trp
385 390 395 400
GCC AGG TCC ATC CCA GCC TTT CAG GCA CTT GGG CAG GAC TGT AAC ACC 1248
Ala Arg Ser Ile Pro Ala Phe Gln Ala Leu Gly Gln Asp Cys Asn Thr
405 410 415
AGC CTA GTG CGG GCC TGC TGG AAC GAG CTC TTC ACC CTA GGC CTG GCC 1296
Ser Leu Val Arg Ala Cys Trp Asn Glu Leu Phe Thr Leu Gly Leu Ala
420 425 430
CAG TGT GCC CAG GTC ATG AGT CTC TCC ACC ATC CTG GCC GCC ATT GTC 1344
Gln Cys Ala Gln Val Met Ser Leu Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ile Val
435 440 445
AAC CAC CTG CAG AAC AGC ATC CAG GAA GAT AAA CTT TCT GGC GAC CGG 1392
Asn His Leu Gln Asn Ser Ile Gln Glu Asp Lys Leu Ser Gly Asp Arg
450 455 460
ATC AAG CAG GTC ATG GAG CAC ATC TGG AAG CTG CAG GAG TTC TGC AAC 1440
Ile Lys Gln Val Met Glu His Ile Trp Lys Leu Gln Glu Phe Cys Asn
465 470 475 480
AGC ATG GCG AAG CTG GAT ATA GAC GGC TAT GAG TAC GCA TAC CTT AAA 1488
Ser Met Ala Lys Leu Asp Ile Asp Gly Tyr Glu Tyr Ala Tyr Leu Lys
485 490 495
GCT ATA GTT CTC TTT AGC CCC GAT CAT CCA GGT TTG AGT GGC ACA AGC 1536
Ala Ile Val Leu Phe Ser Pro Asp His Pro Gly Leu Ser Gly Thr Ser
500 505 510
CAA ATC GAA AAA TTC CAA GAA AAG GCA CAG ATG GAG TTG CAG GAC TAC 1584
Gln Ile Glu Lys Phe Gln Glu Lys Ala Gln Met Glu Leu Gln Asp Tyr
515 520 525
GTG CAG AAA ACC TAC TCG GAA GAC ACG TAC CGA TTG GCC CGG ATT CTC 1632
Val Gln Lys Thr Tyr Ser Glu Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Arg Ile Leu
530 535 540
GTC CGC CTG CCG GCA CTC AGG CTG ATG AGC GCC AAC ATA ACA GAA GAA 1680
Val Arg Leu Pro Ala Leu Arg Leu Met Ser Ala Asn Ile Thr Glu Glu
545 550 555 560
CTT TTT TTT ACT GGT CTC ATT GGC AAC GTT TCC ATA GAC AGC ATA ATC 1728
Leu Phe Phe Thr Gly Leu Ile Gly Asn Val Ser Ile Asp Ser Ile Ile
565 570 575
CCC TAT ATC CTC AAG ATG GAG ACC GCA GAA TAC AAC GGC CAG ATC ACA 1776
Pro Tyr Ile Leu Lys Met Glu Thr Ala Glu Tyr Asn Gly Gln Ile Thr
580 585 590
GGA GCC AGC CTA TAG 1791
Gly Ala Ser Leu
595

