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図面 (9)

課題

癌細胞又は腫瘍細胞を殺傷又は増殖を阻害する薬剤組成物を提供すること。

解決手段

SOM2ペプチドと、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1、BOM1 、及びSP1 のうち少なくとも4つのペプチドとの薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする薬剤組成物。

概要

背景

科学文献における報告には、VIP、ソマトスタチン、及びボンベシン等のペプチドに対する受容体がある癌細胞に見いだされることが開示されている。以下の表1には、VIP、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスP分泌し、それらに対する受容体を有する癌細胞のリストが示されている。

概要

癌細胞又は腫瘍細胞を殺傷又は増殖を阻害する薬剤組成物を提供すること。

SOM2ペプチドと、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1、BOM1 、及びSP1 のうち少なくとも4つのペプチドとの薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする薬剤組成物。

目的

本発明は、ヒト又は他の動物における腫瘍細胞又は癌細胞を殺傷する又は増殖を阻害する、或いはヒト又は他の動物におけるVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの過剰分泌、又はVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの組み合わせの過剰分泌、を防止、阻害、又は調整するための薬剤又は薬剤組成物を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

SOM2ペプチドと、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、BOM1 、及びSP1 のうち少なくとも4つのペプチドとの薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする薬剤組成物

請求項2

VIP1 、VIP2 、SOM1 、SOM2 及びBOM1 の薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする請求項1記載の薬剤組成物。

請求項3

VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2 、BOM1 、及びSP1 の薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする請求項1記載の薬剤組成物。

請求項4

VIP1 の濃度が約10-7Mであり、VIP2 の濃度が約10-8Mであり、VIP3 の濃度が約10-8Mであり、SOM1 の濃度が約10-9Mであり、SOM2 の濃度が約10-8Mであり、BOM1 の濃度が約10-8Mであり、及びSP1 の濃度が約10-8Mであることを特徴とする請求項1又は3記載の薬剤組成物。

請求項5

VIP1 :VIP2 :VIP3 :SOM1 :SOM2 :BOM1 :SP1 のモル比がおよそ1.0:0.1:0.1:0.01:0.1:0.1:0.1であることを特徴とする請求項1、3又は4記載の薬剤組成物。

請求項6

SOM2ペプチドと、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、BOM1 、及びSP1 のうち少なくとも4つのペプチドとの薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする、ヒト又は他の動物における腫瘍細胞又は癌細胞を殺傷する又は増殖を阻害する、或いはヒト又は他の動物におけるVIP、ソマトスタチンボンベシン若しくはサブスタンスPの過剰分泌、又はVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの組み合わせの過剰分泌、を防止、阻害、又は調整するための薬剤

請求項7

ペプチドの組み合わせが、VIP1 、VIP2 、SOM1 、SOM2 及びBOM1 の組み合わせを含むことを特徴とする請求項6記載の薬剤。

請求項8

ペプチドの組み合わせが、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2 、BOM1 、及びSP1 の組み合わせを含むことを特徴とする請求項6記載の薬剤。

請求項9

VIP1 の濃度が約10-7Mであり、VIP2 の濃度が約10-8Mであり、VIP3 の濃度が約10-8Mであり、SOM1 の濃度が約10-9Mであり、SOM2 の濃度が約10-8Mであり、BOM1 の濃度が約10-8Mであり、及びSP1 の濃度が約10-8Mであることを特徴とする請求項6又は8記載の薬剤。

請求項10

VIP1 :VIP2 :VIP3 :SOM1 :SOM2 :BOM1 :SP1 のモル比がおよそ1.0:0.1:0.1:0.01:0.1:0.1:0.1であることを特徴とする請求項6、8又は9記載の薬剤。

請求項11

ソマトスタチン、VIP、ボンベシン、及びサブスタンスPペプチドの類似体を含有する薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする薬剤組成物。

請求項12

薬剤組成物が、ソマトスタチン類似体と、第一VIP類似体、第二VIP類似体、第三VIP類似体、ソマトスタチンの他の類似体、ボンベシン類似体、及びサブスタンスP類似体からなる群から選択される少なくとも4つのペプチドとを含むことを特徴とする請求項11記載の薬剤組成物。

請求項13

ソマトスタチン、VIP、ボンベシン、及びサブスタンスPペプチドの類似体の薬学的に有効な組み合わせを含むことを特徴とする、ヒト又は他の動物における腫瘍細胞又は癌細胞を殺傷する又は増殖を阻害する、或いはヒト又は他の動物におけるVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの過剰分泌、又はVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの組み合わせの過剰分泌、を防止、阻害、又は調整するための薬剤。

請求項14

ペプチドの組み合わせが、ソマトスタチン類似体と、第一VIP類似体、第二VIP類似体、第三VIP類似体、ソマトスタチンの他の類似体、ボンベシン類似体、及びサブスタンスP類似体からなる群から選択される少なくとも4つのペプチドとを含むことを特徴とする請求項13記載の薬剤。

技術分野

(i) 出願人:Rama Mukherjee, Manu Jaggi

背景技術

0001

本発明はペプチド類似体の組み合わせに関するものである。この組み合わせを、結腸直腸、及び腎臓における癌細胞の非制御的増殖を妨げるために用いることが可能である。この組み合わせを、結腸、直腸、肺、胸、及び腎臓における癌の治療、並びに白血病及びリンパ腫の治療に使用することが可能である。本発明はまたかかる類似体の組み合わせを含有する薬剤組成物に関するものである。

0002

科学文献における報告には、VIP、ソマトスタチン、及びボンベシン等のペプチドに対する受容体がある癌細胞に見いだされることが開示されている。以下の表1には、VIP、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスP分泌し、それらに対する受容体を有する癌細胞のリストが示されている。

発明が解決しようとする課題

0003

課題を解決するための手段

0004

本発明は、ヒト又は他の動物における腫瘍細胞又は癌細胞を殺傷する又は増殖を阻害する、或いはヒト又は他の動物におけるVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの過剰分泌、又はVIP、ソマトスタチン、ボンベシン若しくはサブスタンスPの組み合わせの過剰分泌、を防止、阻害、又は調整するための薬剤又は薬剤組成物を提供することを目的とする。

0005

本発明は上述のように癌細胞と同様に腫瘍細胞を殺傷し増殖を抑制するのに有用な薬剤組成物を提供するものである。また、かかる薬剤組成物は、VIP、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスP、或いはVIP、ソマトスタチン、ボンベシン、又はサブスタンスPの何れか組み合わせの過剰分泌を妨げ、抑制し、又は調節することにも有用である。かかる組成物は、ソマトスタチン、VIP、ボンベシン、及びサブスタンスPのペプチド類似体の薬学的効果を有する組み合わせを適切に含む、又はそれらよりなる、又は実質的にそれらからなる。ペプチド類似体については以下により詳細に記述されるが、それら特に記述されたものと機能的に交換可能な構成成分もまた特許請求された薬剤組成物中に使用することが可能である。より詳細にはかかる薬剤組成物は、ソマトスタチンの類似体の1つと、第一VIP類似体、第二VIP類似体、第三VIP類似体、ソマトスタチンの他の類似体、ボンベシン類似体、及びサブスタンスP類似体よりなる群から選択される少なくとも4つのペプチドとを適切に含む、又はそれらよりなる、又は実質的にそれらからなる。より詳細には、かかる組成物は、SOM2(ソマトスタチンの類似体の1つ)と、以下のペプチド:VIP1(VIP類似体)、VIP2(VIP受容体結合インヒビター)、VIP3(VIP受容体アンタゴニスト)、SOM1(ソマトスタチン類似体(Cys2, Tyr3, Orn5, Pen5の4つの頭文字をとって”CTOP”とも略される)BOM1(ボンベシン類似体) 、及びSP1(サブスタンスP類似体) のうち少なくとも4つとの薬学的効果を有する組み合わせを適切に含む、又はそれらよりなる、又は実質的にそれらからなる。好ましい具体例において、薬学的に許容できる担体希釈剤、又は溶剤が使用される。本発明は癌又は他の腫瘍に冒されたヒト、ほ乳類、又は他の動物に対する治療方法を提供する。この方法は、癌又は腫瘍細胞を殺傷又はその増殖を阻害するように薬学的効果量の薬剤組成物を投与することを適切に含む、又はそれらよりなる、又は実質的にそれらからなる。本発明の治療方法は、結腸及び直腸の癌又は腫瘍の治療に特に有用である。また、本発明はVIP、ソマトスタチン、ボンベシン、サブスタンスP或いはVIP、ソマトスタチン、ボンベシン、又はサブスタンスPの何れかの組み合わせの過剰分泌に苦しむヒト、ほ乳類、又は他の動物の治療方法を提供する。かかる方法は、VIP、ソマトスタチン、ボンベシン、サブスタンスP或いはVIP、ソマトスタチン、ボンベシン、又はサブスタンスPの何れかの組み合わせの過剰分泌を妨げ、阻害し、又は調節するように薬学的効果量の薬剤組成物を投与することを適切に含む、又はそれらよりなる、又は実質的にそれらからなる。

