図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(1998年3月3日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (7)

目的

免疫機構解明し、更に未知細胞がT細胞であるか否かを判定する。

構成

細胞抗原受容体の一部をなす約312アミノ酸からなる組換え型ポリペプチドに対する特異抗体と、それを利用したT細胞の検出法

概要

背景

概要

免疫機構解明し、更に未知細胞がT細胞であるか否かを判定する。

細胞抗原受容体の一部をなす約312アミノ酸からなる組換え型ポリペプチドに対する特異抗体と、それを利用したT細胞の検出法

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

哺乳類細胞抗原レセプターβ鎖の少なくとも一部であるポリペプチドの単離された断片。

--

4.特異抗体を産生するハイブリドーマを用い、インビトロでの組織培養またはインビボ動物体内固形もしくは腹水腫瘍を形成させることにより、大量のモノクローナル抗体を得ることができる。

0001

T(胸腺由来細胞は、B細胞同様、特異抗原を認識する。この認識は、T細胞の活性化にとって必須であり、免疫機構における少なくとも2つの主要な機能をT細胞に発揮させる。活性化されたT細胞は、異物性を示す細胞、例えば、ウイルスが感染し、ウイルス抗原を保持する細胞を殺す。さらに活性化T細胞は、B細胞による抗体産生を含めた他の免疫応答を調節する。(H.R.グリーン等、(1983) Ann. Rev. Immunol. 1,439−461;P.C.カン(Kung)等、(1983) Intl. J. Dermatol.22,67−76)

0002

抗原認識は、T細胞におけるレセプターを介するものと考えられる。T細胞抗原レセプター分子的特性および生化学的特性は、抗原のT細胞認識に関する多くの不明確点解明するであろうし、免疫細胞とそのターゲットの間の無数相互作用に関するより多くの理解およびその結果として免疫応答の調節に関するより多くの理解のための助けとなるであろう。

0003

広範囲にわたる成果にもかかわらず、過去20年のT細胞抗原レセプターの特性解明にかかる進歩は遅い。(J.J.マーカロニス(Marchalonis,(1982) Immunol. Today 3,10−12;M.クローネンバーグ(Kronenberg)等、(1983) Cell. 34,327−329)しかしながら最近研究者の数グループが、抗原レセプターの予期される特性を持つT細胞表面たんぱく質を認識し得るネズミモノクローナル抗体を生成した。(J.L.マークス(Marx),(1983) Science 221,444−446)これらの抗体はクローン化されたT細胞の細胞系を用いてマウス免疫化することにより産生され、抗体産生を誘発するために使用された細胞とのみ反応する。ヒトにおける免疫化学的研究(S.C.ミュアー(Meuer)等、(1983) J. Exp. Med. 157,705−719;S.C.ミュアー等、(1983) J. Exp. Med. 158,988−993;R.D.ビグラー(Bigler)等、(1983)J. Exp. Med.158,1000−1005;A.オレステ(Oreste)等、(1983) Cell. 34,711−726;J.カプラー(Kappler)等、(1983) Cell. 35,295−302;S.C.ミュアー等、(1983) Science 222,1239−1242)および齧歯類動物における同研究(K.ハスキンズ(Haskins)等、(1983) J. Exp. Med.157,1149−1161;P.マルラック(Marrack)等、(1983) J. Exp. Med.158,1635−1646;B.W.マクインタイル(McIntyre)およびJ.P.アリソン(Allison), (1983)Cell. 34,739−746;J.カプラー等、(1983) Cell. 34,727−734)において、推定上のT細胞抗原レセプターが、約40,000ダルトンおよび約45,000ダルトンの分子量をそれぞれ持つ2種の異なるポリペプチド鎖で構成される分子であることを示唆している。一定状態のもとで、T細胞レセプター分子は、分子量85,000−90,000ダルトンのジスルアイド連結ヘテロダイマーである。ネズミ系におけるペプチド地図分析により、T細胞レセプターたんぱく質が可変部および定常部を含むことが示唆される。しかしながら、これらの研究は、たんぱく質配列または核酸配列に関する情報を提供していない。

