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課題

解決手段

ストレプトミセス・ラベンドフォリエ(Streptomyces lavendofoliae)MJ908-WF13株を培養し、下記の式で表わされるピペラスタチンBを単離した。ピペラスタチンBはセリンカルボキシペプチダーゼの阻害活性を有し新しい生理作用を有する薬剤として、また抗高血圧剤あるいは利尿剤などの医薬としての用途が期待できる。

概要

背景

セリンカルボキシペプチダーゼは、活性中心セリン残基が存在するカルボキシペプチダーゼである。セリンカルボキシペプチダーゼとしてはカルボキシペプチダーゼYおよび血小板デアミダーゼなどが知られている。

前記の血小板デアミダーゼはサブスタンスPをはじめとするタキキニンブラジキニンなどを分解する〔The Journal of Biological Chemistry、265巻、11265〜11272頁、1990年〕。血小板デアミダーゼによって分解されるサブスタンスPは、血栓溶解活性化作用を有することが報告されている〔Experimentia、49巻、242〜244頁、1993年〕。したがって、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、抗血栓剤ならびにこれらの生理活性ペプチド活性調節剤への応用が期待される。

ラット尿中にはブラジキニンを分解するカルボキシペプチダーゼY様酵素が存在し、当酵素は尿中のブラジキニンを分解することで高血圧症発症関与していることが報告されている〔European Journal of Pharmacology、232巻、181〜190頁、1993年〕。したがってセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、尿中のブラジキニンの生理作用を増強し、抗高血圧剤および利尿剤などへの応用が期待される。

セリンカルボキシペプチダーゼ阻害物質としては、ジイソプロピルフルオロリン酸蛋白質核酸酵素、28巻、1421〜1431頁、1983年〕、キモスタチン〔TheJournal of Biological Chemistry、265巻、11265〜11272頁、1990年〕およびポストスタチン〔European Journal of Pharmacology、232巻、181〜190頁、1993年〕ならびにエベラクトンB〔Japanese Journal of Pharmacology、65巻、79〜82頁、1994年〕などが報告されている。

概要

放線菌培養法によりセリンカルボキシペプチダーゼに対して高い特異性阻害活性を有する新規生理活性物質を提供する。

ストレプトミセス・ラベンドフォリエ(Streptomyces lavendofoliae)MJ908-WF13株を培養し、下記の式で表わされるピペラスタチンBを単離した。ピペラスタチンBはセリンカルボキシペプチダーゼの阻害活性を有し新しい生理作用を有する薬剤として、また抗高血圧剤あるいは利尿剤などの医薬としての用途が期待できる。

目的

ジソイプロピルフルオロリン酸、キモスタチン、ポストスタチン、エベラクトンBなどは、セリンカルボキシペプチダーゼに対する阻害活性の特異性が低い。したがってセリンカルボキシペプチダーゼに対する特異性の高い阻害活性を有する新規化合物が望まれている。本発明の目的は、そのような特異性の高いセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有する新しい生理活性物質、その製造法およびその用途を提供することにある。

効果

実績

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請求項1

次式(I):ID=000003HE=030 WI=092 LX=0590 LY=0350で表わされる生理活性物質ペラスタチンBまたはその薬学的に許容し得る塩。

請求項2

ピペラスタチンB生産菌を培養し、その培養物から請求項1で式(I)で表わされるピペラスタチンBを採取することを特徴とする、生理活性物質ピペラスタチンBの製造法

請求項3

ピペラスタチンBあるいはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤

請求項4

ピペラスタチンBあるいはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗高血圧剤

請求項5

ピペラスタチンBあるいはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する利尿剤

技術分野

0001

本発明は、酵素阻害活性を有する新規生理活性物質であるピペラスタチンB(Piperastatin B)ならびにその製造法に関する。また、本発明はピペラスタチンBまたはその塩を有効成分とする種々の薬剤にも関する。本発明のピペラスタチンBは医薬動物薬、試薬等の分野への応用が期待される。

背景技術

0002

セリンカルボキシペプチダーゼは、活性中心セリン残基が存在するカルボキシペプチダーゼである。セリンカルボキシペプチダーゼとしてはカルボキシペプチダーゼYおよび血小板デアミダーゼなどが知られている。

