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技術 新規ウイルス及びこれを用いた犬の嘔吐下痢症予防剤

出願人 株式会社日清製粉グループ本社
発明者 古閑淑鈴木宏松野重夫小林千佳山本重一郎
出願日 1996年7月31日 (24年3ヶ月経過) 出願番号 1996-201681
公開日 1998年2月17日 (22年9ヶ月経過) 公開番号 1998-042866
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理 糖類化合物 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬
主要キーワード 小型球 集団発生 下痢発症 カプシッド UV光線 酢酸ウラン 下痢便 飼育施設
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この項目の情報は公開日時点(1998年2月17日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (1)

解決手段

次の特性を有する流行性嘔吐下痢発症ウイルス、この逆転写DNA及びこれを有効成分とする犬の流行性嘔吐下痢症予防剤

(1)エンヴェロープを有さない。

(2)直径約30nmの小型球RNAウイルスである、

(3)5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−ATCCATCATCACCATA−3′のプライマーを使用してRT−RCRを実施した場合に長さが約1000bpの産物が得られる。

効果

このウイルス又はDNAは、犬の流行性嘔吐下痢症予防剤の製造に有用である。

概要

背景

近年、ペット、就中子飼育が盛んとなり、子犬嘔吐下痢による被害も増加している。子犬の嘔吐下痢症の原因としてはParvo virus(PV)が良く知られている。このPV感染症予防を目的としてPVを用いたワクチンが既に市販されておりPVが原因である子犬の嘔吐下痢症の予防にはある程度役立っている。

概要

次の特性を有する犬の流行性嘔吐下痢発症ウイルス、この逆転写DNA及びこれを有効成分とする犬の流行性嘔吐下痢症予防剤

(1)エンヴェロープを有さない。

(2)直径約30nmの小型球RNAウイルスである、

(3)5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−ATCCATCATCACCATA−3′のプライマーを使用してRT−RCRを実施した場合に長さが約1000bpの産物が得られる。

このウイルス又はDNAは、犬の流行性嘔吐下痢症予防剤の製造に有用である。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

次の特性を有する流行性嘔吐下痢発症ウイルス。(1)エンヴェロープを有さない、(2)直径約30nmの小型球RNAウイルスである、(3)5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−ATCCATCATCACCATA−3′のプライマーを使用してRT−RCRを実施した場合に長さが約1000bpの産物が得られる。

請求項2

約1000bpの産物の両端の部分配列が5′−CACUAUGAUGCAGAUUA−3′及び5′−UAUGGUGAUGAUGAGAU−3′である請求項1記載のウイルス。

請求項3

両端の部分配列が5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−TATGGTGATGATGAGAT−3′であるか、又はその相補配列である約1000bpの配列を有する請求項1又は2記載のウイルスの逆転写DNA。

請求項4

請求項1もしくは2記載のウイルス、請求項2記載の逆転写DNA、それらの部分配列又はそれらの遺伝子産物もしくは遺伝子組み換え体を有効成分とする犬の流行性嘔吐下痢症予防剤

技術分野

0001

本発明は、流行性嘔吐下痢発症原因となる新規ウイルス、その遺伝子断片及びこれを用いた犬の流行性嘔吐下痢症予防剤に関する。

背景技術

0002

近年、ペット、就中子犬の飼育が盛んとなり、子犬の嘔吐下痢による被害も増加している。子犬の嘔吐下痢症の原因としてはParvo virus(PV)が良く知られている。このPV感染症予防を目的としてPVを用いたワクチンが既に市販されておりPVが原因である子犬の嘔吐下痢症の予防にはある程度役立っている。

発明が解決しようとする課題

0003

しかしながら、このPVワクチンを接種しているにもかかわらず、子犬が流行性の嘔吐下痢を発症することが少なくなかった。従って、PV以外による犬の流行性嘔吐下痢症の原因の究明及びその予防方法の開発が望まれていた。

課題を解決するための手段

0004

そこで、本発明は犬の嘔吐下痢症の原因としてPV以外の病原体があるのではないかとの考えに基づき、研究を重ねた結果、ヒト小児急性胃腸炎の原因ウイルスであるノーウォークウイルス(Norwalk virus)に類似するウイルスが犬の嘔吐下痢症の原因ウイルスであること、このウイルスはPVのワクチンを2回接種しているにもかかわらず集団発生した子犬の流行性嘔吐下痢症例から見出されたこと、また電顕カリヒウイルスやアストロウイルスとは形態学的に異なっていることなどから新規なウイルスであること、またその部分塩基配列を見出し、さらにはこれらがワクチンとして応用可能であることを見出し本発明を完成した。

0005

すなわち、本発明は、次の特性を有する犬の流行性嘔吐下痢発症性ウイルスを提供するものである。
(1)エンヴェロープを有さない、(2)直径約30nmの小型球RNAウイルスである、(3)5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−ATCCATCATCACCATA−3′のプライマーを使用してRT−RCRを実施した場合に長さが約1000bpの産物が得られる。

0006

また、本発明は、両端の部分配列が5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−TATGGTGATGATGAGAT−3′であるか、又はその相補配列である約1000bpの配列を有する上記ウイルスの逆転写DNAを提供するものである。

0007

さらにまた、本発明は上記ウイルス、その逆転写DNA、それらの部分配列、又はそれらの遺伝子産物もしくは遺伝子組み換え体を有効成分とする犬の流行性嘔吐下痢症予防剤を提供するものである。

