技術 蛋白質の相互分離方法

(i)形質転換体の培養：形質転換体Ｅ．coli ＤＨ１／pＴＦ４〔特願昭５８−２２５０７９号(昭和５８年１１月２８日出願)明細書参照；該出願は特開昭６０−１１５５２８号公報に対応する〕を２５０ml容三角フラスコ内のバクト・トリプトン(デイフコ・ラボラトリーズ，アメリカ)１％，バクト・イーストエキス(デイフコ・ラボラトリーズ，アメリカ)０.５％，食塩０.５％およびテトラサイクリン７μg／mlを含む液体培地(ｐＨ７.０)５０mlに接種して３７℃で１晩回転振盪培養した。この培養液をカザミノ酸０.５％，グルコース０.５％およびテトラサイクリン７μg／mlを含むＭ９培地２.５Lの入った５L容ジャーファーメンターに移し３７℃で４時間、ついで３−βインドリルアクリル酸(２５μg／ml)を添加して、さらに４時間通気撹拌培養して培養液２.５Lを得た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃で凍結して保存した。

0001

本発明は、蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付加し該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質の混合物を相互に分離する方法に関する。

0002

サイトカインやペプチドホルモンなど種々の生理活性蛋白質の存在が明らかにされ、また近年の遺伝子工学技術の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量生産、臨床への適用の途を開きつつある。このような技術は、すでにインターフェロン,インターロイキン,Ｂ細胞増殖因子(ＢＧＦ),Ｂ細胞分化因子(ＢＤＦ),マクロファージ活性化因子(ＭＡＦ),リンホトキシン(ＬＴ),腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)などのサイトカイン;トランスホーミンググロースファクター(ＴＧＦ−α);エリスロポエチン,上皮細胞増殖因子,インスリン,ヒト成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホルモン;Ｂ型肝炎ウイルス抗原,インフルエンザ抗原,口蹄疫ウイルス抗原,マラリア原虫抗原などのワクチンの開発に有用な病原性微生物抗原蛋白質;ペプチダーゼ(例、ティシュプラスミノーゲンアクチベーター,ウロキナーゼ,セラチオペプチダーゼなど)やリゾチームなどの酵素;ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの血中蛋白成分など各種生理活性蛋白質の製造に応用されている。

0003

しかし、これらの蛋白質は遺伝子工学手法により製造されるため、しばしば混合物中の他の物質から、最終的に必要な生産物を分離せねばならないという問題が生じている。特に問題になるのは、必要な蛋白質をコ−ドする遺伝子の発現により産生する遺伝子産物が、しばしば必要な蛋白質とそのアミノ末端にメチオニンが付加した第二番目の蛋白質との混合物であることである。付加されたメチオニン(Ｍet)は、所望の遺伝子の発現の開始を指示する翻訳開始コドンＡＴＧの発現と、発現産物から付加したＭet基を除く宿主細胞の発現系の不首尾に由来するものである。この問題は、原核性宿主および真核性宿主の両者で生ずるが、とりわけ原核性宿主における遺伝子の発現においてしばしば生ずる。発現用宿主として大腸菌を用いた発現系において特に問題となる。真核細胞および原核細胞の両者における蛋白質合成は、アミノ酸であるメチオニンをコ−ドするmＲＮＡのコドンＡＵＧから開始するので、とりわけ発現用宿主が大腸菌の場合、蛋白質の発現が必要とする蛋白質をさらにアミノ末端にメチオニンが付加した類似体(Ｎ−Ｍet 類似体)との分子種の混合物であるかどうか予想できない。

0004

事実、大腸菌のイニシェーション・ファクターＩＦー３においてアミノ末端にメチオニン残基を持つ分子種と持たない分子種の両者が存在すること〔ホッペ・ザイラーズ・ツァイシュリフト・フュア・フィジオリシェ・ヘミー(Ｈoppe Seyler'sZ.Physiol.Chem.),３５４巻,１４１５頁(１９７３年)〕や、大腸菌においては、その全蛋白のアミノ末端が主としてメチオニンであること(コーン・スタンプ，アウトラインズ・オブ・バイオケミストリー(Ｏutlines of Ｂiochemistry)４版,ジョン・ウィリー・アンド・サンズ,１９７６年)などが知られている。組換えＤＮＡ技術を用いて製造された蛋白としては、アミノ末端へのメチオニン残基の付加率がヒト成長ホルモンにおいて約１００％〔ネイチャー(Ｎature),２９３巻,４０８頁(１９８１年)〕にも達する例が知られている。遺伝子工学技術によると、必要とする蛋白質に比べそのＭet類似体が高比率に産生するという問題が知られている。ネイチャ−(Ｎature),２９３巻, ４０８頁(１９８１年)においては、ヒト成長ホルモンの製造において、実際に必要とする蛋白質に比べてそのＭet類似体が多量に得られるということを示している。必要とする蛋白質とそのＮ−Ｍet類似体とが混合物として産生する場合、二つの分子種の物理化学的性状における相違は、あるとしても非常に小さいものであるため、相互に分離することは、極めて困難なことである。