0003

前記の血小板デアミダーゼはサブスタンスPをはじめとするタキキニンブラジキニンなどを分解する〔The Journal of Biological Chemistry、265巻、11265〜11272頁、1990年〕。血小板デアミダーゼによって分解されるサブスタンスPは、血栓溶解活性化作用を有することが報告されている〔Experimentia、49巻、242〜244頁、1993年〕。したがって、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、抗血栓剤ならびにこれらの生理活性ペプチド活性調節剤への応用が期待される。

0004

ラット尿中にはブラジキニンを分解するカルボキシペプチダーゼY様酵素が存在し、当酵素は尿中のブラジキニンを分解することで高血圧症発症関与していることが報告されている〔European Journal of Pharmacology、232巻、181〜190頁、1993年〕。したがってセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、尿中のブラジキニンの生理作用を増強し、抗高血圧剤および利尿剤などへの応用が期待される。

0005

セリンカルボキシペプチダーゼ阻害物質としては、ジイソプロピルフルオロリン酸蛋白質核酸酵素、28巻、1421〜1431頁、1983年〕、キモスタチン〔TheJournal of Biological Chemistry、265巻、11265〜11272頁、1990年〕およびポストスタチン〔European Journal of Pharmacology、232巻、181〜190頁、1993年〕ならびにエベラクトンB〔Japanese Journal of Pharmacology、65巻、79〜82頁、1994年〕などが報告されている。

発明が解決しようとする課題

0006

ジソイプロピルフルオロリン酸、キモスタチン、ポストスタチン、エベラクトンBなどは、セリンカルボキシペプチダーゼに対する阻害活性特異性が低い。したがってセリンカルボキシペプチダーゼに対する特異性の高い阻害活性を有する新規化合物が望まれている。本発明の目的は、そのような特異性の高いセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有する新しい生理活性物質、その製造法およびその用途を提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

本発明者らは、上述の期待にこたえるべく酵素阻害活性を有する新規物質の探索を続けていたところ、先にピペラスタチンAを見出した(特開平7-215994号公報)。今回、さらにピペラスタチンA生産菌の一例であるストレプトミセス・ラベンドフォリエ(Streptomyces lavendofoliae)MJ908-WF13株の培養物中に酵素阻害活性を有する別異の物質が生産されていることを見出し、その有効物質を単離し、この新規物質をピペラスタチンBと命名し、その化学構造を決定した。これらの知見に基づいて、本発明を完成させた。

0008

第1の本発明の要旨とするところは、次式(I):
ID=000004HE=030 WI=092 LX=0590 LY=0300
で表されるピペラスタチンBおよびその薬学的に許容し得る塩を提供するものである。

0009

ピペラスタチンBは水に難溶性酸性物質である。ピペラスタチンBはその製薬学的に許容し得る塩の形態に常法で転化できる。このような塩としては、たとえばナトリウムカリウムリチウムなどのアルカリ金属およびカルシウムなどのアルカリ土類金属などとの塩があげられる。

0010

ピペラスタチンBの物理化学的性状は下記のとおりである。
(1)色および形状:白色粉末
(2)融点:216〜218℃
(3)分子式:C37H65N9O10
(4)マススペクトルFAB-MS (pos.) m/z 796(M+H)+
(5)比旋光度:[α]D23−36.6°(c 0.4、メタノール
(6)紫外部吸収スペクトル(メタノール)末端吸収のみを示す。
(7)赤外部吸収スペクトル:添付図面の第1図に示す。
(8)1H-NMRスペクトル:添付図面の第2図に示す。
(9)13C-NMRスペクトル:添付図面の第3図に示す。
(10)溶解性:メタノール、エタノールプロパノールに可溶で、水に難溶である。
(11)薄層クロマトグラフにおけるRf値:0.36
シリカゲル薄層クロマトグラフ(メルク社製、Art.5715)を用い、展開溶媒としてクロロホルム−メタノール−水(65:25:2)を使用した。