0004

最近、国立アレルギー感染症研究所(NIAID)のステフアンドリック(Stephen Hedrick)および、最近までNIAIDに在籍し、現在スタフォード大学医学部のマークデービス(Mark Davis) は、T細胞レセプターたんぱく質(J.L.マークス(Marx) 、(1983)サイエンス221,1278−1279;J.ベルゾフスキー(Berzofsky)、(1983) Immunol. Today 4,299−301)を合成するための遺伝暗号を指定するmRNAからcDNAを製造したいくつかの報告発表した。これらの報告は、コード化たんぱく質が、免疫グロブリン鎖の可変部および定常部と共通の特質を持つことを示唆する。しかしこれらの報告は、以下に関する情報を与えていない。

0005

a)推定上のT細胞レセプターたんぱく質のアミノ酸配列
b)製造されたcDNAの正確な大きさまたはヌクレオチド配列
c)研究されたT細胞の起源(推定上ネズミ細胞)
d)実験計画。および
e)cDNAまたはたんぱく質に関するデータ。
従って、これらの報告では、推測上の結果を再現もしくは立証することが、どの当業者にとってもできない。加えて、レセプターたんぱく質をコードするcDNAまたは、レセプターたんぱく質の利用的可能性に関する提案がない。

0006

本発明は、ヒトT細胞抗原レセプターたんぱく質およびそれをコードする遺伝子の単離および分子特性における詳細な解明に関する。本発明はまたレセプター遺伝子の単離法およびスクリーニング法、その遺伝子のヌクレオチド配列、その遺伝子によりコードされるたんぱく質のアミノ酸配列、および、未知細胞がT細胞であるかどうか決定を含めたヌクレオチド配列およびたんぱく質の用途に関する。

0007

本発明は、ヒトTリンパ系細胞に特異的であるクローン化cDNAを提供する。そのメッセージは、ヒトおよびマウスTリンパ芽球胸腺細胞およびフイヘマグルチニン刺激Tリンパ球において発現されることが発見された。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列の分析はその大きさおよびシステイン残基の相対部位が、マウスおよびヒト免疫グロブリン分子のL鎖と同様であることを示す。本発明のヌクレオチド配列は、ヒトおよびマウス免疫グロブリンのどちらにおいてもL鎖たんぱく質の可変、結合および定常部と広範囲な相同性を示す一帯を含む。これらの特徴は、cDNAクローンが、ヒトT細胞レセプターの部分を特異化するメッセージと一致することを示す。

0008

本発明の詳細な説明は、図を参照しながら、以下に示される。cDNAクローンは、ヒト白血病T細胞系MOLT−3を利用して得られる(ナガサワ、K.およびマック(Mak),T.W.(1982) Cell. Immunol. 71,390−403)。この細胞系は、T細胞特異抗原を含むことが知られている。メッセンジャーRNAは、オリゴ−(dT)−セルロースカラムクロマトグラフィーによりMOLT−3細胞から単離し、cDNAは、ランド(Land)等の方法((1981)Nucleic Acid Res. 9,2251−2266)により合成された。MOLT−3細胞からのmRNAを用いて、二本鎖cDNAが生成されベクターpFP502EB5の Bgl II部位へ挿入された(クラーク(Clark),S.P.およびマック,T.W.(1982) Nucleic Acid Res. 10,3315−3330)。大腸菌株HB101へのトランスフェクションの後、10,000の独立のcDNAクローンが得られた。それらcDNAクローンの内25について無作為に測定したところ、cDNA挿入物の長さが、0.5kbと1.7kb の間であった。T細胞において、独占的かまたは優先的に発現したcDNAをスクリーニングするために、cDNAクローンは、MOLT−3細胞およびヒトB細胞系HSC−58における発現のそれらの相体的レベルに基ずいて分類された。これらのクローンの内4種(YT30、YT35、YT53およびYT76)は、ノーザンゲル分析により、MOLT−3細胞に特異的であることがわかった。1.3 kb の単一メッセージがMOLT−3細胞において見い出されたが、HSC−58においては、見い出されなかった。このメッセージが、T細胞系全般について特異的であるかどうかを試験するために、以下に示す細胞系からのRNAとのハイブリッド形成が試験された。