0006

我々はVIP(バソアクティブインスティナル・ペプチド)、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスPが少なくとも幾つかのヒト腫瘍及び癌細胞から分泌され、それらの細胞にはかかるペプチドの結合部位が存在することを観察した。特に、間接蛍光抗体法により研究された数多くの成長調節ペプチドの中で、その4つのペプチド(つまり、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド(VIP)、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスP)が腫瘍細胞に結合することが示された。(この明細書中、「ペプチドホルモン」、「成長因子」、「成長調節ペプチド」、及び「ペプチド」という語彙は、それぞれ、VIP、ソマトスタチン、サブスタンスP、及びボンベシンを指す)。それは、腫瘍細胞によりペプチドが分泌される箇所には細胞増殖のためのオートクリン(autocrine)機構が存在し、同じ細胞種上の特異的受容体を通して細胞増殖につながる信号を転換するためかも知れない。

0007

以下により詳細に示されるように、腫瘍細胞成長及び生存に対するソマトスタチン、VIP、ボンベシン、及びサブスタンスPの類似体の影響は異なるアッセイ系を使用し研究したものである。VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2 、BOM1 及びSP1 の7つの類似体のアミノ酸配列は表2に与えられている。以下に詳細に説明されるように、これら7つの類似体の組み合わせはMuJ-7 として知られている。付属配列リストセクションにおいて、VIP1(VIP類似体)のアミノ酸配列は配列ID番号:1であり、VIP2(VIP受容体結合インヒビター)のアミノ酸配列は配列ID番号:2である。かかる類似体は手作業及び従来のペプチド合成器を使用して合成される。ペプチドの純度高性能液体クロマトグラフィー及びアミノ酸分析により確立され、一方、その分析配列分析器により再確認される。

0008

0009

腫瘍細胞により合成され分泌された成長因子を異なるアッセイ系により確認した。例えば、癌細胞の非制御増殖に関与するペプチドホルモンは、確立された細胞株において実験を行うことにより確認した。得られた結果は、モデル組織として使用されたヒト結腸アデノ癌腫原発性腫瘍細胞−それに対し我々は細胞株を確立する新規な方法を向上させたのであるが−における実験から得られたデータと一致した。細胞株を確立する新規方法を記述した以下の文献を参照として引用する:Jaggi, M., Mukherjee, R., "Establishment of Tumorigenic Cell Linesfrom Biopsies of Human Colon Adenocarcinomas," Journal of Vasic & Applied Biomedicine, 3(4): 27-35 (1995)。

0010

ペプチドにおけるサンドイッチ形式ELISAが発明者により向上され使用された。サンドイッチ形式ELISAを記述した以下の文献を参照として引用する:Jaggi, M., Mukherjee R., "New, Sensitive and Specific ELISA for theDetection of Neuropeptides in Culture Supernatants," Journal of Immunoassay, 15(2): 129-46 (1994) 。ペプチドの確認は逆相高速液体クロマトグラフィー及び配列分析を使用して行われた。結腸の原発性ヒトアデノ癌腫腫瘍細胞におけるVIP、ソマトスタチン、サブスタンスP、及びボンベシンに対する結合部位は受容体−リガンドアッセイを行うことにより実証した。VIP及びソマトスタチンにおいては2つのクラスの結合部位(高アフィニティ及び準高アフィニティ)が証明され、ボンベシンに対しては1つのクラスの結合部位(高アフィニティ)が証明され、サブスタンスPに対しては1つのクラスの結合部位(準高アフィニティ)が証明された。

0011

表3、4、5及び6はヒト結腸アデノ癌腫の8つの異なる原発性腫瘍培地におけるVIP、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスPの受容体アフィニティのデータを示すものである。これらのデータは125I−VIP、125I−ソマトスタチン、125I−ボンベシン、及び125I−サブスタンスPを使用した受容体−リガンドアッセイを行うことにより得られたものである。受容体−リガンドアッセイの詳細については、「プロトコールの説明」と題された以下のセクションを参照されたい。表3、4、5及び6において、KD (M)は単位がモル(M)である解離定数を表し、R(M/L)は単位がモル/リットル(M/L)である受容体数(つまり、1腫瘍細胞当りの受容体数)を表す。以下の「プロトコールの説明」のセクションに記述されるとおり、KD (M)及びR(M/L)は、受容体−リガンドアッセイからの粗データを使用してスキャッチャード分析を行うLIGANDソフトウェアを使用して計算したものである。

0012

約10-9から約10-10 の範囲のKD (M)値は高アフィニティ受容体を示し、約10-6から約10-8の範囲のKD (M)値は準高アフィニティ受容体を示すものである。腫瘍細胞にはVIPに対して準高アフィニティを有する受容体と同様にVIPに対して高アフィニティを有する受容体も存在するという理由により、表3ではそれぞれの原発性腫瘍培地について2つのKD (M)値及び2つのR(M/L)値が示されている。腫瘍細胞にはソマトスタチンに対して準高アフィニティを有する受容体と同様にソマトスタチンに対して高アフィニティを有する受容体も存在するという理由により、表4ではそれぞれの原発性腫瘍培地について2つのKD (M)値及び2つのR(M/L)値が示されている。腫瘍細胞にはボンベシンに対して高アフィニティを有する受容体のみしか存在しないという理由により、表5ではそれぞれの原発性腫瘍培地について1つのKD (M)値及び1つのR(M/L)値のみが示されている。腫瘍細胞にはサブスタンスPに対して準高アフィニティを有する受容体のみしか存在しないという理由により、表6ではそれぞれの原発性腫瘍培地について1つのKD (M)値及び1つのR(M/L)値のみが示されている。

0013

0014

0015

0016

0017

本発明の範囲内の組み合わせの1つの例は、SOM2 VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、BOM1 、及びSP1 を含む。これ以降MuJ-7 として参照される1つの組み合わせは以下の7つのペプチド類似体を用いて調製したものである:(1)約3464.9の分子量及び約10-7Mの濃度を有するVIP1(VIP類似体)、(2)約1027.55の分子量及び約10-8Mの濃度を有するVIP2(VIP受容体結合インヒビター)、(3)約3342.09の分子量及び約10-8Mの濃度を有するVIP3(VIP受容体アンタゴニスト)、(4)約1061.59の分子量及び約10-9Mの濃度を有するSOM1(ソマトスタチン類似体(CTOP))、(5)約1637.9の分子量及び約10-8Mの濃度を有するSOM2(ソマトスタチンの類似体)、(6)約983.55の分子量及び約10-8Mの濃度を有するBOM1(ボンベシン類似体) 、及び(7)約1515.83の分子量及び約10-8Mの濃度を有するSP1(サブスタンスP類似体) 。前文はMuJ-7 を構成する7つの類似体の好ましい濃度を説明するものであって、7つの類似体それぞれの濃度が約10-6Mから10-12 Mまでの範囲であれば、MuJ-7 の効果があると考えられる。

0018

MuJ-7 は次のようにして調製することが可能である。7つペプチド類似体それぞれのストック溶液を約7から7.4のpHで調製する。下記の試験を行うために無菌燐酸緩衝溶液を使用したのであるが、RPMI1640、緩衝溶液、等張NaCl、リンガー溶液、水(注射用)、蒸留水ポリエチレングリコール(無希釈又は水溶液)、2%Tween水溶液、50%ジメチルスルホキシド水溶液平衡塩類液グリセロール、及び静脈投与に適切な他の従来の液体、等の他の希釈液を使用してもかまわない。それぞれのストック溶液のpHを約7から約7.4に調節するために、1NのHClをpHを低下させるために、又は1NのNaOHをpHを増加させるために使用することができる(勿論、pHを調節するための他の従来の試薬を使用することも可能である)。それぞれのストック溶液中のペプチド類似体の濃度は約10-3Mである。7つのペプチド類似体のアリコットはMuJ-7 製剤が7つのペプチド類似体のそれぞれをほぼ同量含有するように混合される。MuJ-7 中においてVIP1 の濃度は約10-7Mであり、VIP2の濃度は約10-8Mであり、VIP3 の濃度は約10-8Mであり、SOM1 の濃度は約10-9Mであり、SOM2 の濃度は約10-8Mであり、BOM1 の濃度は約10-8Mであり、及びSP1 の濃度は約10-8Mである。1つの具体例において、MuJ-7溶液のpHは約7.0から約7.4の範囲であることができる。この範囲のpHを得るために1NのHClをpHを低下させるために、又は1NのNaOHをpHを増加させるために使用することができる(勿論、pHを調節するための他の従来の試薬を使用することも可能である)。