0011

試験例1
カルボキシペプチダーゼYに対するピペラスタチンBの酵素阻害活性の評価はカルボキシペプチダーゼA〔Journal of Antibiotics、37巻、682〜684頁、1984年〕の酵素阻害活性の測定法変法で行った。すなわち、10mMのヒプリル−L−フェニルアラニンペプチド研究所製)0.01ml、50mMのナトリウムリン酸緩衝液(pH6.5)0.05ml、検体としてのピペラスタチンBを含む水溶液0.034mlを加えた混合液に、カルボキシペプチダーゼY(オリエンタ酵母工業社製)0.05mg/mlとアルブミン1mg/mlを含む水溶液を0.006ml加えて、37℃、45分間反応させた。1N苛性ソーダの0.006mlを加えて反応を停止し、10分後に0.36Mナトリウムリン酸緩衝液(pH7.2)の0.05mlを加え、次いで2%塩化シアヌルメチルセロソルブ溶液0.15mlを加えて発色させ、室温に10分放置後に、その発色した溶液の405nmにおける吸光度(a)を測定した。同時に、検体を含まないで同様に測定した時の吸光度(b)を測定した。なお、この時それぞれに対する盲検の吸光度(a')、(b′)を測定し、阻害率(%)を計算式〔1−(a−a′)/(b−b′)〕×100により計算した。50%阻害率を示す検体の濃度をIC50の値とした。

0012

この定量法でピペラスタチンBは、0.07μg/mlの濃度でカルボキシペプチダーゼYを50%阻害した。

0013

試験例2
ラット尿管尿におけるブラジキニンの分解に対するピペラスタチンBの阻害活性の評価は、European Journal of Pharmacology、232巻、181〜190頁(1993年)に記載の方法の改良法で行った。12〜14週令の雄のSDラットの尿管から採取した尿管尿0.01mlに検体としてのピペラスタチンBと1μmole/mlのブラジキニン(ペプチド研究所製)を含む0.85%の塩化ナトリウム溶液0.03mlとを加え、37℃で45分間反応させた。その後に、0.1%のトリフルオロ酢酸と10%のアセトニトリルを含む水溶液0.5mlを加え反応を止めた。反応液ポアーサイズ0.45μmのメンブレン(日本ミリポア社製)に通したあと、そのうち0.1mlを高速液体クロマトグラフィーに供しブラジキニンの分解を測定した。

0014

すなわち、1.5ml/minの流速でA液(0.1%のトリフルオロ酢酸を含む10%のアセトニトリル水溶液)を用いて平衡化したShodex RS pack DS-613カラム(昭和電工社製)に前記反応液の0.1mlを吸着させた。さらにカラムを3分間A液で洗浄したのち、A液からB液(0.1%のトリフルオロ酢酸を含む40%のアセトニトリル水溶液)への25分間の直線濃度勾配条件で溶出し、さらにB液からC液(0.1%のトリフルオロ酢酸を含む70%のアセトニトリル水溶液)への5分間の直線濃度勾配で溶出して高速液体クロマトグラフィーを行い、その溶出液の210nmにおける吸光度を測定した。反応液中のブラジキニンと、C末端アルギニン残基が切断されたdes-Arg9-ブラジキニンとの濃度は、上記のクロマトグラフィーピーク面積を測定し、基準物質(ともにペプチド研究所製)を用いた外部標準法によって定量した。

0015

前記の条件で検体(ピペラスタチンB)の不存在下にラットの尿管尿中で、ブラジキニンを37℃、45分間反応にかけた場合の反応液を前記の高速液体クロマトグラフィーにかけて得られた溶出液について測定した吸光度と滞留時間(分)との関係を表わすクロマトグラフを添付図面の図4(a)に示す。反応前にブラジキニンは、当初濃度が0.75μmole/mlで存在したが、上記の反応中に分解されて、0.26μmole/mlの濃度に減少し、しかも0.18μmole/mlのdes-Arg9-ブラジキニンが生成したことが認められた。別に、検体としてのピペラスタチンBを100μg/ mlの濃度で添加して存在させながら上記と同様の条件で反応にかけた場合の反応液を前記と同様に高速液体クロマトグラフィにかけ、そしてその溶出液について測定した吸光度と滞留時間(分)との関係を表わすクロマトグラフを添付図面の表4(b)に示す。この場合には、des-Arg9-ブラジキニンの生成は0.01μmole/ml以下に阻害され、ブラジキニンの残存量は0.66μmole/mlとなり、ブラジキニンの分解が抑制されたことが認められる。