0035

配列番号:2
配列の長さ:596
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
Met Thr Ser Pro Ser Pro Arg Ile Gln Ile Ile Ser Thr Asp Ser Thr
5 10 15
Val Ala Ser Pro Gln Arg Ile Gln Ile Val Thr Asp Gln Gln Thr Gly
20 25 30
Gln Lys Ile Gln Ile Val Thr Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Pro Lys
35 40 45
Gln Gln Phe Ile Leu Thr Gly Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Lys Val
50 55 60
Ile Leu Ala Ser Pro Glu Thr Thr Ser Ala Lys Gln Leu Ile Phe Thr
65 70 75 80
Thr Ser Asp Asn Leu Val Pro Gly Arg Ile Gln Ile Val Thr Asp Ser
85 90 95
Ala Ser Val Glu Arg Leu Leu Gly Lys Ala Asp Val Gln Arg Pro Gln
100 105 110
Val Val Glu Tyr Cys Val Val Cys Gly Asp Lys Ala Ser Gly Arg His
115 120 125
Tyr Gly Ala Val Ser Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Ser
130 135 140
Val Arg Lys Asn Leu Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Asn Gln Asp Cys Ile
145 150 155 160
Ile Asn Lys His His Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg Leu Lys Lys
165 170 175
Cys Leu Glu Met Gly Met Lys Met Glu Ser Val Gln Ser Glu Arg Lys
180 185 190
Pro Phe Asp Val Gln Arg Glu Lys Pro Ser Asn Cys Ala Ala Ser Thr
195 200 205
Glu Lys Ile Tyr Ile Arg Lys Asp Leu Arg Ser Pro Leu Ile Ala Thr
210 215 220
Pro Thr Phe Val Ala Asp Lys Asp Gly Ala Arg Gln Thr Gly Leu Leu
225 230 235 240
Asp Pro Gly Met Leu Val Asn Ile Gln Gln Pro Leu Ile Arg Glu Asp
245 250 255
Gly Thr Val Leu Leu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Glu Thr Ser Gln Gly
260 265 270
Ala Leu Gly Thr Leu Ala Asn Val Val Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ser
275 280 285
Glu Ser Leu Asn Asn Gly Asp Thr Ser Glu Ile Gln Pro Glu Asp Gln
290 295 300
Ser Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ala Phe Asp Thr Leu Ala Lys Ala Leu
305 310 315 320
Asn Thr Thr Asp Ser Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ala Asp Gly Ile Asp
325 330 335
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Ile His Val Ile Ser Arg Asp Gln Ser Thr
340 345 350
Pro Ile Ile Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu Ser Asp Thr His Val Thr
355 360 365
Phe Lys Leu Thr Met Pro Ser Pro Met Pro Glu Tyr Leu Asn Val His
370 375 380
Tyr Ile Cys Glu Ser Ala Ser Arg Leu Leu Phe Leu Ser Met His Trp
385 390 395 400
Ala Arg Ser Ile Pro Ala Phe Gln Ala Leu Gly Gln Asp Cys Asn Thr
405 410 415
Ser Leu Val Arg Ala Cys Trp Asn Glu Leu Phe Thr Leu Gly Leu Ala
420 425 430
Gln Cys Ala Gln Val Met Ser Leu Ser Thr Ile Leu Ala Ala Ile Val
435 440 445
Asn His Leu Gln Asn Ser Ile Gln Glu Asp Lys Leu Ser Gly Asp Arg
450 455 460
Ile Lys Gln Val Met Glu His Ile Trp Lys Leu Gln Glu Phe Cys Asn
465 470 475 480
Ser Met Ala Lys Leu Asp Ile Asp Gly Tyr Glu Tyr Ala Tyr Leu Lys
485 490 495
Ala Ile Val Leu Phe Ser Pro Asp His Pro Gly Leu Ser Gly Thr Ser
500 505 510
Gln Ile Glu Lys Phe Gln Glu Lys Ala Gln Met Glu Leu Gln Asp Tyr
515 520 525
Val Gln Lys Thr Tyr Ser Glu Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Arg Ile Leu
530 535 540
Val Arg Leu Pro Ala Leu Arg Leu Met Ser Ala Asn Ile Thr Glu Glu
545 550 555 560
Leu Phe Phe Thr Gly Leu Ile Gly Asn Val Ser Ile Asp Ser Ile Ile
565 570 575
Pro Tyr Ile Leu Lys Met Glu Thr Ala Glu Tyr Asn Gly Gln Ile Thr
580 585 590
Gly Ala Ser Leu

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