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構成

ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)878Rの菌体を含有してなる免疫賦活組成物

効果

組成物は、マイトジェン活性抗腫瘍活性、T細胞増殖活性などの作用にすぐれ、医薬飲食品タイプとして使用され、特に経口投与と併用すると特にすぐれた効果が奏される。

概要

背景

乳酸菌および発酵乳の摂取は、健康および栄養上の面で様々な利点をもたらすことが報告されている(伊敞敏:New Food Industry,Vol.33,No.12,p39(1991))。その中でも抗腫瘍作用は、疾病の予防および治療の面で、乳酸菌および発酵乳に最も期待される性質の1つである。しかし、この抗腫瘍作用については宿主免疫系の介在が示唆されているものの、まだ不明な点が多い(C.F.Fernandes et al.:J.Food Prot.,Vol.53,No.8,p704(1990))。一方、近年、上記したような乳酸菌の生理活性については菌種間あるいは菌株間で大きな差異のあることが明らかにされつつあり(廣田哲二:New Food Industry,Vol.32,No.10,p9(1991))、抗腫瘍作用についても、こうした点からの見直しが必要となっているのが現状である。

概要

ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)878Rの菌体を含有してなる免疫賦活組成物

組成物は、マイトジェン活性抗腫瘍活性、T細胞増殖活性などの作用にすぐれ、医薬飲食品タイプとして使用され、特に経口投与と併用すると特にすぐれた効果が奏される。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
4件

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請求項1

ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)878Rの菌体を含有してなることを特徴とする免疫賦活組成物

請求項2

組成物医薬であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。

請求項3

医薬が経口投与及び非経口投与併用タイプの医薬であることを特徴とする請求項2に記載の組成物。

請求項4

医薬が抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項2又は請求項3に記載の組成物。

技術分野

0001

本発明は、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)878Rの菌体を有効成分として含有する免疫賦活組成物に関するものである。本発明の免疫賦活組成物は、マイトジェン活性抗腫瘍活性およびT細胞増殖活性などの作用を有しており、医薬栄養食品特定保健用食品、その他飲食品として有用である。

0002

本発明に係る組成物は、すぐれた抗腫瘍活性を示すが、経口投与非経口投与とを併用すれば特にすぐれた作用を奏し、本組成物は、それが本来的に有している高い安全性とも相まって特にすぐれた抗腫瘍剤として、腫瘍の予防、治療に大きな貢献をなすものである。

背景技術

0003

乳酸菌および発酵乳の摂取は、健康および栄養上の面で様々な利点をもたらすことが報告されている(伊敞敏:New Food Industry,Vol.33,No.12,p39(1991))。その中でも抗腫瘍作用は、疾病の予防および治療の面で、乳酸菌および発酵乳に最も期待される性質の1つである。しかし、この抗腫瘍作用については宿主免疫系の介在が示唆されているものの、まだ不明な点が多い(C.F.Fernandes et al.:J.Food Prot.,Vol.53,No.8,p704(1990))。一方、近年、上記したような乳酸菌の生理活性については菌種間あるいは菌株間で大きな差異のあることが明らかにされつつあり(廣田哲二:New Food Industry,Vol.32,No.10,p9(1991))、抗腫瘍作用についても、こうした点からの見直しが必要となっているのが現状である。

発明が解決しようとする課題

0004

本発明は、腫瘍その他の疾病の予防、治療に有効な免疫賦活組成物を新たに開発する目的でなされたものである。

課題を解決するための手段

0005

上記目的を達成するため、本発明者らは各方面からの検討を行い、免疫賦活組成物としては、有効性と同様に安全性が重要である点に着目した。そこで、免疫賦活組成物としては、化学合成品ではないこと、飲食品としても利用可能であることが好適であるとの観点にたち、広範な検討を行った。