0005

メチオニン残基は分子量約１３１で、中程度に疎水性を有し、かつ解離基を持たないため電気的に中性のアミノ酸残基である。従って蛋白質のようなそれ自体多数の解離基や疎水性基および親水性基を有する巨大分子〔例えば１３３個のアミノ酸残基からなるインタ−ロイキン−２ポリペプチド(I;但しＸは水素原子)の分子量は約１５,４２０である〕のアミノ末端にメチオニン残基が１残基付加しても蛋白質全体の物理化学的性質には通常大きな影響を及ぼさないと予想され、アミノ末端にメチオニン残基が付加した分子種と付加していない分子種とを相互に分離することはきわめて困難であると考えられる。この難しい問題は、多くの蛋白質において存在し、とりわけ発現用の宿主として大腸菌を用いて発現する蛋白質、特に遺伝子工学技術により製造されるインタ−ロイキン−２やインタ−フェロンを、これらのＮ−Ｍet類似体から分離する場合において、厳しいものがある。インターロイキンー２は、マイトーゲンや抗原によって活性化されたＴ細胞によって産生されるリンホカインの１つであり、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞の増殖および分化に必須の因子であってこれらの細胞を介した免疫反応系において重要な働きをしている。また、インターフェロン−αは、ウイルスや核酸によって活性化された白血球によって産生されるリンホカインの１つであり、細胞に作用してその細胞を抗ウイルス状態にするという生物活性をもち、感染防禦系や腫瘍免疫系において重要な働きをしている。インターロイキンー２やインターフェロン−αはその生物活性から各種免疫不全症,感染症,悪性腫瘍などの治療薬として効果的に使用し得ることが期待されている。現在までにヒト末梢血リンパ球やヒトＴ細胞白血病株(ＪＵＲＫＡＴ株)の培養上清から単離された天然型のインターロイキンー２は、分子量的に異なる幾つかの分子種から成るが、いずれもそのポリペプトド鎖に関しては互いにきわめて良く似ており、アミノ末端は例外なくアラニン残基から始まることが知られている〔特願昭５９ー１４９２４８号(昭和５９年７月１９日出願)明細書(ＥＰＣ公開第０１３２３５９号公報に対応する);プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐro．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ), ８１巻, ２５４３頁(１９８４年)〕。

0006

一方、現在までにヒト白血球の培養上清から単離された天然型のインターフェロン−αは、１０数種のサブタイプからなるが、いずれもそのポリペプチド鎖に関しては、互いにきわめて良く似ており、アミノ末端は例外なくシスティン残基から始まることが知られている〔アチーフ・フュア・ビオヘミー・ウンド・ビオフィジッシェ(Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys.),２２１巻,１頁(１９８３年)〕。本発明者らは、ヒトリンパ球のインターロイキンー２遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌内で発現させることにより非グリコシル化ヒトインターロイキンー２を製造することに成功した〔特願昭５８ー２２５０７９号(昭和５８年１１月２８日出願)明細書参照;ＥＰＣ公開第０１４５３９０号公報に対応する〕。該インターロイキンー２は〔図１〕に示すアミノ酸配列(該図中、Ｘは水素原子またはメチオニン残基を示す)からなるポリペプチド(I)を含有するものであり、アミノ末端アミノ酸としてヒト天然型と同じくアラニン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘは水素原子)とともに、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル−アラニン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘはメチオニン残基)を有する。また、すでに報告されているように〔ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ(Ｊ．Interferon Ｒes．),第１巻,３８１頁(１９８１年); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．),第２５６巻,９７５０頁(１９８１年)〕、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌内で発現させたインターフェロン−αＡは〔図２〕に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する。アミノ末端アミノ酸としては、ヒト天然型と同じくシスティン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘは水素原子)とともに、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル−システィン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘはメチオニン残基)を有する。

0007

同じ蛋白質であってもアミノ末端にメチオニン残基の付加した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造が相互に異なる可能性があり、両者の間でin vivoおよびin vitroでの生物活性や生物学的安定性に差のある可能性もある。また、メチオニン残基のアミノ末端への付加が抗原性の増加あるいは減少をもたらす可能性もあり得よう。従って、生理学上および産業利用上の観点からアミノ末端にメチオニン残基の付加した分子種とそうでない分子種とを分離して両者をそれぞれ実質的に純粋な形で取り出すことはきわめて意義のあることである。アミノ末端へのメチオニン残基の付加率は、培養条件や蛋白質の発現レベルによって左右される可能性がある〔ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ(J．Interferon Res.),１巻,３８１頁(１９８１年)〕が、メチオニン残基の付加率を制御し得た例は今までのところ報告されていない。さらに蛋白質の精製過程においてもアミノ末端にメチオニン残基が付加した分子種と付加していない分子種とを相互に分離した例は今までのところ全く報告されていない。本発明者らは(a)インターロイキン−２とさらにそのアミノ末端にメチオニン残基を有するインターロイキン−２および(b)インターフェロン−αＡとさらにそのアミノ末端にメチオニン残基を有するインターフェロン−αＡとの相互分離法として、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、抗体との特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフイーなどの疎水性の差を利用する方法などを試みたが、それらを相互に分離することは全く出来なかった。

0008

本発明者らは、蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋白質(Ｎ−Ｍet類似体)とを相互に分離することを目的として鋭意研究を行った結果、 それらが意外にも相互に異なる等電点を有する事実を発見した。メチオニンは電気的に中性のアミノ酸であるため蛋白質のアミノ末端に付加してもその蛋白質全体の電荷には全く影響を及ぼさないと考えられ、従ってインターロイキンー２のような蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋白質とが異なる等電点を有することは全く予想外の発見であった。この発見に基づき、蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質（Met−蛋白質）の混合物を等電点の差異に基づく分離手段に付すことにより蛋白質と該蛋白質にメチオニンが付加した蛋白質（Met−蛋白質）とを相互分離できることを見いだした。