0019

MuJ-7 はヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞に対して試験され、MuJ-7 を構成するペプチド類似体のそれぞれについてもヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞及び他の癌細胞株に対して試験を行った。ヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞における結果は表7にまとめられており、他の腫瘍又は癌細胞株における結果は表8にまとめられている。表7及び8はそれぞれのペプチド類似体及びMuJ-7 における最大細胞毒性を示している。

0020

表7及び8に記載されているMuJ-7 及びそれぞれのペプチド類似体における細胞毒性は、テトラゾリウム塩の1種であるMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)が代謝活性細胞によって吸収され、活性ミトコンドリアにより青色ホルマザン生成物に代謝されてそれが分光光度計により測定されることを基礎とする1日MTT細胞毒性アッセイを行うことにより試験されたものである。MTTアッセイについては、Mosmann, T., "Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays", Journal of Immunological Methods65: 55-63 (1983) を参照されたい。1日MTT細胞毒性アッセイに必要なMTTストック溶液を調製するために、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾル-2- イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(シグマカタログNo. M 2128) をpH7.4の燐酸緩衝溶液に溶かして5mg/mlの濃度のMTTを得、小量の不溶残留物を除去し滅菌するために得られた混合物を0.22μのフィルタを通してろ過し、ろ過した混合物をMTTストック溶液(20μl/200μl溶媒)とした。簡潔に説明すると、それぞれのタイプの腫瘍細胞について約20000から50000の細胞を96ウェル培養プレートに植え、それぞれのペプチド類似体又はMuJ-7 をCO2インキュベータ中で約24時間培養した。ペプチド類似体及びMuJ-7 の濃度は表7及び8に記載されている。(表8において、ペプチド類似体の濃度は10-6M、10-7M及び10-8Mについて記載されている)。ペプチド類似体又はMuJ-7 により処理しない対照についても同様に培養した。約100μg(20μl)のMTTをそれぞれのウェルに加えることにより約24時間後にアッセイを終了させ、次に約1時間更に培養し、最後に約50μlの10%SDS−0.01NHClをそれぞれのウェルに添加して細胞を溶解させてホルマザンを溶かした。37℃で約1時間培養した後、分光光度計により540nmの値を読み、以下の式:
細胞毒性率=100×[1−(X/R1)]
(ここでX=(処理検体の540nmにおける吸収度)−(ブランクの540nmにおける吸収度)であり、R1 =(未処理対照の540nmにおける吸収度)−(ブランクの540nmにおける吸収度)である)を用いて細胞毒性率(つまり、殺傷率又は阻害率)を計算した。従って、ここに報告されるMTT細胞毒性アッセイのそれぞれにおいて、細胞毒性は上記の式に従って計算され、未処理対照の増殖度を100%の値とすることを基礎とするものである。

0021

0022

0023

表8において、K562細胞はヒト白血病細胞であり、MOLT-4細胞はヒトリンパ腫細胞であり、L132細胞はヒト肺癌腫細胞であり、PC3 細胞はヒト膵臓腫瘍細胞であり、MCF-7 はヒト乳癌細胞であり、HuTu80細胞はヒト十二指腸腫瘍細胞であり、Hu 746T 細胞はヒト胃癌細胞であり、SKO.007 細胞はヒト骨髄腫細胞であり、HT29細胞はヒト結腸腫瘍細胞であり、SW620 細胞はヒト結腸腫瘍細胞であり、G401 細胞はヒト腎臓癌細胞であり、SK.MEL.28 細胞はヒト骨髄腫細胞であり、PTC細胞はヒト結腸腫瘍細胞である。

0024

表7及び8の結果は、ペプチド類似体(VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2 、BOM1 、及びSP1 )はMuJ-7 中で組み合わされて使用された場合により効果的であることを示している。MuJ-7 を構成する7つのペプチド類似体の5つの異なる準組み合わせをヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞に対して試験した。準組み合わせは表9に記載されている。それぞれの準組み合わせは1日MTT細胞毒性アッセイを行うことにより試験した。簡潔に説明すると、約20000から50000のヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞を96ウェルの培養プレートに植え、それぞれの準組み合わせをCO2インキュベータ中で約24時間培養した。ペプチド類似体の濃度は表9に記載されている。準組み合わせにより処理しない対照についても同様に培養した。約100μg(20μl)のMTTをそれぞれのウェルに加えることにより約24時間後にアッセイを終了させ、次に約1時間更に培養し、最後に約50μlの10%SDS−0.01NHClをそれぞれのウェルに添加して細胞を溶解させてホルマザンを溶かした。37℃で約1時間培養した後、分光光度計により540nmの値を読み、上記の式を用いて細胞毒性率(つまり、殺傷率)を計算した。表9にはそれぞれの準組み合わせにおける最大細胞毒性が示されている。

0025

0026

他の実験においては、他のペプチド類似体:ソマトスタチン類似体--RC-160、サブスタンスP類似体--サブスタンスP1-6 及びスパンチドI(Spantide I)、コレシストキニン類似体--CCK-33、及びグルカゴン類似体--ヒトグルカゴン、が試験された。これらペプチド類似体のそれぞれはヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞に対して試験された。それぞれのペプチドは1日MTT細胞毒性アッセイを行うことにより、10M-6から10M-10 の間の濃度で試験された。簡潔に説明すると、約20000から50000のヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞を96ウェルの培養プレートに植え、それぞれのペプチド類似体をCO2インキュベータ中で約24時間培養した。ペプチド類似体により処理しない対照についても同様に培養した。約100μg(20μl)のMTTをそれぞれのウェルに加えることにより約24時間後にアッセイを終了させ、次に約1時間更に培養し、最後に約50μlの10%SDS−0.01NHClをそれぞれのウェルに添加して細胞を溶解させてホルマザンを溶かした。37℃で約1時間培養した後、分光光度計により540nmの値を読み、上記の式を用いて細胞毒性率(つまり、殺傷率)を計算した。サブスタンスP1-6 による最大細胞毒性は約35.9%であり、RC-160による最大細胞毒性は約58.0%であり、スパンチドIによる最大細胞毒性は約30.8%であり、ヒトグルカゴンによる最大細胞毒性は約0%であり、CCK-33による最大細胞毒性は約17.8%であった。 表10には他のVIP類似体が記載されており、表11には他のソマトスタチン類似体が記載されており、表12には他のボンベシン類似体が記載されており、表13には他のサブスタンスP類似体が記載されている。表10〜13に記載されている類似体はMuJ-7 を構成するペプチド類似体の幾つかと置き換えることが可能である。

0027

表2及び表10〜13及び「配列リスト」において、「Pen 」はペニシラミンの略であり、「Ψ」は代用結合(surrogate bond)を示し、

0028

0029

還元結合(reduced bond)を示し、「pGlu」はパイログルタミン酸(つまり、5-オキソ-プロリン)を示し、「NicLys」はリシン-(ニコチノイル)(つまり、ニコチンがリシン側鎖のε−アミノ基に結合したもの)を示し、「MePhe 」はメチルフェニルアラニンを示し、「Nle 」はノルロイシンを示す。表2及び表10〜13及び請求の範囲に開示されるアミノ酸配列は、表2及び表10〜13に開示されるアミノ酸配列の保守的に変形された変異種を含むものである。特許請求される発明は、表2及び表10〜13に開示されるアミノ酸配列をC末端及び/又はN末端からアミノ酸残基(例えば、1つ、2つ、又はおそらくはそれ以上のアミノ酸残基)を取り除いて短くしたとしても依然有効であると考えられる。また、特許請求される発明は表2及び表10〜13に開示されるアミノ酸配列のC末端及び/又はN末端のアミノ酸残基(例えば、1つ、2つ、又はおそらくはそれ以上のアミノ酸残基)を他のアミノ酸残基で置き換えたとしても依然有効であると考えられる。

0030

0031

0032

0033

0034

本発明の他の例において、癌に冒されたほ乳類(ヒトを含む)を治療する方法が提供される。治療可能な癌の種類には、白血病及びリンパ腫;膵臓、及び前立腺のアデノ癌腫;並びに結腸、直腸、肺、胸及び腎臓の癌が含まれるが、特にそれらに制限されるわけではない。加えて、本発明はVIP、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスPのペプチドのうちの1種又はそれ以上の過剰分泌に特徴付けられる他の疾病及び癌を治療する方法を提供するものである。

0035

本発明の方法は、SOM2 と、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、BOM1 及びSP1 のペプチドのうち少なくとも4との薬学的に有効である組み合わせをほ乳類に体系的に投与することを含む、又はそれらよりなる、又は実質的にそれらからなる。組み合わせの有効投与量はほ乳類の体重1kgにつき15〜170μg(好ましくは25〜40μg)のペプチドであるが、所望される効果、投与方法、選択されるペプチド、及び治療される癌に依存する。体系的投与とは、経口、経直腸、経鼻トランスダーマル非経口(つまり、筋肉静脈、及び皮下注射)意味するものである。適切な医療における実施においては、不都合な害のある副作用を引き起こすことなく抗癌作用を発揮する投与量でかかる組成物を投与することが好ましい。組成物は単独又は他の医薬剤との混合物として投与することが可能である。