0009

a)T細胞系ジャーカット(Jurkat)およびCEM(T)
b)B細胞系RPM1 1788(B)およびRPM1 3638(B)
c)B細胞慢性リンパ球性白血病患者からの細胞
d)赤血白血病細胞系K562およびH.メッスナー(Messner)(オンタリオ癌研究所(Ontario Cancer Institute))から得られた赤血白血病細胞
e)正常骨髄細胞
f)膀胱腫瘍細胞系MGHU−1

0010

Fig 1a(図1)から、1.3kbメッセージは、試験された3種のT細胞系のすべてにおいて発現されたが、非T細胞または細胞系のどれにおいても発現されなかったことが観察される(矢印部分)。

0011

他のヒトおよびマウスのT細胞およびB細胞におけるこれらメッセージの発現もまた、ノーザンゲル分析によって試験された。Fig 1b(図2)にまとめられた結果は、cDNAクローンに相補的な配列が、MOLT−3T細胞において発現され、HSC−58B細胞において発現されないという上記結果を確証するものである。加えて、そのcDNAは、正常ヒト胸腺細胞、フイトヘマグルチニン(PHA)刺激ヒト末梢血T細胞およびマウスT細胞系RBL−5において発現された(Fig 1b)。これらの結果は、cDNAクローンYT30、YT35、YT53およびYT76は、T細胞系において共通なmRNAから誘導されることを示す。

0012

T細胞特異的cDNAクローンに対応するmRNAによりコードされたたんぱく質の大きさを決定するために、パーネス(Parnes)等のインビトロでのハイブリッドセレクト法が使用された((1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA78,2253−2257)。MOLT−3からの全mRNAは、クローンYT35またはYT76と、アニーリングされた。1日後非結合mRNAは除去され、ハイブリッドされたmRNAは低イオン条件下に投入され、ウサギ網状赤血球溶解物とともにインビトロにおいて翻訳された。このハイブリッド選択法の後合成されたたんぱく質は、Fig 2(図3)に示される。30,000ダルトンのたんぱく質(矢印)が、T細胞特異的cDNAクローンにより選択されたmRNAによりコードされるようであり、約45,000ダルトンの分子量を持つより大きいたんぱく質は、インビトロでの翻訳システム固有なものであった。

0013

YT35クローンのヌクレオチド配列は、サンガー(Sanger)等のジデオキシチエインターミネーティングインヒビター法(dideoxychain terminatinginhibitor method)((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74,5463−5467)を用いて決定された。1151ヌクレオチドの完全配列が Fig3に示される。この配列を調べると、位置974でTGA終結塩基連鎖を持つロング読み取り枠を示している。 Fig3(図4図5)の下の部分において、3つのコーデング枠のメチオニンコドン(線の下の縦棒)および終結コドン(線の上の縦棒)が示される。

0014

この読み取り枠における最初のATGメチオニンコドン(位置38)で開始するたんぱく質は、推定上34938ダルトンの分子量を持ち、これは、ハイブリッドセレクションおよびインビトロ翻訳の結果( Fig2)と、大体一致するこのたんぱく質において、NおよびC末端近隣領域( Fig3において、行上の横線)に、非極性無電荷アミノ酸一連が存在する。N−グリコレーション可能部位は、 Fig3においてアミノ酸を示す行の下の横線で示される。T細胞特異的クローンの推定されるアミノ酸配列が、免疫グロブリン配列または、T細胞関連たんぱく質配列のどれに対しても同様であるかを決定するために、これらのたんぱく質は、対角線マトリックス分析により測定された( Fig4(図6))。長い領域における相同性が、クローンYT35から推定されるたんぱく質配列と、マウスλL鎖( Fig4a)およびヒトλおよびκL鎖の間に観察された。この相同性はバックグランドが、21の隣接アミノ酸にわたる>35%相同性を期待することにより減ぜられる場合に、より容易に認識される。得られたプロット( Fig4b、4cおよび4d)により高い相同性を示す2種の一連物の存在が示される(1つは、可変部のC−末端側近傍、他は、定常部のN−末端側近傍)。これらの配列の直接的比較が Fig5(図7)に示される。YT35の位置42、111、166および231でのシステイン残基は、下線により示される。配列間の同一性星印(*)で示され、縦線は、保存的(conservative) 変化を表わす。空白部(−)は、対等性(matchup)を強めるために挿入される。保存的変化を認識するために、アミノ酸は以下の様に分類された。
酸性物アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)
塩基性物−ヒスチジン(H)、リジン(K)、およびアルギニン(R)
無電荷極性物−アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、およびトレオニン(T)および
非極性物−アラニン(A)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、プロリン(P)、バリン(V)、トリプトフアン(W)およびチロシン(Y)