0006

そして、飲食品の製造にも広く利用されている微生物、特に乳酸菌に着目し、本発明者らは、乳酸菌の示す抗腫瘍作用について菌種間および菌株間で鋭意研究を行なったところ、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)878R株に特に強い活性が認められ、非常に有望な抗腫瘍剤として利用できることを見い出すとともに特に有効な投与方法発見し、すぐれた安全性も確認し、本発明を完成するに至った。

0007

すなわち、本発明者らは、発酵乳のスターターとして用いられる各種乳酸菌菌体について、二重移植腫瘍系(診療新薬、Vol.28,No.3,p44,1991)を指標にして検索を行った。

0008

この実験系においては、BRM(biological responsemodifier)の抗腫瘍効果が、好中球マクロファージTリンパ球など多くの免疫細胞系とインターロイキン1(IL−1)、インターロイキン8(IL−8)、単球走化活性因子(MCAF)などのサイトカインとが関連した一連の免疫カスケード反応によって起っていることが示唆されている(海老名卓三郎ら:Biotherapy,Vol5,No.13,p1951,1991)。そして実際には、遠隔再発腫瘍に対する増殖抑制効果を評価することができるため、これまでのBRMの抗腫瘍効果の評価よりも更に実用的なものと考えられる。

0009

この二重移植腫瘍系において、抗腫瘍効果を示す物質としては、これまで担子菌製剤PSKなどが見出されているが(海老名卓三郎ら:癌と化学療法、Vol14,No.6,p1841,1987)、乳酸菌についての検討は全く行われてこなかった。

0010

そこで、一連の乳酸菌の抗腫瘍効果について改めて検討した結果、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)の一菌株が強い抗腫瘍活性を有することを見出した。更にまた、この菌株の抗腫瘍作用は、経口投与でも有効なこと、そして、菌体自身もマイトジェン活性及びT細胞増殖活性を有することも併せて確認し、本発明を完成するに至った。

0011

すなわち本発明は、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス878R株(以下、878Rないし878R株ということもある)を含有する免疫賦活組成物を基本的技術思想とするものである。

0012

本発明に係る免疫賦活組成物に用いるラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス878R株の菌体は、生菌および死菌のいずれであってもよく、原料菌体の取得のための培養法および菌体分離法にも制限はない。菌体としては、純粋に分離した菌体(乾燥菌体、湿潤菌体を問わない)のほか、菌体含有物培養物懸濁物ヨーグルト等菌体含有飲食品その他菌体を含有するもの)、処理物濃縮、乾燥、ペースト化、又は逆に希釈したもの、超音波および高圧破壊処理したもの等各種処理物)を広く包含するものである。

0013

本発明に係る免疫賦活組成物は、878R株、その含有物及び/又はその処理物を有効成分とし、常用される製剤用補助剤を用いて、各種剤型に製剤化し、医薬タイプとして使用することができ、特に本発明においては、非経口投与のほか経口投与できることが確認されたので、経口投与用の医薬に製剤化することが可能となり、きわめて有用である。その際、878R株は、ヨーグルト等発酵食品のスターターとしても利用されるものである故、安全性については問題がない。後記する実施例からも安全性は立証されているところである。現に、マウスを用いた10日間の急性毒性試験の結果、1000mg/kgの経口投与でも死亡例は認められなかった。

0014

本発明に係る免疫賦活組成物は、医薬として投与する場合、症状、投与ルート等によっても異なるが、一般的に成人において、1日当り、静脈投与の場合は後記実施例に係る菌体0.01〜1000mg、好ましくは0.1〜100mg/kg、筋肉投与の場合は同じく0.01〜1000mg、好ましくは0.1〜100mg/kg、経口投与の場合も同じく0.5〜2000mg、好ましくは1〜1000mg/kgの範囲内で投与するのがよく、経口投与と非経口投与を併用することも可能である。