発明を実施するための最良の形態

0036

組成物は任意に及び好ましくは薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤、溶媒、結合剤、安定剤等を含有する。かかる希釈剤には、RPMI1640 、緩衝溶液、等張NaCl、リンガー溶液、水、蒸留水、ポリエチレングリコール(非希釈又は水溶液)、2%Tween水溶液、50%ジメチルスルホキシド水溶液、プロピレングリコール(非希釈又は水溶液)、燐酸緩衝液、平衡塩類液、グリセロール、及び静脈投与に適切な他の従来の液体等が含まれる。1投与当り約10から2000μgの組成物を提供する薬剤組成物が好ましく、通常は、錠剤ロゼンジカプセル粉末、溶液、又は油状懸濁液、シロップエリキシル剤、及び水溶液として調製される。用いられる薬剤組成物の属性は勿論所望される投与ルートに依存する。

0037

本発明は下記の例を参照して更に詳細に説明されるが、これらの例は単に説明を目的とするものであり、本発明をこれに限定するものではない。
MuJ-7 のインビトロにおける研究
例1
ファインニードル吸引細胞学FNAC)及び病理組織学により確認されたヒト結腸アデノ癌腫を用いてヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞株を確立した。これらの細胞を、ヒト結腸アデノ癌腫細胞上に存在する91 KD の表面抗原に特異的なモノクロナール抗体によりポジティブ染色した。これらの細胞の腫瘍発生力をヌードマウスにこれらの細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させることにより証明した。12の主用培地の特徴は表14に記載されている。

0038

0039

(注:AC=上行結腸、DC=下行結腸、TC=横行結腸、FNAC=ファインニードル吸引細胞、Hist.=病理組織、Mab=モノクロナール抗体標識、ND=未検査)
表14に記載された12のヒト結腸アデノ癌腫細胞培養のそれぞれに由来するヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞がMuJ-7 (約20μl/ウェル)と共に約72時間約37℃でCO2インキュベータ中で培養された96ウェルの培養プレートにおいてMuJ-7 の抗増殖効果を研究した。MuJ-7 を加えなかったヒト結腸アデノ癌腫細胞を対照とした。トリチウムを導入した 3H]チミジン(約1μCi/ウェル)をそれぞれのウェルに加え、プレートを更に約1時間インキュベートした。細胞をフィルターマット上に採取し、 3H]チミジンの細胞分裂中の細胞への導入をベータプレート(Pharmacia) により計算した。本明細書中に記載されるトリチウム導入 3H]チミジン細胞毒性アッセイのそれぞれにおいては、未処理の対照における細胞の増殖を100%とするものとする。例1においては、MuJ-7 が腫瘍細胞の増殖を約95%阻害したことが観察された。
例2
MuJ-7 の細胞毒性効果を1日MTTアッセイにより再確認した。1日MTT細胞毒性アッセイのためのMTTストック溶液の調製方法は上述のとおりである。簡潔に説明すると、上記表14に記載された12のヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞培養をMuJ-7 (約20μl/ウェルのMuJ-7 を時間=0において添加)と共に96ウェル培養プレートを用いて、約5%CO2 中、約37℃で約24時間インキュベートした。MuJ-7 により処理しなかった12のヒト結腸アデノ癌腫細胞培養からの細胞を対照とした。次に、ストックMTT溶液(約100μgMTT/ウェル)をそれぞれのウェルに加え、更に約1時間培養を続けた。細胞中に形成されたホルマザンの結晶を約10%のドデシル硫酸ナトリウム及び約0.01NのHClからなる洗剤を添加して溶解させ、それぞれのウェルの540nmにおける光学密度を分光光度計により読みとった。光学密度は増殖し代謝活性のある細胞の数に正比例するものである。MuJ-7 はMTT細胞毒性により評価されたように12のヒト結腸アデノ癌腫細胞培養のそれぞれの増殖−活性を阻害した。阻害率は約80.7%から約95.2%の範囲であった。表15は12のヒト結腸アデノ癌腫細胞株のそれぞれのおよその阻害率をリストにしたものである。表14における生検番号1〜12のそれぞれは表15のサンプル番号PTC-1 〜PTC-12に対応するものである。

0040

0041

例3
MuJ-7 の細胞毒性効果を3種類のヒト結腸癌細胞株(CoLo 205、HT29 及びSW620)を用いた3日MTTアッセイにより試験した。3日MTT細胞毒性アッセイのためのMTTストック溶液の調製方法は上述の1日MTT細胞毒性アッセイのためのMTTストック溶液の調製方法と同様である。簡潔に説明すると、CoLo205、HT 29 及びSW 620細胞を96ウェルの培養プレート(約50000癌細胞/ウェル)を用いて、約5%CO2 中、約37℃で約72時間インキュベートした。MuJ-7 (約20μl/ウェル)を時間=0、24、48時間において全ての処理サンプルに添加した。MuJ-7 により処理しなかったCoLo 205、HT 29 及びSW620細胞を対照とした。次に、ストックMTT溶液(約100μgMTT/ウェル)をそれぞれのウェルに加え、更に約1時間培養を続けた。細胞中に形成されたホルマザンの結晶を約10%のドデシル硫酸ナトリウム及び約0.01NのHClからなる洗剤を添加して溶解させ、それぞれのウェルの540nmにおける光学密度を分光光度計により読みとった。MuJ-7 によるCoLo 205、HT 29 及びSW620の阻害率はそれぞれ、約80%、約18%及び約41%であった。
例4
MuJ-7 の13種類の腫瘍細胞株における細胞毒性効果を研究するために、3日MTTアッセイを用いて実験を行った。これらの細胞株は、K562細胞(ヒト白血病)、MOLT-4(ヒトリンパ腫)、L 132 (ヒト肺癌腫)、MCF-7 (ヒト乳癌)、SW 620(ヒト結腸)、G 401 (ヒト腎臓)、CoLo 205(ヒト結腸)、HuTu80(ヒト十二指腸)、Hu 746T (ヒト胃)、HT29(ヒト結腸)、PC3 (ヒト膵臓)、SKO.007 (ヒト骨髄腫)、及びSK.MEL.28 (ヒト黒色腫)である。3日MTT細胞毒性アッセイのためのMTTストック溶液の調製方法は上述の1日MTT細胞毒性アッセイのためのMTTストック溶液の調製方法と同様である。簡潔に説明すると、13のヒト腫瘍細胞株からの細胞を96ウェルの培養プレート(約50000癌細胞/ウェル)を用いて、約5%CO2 中、約37℃で約72時間インキュベートした。MuJ-7 (約20μl/ウェル)を時間=0、24、48時間において全ての処理サンプルに添加した。MuJ-7 により処理しなかった13のヒト腫瘍細胞株からの細胞を対照とした。次に、ストックMTT溶液(約100μgMTT/ウェル)をそれぞれのウェルに加え、更に約1時間培養を続けた。細胞中に形成されたホルマザンの結晶を約10%のドデシル硫酸ナトリウム及び約0.01NのHClからなる洗剤を添加して溶解させ、それぞれのウェルの540nmにおける光学密度を分光光度計により読みとった。MuJ-7 による13の細胞株におけるおよその細胞毒性率(つまり、阻害率)は表16に記載されている。SKO.007 (ヒト骨髄腫)、及びSK.MEL.28 (ヒト黒色腫)における阻害は観察されなかった。