0016

さらに、第2の本発明の要旨は、ストレプトミセス属に属する前記の式(I)で表わされるピペラスタチンBの生産菌を培養し、その培養物からピペラスタチンBを採取することを特徴とするピペラスタチンBの製造法にある。

0017

本発明の方法に使用されるピペラスタチンBの生産菌の一例としては、本発明者らにより分離された前記のストレプトミセス・ラベンドフォリエ(Streptomyceslavendofoliae)MJ908-WF13がある。なお、MJ908-WF13株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成5年11月1日、FERM P-13940として受託されている(特開平7−215994号、参照)。

0018

MJ908-WF13株の菌学的性状は下記の通りである。
1.形 態
MJ908-WF13株は、分枝した基生菌糸よりらせん状の気菌糸伸長する。輪生枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子鎖には50個以上の円筒形の胞子の連鎖を認め、胞子の大きさは約0.5〜0.9×0.7〜1.0ミクロンであった。なお、胞子の表面は平滑である。

0019

2.各種培地における生育状態
色の記載について[ ]内に示す標準は、コンティナー・コーポレーションオブ・アメリカカラーハーモニーマニュアル(Container Corporation ofAmericaのcolor harmony manual)を用いた。
(1)シュクロース硝酸塩寒天培地(27℃培養)
無色の発育上に、うすピンク[5gc, Peach Tan〜4ec, Bisque]の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(2)グルコースアスパラギン寒天培地(27℃培養)
うす黄[1ca, Cream]の発育上に、うすピンク[5ca, Pale Peach〜4gc, NudeTan]の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(3)グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP-培地5、27℃培養)
うす黄[3ca, Pearl Pink]の発育上に、うすピンク[5gc, Peach Tan]〜うす赤[5ie, Copper Tan]の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びる。
(4)スターチ無機塩寒天培地(ISP-培地4、27℃培養)
うす黄[3ca, Pearl Pink]の発育上に、うすピンク[5gc, Peach Tan〜4ec,Bisque]の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。

0020

(5)チロシン寒天培地(ISP-培地7、27℃培養)
うす茶[3lg, Lt Brown〜3ig, Beige Brown]の発育上に、うすピンク[5ec,Dusty Peach〜5gc, Peach Tan]の気菌糸を着生する。溶解性色素は暗い茶を呈する。
(6)栄養寒天培地(27℃培養)
明るい黄味だいだい[2gc, Bamboo〜3gc, Lt Tan]の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(7)イースト麦芽寒天培地(ISP-培地2、27℃培養)
うす黄茶[2ic, Honey Gold]の発育上にうすピンク[5ec, Dusty Peach]〜ピンク灰[5ge, Rosewood]の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。
(8)オートミール寒天培地(ISP-培地3、27℃培養)
うす黄茶[2ic, Honey Gold]の発育上に、うすピンク[5ec, Dusty Peach〜5gc, Peach Tan]の気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。
(9)グリセリン・硝酸塩寒天培地(27℃培養)
うす黄[3ca, Pearl Pink]の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。

0021

(10)スターチ寒天培地(27℃培養)
無色の発育上に、うすピンク[5gc, Peach Tan〜4ec, Bisque]の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(11)リンゴ酸石灰寒天培地(27℃培養)
無色〜うす黄の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(12)セルロースろ紙片添加合成液、27℃培養)
53日間の培養では生育しなかった。
(13)ゼラチン穿刺培養
15%単純ゼラチン培地(20℃培養)では、うす黄〜黄茶の発育上に、うすピンクの気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地(24℃培養)の場合、無色〜うす黄の発育上に、うすピンクの気菌糸を着生し、溶解性色素は茶色を呈する。
(14)脱脂牛乳(37℃培養)
発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。