0015

878R株は、経口投与によって所期の目的を達成しうるので、本発明に係る免疫賦活組成物は、飲食品タイプとして使用することができる。そのためには、878R株、その含有物及び/又はその処理物を各種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク錠剤、その他各種の飲食品タイプにしたり、飲食品に直接添加したり、あるいは、これをスターターにしてヨーグルトとする等これを利用して発酵食品にする等、各種の方法を利用することができる。このように飲食品タイプとした本発明組成物は、長期間に亘って摂取することが可能であるので、腫瘍の予防、再発防止等の目的で、通常の飲食品のほか、特定保健用食品、栄養剤、健康食品等として市販に供することができる。

0016

本発明において使用する菌であるラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)878Rは、工業技術院微生物工業技術研究所(現、生命工学工業技術研究所)に微工研条寄第125号(FERM BP−125)として寄託されており、有効に使用される。なお、本寄託において寄託者が付した識別のための表示の欄には、Lactobacillus bulgaricus No.878−Rと表示されているが、本菌は分類改正されて、現在は上記のようにLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusに分類されている(BERGEY’SMANUAL OF Systematic Bacteriology,volume2,p1219−1220)。

0017

ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカス878Rの菌学的性質は、次のとおりである。
形態BL寒天培地でよく生育し、時に長状を呈する桿菌で、若い生育旺盛なカルチャーでは単一層を成す。メチレンブルー染色で顆粒を呈する
コロニー白〜明灰色の通常、表面が粗く(rough)1〜3mm径
生育環境嫌気性あるいは通性嫌気性
生育温度 15℃で生育せず、45℃あるいは50〜52℃でも生育
牛乳培養凝固:最終乳酸酸度1.6%
カタラーゼ
グラム染色性
糖の資化性:(ガスの発生はいずれもなし)
アミグダリン
セロビオース
フラクトース
ガラクトース
グルコース
ラクトース
マルトース
マンノース
サリシン
サッカロース
トレハロース
エスクリン
乳酸旋光性D(−)

0018

以下に本発明の実施例を示す。

0019

発酵乳の製造に用いられるLactobacillus helveticus 806(以下、806と略す)、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 878R(以下、878Rと略す。FERM BP−125)、同2038(以下、2038と略す)、及びStreptococcus salivarius subsp.thermophilus 1131(以下、1131と略す)の各菌体を、EG寒天培地より寒天および馬血液を除いた液体培地接種し、37℃の温度で24時間培養した。培養後、集菌、洗浄生理食塩水)し、菌体懸濁液5×109/ml(pH7.0滅菌リン酸緩衝液)に調製した。

0020

マウスとしてBALB/cマウス(7週令、雄:(株)船橋農場)を使用し、腫瘍としてはBALB/cマウスと同系のMeth−A線維肉腫細胞を皮下に接種し、固型腫瘍として使用し、上記で得た乳酸菌製剤の抗腫瘍作用について、二重移植腫瘍系(海老名卓三郎:診断と新薬、Vol.28,No.3,p44,1991)を用いて検討を行った。(実施例1の以上の方法は実施例2以下でも同様に実施した。)

0021

すなわち、BALB/cマウスの右側腹皮内に106個、左側腹皮内に2×105個のMeth−A細胞を同時に移植し、右側の大きな腫瘍(原発巣と想定)が指で触れるようになる3日目より腫瘍内に乳酸菌製剤を3日間投与することにより治療し、治療していない左側の遠隔腫瘍(転移巣と想定)の退縮を観察した。

0022

抗腫瘍効果の評価は、腫瘍接種後経日的に腫瘍径を測定し、√(長径×短径)(mm)で腫瘍の大きさを表わし、21日目の腫瘍重量(g)とともに判定した。治癒率の比較にはx2検定を、腫瘍の大きさ並びに腫瘍重量の比較にはt検定を行った。得られた結果を下記表1に示す。

0023

0024

上記結果から明らかなように、4種の乳酸菌製剤をそれぞれ0.5mgずつ腫瘍移植後3日目から3、4、5日目の3回右側腫瘍に投与したところ、上記に示すように右側腫瘍ではほとんどが治癒し、著明な抗腫瘍効果が認められた。一方左側腫瘍では806株と878R株に腫瘍の増殖抑制が観察された。すなわち両乳酸桿菌には免疫賦活作用があることが認められた。コントロールとしては滅菌生理食塩水同量、3日間投与した。