0042

0043

例5
ヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞を104細胞/mlの密度で5つの異なるフラスコに植えた。10%のウシ胎児血清を含有するRPMI1640 (5ミリリットル)をそれぞれのフラスコに加えた。MuJ-7 (約200μl)を4つのフラスコに加えた。MuJ-7 を加えなかった5番目のフラスコを対照として使用した。約12時間から約96時間の間の異なる経過時間で細胞をMuJ-7 で処理した後、ヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞からゲノミックDNAを抽出した。ゲノミックDNAの抽出に使用された方法の詳細については「プロトコールの説明」と題された下記のセクションを参照されたい。第一フラスコ中の腫瘍細胞からは約12時間後にゲノミックDNAを抽出し、第二フラスコ中の腫瘍細胞からは約24時間後にゲノミックDNAを抽出し、第三フラスコ中の腫瘍細胞からは約48時間後にゲノミックDNAを抽出し、第四フラスコ中の腫瘍細胞からは約96時間後にゲノミックDNAを抽出し、対照フラスコ中の腫瘍細胞からは約96時間後にゲノミックDNAを抽出した。処理及び未処理細胞双方からのDNAを臭化エチジウムを染色に使用して1%アガロースゲル上で泳動した。MuJ-7 で48時間及び96時間処理した腫瘍細胞のDNAは、プログラム化細胞死示唆するスミアゲル上に形成し、一方未処理細胞からのDNAはそれが完全な形態で存在することを証明する鋭い帯を10kbの位置に形成した。MuJ-7 で24時間処理した腫瘍細胞のDNAは、ゲル上にスミアを形成しなかった。従って、インビトロの時間−速度実験は、MuJ-7 による処理によってプログラム化細胞死が約24時間から約48時間の間に起こることを示すものである。
インビボ実験における投与MuJ-7 の成分
投与MuJ-7 成分を以下の方法により調製した。最初に7種のペプチド類似体それぞれのストック溶液を約7.4のpHの無菌燐酸緩衝溶液を使用して調製した。それぞれのストック溶液のペプチド類似体濃度は約10-3Mであった。MuJ-71投与量中における7種のペプチドの総重量が、投与量に依存して、約8〜16μgになり、MuJ-7 製剤が7種のペプチド類似体のそれぞれをほぼ同量含有するように、7種のペプチド類似体のアリコットを混合した。MuJ-7 中、VIP1 の濃度は約10-7Mであり、VIP2 の濃度は約10-8Mであり、VIP3 の濃度は約10-8Mであり、SOM1 の濃度は約10-9Mであり、SOM2 の濃度は約10-8Mであり、BOM1 の濃度は約10-8Mであり、SP1 の濃度は約10-8Mであった。無菌RPMI 1640 を加えることによりこの溶液の容量を約150μlとした。RPMI 1640 はロズウェル・パークメモリアル・インスティテュート(Rosewell Park Memorial Institute)において向上された細胞培養培地である。RPMI 1640 の成分は表17に記載されている。

0044

0045

以下のインビボ実験全体を通して、MuJ-7 を注射しなかった対照マウスにはその代わりにRPMI1640 を注射した。対照マウスにおける腫瘍の進行成長はRPMI 1640 がMuJ-7 の効果に重要なものではないことを示すものである。以下のインビボ実験において、腫瘍の容積は副はさみ尺(vernier calliper)を使用して計算した。腫瘍の短辺(a) 及び長辺(b) を正確に計測し、以下の式:
腫瘍容積= 0.4×a2×b
を用いて容積を計算した。

0046

上記の腫瘍容積を計算式は、H. J. Winn, National Cancer Institute Monograph 2 (1959) 113-138によるものである。以下のインビボ実験において、腫瘍重量の測定は、実験の終了時に皮膚の真下の筋肉層上の後部表面に成長している腫瘍全部分をマウスから摘出することによって行った。腫瘍に付着している皮膚及び他の組織を全て除去し、腫瘍重量を即座に分析用バランスによって測定した。
腫瘍発生ヌードマウスのインビボ研究
例6〜13に記述される様々なインビボプロトコールに従いMuJ-7 によって処理された52匹の腫瘍を有するヌードマウスのうち、49匹のマウスが完全又は部分的腫瘍縮小を示した。経過時間におけるMuJ-7 処理による腫瘍縮小の効果を示す図1には、例6〜13に記述されたインビボプロトコールにおける全てのマウスの平均腫瘍容積(mm3)が経過日数と対比させて示されている(図1におけるデータポイントのそれぞれは、別々の実験からの異なる数のマウスの平均腫瘍容積を示すものである)。図1において、マウスは4つのカテゴリーグループ分けされている:(1)未処理対照マウス(△)、(2)MuJ-7 の最初の投与を第5日までに受けた処理マウス(+)、(3)MuJ-7 の最初の投与を第5日以降第12日までに受けた処理マウス(▲)、及び(4)MuJ-7 の最初の投与を第12日以降第20日までに受けた処理マウス(▽)。
例6
第1日において10匹のBALB/Cヌードnu/nu マウスにヒト結腸アデノ癌腫の原発性細胞(約1千万腫瘍細胞/マウス)を移植し、移植後約1時間経過で最初のMuJ-7 をこれらのマウスに投与した。それぞれの処理マウスにおける1日のMuJ-7注射量中には、約1.143μgのVIP1 、約1.143μgのVIP2 、約1.143μgのVIP3 、約1.143μgのSOM1 、約1.143μgのSOM2 、約1.143μgのBOM1 、及び約1.143μgのSP1 が含まれていた。従って、1日当りのMuJ-7 総投与量中にはそれぞれがおよそ同量の7種のペプチド類似体(VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2 、BOM1 、及びSP1)がいつも含有され、これら7種のペプチド類似体の総重量は約8μgであったということになる。MuJ-7 の1日の総重量はほぼ同量になるように3等分した。約8時間の間隔をおいて、一日に3回、3等分のうちの1つを処理マウスそれぞれに注射した。1日のうち最初の投与は尾の静脈に注射し、2回目の投与は臀部筋肉の一方に注射し、3回目の投与は他方の臀部筋肉に注射した。2週間に渡り処理を継続した。10匹の処理マウスの体重に近い体重を有する無作為に選択したBALB/Cヌードnu/nu マウスを対照とした。対照マウスには処理マウスと同様に同タイプ及びおよそ同一数のヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞を皮下注射した。対照マウスにはMuJ-7 を与えなかった。

0047

処理及び未処理マウスの腫瘍容積を4日おきに記録した。表18にはそれぞれの処理マウスにおける腫瘍容積(mm3)が記載されており、表19にはそれぞれの未処理マウス(対照)における腫瘍容積(mm3)が記載されている。図2は処理マウス(○)及び未処理マウス(+)の平均腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図2中、矢印は第1日において腫瘍細胞移植後約1時間経過した後最初のMuJ-7 を処理マウスに投与したことを示すものである。

0048

0049

0050

MuJ-7 を使用した処理によって、処理マウスのうち約90%において腫瘍成長が妨げられた。更に、実験期間中1匹の処理マウスとも死ぬことはなかった。これと比較して、対照マウスには腫瘍の成長が観察され、それは結果的にマウスの死につながった。
例7
第1日において20匹のBALB/Cヌードnu/nu マウスを10匹づつの2つのグループに分け、それぞれにヒト結腸アデノ癌腫の原発性細胞(約1千万腫瘍細胞/マウス)を移植した。グループ1のマウスには第12日(つまり、第1日の腫瘍細胞移植後11日経過後)に最初のMuJ-7 を投与した。グループ2のマウスには第20日(つまり、第1日の腫瘍細胞移植後19日経過後)に最初のMuJ-7 を投与した。これらの20匹の処理マウスに14日間に渡り毎日1日分のMuJ-7 を与えた。それぞれの処理マウスにおけるMuJ-7 の1日注射量中には、約1.143μgのVIP1 、約1.143μgのVIP2 、約1.143μgのVIP3 、約1.143μgのSOM1 、約1.143μgのSOM2 、約1.143μgのBOM1 、及び約1.143μgのSP1 が含まれていた。従って、1日当りのMuJ-7 総投与量中にはそれぞれがおよそ同量の7種のペプチド類似体(VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2 、BOM1 、及びSP1)がいつも含有され、これら7種のペプチド類似体の総重量は約8μgであったということになる。MuJ-7 の1日の総重量はほぼ同量になるように3等分した。約8時間の間隔をおいて、一日に3回、3等分のうちの1つを処理マウスそれぞれに注射した。1日のうち最初の投与は尾の静脈に注射し、2回目の投与は臀部筋肉の一方に注射し、3回目の投与は他方の臀部筋肉に注射した。グループ1及びグループ2の20匹の処理マウスの体重に近い体重を有する無作為に選択した5匹のBALB/Cヌードnu/nu マウスを対照とした(この5匹のマウスをグループ1及びグループ2の双方の実験における対照とした)。対照マウスには処理マウスと同様に同タイプ及びおよそ同一数のヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞を皮下注射した。対照マウスにはMuJ-7 を与えなかった。

0051

グループ1のマウスに対しては腫瘍容積を5日おきに記録した。表20には処理マウス及び5匹の対照(未処理)マウスにおける平均腫瘍容積が記載されている。このうち3匹の未処理対照マウスは第31、32及び34日に死に、これらの死んだマウスはその死後の測定からは除外された。

0052

0053

グループ1の10匹の処理マウスのうち8匹が第42日までに腫瘍の完全な消滅を示した。完全な消滅の際には腫瘍重量及び腫瘍容積の測定は不可能であった。それ故、表20及びこの段落において、第42日のグループ1処理マウスの平均腫瘍容積及び平均腫瘍重量に関して完全な消滅を示した8匹のマウスは除外されている。表20に示されるとおり、MuJ-7 を与えられたグループ1のマウスの平均腫瘍容積は第22日に約9.8mm3 であったものが第42日には約44.8mm3 に増加し、一方、対照(未処理)マウスの平均腫瘍容積は第22日に約122.1mm3 であったものが第42日には約1978.1mm3 に増加した。第42日において腫瘍の完全な消滅を示さなかったグループ1の2匹の処理マウスの平均腫瘍重量は約51mgであり、一方、未処理対照マウスにおける第42日の平均腫瘍重量は約1196mgであった。

