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技術 パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチド

出願人 藤沢薬品工業株式会社
発明者 青木宙北尾忠利
出願日 1989年3月24日 (31年3ヶ月経過) 出願番号 1997-030069
公開日 1997年12月16日 (22年6ヶ月経過) 公開番号 1997-322782
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード アンギュラ STEP 反応カラム 側末端 ディスポーザ 類結節症 養殖場 分類法
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1997年12月16日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (1)

解決手段

この発明は、細菌性類結節症原因菌であるパスツレラ・ピシシーダ種の決定オリゴヌクレオチドに関するものであり、該菌種の同定に有用なものである。

概要

背景

および

概要

この発明は、細菌性類結節症原因菌であるパスツレラ・ピシシーダ種の決定オリゴヌクレオチドに関するものであり、該菌種の同定に有用なものである。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

次のような塩基配列からなるパスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドGCACTACGAATGTGAAAACCC,GGTGACACATCGACTACTGCAまたはCTTGTGGAGTAATGCTGACAG

技術分野

0001

魚病菌による感染症養殖場で発生したとき、その原因菌究明することは魚病の予防・治療にとって重要なことである。従来、魚病菌を問わず一般細菌分類、同定はその形態や生化学的性状あるいは免疫学的手法を用いた生物学的性状でおこなわれてきた。最近、生化学あるいは分子遺伝学の進歩により、その菌の持つ染色体DNAやRNA、菌体物質および菌が生産する物質を比較することによる、いわゆる化学的性状による分類が行なわれるようになってきた。しかしながら、生物学的性状あるいは化学的性状による分類法は、最近の分類学にとっては重要であるが、各々の手法は複雑で時間を費やすために、病の原因菌を簡便かつ迅速に同定するには適していない。

背景技術

0001

この発明は魚病菌の種決定遺伝子DNAに関するものであり、さらに詳細にはパスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドおよびそれを含有する該菌種の同定用試薬に関するものである

0002

課題を解決するための手段

0002

および

0003

0004

0005

0006

0007

0008

この様にして得られた、二種類のビブリオアンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドは次のような特徴を有する。
(1)該オリゴヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ次の通りである。

0009

0010

0011

0012

0013

ID=000004HE=020 WI=051 LX=1245 LY=0500
条件:検出器紫外吸光光度計(254nm)
カラムM&S INSTRUMENTS INC
品番A104−15
カラム温度室温
移植トリエチルアミンアセトニトリル混液(95:5)
流量 1,000ml/分
注入量 100μl

0014

また、三種類のパスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドは、それぞれ次の特徴を有する。
(1)該オリゴヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ次の通りである。

0015

0016

0017

発明の効果

0018

0019

ID=000007HE=030 WI=053 LX=1235 LY=1850
条件:検出器紫外吸光光度計(254nm)
カラムM&S INSTRUMENTS INC製
品番A104−15
カラム温度室温
移植相トリエチルアミン・アセトニトリル混液(95:5)
流量 1,000ml/分
注入量 100μl

0020

0021

0022

0023

次にこの発明を実施例により説明する。
実施例1(ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドNo.1および2の製法
目的の塩基配列に従って、バイオサーチ社製DNA合成装置サイクロン(SYCLONE)を使用し、その説明書にしたがって合成した。即ち、装置に下表1に示した試薬装填し、目的の塩基配列に従って希望シーケンスキーボードから入力、プレパックされたCPG支持体(0.2μmol)からなるショートフラグメントディスポーザ反応カラムを装填し、自動運転した。

0024

0025

0026

0027

実施例2(パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドNo.3,No.4およびNo.5の製法)
目的の塩基配列に従って、バイオサーチ社製DNA合成装置サイクロン(SYCLONE)を使用し、その説明書にしたがって合成した。即ち、装置に実施例1の表1に示した試薬を装填し、選んだ塩基配列に従って希望のシーケンスをキーボードから入力、プレパックされたCPG支持体(0.2μmol)からなるショートフラグメント用ディスポーザル反応カラムを装填し、自動運転した。

0028

0029

0030

実施例3(DNAハイブリダイゼーション法によるビブリオ・アンギュラルムの同定)
被験菌株のDNA液の調整)表2に示したように各種の魚病菌の標準株および野外分離株を準備し、それぞれの菌種について表2に記載した培地各10mlに一夜培養した菌液を得た。得られた培養菌液を6,000rpmで10分間遠心して、上澄液を捨て、それぞれの沈殿菌体にトリス・HCl(pH8.0)とEDTAをそれぞれ50mM含有する溶液0.5mlを加えた。これらの菌体を含む溶液を−20℃で凍結した後、0.25Mトリス・HCl(pH8.0)にリゾチーム和光純薬製)10mg/mlを溶解した溶液を0.2ml加えた。これらを室温に放置して解凍した後、氷冷下で45分間反応させた。次にSTEP溶液(プロテナーゼKlmg/ml,0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS),50mMトリス・HCl(pH7.5),0.4M EDTA)を0.4ml加え、時々撹拌しながら50℃で60分間反応させた。

0031

0032

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実施例4(DNAハイブリダイゼーション法によるパスツレラ・ピシシーダの同定)
(被験菌株のDNA液の調整)表4に示したように各種の魚病菌の標準株および野外分離株を準備し、それぞれの菌種について表4に記載した培地各10mlに一夜培養した菌液を得た。得られた培養菌液を6,000rpmで10分間遠心して、上澄液を捨て、それぞれの沈殿菌体にトリス・HCl(pH8.0)とEDTAをそれぞれ50mM含有する溶液0.5mlを加えた。これらの菌体を含む溶液を−20℃で凍結した後、0.25Mトリス・HCl(pH8.0)にリゾチーム(和光純薬製)10mg/mlを溶解した溶液を0.2ml加えた。

0038

0039

0040

標識プローブDNAの作製)実施例2で得られた三種類のパスツレラ・ピスシシーダの種決定オリゴヌクレオチドNo.3,オリゴヌクレオチドNo.4およびオリゴヌクレオチドNo.5のそれぞれの5’側末端をγ32P(NEN社)により標識(前出)し、標識化合物を作製した。
(DNA−DNAドットハイブリダイゼーション)先に作製した被験菌の染色体DNA液を100℃で5分間加熱し、氷水急冷した後、分画したニトロセルロースフィルター上にそれぞれプロットし、良く乾燥させた後、80℃で2時間熱処理を加えた。

0041

0042

図面の簡単な説明

0043

0044

0045

図1オリゴヌクレオチドNos1−5のポリアクリアミドゲル電気泳動の結果を、pBR322制限酵素HpaIIで切断したものを指標にして示したものである。

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