0009

すなわち、本発明は、蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質の混合物を等電点の差異に基づく分離手段に付すことを特徴とする蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した蛋白質との相互分離方法を提供するものである。

0010

本願明細書において「蛋白質」とは、糖鎖を有するものもしくは有さないもののいずれをも含み、また、例えば化学反応もしくは酵素反応により、化学的または構造的に修飾されたポリペプチドを包含する、アミノ酸の１次構造からなる高分子物質を意味する。また「Ｍet−蛋白質」とは、上記「蛋白質」にさらにメチオニン基が付加したものを意味する。本発明は、とりわけ、所望の蛋白質およびそれと同一もしくは同様の生理活性を有するＭet−蛋白質に係るものである。本発明における好ましいＭet−蛋白質は、所望の蛋白質の生理活性を奏するに十分な、該蛋白質とのアミノ酸配列上の類似性を有するものである。本発明は、所望の蛋白質のそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を付加した蛋白質(Ｎ−Ｍet類似体)を包含するＭet−蛋白質から蛋白質を分離する方法による生産物に関するものである。とりわけ、本発明は、そのＮ−Ｍet類似体を実質的に含有しないインタ−ロイキン−２蛋白質の分離、およびそのＮ−Ｍet類似体を実質的に含有しないインタ−フェロン−αの分離に関するものである。

0011

本願明細書において「生理活性」とは、生理学的および免疫学的活性および効果を含むインビボもしくはインビトロで生存していてもいなくてもよい細胞,細胞の一部,細胞もしくは他の生理学的作用に基づく生産物および生物学的物質を含む生体および(または)生理物質への活性または効果を意味する。上記蛋白質およびそれにメチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)の混合物は、通常遺伝子組換え技術で製造でき、通常大腸菌,枯草菌,酵母,動物細胞を用いて発現させることにより製造できる。上記蛋白質としては、各種生理活性蛋白質が挙げられ、例えば、インターフェロン(ＩＦＮ;例、ＩＦＮ−α,ＩＦＮ−β,ＩＦＮ−γなど),インターロイキン(例、インターロイキン−１,インターロイキン−２など),Ｂ細胞増殖因子(ＢＧＦ),Ｂ細胞分化因子(ＢＤＦ),マクロファージ活性化因子(ＭＡＦ),リンホトキシン(ＬＴ),腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)などのサイトカイン;トランスホーミンググロースファクター(ＴＧＦ−α);エリスロポエチン,上皮細胞増殖因子,インスリン,ヒト成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホルモン;Ｂ型肝炎ウイルス抗原,インフルエンザ抗原,口蹄疫ウイルス抗原,マラリア原虫抗原などの病原性微生物抗原蛋白質;ペプチダーゼ(例、ティシュプラスミノーゲンアクチベーター,ウロキナーゼ,セラチオペプチダーゼなど)やリゾチームなどの酵素;ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの血中蛋白成分が挙げられる。これら蛋白質の中でも、分子量約３,０００〜５０,０００、とりわけ約５,０００〜３０,０００のもの、 またアミノ酸数として約３０〜５００、 とりわけ約５０〜３００のものに対して、 本発明の蛋白質の相互分離方法は有利に適用ができる。

0012

また蛋白質の等電点が約４〜１１とりわけ、 約５〜８のものにおいて、有利に相互分離を行うことができ、また蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基を有する蛋白質との等電点の差が、約０.０１以上、好ましくは約０.１以上とりわけ０.０１〜０.２程度あることが好ましい。とりわけ、遺伝子組換え技術で製造されたインターロイキン−２やインターフェロン−αに対して、有利に本発明の相互分離方法が適用できる。ここでインターロイキン−２とは天然のヒトインターロイキン−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例えばインターロイキン−２レセプターや抗インターロイキン−２抗体との結合能、を有するものであればいずれでもよく、具体的には〔図１〕で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(I;但しＸは水素原子)や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよく、例えばポリペプチド(I)のアミノ末端から１個のアミノ酸(ＥＰＣ公開９１５３９号公報)または４個のアミノ酸を欠くフラグメント(特願昭５８−２３５６３８号,昭和５８年１２月１３日出願,明細書参照、特開昭６０−１２６０８８号公報に対応)やカルボキシル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリペプチド(I)の構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換されたもの、例えば１２５位のシステイン残基がセリン残基に置換されたもの(特開昭５９−９３０９３号公報)でもよい。これらのポリペプチドは、非グリコシル化ポリペプチドであることが好ましく、とりわけ〔図１〕に示すアミノ酸配列を有するＩＬ−２が好ましい。以下の本願明細書においては、これらのインターロイキン−２をＩＬ−２と略記し、それらのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有するインターロイキン−２をＭet−ＩＬ−２と略記することがある。

0013

ここでインターフェロン−αとは天然のヒトインターフェロン−αと同様の生物学的もしくは免疫学的活性例えばインターフェロンαレセプターや抗インターフェロンα抗体との結合能を有するものであればいずれでもよく、例えば〔図２〕で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(II;但しＸは水素原子)が挙げられる。さらにインターフェロン−αの生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよく、たとえばポリペプチド(II)のアミノ末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントやカルボキシル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリペプチド(II)の構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換されたものでもよい。とりわけインターフェロン−αＡが好ましい。これらのポリペプチドは非グリコシル化ポリペプチドであることが好ましい。以下の本願明細書においては、これらのインターフェロン−αＡをＩＦＮ−αＡと略記し、ＩＦＮ−αＡのアミノ末端にメチオニン残基を有するＩＦＮ−αＡをＭet−ＩＦＮ−αＡと略記することがある。上記蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋白質の混合物としては、混合蛋白質として５０％以上、好ましくは８０％以上、とりわけ９９％以上の純度を有するものが用いられる。