0054

グループ2の10匹の処理マウスのうち8匹が第34日(つまり、癌細胞移植後33日目)までに腫瘍の完全な消滅を示した。完全な消滅の際には腫瘍重量及び腫瘍容積の測定は不可能であった。それ故、この段落において、第34日のグループ2処理マウスの平均腫瘍容積及び平均腫瘍重量に関して完全な消滅を示した8匹のマウスは除外されている。対照マウスのうち1匹は第31日に死に、1匹は第32日に死に、更にもう1匹が第34日に死んだ。このため、この段落において、第34日の対照マウスの平均腫瘍容積及び平均腫瘍重量に関して、第34日より前に死んだ2匹のマウスは除外されている。グループ2の処理マウスにおいて、MuJ-7 は第22日に約105mm3 であった平均腫瘍容積を第34日には約3.1mm3 なるまで減少させ、一方、対照(未処理)マウスの平均腫瘍容積は第22日に約122.1mm3 であったものが第34日には約1888mm3 にまで増加した。第34日の実験終了時における腫瘍の完全な消滅を示さなかったグループ2の2匹の処理マウスの平均腫瘍重量は約23mgであり、一方、未処理対照マウスにおける第34日の平均腫瘍重量は約746mgであった。

0055

図3はグループ1の処理マウス(○)、グループ2の処理マウス(□)、及び未処理対照マウス(+)の平均腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図3中、第12日の下の矢印はグループ1のマウスが最初にMuJ-7 を投与された時を示し、第20日の下の矢印はグループ2のマウスが最初にMuJ-7を投与された時を示す。
例8
ヒト結腸癌細胞株(HT29 、SW 620及びCoLo 205)を使用して、ヒト起源原発性結腸腫瘍を有するBALB/Cヌードnu/nu マウスの治療におけるMuJ-7 の有効性の試験を行った。更に、MuJ-7 の有効性をヒト肺癌株L 132 からの細胞を注射したBALB/Cヌードnu/nu マウスの治療において証明した。簡潔に説明すると、上記のヒト癌細胞株(HT 29 、SW 620及びCoLo 205)のそれぞれを、2匹のヌードマウス(そのうち1匹は対照とする)に1200万癌細胞/マウスの割合で皮下注射し(第1日)、注射後3〜11日からMuJ-7 による非対照マウスの治療を開始した。一旦治療を開始した後は、処理マウスのそれぞれにMuJ-7 を14日間連続して注射し、1日のMuJ-7 投与量の約3分の1を1回当りに注射した。それぞれの処理マウスにおけるMuJ-7 の1日注射量中には、約1.143μgのVIP1 、約1.143μgのVIP2 、約1.143μgのVIP3 、約1.143μgのSOM1 、約1.143μgのSOM2 、約1.143μgのBOM1 、及び約1.143μgのSP1 が含まれていた。HT 29 癌細胞を移植された処理マウスに対しては第12日目(つまり、癌細胞の注射後11日)に治療を開始し、SW620癌細胞を移植された処理マウスに対しては第8日目(つまり、癌細胞の注射後7日)に治療を開始し、CoLo 205癌細胞を移植された処理マウスに対しては第4日目(つまり、癌細胞の注射後3日)に治療を開始し、L 132 癌細胞を移植された処理マウスに対しては第5日目(つまり、癌細胞の注射後4日)に治療を開始した。MuJ-7 の1日の総重量はほぼ同量になるように3等分した。約8時間の間隔をおいて、一日に3回、3等分のうちの1つを処理マウスそれぞれに注射した。1日のうち最初の投与は尾の静脈に注射し、2回目の投与は臀部筋肉の一方に注射し、3回目の投与は他方の臀部筋肉に注射した。処理マウスの体重に近い体重を有する無作為に選択したBALB/Cヌードnu/nu マウスを対照とした。対照マウスには処理マウスと同様に同タイプ及びおよそ同一数のヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞を皮下注射した。対照マウスにはMuJ-7 を与えなかった。

0056

SW 620細胞に関する実験において、未処理対照マウスの腫瘍容積は第6日に約67.5mm3 であったものが第26日(つまり、第1日の癌細胞注射後25日)には約508.9mm3 にまで増加し、その時点でマウスは腫瘍が原因で死んでしまった。一方、MuJ-7 処理したマウスの腫瘍容積は第6日に約47.1mm3 であったものが第16日(処理9日後)には完全に消滅してしまった。表21には第6日から死ぬまでの未処理対照マウス及び処理マウスの腫瘍容積測定結果(単位:mm2)が記載されている。図4は処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図4中、矢印は処理マウスが第8日に最初にMuJ-7 を投与されたことを示す。第87日目(つまり第1日のSW 620細胞注射後86日)に死んだ処理マウスの生存時間は、未処理対照マウスと比較して、約244%増加した。生存時間における増加率は以下の式:
生存時間増加率 = (NTNC) /NC ×100
(ここでNT は処理マウスの死んだ日数(又は生存が確認された最後の日数)から癌細胞を注射した日の日数を引いたものであり、NC は未処理対照マウスの死んだ日数から癌細胞を注射した日の日数を引いたものである)に従い計算した。

0057

0058

HT29細胞に関する実験において、未処理対照マウスの腫瘍容積は第10日に約95.1mm3 であったものが第52日(つまり、第1日の癌細胞注射後51日)には約4536.3mm3 にまで増加し、その時点でマウスは腫瘍が原因で死んでしまった。それと比較して、MuJ-7 処理したマウスの腫瘍容積は第10日に約159.1mm3 であったものが第52日には約2192.7mm3 と比較的ゆっくり増加し、その後第86日(つまり、第1日の癌細胞注射後85日)には約1556.4mm3 に腫瘍容積が減少した。表22には第10日から死ぬまでの未処理対照マウス及び処理マウスの腫瘍容積測定結果(単位:mm2)が記載されている。図5は処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図5中、矢印は処理マウスが第12日に最初にMuJ-7 を投与されたことを示す。第104日目(つまり第1日のHT 29 細胞注射後103日)に死んだ処理マウスの生存時間は、未処理対照マウスと比較して、約102%増加した。

0059

0060

CoLo 205細胞に関する実験において、未処理対照マウスの腫瘍容積は第3日に約74.9mm3 であったものが第22日(つまり、第1日の癌細胞注射後21日)には約7344.9mm3 にまで増加し、その時点でマウスは腫瘍が原因で死んでしまった。それと比較して、MuJ-7 処理したマウスの腫瘍容積は第3日に約78.2mm3 であったものが第8日(処理後4日)には完全に消滅してしまった。表23には第3日から死ぬまでの未処理対照マウス及び処理マウスの腫瘍容積測定結果(単位:mm2)が記載されている。図6は処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図6中、矢印は処理マウスが第4日に最初にMuJ-7 を投与されたことを示す。第79日目(つまり第1日のCoLo 205細胞注射後78日)に死んだ処理マウスの生存時間は、未処理対照マウスと比較して、約271%増加した。

0061

0062

L 132細胞に関する実験において、未処理対照マウスの腫瘍容積は第2日に約28.5mm3 であったものが第34日(つまり、第1日の癌細胞注射後33日)には約7174.3mm3 にまで増加し、その時点でマウスは腫瘍が原因で死んでしまった。一方、MuJ-7 処理したマウスの腫瘍容積は第2日に約38.3mm3 であったものが第27日(処理後22日)には完全に消滅してしまった。表24には第2日から死ぬまでの未処理対照マウス及び処理マウスの腫瘍容積測定結果(単位:mm2)が記載されている。図7は処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図6中、矢印は処理マウスが第5日に最初にMuJ-7 を投与されたことを示す。第70日目(つまり第1日のL 132 細胞注射後69日)に死んだ処理マウスの生存時間は、未処理対照マウスと比較して、約109%増加した。