0015

Fig 4において見い出された最も高い相同性は、YT35配列における位置111および166でのシステイン残基周辺領域に一致する。位置42および231でのシステイン残基近傍においても同じく、配列は、全く同様である。Fig 5はまた、 Fig4aにおける全YT35たんぱく質に沿って見い出された相同性をも強調する。ヒトκL鎖たんぱく質に対するクローンYT35の推定アミノ酸配列の比較は、λL鎖に対するよりもわずかに低い相同性を示した(容易に検出される。)(図示されていない。)。より少なく示された相同性が、ヒトまたはマウス免疫グロブリンのH鎖に対して発見されたが、マウスH−2、Thy−1またはヒトHLAに対しては注目に値する相同性は発見されなかった。λL鎖と重なった一連の249アミノ酸に沿った全相同性は、マウスλL鎖に対して33%が一致し、定常部においては38%である。同様に、保存的変化を考慮に入れれば、それぞれ、相同性は、59%および58%に増加する。ヒトλL鎖の定常部に対するそれぞれの相同性は、同様に36%が一致し、保存的変化を考慮すれば61%である。クローンYT35によってコードされたたんぱく質がヒトおよびマウスL鎖に対して一様に同様なものであり、その同様性はヒトおよびマウスL鎖がそれらの間に最大限に保存される場合、最も高いということを示すことは重大なことである。また、λおよびκ鎖に対する最も高い相同性は、異なった位置で生ずる( Fig4)。

0016

先の結果は、2つの重要な発見を示している。第1は、ヒトT細胞特異的cDNAクローンが単離された。第2は、そのヌクレオチド配列から推定されるたんぱく質が、システインの相対部位(より注目すべきは、可変部、結合部、および定常部に対する広範囲の相同性が発見され得る)において同様性を持つように、ヒトおよびマウス免疫グロブリンL鎖分子と共通点を持つことが決定された。これらの構造的特徴は、YT35によってコードされたたんぱく質が、特異化されたTリンパ球機能を仲介する抗原レセプターの一部であることを当業者に示すものである。

0017

少なくとも約936ヌクレオチドの核酸配列は、T細胞抗原レセプター、例えば霊長類T細胞抗原レセプター好ましくはヒトT細胞抗原レセプターの少なくとも一部であるポリペプチドをコードする。核酸はDNA、例えばcDNA、またはRNAであり得る。1方のそういったDNA配列は、 Fig3における一部において示される。他のDNA配列は、 Fig3に示される位置973−800の配列と一致する少なくとも約174の塩基配列を、5′末端で持つ。1方のそういったRNA配列は、 Fig3に示されるそれと相補的配列である。他のRNAは、 Fig3に示される位置973−800の配列と相補的な少なくとも約174の塩基配列を3′末端で持つ。

0018

核酸配列は、検出用標識例えば放射性蛍光性またはビオニレートされた(biotinylated) 標識でラベルされた場合、プローブとして使用され得る。本発明にかかる標識プローブ核酸配列は、中でも未知の細胞、例えば癌細胞がT細胞であるかどうかを決定するために使用され得る。