0014

本発明においては、上記混合物を等電点の差異に基づく分離手段に付すことによりこれらを相互分離することができる。なお、実施例１記載の方法によれば、ＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の等電点はそれぞれ７.７および７.５と算出された。また、実施例６記載の方法によれば、ＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡの等電点は、それぞれ６.２および６.３と算出された。本発明における等電点の差異に基づく分離手段としては、等電点の差が０.０１〜０.２程度である蛋白質を相互に分離する方法であればどんなものでも適用でき、たとえばアンホラインを利用する密度勾配等電点電気泳動法,ゲル等電点電気泳動法,等速度電気泳動法などの電場の中で蛋白質を泳動させる方法やクロマトホーカシング法,ＦＰＬＣ法(Ｆast Protein Liquid Chromatography),ＤＥＡＥ(diethylaminoethyl)−,ＣＭ(carboxymethyl)−またはＳＰ(スルホプロピル)−イオン交換カラムクロマトグラフ法などの、溶出カラム等の荷電担体に付加した蛋白質を、pＨ勾配または塩濃度勾配を作成して等電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担体から蛋白質を順に脱離して溶出させる方法など自体公知の方法やこれらを組合せた方法などが挙げられる。これらの分離法に用いられる試薬および器具類はいずれも市販されているものであり容易に入手可能である。たとえばアンホラインはＬＫＢ社(スエ−デン)から、ゲル等電点分離法に用いるゲルはセファデックスＩＥＦとしてファルマシア社から、またＰＡＧ(ポリアクリルアミドゲル)プレートとしてＬＫＢ社から、クロマトホーカシング法の担体および溶出緩衝液はポリバッファー交換体ＰＢＥ９４,同ＰＢＥ １１８やポリバッファー７４,ポリバッファー９６としてファルマシア社(スエ−デン)から、ＦＰＬＣ法に用いるたとえばモノＰカラムやモノＱカラムおよび溶出用緩衝液はファルマシア社から、ＤＥＡＥ−イオン交換体はＤＥＡＥ−トヨパールとして東洋曹達工業(株)から、ＣＭ−イオン交換体はＣＭ−トヨパールとして東洋曹達工業(株)から、ＳＰイオン交換体はＳＰ−５ＰＷとして東洋曹達工業(株)からあるいはＳＰ−セファデックスとしてファルマシア社から入手できる。〔メソッズ・イン・エンザイモロジ−(Methodsin Enzymology, 第５巻,３−２７頁(１９６２年)〕。

0015

市販のたとえばＰＡＧプレート(245×110×1mm,ＬＫＢ社製)を用いるゲル等電点電気泳動分離法ではＰＡＧプレートとしてpＨ3.5.−9.5用プレート,pＨ5.5−8.5用プレートなどを、陽極液として１Ｍリン酸,0.4ＭＨＥＰＥＳ緩衝液などを、陰極液として１Ｍ水酸化ナトリウム,0.1Ｍ水酸化ナトリウムなどを使用する。通常プレート１枚あたり１０〜１０００μgの蛋白質をのせて、電力は１〜２００Ｗ,好ましくは１０〜５０Ｗで、温度は０〜２０℃,好ましくは２〜５℃で泳動を行う。泳動時間は０.５〜５０時間,通常は１.５〜５時間である。また市販のたとえばモノＰカラム(0.5×２０cm,ファルマシア社製)を用いるＦＰＬＣ法では平衡化緩衝液として、たとえば0.025Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pＨ9.5),0.075Ｍトリスー酢酸緩衝液(pＨ9.3)などを用い、溶出緩衝液として１％(v／v)ファルマライト(８−10．5)−5.2％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(pＨ7.0〜 8.0),１０％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)および１０％(v／v)ポリバッファー９６−酢酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)などを用いる。通常、０.１〜 １０mgの蛋白質をのせて、１〜５０ml／hの、好ましくは１０〜３０ml／hの流速でＦＰＬＣを行う。

0016

クロマトホーカシング法ではゲルとして市販のＰＢＥ１１８およびＰＢＥ９４(ファルマシア社製)などを用い、平衡化緩衝液として0.025Ｍトリエチルアミン−塩酸緩衝液(pＨ11.0),0.025Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pＨ9.4)および0.025Ｍジエタノールアミン−酢酸緩衝液(pＨ9.4)などを、溶出緩衝液として2.2％(v／v)ファルマライト(８−10.5)−塩酸緩衝液(pＨ7.0〜8.0), １０％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(pＨ7.0〜8.0)および１０％(v／v)ポリバッファー９６−酢酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)などを用いる。カラムのベッド容積としては蛋白質１gあたり0.01〜0.1,好ましくは１００〜１０００mlのものを用い、流速はＳＶ＝0.01〜１０,好ましくはＳＶ＝0.1〜1.0でクロマトフォーカシングを行う。カラム温度は０〜３０℃,好ましくは２〜５℃に保つのがよい。本発明の分離法によれば、蛋白質とそれにメチオニン残基を付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)はその等電点の差異に従って、電場中で泳動するかもしくはpＨ勾配をつけたカラム中の担体から順に脱離して溶出されるかして互いに分離される。特にpＨ勾配や塩濃度勾配をつけずに、イオン交換体を用いるイソクラチック溶出法を適用しても分離しうる。所望により上記の方法に従って分離した蛋白質のみを含む画分およびそれにさらにメチオニン残基が付加した蛋白質を含む画分から実質的に純粋な蛋白質およびそれにさらにメチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)をそれぞれ採取することができる。この目的のためには、自体公知の塩折法,疎水クロマトグラフ法,ゲルろ過法,イオン交換クロマトグラフ法や高速液体クロマトグラフ法などの蛋白質の精製に一般的に用いられる方法を適宜組み合わせて用いればよい。