0063

0064

例9
2匹のBALB/Cヌードnu/nuマウスのそれぞれに約10億個のヒト結腸アデノ癌腫細胞を移植した(第1日)。第22日目(つまり、癌細胞の注射後21日)から1匹のマウスに、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 及びSOM2 の組み合わせの1日投与量腹腔内注射により与えた。14日間に渡りこの処理マウスに約8μgの組み合わせを与えた。この組み合わせは、約1.6μgのVIP1 、約1.6μgのVIP2 、約1.6μgのVIP3 、約1.6μgのSOM1 及び約1.6μgのSOM2 を含有するものであった。この処理マウスに対して第35日目(つまり、第1日の癌細胞の注射後34日)に最後の組み合わせを与えた。第35日目の実験終了後、処理マウスの腫瘍容積は約720mm3 であった。他のマウスは未処理であり対照とした。第35日に未処理対照マウスの腫瘍容積は約3584mm3 であった。
例10
3匹のBALB/Cヌードnu/nu マウスのそれぞれに約10億個のヒト結腸アデノ癌腫細胞を移植した(第1日)。第2日目(つまり、癌細胞の注射後1日)から2匹のマウスに、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 及びSOM2 の組み合わせの1日投与量を腹腔内注射により与えた。14日間に渡り1日に1度、この処理マウスに約8μgの組み合わせを与えた。この組み合わせは、約1.6μgのVIP1 、約1.6μgのVIP2 、約1.6μgのVIP3 、約1.6μgのSOM1 及び約1.6μgのSOM2 を含有するものであった(これらを1度に与え、分けることはしなかった)。この処理マウスに対して第15日目(つまり、第1日の癌細胞の注射後14日)に最後の組み合わせを与えた。第15日目の実験終了後、処理マウスの腫瘍容積は約80mm3 であり、腫瘍重量は約0.149gであった。第15日に未処理対照マウスの腫瘍容積は約384mm3 であり、腫瘍重量は約0.406gであった。
例11
2匹のBALB/Cヌードnu/nu マウスのそれぞれに約10億個のヒト結腸アデノ癌腫細胞を移植した(第1日)。第2日目(つまり、癌細胞の注射後1日)から2匹のマウスに、VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 及びSOM2 の組み合わせの1日投与量を腹腔内注射により与えた。14日間に渡り、この処理マウスに約8μgの組み合わせを与えた。この組み合わせは、約1.6μgのVIP1、約1.6μgのVIP2 、約1.6μgのVIP3 、約1.6μgのSOM1及び約1.6μgのSOM2 を含有するものであった。組み合わせの1日の総重量をほぼ同量になるように3等分した。約8時間の間隔をおいて、一日に3回、3等分のうちの1つを処理マウスそれぞれに注射した。1日のうち最初の投与は静脈内投与とし、2回目及び3回目の投与は筋肉内注射とした。この処理マウスに対して第15日目(つまり、第1日の癌細胞の注射後14日)に最後の組み合わせを与えた。第15日目の実験終了後、処理マウスの腫瘍容積は約0.8mm3 であり、腫瘍重量は約0.009gであった。他のマウスは未処理であり対照とした。第15日に未処理対照マウスの腫瘍容積は約1728mm3 であり、未処理対照マウスの腫瘍重量は約2.18gであった。
例12
3匹のBALB/Cヌードnu/nu マウスのそれぞれに約1600万個のヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞を移植した(第1日)。第21日目(つまり、癌細胞の注射後20日)、第22日目、及び第23日目にこれらのマウスのうち2匹に、1日投与量分のMuJ-7 を与えた。この3日間のそれぞれの日においてそれぞれの処理マウスに与えたMuJ-7 の1日分投与量には、約1.143μgのVIP1 、約1.143μgのVIP2 、約1.143μgのVIP3 、約1.143μgのSOM1 、約1.143μgのSOM2 、約1.143μgのBOM1 、及び約1.143μgのSP1 が含まれており、7種のペプチド類似体の総重量は約8μgであった。第24日から第34日にかけては、それぞれの処理マウスに与えたMuJ-7 の1日分投与量には、約2.286μgのVIP1 、約2.286μgのVIP2 、約2.286μgのVIP3 、約2.286μgのSOM1 、約2.286μgのSOM2 、約2.286μgのBOM1 、及び約2.286μgのSP1 が含まれており、7種のペプチド類似体の総重量は約16μgであった。MuJ-7 の1日の総重量をほぼ同量になるように3等分した。約8時間の間隔をおいて、一日に3回、3等分のうちの1つを処理マウスそれぞれに注射した。1日のうち最初の投与は尾の静脈に注射し、2回目の投与は臀部筋肉の一方に注射し、3回目の投与は他方の臀部筋肉に注射した。2匹の処理マウスの体重に近い体重を有する3匹目の未処理マウスを対照とし、このマウスにはMuJ-7 を与えなかった。表25には、1匹目の処理マウスについては第55日まで、2匹目の処理マウス及び対照マウスについては死ぬまでの腫瘍容積(mm3)が示されている。少なくとも第55日目(つまり第1日目の腫瘍細胞注射後54日)まで生きた1匹目の処理処理マウスの生存時間は、未処理対照マウスと比較して、少なくとも約108%増加した。第38日目(つまり第1日目の腫瘍細胞注射後37日)に死んだ2匹目の処理処理マウスの生存時間は、未処理対照マウスと比較して、約42%増加した。

0065

0066

例13
22匹のBALB/Cヌードnu/nuマウスのそれぞれに約1000万個のヒト結腸アデノ癌腫の原発性腫瘍細胞を移植した(第1日)。第15日目にこれらのマウスのうち12匹に1日投与量分のMuJ-7 を与え、これを14日間続けた。それぞれの処理マウスに与えたMuJ-7 の1日分投与量には、約1.143μgのVIP1、約1.143μgのVIP2 、約1.143μgのVIP3 、約1.143μgのSOM1 、約1.143μgのSOM2 、約1.143μgのBOM1 、及び約1.143μgのSP1 が含まれていた。従って、MuJ-7 の1日分投与量には7種のペプチド類似体(VIP1 、VIP2 、VIP3 、SOM1 、SOM2、BOM1 、及びSP1 )がいつもほぼ同量含まれており、これら7種のペプチド類似体の1日の総重量は約8μgであった。MuJ-7 の1日の総重量をほぼ同量になるように3等分した。約8時間の間隔をおいて、一日に3回、3等分のうちの1つを処理マウスそれぞれに注射した。1日のうち最初の投与は尾の静脈に注射し、2回目の投与は臀部筋肉の一方に注射し、3回目の投与は他方の臀部筋肉に注射した。10匹の未処理マウスを対照として使用した。対照は、12匹の処理マウスの体重に近い体重を有するBALB/Cヌードnu/nu マウスから10匹を無作為に選択した。対照マウスには処理マウスと同様に、同タイプ及びおよそ同一数のヒト結腸アデノ癌腫腫瘍細胞を注射した。対照マウスにはMuJ-7 を与えなかった。それぞれの処理及び未処理マウスの腫瘍容積を概略5日おきに記録した。表26には12匹の処理マウスそれぞれの腫瘍容積(mm3)が示され、表27には10匹の未処理対照マウスそれぞれの腫瘍容積(mm3)が示されている。

0067

0068

0069

図8は処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の平均腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。図9は処理マウスの生存率点線)及び未処理対照マウスの生存率(実線)を経過日数との関係で示すグラフである。図8及び9において、矢印は処理マウスが第15日に最初のMuJ-7 を投与されたことを示す。

0070

10匹の対照マウスのうち8匹が第25日から第35日にかけて死んだ。これと比較して、12匹の処理マウスのうち5匹が腫瘍の完全な消滅を示し、12匹の処理マウスのうち他の5匹は腫瘍の部分的縮小を示した。従って、12匹の処理マウスのうち10匹が腫瘍の完全又は部分的縮小を示したことになり、一方、処理マウスのうち残りの2匹(マウス番号11及び13)においては異なる結果となった。処理マウス番号11は第15日から第30日の間にMuJ-7 による治療を受けた。MuJ-7 による処理が終了した後、マウス番号11の腫瘍は成長し始め、結果として第50日にマウス番号11は死んだ。しかしながら、マウス番号11の生存時間は未処理対照マウスの平均生存時間を上回るものである。処理マウス3もまた未処理対照マウスにおける平均腫瘍成長速度と比較して減少した腫瘍成長速度を示した。処理マウス3は結果的に第50日に死んだが、処理マウス3の生存時間もまた未処理対照マウスの平均生存時間を上回るものである。