0025

実施例1に記載した二重移植腫瘍系に更にそれぞれの乳酸菌製剤をマウス用飼料F2((株)船橋農場)に2%ずつ配合したペレタイザー成形飼料をad libに与えて、その抗腫瘍効果を比較した。コントロールとしては、マウス用飼料F2そのものを与えた。得られた結果を下記表2に示す。

0026

0027

上記結果から明らかなように、878R株だけに左右腫瘍に対し抗腫瘍効果が認められた。以上の結果から、878R株が腫瘍内投与による右側腫瘍の治癒並びに左側腫瘍の増殖抑制と経口投与(飼料による)による抗腫瘍効果が認められ、最も興味深い乳酸桿菌と考えられた。

0028

最も抗腫瘍効果にすぐれていることが上記によって立証された878R株について、更に以下のような確認を行った。

0029

(1)抗腫瘍効果の用量応答
二重移植腫瘍系において、878R製剤の用量応答(dose response)を調査し、下記表3の結果を得た。

0030

0031

上記結果から明らかなように、878R製剤は、0.5mg3回投与が最も効果があり、0.05mg3回投与でも左右腫瘍の著明な抗腫瘍効果が認められた。以上の結果は今迄調べたBRM中最も効果のある担子菌製剤PSKに比しても濃度が100分の1でも効果があることから有望な抗腫瘍剤であることが確認されたので、次のその作用機作について解明を加えた。

0032

(2)養子免疫細胞移入
二重移植腫瘍系において、878R製剤0.05mgの3回右側腫瘍内投与により、左側腫瘍まで治癒する機序解析するため、878R株免疫脾細胞採取し、その2×107個を別のマウスの腫瘍内に投与する養子免疫細胞移入(adoptive transfer)の実験を行った。すなわち、担癌14日目のマウスの脾細胞を採取し、2×107細胞を3日目のMeth−A腫瘍内にsuppressor T細胞の機能を抑制するcyclophosphamide(CY)を2mg/マウス静脈内注射して一時間後移入するadoptivetransferの実験を行った。得られた結果を下記表4及び図1に示す。

0033

0034

上記結果から明らかなように、マウス6匹中5匹で完全治癒が確認された。正常マウスの脾細胞には抗腫瘍効果がないことから878R製剤投与により脾細胞中にMeth−A腫瘍を殺す能力を持ったリンパ球を増加させていることが確認された。

0035

(3)腫瘍組織内でのNCF及びMCFの産生
878R株投与により二重移植腫瘍系の左右腫瘍内においてどのようなことが起っているか調べるため、878R製剤投与後1日目の腫瘍組織を採取し、10%胎児牛血清加RPMI培地で24時間培養し、その培養上清のNCF(好中球走化因子)並びにMCF(マクロファージ走化因子)活性を測定した。

0036

すなわち、これらの走化活性は、ケモタキセルクラボウ社製)により24穴マイクロプレートを使って測定した。NCF(好中球走化因子)活性には標的細胞として3% proteose peptone 1mlを14時間前に腹腔内接種したマウスの腹腔滲出細胞(PEC)中の好中球を使用した。MCF(マクロファージ走化因子)活性には標的細胞として3% thioglycolate 1mlを3日前に腹腔内接種したマウスのPEC中のマクロファージを使用した。

0037

方法は24穴マイクロプレートの外筒に左右の腫瘍組織の培養上清を500μl入れ、内筒に2×105個のPECを200μl入れ、CO2培養器で90分〜3時間培養した後、内筒の底にある5μmのフィルターを介して走化してきた好中球ならびにマクロファージ数をMay−Giemsa染色により400〜1,000倍油浸顕微鏡算定した。得られた結果を下記表5に示す。