0017

本発明は、遺伝子工学技術で製造した蛋白質を、そのＮ−Ｍet類似体など対応するＭet−蛋白質を実質的に含まないよう分離することを初めて可能ならしめたものである。本発明により製造される蛋白質は、対応するＭet−蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２％以下、とりわけ１以下しか含まないのである。同様に、本発明は遺伝子工学技術で製造した Ｍet−蛋白質を、その対応する蛋白質を実質的に含まないよう分離することを初めて可能ならしめたものである。本発明により製造される Ｍet−蛋白質は、対応する蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２％以下、とりわけ１％以下しか含まないものである。

0018

これまでＭet−ＩＬ−２およびＭet−ＩＦＮ−αＡを蛋白質として分離したとの報告はなく、本発明ははじめて高度に精製されたＭet−ＩＬ−２蛋白質およびＭet−ＩＦＮ−αＡ蛋白質をも提供するものである。本発明により製造される蛋白質およびそれにメチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)は、いずれも天然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学的活性を有し、高純度に精製されており夾雑蛋白質、発熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として安全に使用される。本発明により得られるＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２はいずれも正常なＴ細胞やナチュラルキラー細胞をその機能を保持させたまま増殖させる活性を有する。したがって、本発明により得られるＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２は、それぞれＴ細胞やナチュラルキラー細胞をインビトロで長期にわたり増殖,継代したりクローン化するのに使用できる。なお、この性質を利用してヒトＩＬ−２の活性を測定することができる。

0019

さらに、本発明により得られるＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２は、たとえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラーＴ細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す能力をもつところのナチュラルキラー細胞をインビトロで選択的に増殖させることができ、またこのキラーＴ細胞を生体へ移入する際に、本発明により得られるＩＬー２またはＭet−ＩＬ−２を同時に接種することにより、その抗腫瘍効果を増大させることから、温血動物(例、マウス,ラット,ウサギ,犬,ネコ,ブタ,ウマ,ヒツジ,ウシ,人など)の腫瘍の予防,治療や免疫機能低下疾患の治療のために用いることができる。本発明により得られるＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２はそれぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。本発明により得られるＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を腫瘍の予防,治療剤として用いるには、当該物質を自体公知の担体と混合希釈して、たとえば注射剤,カプセル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与することができる。さらに、前述したようにインビトロで増殖させたキラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共にまたは単独で使用することができる。本発明のＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２は、公知の天然から分離されたヒトＩＬ−２と実質的に同じ生物活性を有するのでこれと同様に使用することができ、細胞のＩＬ−２受容体との解離定数がきわめて小さいことから、極く小量の投与で良い。Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用するためには、本発明のＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を約０.０１〜１ユニット／ml、好ましくは約０.１〜０.５ユニット／mlの濃度で培地に添加して用いることができる。インタ−ロイキン−２の生物活性の測定は、インタ−ロイキン−２依存性細胞を用いる方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ−チ・コミュニケ−ションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.)，１０９巻，３６３頁(１９８２年)〕により行なうことができる。

0020

Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用する具体例としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にヒト末梢血より分離したＴ細胞(１×１０6個／ml)およびＸ線(１５００ラッド)照射したＢ細胞トランスフォーマント(１×１０6個／ml)を加えて３７℃，５％ ＣＯ2存在下で３日間リンパ球混合培養を行なって得られるアロ抗原感作Ｔ細胞を含む細胞浮遊液に本発明のＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を０.１〜０.５ユニット／mlの濃度で加え約一週間ごとに培地交換しながら約１か月間培養を続ける方法などが挙げられる。本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡはいずれも細胞に作用してその細胞を抗ウイルス状態にする活性を有する。なお、この性質を利用してヒトＩＦＮ−αＡの活性を測定することができる。さらに、本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡは、抗ウイルス作用だけでなく、細胞増殖抑制作用，抗体産生抑制作用，ナチュラルキラー活性の増強作用などを併せもっている。本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡはそれぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。本発明により得られるＩＦＮ−αＡまたはＭet−ＩＦＮ−αＡを治療剤として用いるには、当該物質を自体公知の担体と混合希釈して、たとえば、注射剤，カプセル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与することができる。投与量は１日当たり１×１０6〜１×１０8ユニット，好ましくは５×１０7〜６×１０7ユニットである。