0022

3.生理的性質
(1)生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地(溶性デンプン1.0%、イースト・エキス0.2%、ひも寒天3.0%、pH7.0)を用い、10℃、20℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各温度で試験した結果、50℃を除き、そのいずれの温度でも生育する。生育至適温度は27℃〜30℃付近と思われる。
(2)ゼラチンの液化(15%単純ゼラチン培地、20℃培養;グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、24℃培養)
単純ゼラチン培地においては49日間の培養で液化が認められなかった。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地においては培養後16日目より液化が認められ、3週間を経過しても完了しなかった。その作用は弱い方である。
(3)スターチの加水分解(スターチ・無機塩寒天培地、ISP-培地4及びスターチ寒天培地、いずれも27℃培養)
いずれの培地においても培養後3日目頃より水解性が認められ、その作用は強い方である。

0023

(4)脱脂牛乳の凝固ペプトン化(脱脂牛乳、37℃培養)
2回試験を行い、1回目は培養後18日目頃より凝固状を呈し、2〜3日で完了後、ペプトン化が始まった。更にペプトン化は3週間の培養で完了せず、その作用は中等度〜弱い方である。2回目は培養後16日目頃より凝固なしにペプトン化が始まり、培養3週間で完了した。その作用は中等度である。
(5)メラニン様色素の生成(トリプトン・イースト・ブロス、ISP-培地1;ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ISP-培地6;チロシン寒天培地、ISP-培地7;いずれも27℃培養)
いずれの培地においても陽性である。

0024

(6)炭素源利用性プリハム・ゴトリーブ寒天培地、ISP-培地9、27℃培養)
D−グルコース、D−キシロース、L−アラビノースを利用して発育し、ラクトース、D−フラクトース、シュクロース、イノシトールラフィノース及びD−マンニトールは利用しない。ラムノースおそらく利用しない。
(7)硝酸塩の還元反応(0.1%硝酸カリウム含有ペプトン水、ISP-培地8、27℃培養)陽性である。(8)セルロースの分解(ろ紙片添加合成液、27℃培養)
53日間の観察で分解は認められない。

0025

以上の性状を要約すると、MJ908-WF13株は、その形態上、基生菌糸よりらせん状の気菌糸を伸長し、輪生枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子鎖には50個以上の円筒形の胞子を連鎖し、その表面は平滑である。種々の培地で、発育はうす黄〜うす黄茶、気菌糸はうすピンク〜ピンク灰を呈し、溶解性色素は茶色味を帯びる。生育至適温度は27〜30℃付近である。メラニン様色素の生成は陽性、蛋白分解力は中等度〜弱い方、スターチの水解性は強い方である。なお、細胞壁に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸は、LL−型であった。

0026

これらの性状より、MJ908-WF13株は、ストレプトミセス(Streptomyces)属に属すると考えられる。本物質と類似の構造のデプシドマイシン(depsidomycin、文献、The Journal of Antibiotics、43巻、1195頁、1990年)の生産菌でストレプトミセス・ラベンドフォリエ(Streptomyces lavendofoliae; 文献1、International Journal of Systematic Bacteriology、18巻、333頁、1968年;文献2、International Journal of Systematic Bacteriology、30巻、390頁、1980年;文献3、Berqey's Manual of Systematic Bacteriology、4巻、2490頁、1989年)と同定されたMI951-62F2株が近縁の種としてあげられた。

0027

そこで当研究所保存のMI951-62F2株、ストレプトミセス・ラベンドフォリエISP 5217株およびMJ908-WF13株とを実地に比較検討した。その成績大要次表に表示する。

0028

0029

表1から明らかなように、MJ908-WF13株とストレプトミセス・ラベンドフォリエISP 5217株とは、硝酸塩の還元反応及びイノシトールの利用性を除き、よく一致した性状を示した。また、本菌株とストレプトミセス・ラベンドフォリエMI951-62F2株とは、ゼラチンの液化を除き、いずれの性状においてもよく一致していた。しかし、前回のMI951-62F2株の同定試験の際にはグルコース・ペプトン・ゼラチン培地においてゼラチンの液化が弱いことが認められた。これらのことから、MJ908-WF13株はストレプトミセス・ラベンドフォリエIMC S-0784(MI951-62F2)に最も近縁であると考えられる。そこで、MJ908-WF13株をストレプトミセス・ラベンドフォリエ(Streptomyces lavendofoliae)MJ908-WF13と同定した。MJ908-WF13株は他の放線菌に見られるようにその性状が変化し易い。例えば、MJ908-WF13株の、またはこの株に由来する突然変異株(自然発生または誘発性)、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ピペラスタチンBを生産する菌は全て本発明に使用できる。