0038

0039

上記から明らかなように、878R製剤の右側腫瘍内投与により、右側腫瘍内にNCF活性が有意に増加しており、NCF産生が以下の免疫カスケード反応の引き金になっていることが認められた。

0040

(4)血清AP誘導
BALB/cマウスに878R製剤を皮内注射したときに血清IAP(免疫抑制酸性蛋白質)値をsingle radial immunodiffusion(SRID)法を用い、測定した。結果を図2に示す。

0041

前記のように、878R株投与によりNCFが誘導されることにより、腫瘍内に好中球が浸潤し、抗腫瘍効果が誘起されることが充分に示唆されたので、活性化好中球並びにマクロファージが産生することが知られている免疫抑制酸性蛋白質IAPの産生に関して検討した。878R製剤0.05mgずつ3日間皮内投与したときの血清IAP値を調べた結果、図2に示すように一過性のIAP値の増加が認められた。

0042

上記したところから明らかなように、本発明において使用する乳酸桿菌878R株の抗腫瘍効果は、細菌製剤であるBCGやOK−432と同じ結果を示した。また、NCF、MCF誘導能の測定結果から、右側腫瘍でNCF活性の誘導が認められたが、この結果はBCGと全く同じ結果であった。更に好中球とマクロファージが活性化した指標としての血清IAPの誘導も認められ、これもBCGやOK−432と同じ挙動である。

0043

以上の結果をまとめると、878Rの抗腫瘍活性の詳細なメカニズムは後の研究にまかせねばならないが、現時点では一応次のように考えられる。

0044

すなわち、乳酸桿菌Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus 878Rを原発腫瘍内に投与すると、NCFが誘導され好中球が浸潤し、更に好中球、マクロファージが活性化してIAPが誘導され、右側原発腫瘍が退縮に働く。次に活性化マクロファージ腫瘍細胞との反応によりIL−1が産生され、脾臓中に抗腫瘍作用を持ったリンパ球が誘導される。このリンパ球が血流を介して左側遠隔腫瘍に達すると腫瘍細胞を認識し、遠隔腫瘍の増殖を抑制するものと考えられる。

0045

更に本発明において特徴的なことは878R株腫瘍内投与に飼料による経口投与を加えることにより抗腫瘍効果が増強されることで、このことは担子菌製剤PSKの腫瘍内投与にPSKの経口投与を併用すると切除免疫を増強することや手術前に腫瘍内投与し、手術後経口投与しておくと、再接種腫瘍の増殖を有意に抑制することと符合する。

0046

すなわち878株を一度腫瘍内に投与しておくとマクロファージ・リンパ球系が記憶しており、経口投与により腸管内のマクロファージに878株が取り込まれることによりマクロファージの認識記憶機構が働き、活性化し、抗腫瘍効果の増強に働くものと思われる。すなわち878株は宿主の免疫増強作用を持った抗腫瘍薬剤となることを示したもので、今後更にその作用機作の詳細な解明が期待される。

発明の効果

0047

本発明に係る免疫賦活組成物は、ラクトバチルスデルブリッキサブスピーシズブルガリカスに属する菌株の中から特に抗腫瘍作用の高い菌株を選択し、これを有効成分とするものである。抗腫瘍作用は、経口的に投与された場合にも認められ、更に、菌体そのものが各種免疫賦活活性を有することも確認されているので、本免疫賦活剤薬剤の形態で用いることはもちろん、それ以外に発酵乳などの食品の形態で生体に投与されれば、腫瘍に関する疾病の予防および治療に対して著しい効果を発揮するものである。

0048

また本発明に係る免疫賦活組成物は、局所投与といった非経口投与と経口投与とを併用することにより、更にすぐれた抗腫瘍効果を奏するという卓越した特徴も有するものである。

図面の簡単な説明

0049

図1Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 878R菌体で免疫した脾細胞の抗腫瘍作用を示す。
図2同菌体の皮内投与後の血清IAPの産生を示す。

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