0019

本発明にかかるcDNA配列は、以下の様に製造され得る。完全なメッセンジャーRNA(mRNA)は、T細胞、例えばMOLT−3または胸腺細胞から得られ、mRNAに相補的なcDNAを製造するために使用される。cDNAは、適切なクローニングビヒクル(vehicle)、例えばpBR322またはpEP502EBSへ挿入され、次いで、適切な宿主、例えば大腸菌へ挿入される。結果得られた宿主は、cDNAの複製を多数生成させ得る適切な条件下で培養される。このように生成されたcDNAは回収され、それがT細胞においてのみ発現されるのかどうかを決定するためにスクリーニングされる。

0020

T細胞抗原レセプターをコードするcDNAを持つ適切なクローニングビヒクルを含む宿主細胞が製造され、当業者にとって既知の方法に従ってレセプターポリペプチドを生成するために使用される。

0021

本発明はまた、T細胞抗原レセプターの少なくとも一部であり Fig3に示される様な少なくとも約312のアミノ酸を含むポリペプチドを包含する、核酸配列によりコードされるポリペプチドに関する。 Fig3に示される位置255−312の配列と一致する少なくとも約58のアミノ酸をc−末端で含む少なくとも約312のアミノ酸の他のポリペプチドは、T細胞レセプター抗原である。そのようなポリペプチドは、21にわたる隣接アミノ酸が約35%より大きい相同性をマウスおよびヒトλL鎖に対して持つ少なくとも1つの配列を含む。その相同性は可変部、結合部、および定常部における配列とともに存在している。

0022

ポリペプチドに対する抗体、例えば、モノクローナル抗体または血清由来抗体は当業者により既知の方法を用いて製造され得る。そのような抗体はT細胞レセプター抗原の存在を検出するため、および未知の細胞、例えば癌細胞が、T細胞であるかどうかを決定するために使用され得る。そのために試験されるべき試料は、抗原抗体複合体を形成するための適切な条件下で抗体で処理され、複合体が存在するかどうかが決定される。

図面の簡単な説明

0023

細胞抗原受容体ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、当業界ではよく知られているKohlerとMilsteinの方法(Nature, 256:495−497 (1975))、それを詳しく解説したGalfreとMilstein(Methodsin Enzymology 73:3−46)(1981))などの方法に従って作成することができる。適切な方法の例としては以下のようなものがある。
1.12週令のBALB/Cマウスを精製したT細胞抗原受容体を含む血清で免疫し、3週間後に2回目の血清注射を行った。2回目の注射の2週間後に抗血清アッセイで最もよかった個体を融合用に選んだ。1ヶ月の休養期間の後動物に抗原を含む血清を静脈注射した。静脈注射の4日後に動物を殺し、脾臓を取り出し細胞を遊離させ、約108個の脾臓細胞と約107個のミエローマ細胞を混合し、遠心して細胞をペレットにして上清を完全に除いた。
2.ペレットをそっとほぐして40℃の湯浴中におき、0.8mlの50%ポリエチレングリコールかきまぜながら加え、融合を行わせた。
3.徐々に培地を加えてPEGの濃度を下げ、細胞を遠心で集め、48穴のプレートに蒔き、HAT培地で3週間培養した。蛋白イムノブロットウェスターンブロット)を用いて、特異的抗体を産生しているハイブリッドをウェルごとにスクリーニングした。有望なウェルについては細胞を増やして制限希釈で2回クローニングし、イムノブロッティングにより再度選択し陽性なクローンを同定した。

0024

図1クローンYT35とのハイブリッドを形成するT細胞RNAおよび非T細胞RNAのノーザン法試験の結果を示す図である。
図2図1続きである。
図3クローンYT35およびYT76とのハイブリッドを形成するmRNAのインビトロにおける翻訳生成物のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。
図4T細胞特異的クローンYT35部分のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。但し、YT35においてTはチミンヌクレオチド、Gはグアニンヌクレオチド、Aはアデニンヌクレオチド、およびCはシトシンヌクレオチドをそれぞれ示す図である。
図5図4の続きである。
図6YT35の推定されるアミノ酸配列と、マウスおよびヒトL鎖のアミノ酸配列の対角線点マトリックス(diagonal dot matrix)比較を示す図である。
図7クローンYT35の推定されるアミノ酸配列とマウスおよびヒトλL鎖のそれとの直接比較を示す図である。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