0030

ピペラスタチンB生産菌の培養について以下に説明する。本発明の方法では、前記のピペラスタチンB生産菌を通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴デキストリン澱粉グリセロール糖蜜、動・植物油等を使用しうる。また、窒素源としては、大豆粉小麦小麦胚芽コーンスティープリカー綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス硫酸アンモニウム硝酸ナトリウム尿素等を使用しうる。その他必要に応じナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムコバルト塩素燐酸硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ピペラスタチンBの生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。

0031

ピペラスタチンB生産菌の培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培養法が最も適している。培養に適当な温度は15〜37℃であるが、多くの場合26〜30℃付近で培養する。ピペラスタチンBの生産は培地や培養条件により異なるが、振盪培養タンク培養のいずれにおいても通常1〜10日間でその蓄積最高に達する。培養中のピペラスタチンBの蓄積量が最高になったときに培養を停止し、培養液からこの目的物質を単離精製する。

0032

ピペラスタチンBの採取と精製は次のように行われる。すなわち、本発明によって得られるピペラスタチンB生産菌の培養物からピペラスタチンBの採取に当たっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば、溶剤抽出法イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマトグラフィー法ゲルろ過法透析法沈澱法等を単独でまたは適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、ピペラスタチンBは、培養菌体中からはメタノール等の有機溶剤で抽出される。また、培養液中に蓄積されたピペラスタチンBは、クロマトグラフ用活性炭和光純薬工業株式会社製)などの吸着剤に吸着させ、有機溶剤と水の混合液で溶出される。たとえば、70%プロパノールなどでピペラスタチンBは溶出される。ピペラスタチンBを更に精製するには、シリカゲル(シリカゲル60、メルク社製、等)あるいはYMC-GELODS-A60-200/60(株式会社山村化学研究所製)等を用いるクロマトグラフィーまた高速液体クロマトグラフィーまたは向流分配法などを行うとよい。以上のような方法により、あるいはこれらを適宜組み合わせることにより、高純度のピペラスタチンBが得られる。

0033

ピペラスタチンBの急性毒性を評価するために、ピペラスタチンBをマウス腹腔内投与して2週間観察した結果、100mg/kgの投与でも毒性を示さなかった。第1の本発明によるピペラスタチンBまたはその塩は、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有することより、セリンカルボキシペプチダーゼの生体内での働きを研究するのに有用な試薬である。

0034

従って、第3の本発明によると、ピペラスタチンBまたはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤が提供される。

0035

更に、ピペラスタチンBはセリンカルボキシペプチダーゼに対して高い特異性で酵素阻害活性を有することに由り抗高血圧剤または利尿剤として利用できる。それ故、第4の本発明によると、ピペラスタチンBまたはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する抗高血圧剤が提供される。また、第5の本発明によると、ピペラスタチンBまたはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する利尿剤が提供される。

0036

第1の本発明によるピペラスタチンBまたはその塩は、抗高血圧剤またはその他の医薬として使用する場合、薬学的に許容できる通常の固体または液体状の担体混和することにより医薬組成物として製剤できる。

0037

従って、本発明の抗高血圧剤と利尿剤は、ピペラスタチンBまたはそれの薬学的に許容される塩を有効成分として含有し且つこれと混和された薬学的に許容できる固体または液体状の担体を含有する医薬組成物の形であることができる。

0038

本発明によるピペラスタチンBまたはその塩は、医薬として用いる場合は、一般に経口的にまたは非経口的に投与できる。ピペラスタチンBはマウスに腹腔内投与した場合に100mg/kg以上のLD50値を示し、毒性が低い。

0039

ピペラスタチンBまたはその製薬学的に許容できる塩は、賦形剤あるいは担体と混合して注射剤経口剤または坐剤などの製剤の形で投与される。賦形剤および担体としては製薬学上許容されるものが選ばれ、その種類および組成投与経路投与方法によって決まる。例えば、液状担体として水、アルコールもしくは大豆油ゴマ油ミネラル油などの動植物油などが用いられる。固体担体としてマルトース、シュクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体シクロデキストリンなどの多糖類ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。