0071

10匹の未処理対照マウスのうち、2匹が第25日に死に、2匹が第30日に死に、4匹が第35日に死に、2匹が第35日以降に死んだ。完全に腫瘍が消滅した5匹の処理マウスを第55日に検査したが腫瘍の再発は観察されなかった。残りの7匹の処理マウスのうち、4匹が第40日に死に、1匹が第50日に死に、2匹が第55日に死んだ。従って、これら7匹の処理マウスの生存時間は10匹の未処理対照マウスの平均生存時間を上回るものである。
プロトコールの説明
間接蛍光抗体法:3〜4日経過した培養から採取した約104細胞/mlの濃度を有する約100μlの活発粘着性腫瘍細胞を24デイ培養プレートの円形無菌カバーグラスに入れ、CO2インキュベータにおいて37℃でインキュベートした。24時間後、腫瘍細胞が培養表面に付着し始めた際に、ウェルを成長培地洗浄し、CO2 インキュベータで37℃において更にインキュベートした。約4〜5日後、粘着性腫瘍細胞が付着したカバーグラスを、RPMI1640 を含有する約5%のウシ胎児血清(以後、「FCS]とする)を用いてよく洗浄し、次に、約5%のFCSを含有し、約7.4のpHである約0.05Mの燐酸緩衝溶液(以後、「PBS」とする)により洗浄し、更に、PBSのみを使用して洗浄した。次に、カバーグラス上の腫瘍細胞を抗ペプチドポリクロナール抗体の1:50希釈と共に約37℃で約1時間インキュベートした。カバーグラスを上記の要領で再び洗浄し、腫瘍細胞を上記と同じ条件下で抗ウサギIgG-FITC複合体の1:200希釈と共にインキュベートした。洗浄の後、パラフェニルジアミンの結晶を含有する1:1の炭酸水素塩緩衝液−グリセロールで作成した培地中にカバーグラスをマウントし、ガラススライド上に上下を逆にして透明ワニス溶液を用いて封入した。腫瘍細胞をMicrophot FX顕微鏡を用い紫外光の下で観察した。
サンドイッチELISA法丸底マイクロタイタ高活性化(Maxisorp)プレート(Nunc,カタログNo. 449824) のウェルを、約0.05%のTween 20(PBS-T) を含有し、pHが約7.4である100μlの約0.05Mの燐酸緩衝溶液中の1μgの精製抗体により被覆し、約37℃で約1時間インキュベートした。インキュベート終了後、自動プレート洗浄器(BDSL, UK)中でPBS-0.2%Tween を用いてウェルを2回洗浄した。それぞれのウェルに原発性腫瘍培地のアミコン(Amicon)濃縮培地上澄み(100μl)を加え、約37℃で約1時間インキュベートした。上記の要領でウェルを3回洗浄した。色を向上させるため、クエン酸−燐酸緩衝液(pH:約5.5)に基質(1mg/mlのオルトフェニルジアミン+1μlのH2 O2)を加えたもの(25μl)をそれぞれのウェルに添加し、暗下において約37℃で約5分間インキュベートした。色の向上は10μlの5N・H2 SO4 を加えることにより完了させた。490nmにおけるそれぞれのウェルの吸光度マルチスキャンミクロプレート分光計(Biotech, USA)を使用して求めた。
逆相高速液体クロマトグラフィー:腫瘍細胞培養の上澄みを5ミクロン(46mm×15cm)カラムを用いてWaters C−18 にかけた。溶媒系グラジエントとして使用された2種類の溶媒から構成された。溶媒Aは約0.1%のトリフロロ酢酸からなり、溶媒Bは溶媒A中の約80%のアセトニトリルからなるものであった。1.0ml/分の流速を維持し、約45分で約40%〜100%の溶媒Bのグラジエントになるよう調整した。230nmの波長でUV検知器を使用し、ペプチドの検出を行った。
受容体−リガンドアッセイ:腫瘍細胞を75cm3フラスコ中で群成させ、培地をデカントした。ゴムポリスマンを使用して細胞をはぎ取り、約0.5×106 細胞/50μlの濃度になるように、RPMI 1640 中に約5%のウシ血清アルブミン(以後、「BSA」とする)を含む最低量の結合緩衝液に懸濁させた。アッセイ管中の細胞に増加カウントのI-125 ペプチドを加え、結合緩衝液を加えることにより容量を約200μlにした。ガンマ計数機を使用してそれぞれの管の放射性カウントを測定した。次に、全ての管を約37℃で約1時間インキュベートした。反応を終了させるために、2mlの温結合緩衝液をそれぞれの管に加え、ボルテックスにより十分に混合した。管を4℃において約2500rpm(回転/分)で約10分間遠心分離した。上澄みを捨て、ブロットペーパを用いて管を乾燥させた。次に、それぞれの管をガンマ計数機を用いてカウントした。それぞれの管に加えられたカウントを結合カウントに対してプロットし、飽和曲線を作成した。

0072

1管当りの最適細胞数及びトレーサカウントを標準曲線から決定した。これは固定細胞濃度にトレーサを添加した際に結合カウント数に更なる増加がない条件に対応する。低温競合実験をこれらの飽和条件で行った。先に最適化した固定細胞濃度及びトレーサカウントをアッセイ管に加えた。その後、低温VIP、ソマトスタチン、ボンベシン、及びサブスタンスPを濃度を増加させて添加し(複製)、結合緩衝液を加えて容量を200μlとした。次に、これらの管を標準曲線の作成において記述した方法と同一の方法を用いて処理した。

0073

KD (M)及びR(M/L)の計算において、複製した管の平均カウントを標識及び未標識ペプチドの分子量、比活性投与量単位、管容量及びカウント時間等の他のデータと共にLIGANDソフトウェアにインプットした(LIGANDソフトウェア(バージョン3.0)は1986年にG. A. McPherson により作成され、英国、ケンブリッジ、68ヒルズロードのElsevier, BIOSOFT により発行され、配給された放射性リガンド結合分析プログラムである)。このLIGANDソフトウェアは、それぞれの管に加えられたカウント総数により結合カウント数を割ったものをY軸にとり、それぞれの管に加えられたカウント総数をX軸に対数形式でとってグラフ化することによりスキャッチャード分析を行うものである。LIGANDソフトウェアは、KD (M)及びR(M/L)を計算するためにグラフにおける傾きの切片を使用するものであった。
ゲノミックDNAの抽出:原発性腫瘍細胞をインビトロで群成させ、その単層を氷温トリス緩衝液(以後、「TBS]とする)により2回洗浄した。ポリスマンを使用して細胞を約0.5mlのTBS中に懸濁させた。細胞懸濁液を遠心分離管に移し、氷上で保存した。フラスコをおよそ1mlの追加TBSで洗浄し、洗浄後の液を遠心分離管中の細胞懸濁液と混合した。約4℃において約1500×gで約10分間遠心分離を行うことにより細胞を回収した。細胞を約5〜10容量の氷温TBSに再び懸濁させ、遠心分離を再び行った。最後に、細胞を約5×107 細胞/mlの濃度でトリスエデテート(Tris edetate)(以後、「TE」とする、TEは約8.0のpHを有する)中に懸濁させた。10ミリリットルの抽出用緩衝液を1mlの細胞懸濁液に加え、溶液を約37℃で約1時間インキュベートした。この溶液にプロテイナーゼKを最終濃度が100μ/mlになるように加え、ゆっくりとした振とう速度の水浴中で約50℃で約12時間インキュベートした。次に溶液を室温まで冷やし、遠心分離管に移した。0.5MのTris.Cl (約8.0pH)で平衡させた等量のフェノールクロロホルムを加え、2つの相を約10分間ゆっくりと混合させた。2つの相を約5000×gの遠心分離を約15分間室温で行うことにより分離させた。粘性水相を遠心分離管に移し、フェノール−クロロホルムを使用して抽出を2回繰り返した。次に、1/2容量の7.5M酢酸アンモニウム及び2容量の氷温100%エタノールを水相に加えた。形成された糸状のDNAを70%エタノールにより洗浄した。これをデカントし、Speedvac(Savant)上で乾燥させた。ペレットをTE中に再び懸濁させた。

図面の簡単な説明

0074

上記の実施例は説明を目的とするものであり、この中に特に開示されていない要素を用いて本発明を適宜実施することも可能である。本発明の請求の範囲は本発明に一致する最も広い範囲のものである。
配列リスト
(1)一般情報

0075

図1例6〜13に記述されたインビボプロトコールにおける全てのマウスの平均腫瘍容積(mm3)を経過日数と対比させて表すことによりMuJ-7 の腫瘍縮小効果を経過時間と共に示すグラフである。
図2例6に記述されたインビボプロトコールにおける処理マウス(○)及び未処理マウス(+)の平均腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図3例7に記述されたインビボプロトコールにおけるグループ1の処理マウス(○)、グループ2の処理マウス(□)、及び未処理対照マウス(+)の平均腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図4例8に記述されたSW 620を使用したインビボプロトコールにおける処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図5例8に記述されたHT29 を使用したインビボプロトコールにおける処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図6例8に記述されたCoLo 205を使用したインビボプロトコールにおける処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図7例8に記述されたL 132 を使用したインビボプロトコールにおける処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図8例13に記述されたインビボプロトコールにおける処理マウス(○)、及び未処理対照マウス(+)の平均腫瘍容積(mm3)を経過日数との関係で示すグラフである。
図9例13に記述されたインビボプロトコールにおける処理マウスの生存率(点線)及び未処理対照マウスの生存率(実線)を経過日数との関係で示すグラフである。

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