0021

本願明細書，請求の範囲および図面において、アミノ酸を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃommission on Ｂiochemical Ｎomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
Ｇly :グリシン
Ａla :アラニン
Ｖal :バリン
Ｌeu :ロイシン
Ｉle :イソロイシン
Ｓer :セリン
Ｔhr :スレオニン
Ｃys :システイン
1/2Ｃys :ハーフシスチン
mＣys :カルボキシメチルシスティン
Ｍet :メチオニン
Ｇly :グルタミン酸
Ａsp :アスパラギン酸
Ｌys :リジン
Ａrg :アルギニン
Ｈis :ヒスチジン
Ｐhe :フェニールアラニン
Ｔyr :チロシン
Ｔrp :トリプトファン
Ｐro :プロリン
Ａsn :アスパラギン
Ｇln :グルタミン
Ａsp／Ａsn : アスパラギン酸／アスパラギン
Ｇlu／Ｇln : グルタミン酸／グルタミン

0022

以下の実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお参考例に開示した形質転換体、エシェリヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＤＨ１／pＴＦ４は財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)にＩＦＯ−１４２９９として、また昭和５９年４月６日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)にＦＥＲＭ Ｐ−７５７８として寄託され、 該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８として同研究所に保管されている。また、形質転換体エシェリヒア・コリＮ４８３０／ｐＴＢ２８５はＩＦＯにＩＦＯ−１４４３７として、また昭和６０年４月３０日からＦＲＩに ＦＥＲＭＰ−８１９９として寄託され、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８５２として同研究所に保管されている。

0023

実施例１
ＦＰＬＣによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキシン−２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.０)(蛋白質濃度，１.１８mg／ml)５ml(５.９mg)を０.０２５Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pＨ９.４)で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０．５×２０ｃｍ，ファルマシア社製)にのせ、ついで１％(v／v)ファルマライト(８−１０.５)−５.２％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(pＨ８.０)を用いてモノＰカラムに吸着したタンパク質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温下、流速３０ml／hで行った。その結果、〔図２〕に示すようにｐＨ８.０で溶出されるピーク１とｐＨ７.９で溶出されるピーク２とに分離された。そこで、これらを分取後、ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するため、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフイーを行った。カラム，ウルトラポアＲＰＳＣ(１.０×２５cm，アルテックス社，アメリカ)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水;溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラム，０分(５５％Ａ＋４５％Ｂ)−４分(５５％Ａ＋４５％Ｂ)−２８分(４２％Ａ＋５８％Ｂ)−３８分(３４％Ａ＋６６％Ｂ)−４３分(２０％Ａ＋８０％Ｂ)−４４分(５５％Ａ＋４５％Ｂ)；溶出速度３.０ml／min。このクロマトグラフイーによって得られた溶液をそれぞれ凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。ＦＰＬＣにおけるピーク１およびピーク２から得られたものを、それぞれＰ１およびＰ２となずけた。Ｐ１の収量は１.１２mg(１９.０％), Ｐ２の収量は３.０１mg(５１.０％)であった。次に得られたＰ１およびＰ２について蛋白化学的分析を行った。Ｐ１およびＰ２それぞれ ４５μg(３nmol)を用い、気相プロテインシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ社製４７０Ａ型)を用いる自動エンドマン分解法によりＰ１およびＰ２のアミノ末端アミノ酸配列を決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸(ＰＴＨ−アミノ酸)はミクロパックＳＰ−Ｃ１８カラム(バリアン社製)を用いる高速液体クロマトグラフイーにより同定した。各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を〔表１〕に示す。

0024

0025

カルボキシル末端アミノ酸の分析は次のようにして行った。すなわちＰ１およびＰ２をヒドラジン分解用ガラス管にとり、無水ヒドラジンを加えて減圧下に封管したのち１００℃で６時間加熱した。得られたヒドラジン分解物をベンズアルデヒド処理したのち、遊離アミノ酸を日立製８３５型アミノ酸分析計により測定した。その結果、Ｐ１およびＰ２ともにスレオニンのみが検出され、回収率はそれぞれ３４.８％および３４.０％であった。このことからＰ１およびＰ２のカルボキシル末端アミノ酸はスレオニンと同定された。アミノ酸組成分析は４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて減圧下に封管後、１１０℃で２４，４８，７２時間、加水分解し、日立製８３５型アミノ酸分析計により実施した。シスチンおよびシステインは過ギ酸酸化したのち、減圧下定沸点塩酸中で２４時間加水分解してアミノ酸分析計によりシステイン酸として定量した。アミノ酸分析値は２４，４８および７２時間の加水分解で得られた値を平均して求めた。ただし、セリンおよびスレオニンの値は加水分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果を〔表２〕に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析およびアミノ酸組成分析の結果から、Ｐ１は〔図１〕中Ｘ＝水素原子で示される分子種(ＩＬ−２)を、Ｐ２は〔図１〕中Ｘ＝メチオニン残基で示される分子種(Ｍet−ＩＬ−２)をそれぞれ９８％および９９％以上の純度で含んでいることが確認された。