0040

注射剤として製剤する場合には、液状担体は一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトールなどの糖類水溶液エチレングリコールポリエチレングリコール、などのグリコール類であることができる。また、イノシトール、マンニトール、グルコース、マンノース、マルトース、シュクロースなどの糖類、フェニルアラニンなどのアミノ酸類などの賦形剤と共に凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤例えば滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖液電解質溶液アミノ酸などの静脈投与用液体に溶解して使用できる。

0041

製剤された組成物中におけるピペラスタチンBの含量は製剤型により種々異なるが、通常は0.1〜98重量%、好ましくは1〜90重量%である。例えば注射液の場合には、通常、0.1〜5重量%の含量でピペラスタチンBを含むようにすることがよい。経口投与の場合には、前記固体担体もしくは液状担体と共に錠剤カプセル剤粉剤顆粒剤ドライシロップ剤液剤シロップ剤などの形態で用いられる。カプセル、錠剤、顆粒、粉剤の場合、一般にピペラスタチンBの含量は3〜98重量%、好ましくは5〜90重量%であり、残部は担体である。

0042

本発明によるピペラスタチンBまたはその塩の投与量は、患者年令、体重、症状、治療目的などにより決定される。しかし、その投与量は動物試験の結果など種々の状況を案して総投与量が一定量を越えない範囲で、連続的または間けつ的に投与できる。一定の条件下における投与の適量と投与回数は、専門医の決定による。

発明を実施するための最良の形態

0043

以下に本発明の実施例を示すが、ピペラスタチンBの性状が本発明によって明らかにされたので、それらの性状にもとずきピペラスタチンBの製造法を種々考案することができる。従って本発明は実施例に限定されるものではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明によって明らかにされたピペラスタチンBの性状にもとずいて公知の手段を施してピペラスタチンBを生産、濃縮、抽出、精製する方法をすべて包括する。

0044

実施例1
種培地として、グルコース2.0%、グリセリン2.0%、ファーマメディア 1.0%、トーストソーヤ 1.2%、塩化ナトリウム0.5%、炭酸カルシウム0.32%、塩化マンガン水和物0.005%の組成からなる培地を用いた。なお、この培地の殺菌前のpHは7.4に調整した。

0045

前記の種培地(110ml)を分注した500ml容三角フラスコを120℃で20分間殺菌し、これにストレプトミセス・ラベンドフォリエMJ908-WF13株(FERM P-13940)の斜面寒天培養の1白金耳接種し、毎分180回転の回転式振盪器を用いて26℃で48時間振盪培養して種培養とした。次いで前記の培地(110ml)を分注した500ml容三角フラスコを120℃で20分間殺菌し、これに種培養2mlを接種し、30℃で7日間振盪培養した。培養終了後、濾過助剤として珪藻土を加えて濾過し、培養濾液を得た。

0046

上記のようにして得られた培養濾液15Lをクロマトグラフ用活性炭(和光純薬工業株式会社製)1Lのカラムに吸着させ、2Lの精製水で洗浄したのち4Lの70%プロパノール水で溶離し、活性画分を含む溶離液減圧濃縮して褐色の粗物質15.0gを得た。

0047

この粗物質を精製水に溶解したのち、250mlのYMC-GELODS-A60-200/60(株式会社山村化学研究所製)に吸着させ、4Lの0〜100%メタノール水の濃度勾配法によって溶離し、活性画分を含む溶離液を凍結乾燥活性粗粉末1.18gを得た。さらにこの粉末をクロロホルム−メタノール(8:1)に溶解したのち、同溶媒充填した150mlのシリカゲル60に吸着させ、2.4Lのクロロホルム−メタノール(5:1)と3Lのクロロホルム−メタノール(2:1)で順次溶離し、活性画分を含む溶離液を減圧濃縮してピペラスタチンAとピペラスタチンBを含む粗物質440mgを得た。