発明を実施するための最良の形態

0008

本発明のウイルスは、PVのワクチンが無効な犬の流行性嘔吐下痢症例に見出され、流行性の嘔吐下痢症を発症した犬の糞便より採取することができる。例えば、犬の下痢便より上澄液をとり、界面活性剤を加えて乳化し、乳化液ショ糖溶液上に重層した後、超遠心することにより得られる。

0009

得られた本発明ウイルスは、直径約30nmの小型球形RNAウイルスであり、エンヴェロープを有さない。また、電顕上、カリヒウイルスやアストロウイルスとは形態学的に異なっている。

0010

本発明ウイルスはRNAウイルスであるので、RT−PCRにより逆転写DNAを増幅させてその塩基配列を決定することができる。まず、ウイルス粒子からRNAを抽出し、逆転写酵素を用いて逆転写させる。得られたDNAにPCRを施す。PCR用プライマーとしては、ノーウォークウイルス遺伝子オープンリーディングフレーム1中のプライマーペア(5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−ATCTCATCATCACCATA−3′)を用いることが好ましい。その結果、両端の部分配列が5′−CACTATGATGCAGATTA−3′及び5′−TATGGTGATGATGAGAT−3′である約1000bpのPCR産物が得られた。従って、本発明ウイルスの逆転写DNAは当該部分配列又はその相補配列を有する。一方、本発明ウイルスは、両端の部分配列が、5′−CACUAUGAUGCAGAUUA−3′及び5′−UAUGGUGAUGAUGAGAU−3′である約1000bpの配列を有するものである。なお、プライマーペアとしてノーウォークウイルス遺伝子由来のものを用いたが、ノーウォークウイルスは、このプライマーペアを用いたPCR産物の分子量が325bpであることから、本発明ウイルスがノーウォークウイルスと異なることは明らかである。

0011

本発明のウイルス、その逆転写DNA、それらの部分配列、又はそれらの遺伝子産物もしくは遺伝子組み換え体は犬の流行性嘔吐下痢症予防剤として利用できる。好ましくは当該遺伝子がコードする物質のうち免疫原性に優れた部分、例えばカプシッド蛋白をコードする遺伝子をアデノウイルスワクチニアウイルスバキュロウイルス酵母等にベクターを利用して組み込み大量に発現させることによりワクチン、すなわち犬の嘔吐下痢症予防剤として利用することができる。

0012

本発明ウイルスの逆転写DNA断片を他のベクターに組み込み、その遺伝子がコードする物質(遺伝子産物)を得るには、例えば、カイコ核多角体病ウイルスによるタンパク質大量発現用キット:Bom−Ex(日本農産工業株式会社製、フナコシ株式会社販売)と、昆虫樹立細胞:BmN4細胞(日本農産工業株式会社製、フナコシ株式会社販売)やカイコ幼虫(日本農産工業株式会社製、フナコシ株式会社販売)とを組み合わせて利用することができる。

0013

また、大腸菌宿主に用いて本発明ウイルスの逆転写DNA組み込みのための挿入プラスミドを作製し、さらにこの挿入プラスミドのトランスフェクションとワクチニアウイルスとの感染を同時に行って、培養動物細胞中で、相同性組換えにより遺伝子組換えワクチニアウイルスを生成させワクチンとして利用することもできる。

0014

得られたワクチンは、例えば子犬又は妊娠中母犬投与することにより犬の嘔吐下痢症の予防に利用することができる。またアデノウイルスやワクチニアウイルスに組み込んだ場合にはアデノウイルスやワクチニアウイルスそのものを投与しても良い。

0015

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。

0016

実施例1(ウイルスの分離)
犬の集団飼育施設において1以下の子犬に流行性の嘔吐下痢症が発生した。この子犬の下痢便の乳剤を30%ショ糖溶液上に重層して、回転数35000rpm 2時間超遠心を行い、その沈渣蒸留水で再浮遊し酢酸ウランによりネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡日本電子株式会社製;JEOL 100C)により33,000倍にて観察し、直径約30nmの小型球形ウイルスを検出した(図1)。

0017

実施例2(RT−PCRによるDNAの検出)
実施例1で用いた糞便乳剤200μlに6Mグアニジンチオシアネートを等量加えた後に、RNaid法によってRNAを抽出し、25μlの蒸留水に再浮遊させた。PCR用プライマーとしてノーウォークウイルス遺伝子のオープンリーディングフレーム1中のプライマーペア(Sense 82, 5′-CACTATGATGCAGATTA-3′;Antisense 81, 5′-ATCTCATCATCACCATA-3′;4544-4869)を使用した。200μMdNTPs、0.25μM 81プライマー、50単位RNasin(生化学工業株式会社製)、1.25mMジチオスレイトール、5単位AMV逆転写酵素を含むPCR緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.3、75mM KCl、1.5mM MgCl2、1%ゼラチン)15μlに抽出したRNAを5μl加えた。逆転写反応は42℃で1時間行った後、0.25μM 82プライマーと1単位Taqポリメラーゼ(宝酒造株式会社製)を含むPCR緩衝液30μlを加えた。DNA増幅は、最初の変性処理を3分間行った後、変性処理94℃1分、アニーリング45℃1分20秒、増幅反応72℃1分のサイクルを40回行い、最後に増幅反応72℃15分間行った。PCR産物について1.5%アガロース電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド染色しUV光線下で観察したところ1000bp付近バンドが検出され、上記の流行性嘔吐下痢の原因が本発明ウイルスであったことが確認された。

発明の効果

0018

本発明ウイルス又はそのDNAを用いれば、犬、とりわけ子犬の嘔吐下痢症の予防剤を製造することができる。

図面の簡単な説明

0019

図1本発明ウイルスの形態を示す電子顕微鏡写真である。

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