0026

0027

次にアンフォラインＰＡＧプレート(ＬＫＢ社製)を用いてＰ１およびＰ２の等電点を測定した結果を〔図３〕に示す。原料として用いたＩＬ−２およびＭetＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキン−２は等電点電気泳動では２本のバンドを示すのに対し、本実施例で得られたＰ１およびＰ２は、それぞれ互いに泳動距離の異なる１本のバンドとして泳動された。また、泳動後のＰＡＧプレート断片のpＨを測定することにより、Ｐ１(ＩＬ−２)の等電点は７.７、Ｐ２(ＭetＩＬ−２)の等電点は７.５と算出された。さらに、得られたＰ２に関して以下のようにしてトリプシン消化を行いペプチドマップを得た。すなわち、５０μgのＰ２を含む０.０２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液(pＨ８.０)１００μlに、１.２５μgのＴＰＣＫ−トリプシン(ワシントン社製，アメリカ)を加えて３７℃で２８時間反応させた。反応液に１％(v／v)トリフルオロ酢酸４００μlを加えて反応を停止させた。得られた消化液について下記の条件下で高速液体クロマトグラフイーを行い〔図４〕に示すマップを得た。
高速液体クロマトグラフ：バリアン社(アメリカ)５０４０型
カラム：ヌクレオシル５Ｃ１８(マヘレーナーゲル社製，西ドイツ)
カラム温度：３０℃
溶出溶媒：
Ａ液,０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水(v／v)
Ｂ液,０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル(v／v)
溶出プログラム：０分(８５％Ａ＋１５％Ｂ)−１５分(７２％Ａ＋２８％Ｂ)-１６分(６４％Ａ＋３６％Ｂ)−８０分(４０％Ａ＋６０％Ｂ)−８５分(１５％Ａ＋８５％Ｂ)
〔直線勾配〕
溶出速度：３.０ml／分
検出法：オルトフタールアルデヒド法〔Anal.,Chem.，第43巻，880頁(1971年)〕によるポストラベル法

0028

実施例２
クロマトホーカシングによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキンー２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.０)(蛋白質濃度,１.０９mg／ml)５００ml(５４５mg)を０.０２５Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液(ｐＨ９.４)で平衡化したＰＢＥ９４(ファルマシア社製)カラム(２.７×８７cm)にのせ、ついで溶出液として１％(v／v)ファルマライト(８−１０.５)−５.２％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いてクロマトホーカシングを行った。なお、この操作は４℃,流速２００ml／hで行った。その結果、〔図５〕に示すように、ｐＨ８.５で溶出されるピーク１とｐＨ８.３で溶出されるピーク２とに分離された。実施例１で示した同様の方法でポリバッアーを除去した後のタンパクの収量はピーク１で９４.８mg(１７.４％)，ピーク２で３３６mg (６１.６％)であった。また、アミノ末端アミノ酸分析をダンシル化反応後、塩酸加水分解し、生じたダンシルアミノ酸をミクロパックＳＰカラムを用いる高速液体クロマトグラフイーで検出する方法で行った結果、ピーク１はＩＬ−２を９９.６％以上の純度でピーク２はＭet−ＩＬ−２を９９.５％以上の純度で含んでいることが確認された。

0029

実施例３
ＤＥＡＥ−トヨパールイオン交換クロマトグラフイーによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキン−２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.０)(蛋白質濃度：１.０３mg／ml)１０ml(１０.３mg)に等容の１０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ９.０)を加えてｐＨを８.５に調整したのち、１０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ８.５)で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ(東洋曹達工業(株)製)カラム(１.０×６４cm)にのせ、１０mＭトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ８.５)１Ｌと１０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ７.０)１Ｌを用いるｐＨ勾配法で溶出を行った。なお、この操作は４℃，流速１００ml／hで行った。その結果、分離能はＦＰＬＣやクロマトフォーカシングに比べて劣っていたが、２つのピーク(ピーク１とピーク２)が検出された。それぞれのピークが重なり合わないように、ピーク１は前半分をピーク２は後半分を分取した。収量はピーク１で０.８２mg(８.０％),ピーク２で１.９８mg (１９.２％)であった。また、ダンシル法によるアミノ末端アミノ酸分析の結果、ピーク１はＩＬ−２を９０％以上，ピーク２はＭet−ＩＬ−２を９５％以上含んでいることが確認された。

0030

実施例４
ＦＰＬＣによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離:参考例１(iii)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２を含む非グリコシル化ヒトインターロイキンー２部分精製標品５mlを、０.０２５Ｍジエタノールアミンー塩酸緩衝液(pＨ９.４)で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０.５×２０cm，ファルマシア社製)にのせ、ついで１％(v／v)ファルマライト(８〜１０.５)−５.２％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いてモノＰカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出速度：２５ml／h，カラム温度：室温。その結果、ＩＬ−２を含む画分(ピーク１)とＭet−ＩＬ−２を含む画分(ピーク２)とに分離された。ピーク１の活性回収率は２５％，ピーク２の活性回収率は５４％であった。

0031

実施例５
ＳＰ−５ＰＷカラムによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参考例２で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキン−２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.０，蛋白質濃度１.０３mg/ml)０.５mlを０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.４)で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用ＳＰ−５ ＰＷカラム(０.７５×７.５cm；東洋曹達社製)にのせ０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて蛋白質を溶出した。カラム温度は３５℃に、緩衝液の流速は０.５ml／minに設定した。クロマトグラフシステムはバリアン社製５５００型液体クロマトグラフを用いた。 その結果〔図７〕に示すように、非グリコシル化インターロイキン−２は２つのピーク(ピークＡおよびピークＢ)として溶出された。それぞれのピークを分取し(図中太実線で示す)アミノ末端アミノ酸の分析を行った結果、ピークＡはＭet−ＩＬ−２を、ピークＢはＩＬ−２をそれぞれ９９.５％以上の純度で含んでいることが確認された。