0048

この粗物質をL.L.N.モデルNMF(三鬼エンジニアリング社製)による遠心液分配クロマトグラフを用いて精製を行った。すなわちクロロホルム−メタノール−水(5:6:4)の溶媒系上層固定相液とし下層移動相液として20℃、遠心部の回転数を毎分700回転、移動相液の流速を毎分10mlの条件で正溶出(500ml)した後、反転溶出した。得られた活性画分のうちピペラスタチンBの混在する画分を凍結乾燥し白色粉末36.7mgを得た。

0049

この白色粉末をCapcellpak C18カラム(資生堂社製)による高速液体クロマトグラフを用いて精製を行った。すなわち粉末を15%アセトニトリル水溶液に溶解したのち、毎分6.0mlの流速で同溶液を用いて平衡化したCapcellpak C18カラム(φ20×250mm)に吸着させ、さらに5分間同溶液で洗浄したのち、15%から40%アセトニトリル水溶液による95分間の直線濃度勾配条件で溶出した結果、ピペラスタチンAを含む画分とピペラスタチンBを含む画分とに分離することができ、ピペラスタチンBを含む活性画分を凍結乾燥して白色粉末10.4mgを得た。

0050

つぎにこの白色粉末をメタノールに溶解したのち、メタノールを展開溶媒としたセファデックスLH20のカラムを用いて精製を行い、ピペラスタチンBを含む活性画分を凍結乾燥して白色粉末9.1mgを得た。

0051

この白色粉末をさらに、Capcellpak C18カラム(資生堂社製)による高速液体クロマトグラフを用いて精製を行った。すなわち粉末を20%アセトニトリル水溶液に溶解したのち、毎分6.0mlの流速で同溶液を用いて平衡化したCapcellpakC18カラム(φ20×250mm)に吸着させ、さらに5分間同溶液で洗浄したのち、20%から40%アセトニトリル水溶液による95分間の直線濃度勾配条件で溶出し、ピペラスタチンBを含む活性画分を凍結乾燥して白色粉末4.9mgを得た。

0052

つぎにこの白色粉末をL.L.N.モデルNMF(三鬼エンジニアリング社製)による遠心液液分配クロマトグラフを用いて精製を行った。すわちちクロロホルム−メタノール−水−酢酸(5:6:4:0.15)の溶媒系の上層を固定相液とし下層を移動相液として20℃、遠心部の回転数を毎分700回転、移動相液の流速を毎分10mlの条件で正溶出した後(500ml)、反転溶出した。得られた活性画分を凍結乾燥した結果、4.8mgのピペラスタチンBの純粋な白色粉末を得た。融点216〜218℃。

0053

ピペラスタチンBの培養工程中の追跡は、カルボキシペプチダーゼYに対する酵素阻害活性でまた精製工程中での追跡は、酵素阻害活性に加えて展開溶媒としてブタノール−メタノール−水(4:1:2)、クロロホルム−メタノール−水(65:25:2)あるいはクロロホルム−メタノール−水−酢酸(100:20:1:1)によるシリカゲル薄層クロマトグラフ(メルク社製、Art.5715)を用いて行った。

発明の効果

0054

本発明のピペラスタチンB物質はセリンカルボキシペプチダーゼに対して高い特異性で阻害活性を有しており、新しい薬理作用を有する薬剤としての有用性が期待される。また、試験例2に示したように、尿中におけるブラジキニンの分解を抑制することで利尿剤あるいは抗高血圧剤などとしての有用性が期待できる。

図面の簡単な説明

0055

図1ピペラスタチンBの臭化カリウム錠内での赤外線吸収スペクトル
図2ピペラスタチンBの重DMSO溶液中での400MHzで測定した1H-NMRスペクトル。
図3ピペラスタチンBの重DMSO溶液中での125 MHzで測定した13C-NMRスペクトル。
図4(a)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてラットの尿管尿におけるにブラジキニンの分解を37℃で45分間行った後の反応液中のブラジキニンの残存量と生成したdes-Arg9-ブラジキニンの生成量とを210nmの吸光度の測定により分析したクロマトグラフィー図
(b)ピペラスタチンBの100μg/mlを添加した条件で上記の反応を行った場合における反応液中のブラジキニンの残存量とdes-Arg9-ブラジキニンの生成量とを分析したクロマトグラフィー図。

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