0032

実施例６
ＦＰＬＣによるＩＦＮ−αＡとＭet−ＩＦＮ−αＡとの分離：参考例３に記載の方法によって得られたＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡの混合物である非グリコシル化ヒトインターフェロンαＡを含む０.１２Ｍ塩化ナトリウム−０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.０)(蛋白質濃度，２.９６mg/ ml)１.０ml(２.９６mg)を０.０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液(ｐＨ６.７)で平衡化したＰＤ−１０カラム(１.５×５cm，ファルマシア社製)にのせ脱塩を行った。 このようにして得られた非グリコシル化ヒトインターフェロンαＡを含む溶出液(蛋白質濃度，１.５８mg/ml)１.５ml(２.３７mg)を０.０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液 (ｐＨ６.７)で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０.５×２０cm，ファルマシア社製)にのせ、 ついで１０％(V/V)ポリバッファー７４−塩酸緩衝液(ｐＨ５.５)を用いてモノＰカラムに吸着した蛋白質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温下、流速３０ml/hで行った。 その結果、〔図８〕に示すようにｐＨ５.６で溶出されるピークＩとｐＨ５.４で溶出されるピークIIとして分離された。そこで、 これらを分取後、 ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するため、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラム，ウルトラポアＲＰＳＣ(１.０×２５cm，アルテックス社製)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラム，０分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)−４５分(４５％Ａ＋５５％Ｂ)−４６分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)；溶出速度３.０ml/min。このクロマトグラフィーによって得られた溶液をそれぞれ凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。 ＦＰＬＣにおけるピークＩおよびピークIIから得られたものを、それぞれＰＩおよびＰIIとなずけた。ＰＩの収量は０.７２３mg(２４.４％)，ＰIIの収量は０.９４５mg(３１.９％)であった。

0033

次に得られたＰＩおよびＰIIについて蛋白化学的分析を行った。ＰＩおよびＰIIを還元カルボキシメチル化したのち、それぞれ４０μg(２.１nmol)を用い、気相プロティンシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ社製４７０Ａ型)を用いる自動エドマン分解法によりＰＩおよびＰIIのアミノ末端アミノ酸配列を決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸(ＰＴＨ−アミノ酸)はミクロパックＳＰ−Ｃ１８カラム(バリアン社製)を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同定した。 各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を〔表３〕に示す。

0034

0035

カルボキシル末端アミノ酸の分析を実施例１と同様にして行った結果、ＰＩおよびＰIIともにグルタミン酸のみが検出され回収率はそれぞれ１２.５％および１４.３％であった。アミノ酸組成分析を実施例１と同様にして行った結果を〔表４〕に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析およびアミノ酸組成分析の結果から、ＰＩは〔図２〕中Ｘ＝メチオニン残基で示される分子種(Ｍet−ＩＦＮ−αＡ)を、ＰIIは〔図２〕中Ｘ＝水素原子で示される分子種(ＩＦＮ−αＡ)をそれぞれ９８％以上の純度で含んでいることが確認された。

0036

0037

また、アンフォラインＰＡＧプレート(ＬＫＢ社製)を用いてＰＩおよびＰIIの等電点を測定した結果、ＰＩ(Ｍet−ＩＦＮ−αＡ)の等電点は６.３，ＰII(ＩＦＮ−αＡ)の等電点は６.２と算出された。

0038

実施例７
ＩＬ−２注射用製剤：実施例１で得られたＩＬ−２含有溶液を、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.０)で平衡化したＣＭトヨパール(東洋曹達工業(株))カラムに無菌条件下で吸着させ、０.１５ＭのＮaＣlを含む上記緩衝液で溶出させる。溶出液に０.１５ＭＮaＣlを適宜加えて希釈し、ＨＳＡを０.５％になるように添加してメンブランフイルター(孔径０.２２μm)を用いてろ過後、得られたろ液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用ＩＬ−２を調製する。本注射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解する。

0039

実施例８
ＩＦＮ−αＡ注射用製剤：実施例６で得られたＩＦＮ−αＡ含有溶液を、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.０)で平衡化したＣＭトヨパール(東洋曹達工業(株))カラムに無菌条件下で吸着させ、０.１５ＭのＮaＣlを含む上記緩衝液で溶出させる。溶出液に０.１５ＭＮaＣlを適宜加えて希釈し、ＨＳＡを０.５％になるように添加してメンブランフィルター(孔径０.２２μm)を用いてろ過後、得られたろ液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用ＩＦＮ−αＡを調製する。本注射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解する。上記注射用製剤は、それぞれ上記精製ＩＬ−２およびＩＦＮ−αＡを、精製Ｍet−ＩＬ−２およびＭet−ＩＦＮ−αＡに置き換えることにより、Ｍet−ＩＬ−２およびＭet−ＩＦＮ−αＡの注射用製剤とすることができる。

0040

参考例１
非グリコシル化ヒトインターロイキン−２の製造I：

0041

図１参考例１で得られた非グルコシル化ヒトインターロイキシン−２蛋白質のアミノ酸配列(図中Ｘは、水素原子またはメチオニン残基を表わす)を示す。
図２参考例３で得られた非グリコシル化ヒトインターフェロン−αＡ蛋白質のアミノ酸配列(図中Ｘは、水素原子またはメチオニン残基を表わす)を示す。
図３実施例１におけるＦＰＬＣの結果を示す。
図４実施例１における等電点電気泳動の結果を示す。
図５実施例１におけるトリプシン消化ペプチドマッピングの結果を示す。
図６実施例２におけるクロマトホーカシングの結果を示す。
図７実施例５におけるＳＰ−５ＰＷイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。
図８実施例６におけるＦＰＬＣの結果を示す。
図９参考例３におけるプラスミドｐＴＦ１の構築図を示す。
図１０参考例３におけるｐＴＢ２８５の構築図を示す。