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技術 固相免疫学的検定法

出願人 ザ、ナショナル、ブラッド、オーソリティー
発明者 スコット,マリオンレスリー
出願日 1993年5月26日 (26年6ヶ月経過) 出願番号 1994-500318
公開日 1996年2月6日 (23年10ヶ月経過) 公開番号 1996-501145
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 集結度 ゴース イメージ分析器 保存袋 プラスティック材料 調製体 透過分光 不規則抗体
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1996年2月6日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (3)

課題・解決手段

血清または血漿試料中の、細胞表面抗原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する固相法試料を、前記抗原を含む固定された調製物と接触させ、その抗体の結合対を結合させた標識ラテックス粒子からなるインディケーターを用いてそこに結合した抗体を検出または検定する。

概要

背景

概要

血清または血漿試料中の、細胞表面抗原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する固相法試料を、前記抗原を含む固定された調製物と接触させ、その抗体の結合対を結合させた標識ラテックス粒子からなるインディケーターを用いてそこに結合した抗体を検出または検定する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
3件

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請求項1

血清または血漿試料中の、細胞表面抗原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する固相法であって、ここで該方法は、前記試料は、前記抗原担持する固定化細胞調製体と接触させ、それに結合した抗体をインディケーターにより検出または検定する方法であり、前記インディケーターが、標識されたラテックス粒子に結合された、前記抗体に対する結合対からなるものである、方法。

請求項2

ラテックス粒子がポリビニルトルエンを含んでなるものである、請求の範囲第1項に記載の方法。

請求項3

粒子の直径が0.8〜6.4ミクロンである、請求の範囲第1項または2項に記載の方法。

請求項4

前記ラテックス粒子の標識が酵素である、請求の範囲第1〜3項のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

細胞血液細胞である、請求の範囲第1〜4項のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

細胞が赤血球または赤血球ゴーストである、請求の範囲第5項に記載の方法。

請求項7

細胞が赤血球ゴーストである、請求の範囲第6項に記載の方法。

請求項8

細胞がレクチンによって表面上に固定されている、請求の範囲第1〜7項のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

レクチンがガラクトシル残基に特異性を有するものである、請求の範囲第8項に記載の方法。

請求項10

レクチンが、Agaricus bisporus 、Agaricuscampestris 、またはBauhinia purpurea レクチンを含んでなるものである、請求の範囲第9項に記載の方法。

請求項11

固定されたゴースト糖アルコールの存在下にて乾燥されたものである、請求の範囲第7項に記載の方法。

請求項12

糖アルコールがキシリトールである、請求の範囲第11項に記載の方法。

請求項13

血清または血漿試料中における細胞表面抗原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する固相法用のキットであって、a)固体支持体に固定した前記抗体に対する抗原を与える少なくとも一種類の細胞膜調製物、b)ラテックス粒子に結合した前記標的抗体の結合対を含んでなる検出可能に標識したインディケーター試薬を含んでなるキット。

0001

本発明は、固相免疫学的検定法、特に血液試料スクリーニングに用いられる
固相血清学的検定法に関する。

0002

免疫検定法、特に血清学的検定法は、臨床科学で日常的に用いられる重要な方
法である。血液型に特異な抗体を、輸血前に患者血清から検出できるようにす
ることが特に重要である。輸血前に、供血者および患者の血液試料は主要な血液
抗原であるA、B、O、およびRh(D)の表現型分類された後、Duff
y、Kidd、Kell、MNSおよび他のRh特異性などの患者の血清中に含
まれる非定型抗体に関しスクリーニングされる。このような不規則抗体を検出し
た後、同定を行うことにより、輸血に適する血液、すなわちこれらの不規則抗体
が向けられる抗原を発現しない血液を容易に選択することができる。適切に選択
された血液を輸血することによって、軽度の発熱から死亡にまで及ぶ患者の輸血
反応が避けられる。

0003

既知の血清学的検定法は、赤血球の抗原−抗体の相互作用検出用懸濁液中での
赤血球の凝集作用を利用したものである。このような患者の血清中の抗体検出試
験は、本質的に手作業による試験であって、極めて主観的であ
り、オペレーター自身が凝集作用の有無を視覚的に識別することが要求される。
抗原に対して陽性を示す血液をin vivo で輸血する場合に臨床上重篤輸血反応
を起こすことがある抗体の多くは、低濃度で存在し、in vitroでは血清/血漿
希釈せずに試験を行っても、弱い凝集反応しか引き起こさない。余り熟練してい
ないオペレーターは弱い凝集反応を見逃しがちなことから、このような試験操作
は、実際上、感受性および精確性に欠ける。

0004

他の分野では、固相免疫検定法が用いられており、抗原調製物固体支持体
に固定し、抗体を含む試験試料暴露した後、結合した抗体を例えば酵素または
放射能標識した二次抗体を用いて検出する。この方法は、容易に自動化できる他
標識物質を適当に選択することによって結果を定量できるという利点を有する
。このような方法の感受性は非常に高い。

0005

固相法は、標的抗体と反応する固定した赤血球を用いることによって、不規則
血液細胞抗体の抗体スクリーニングに応用されている。この手法では、赤血球に
結合した抗グロブリンを、抗体−抗原相互作用の検出手段として用いており、こ
れは抗グロブリンと固定した標的抗体との間の結合反応によるものである。この
ような赤血球を、「インディケーター」という。赤血球は、例えば塩化クロム
どを用いた直接的な抗グロブリンへの化学的カップリングによって、あるいは赤
血球および抗グロ
リン試薬の両方に結合する抗Rh(D)のような赤血球抗原に対する抗体を用い
て調製し、インディケーターとして用いる。これらの系では、陽性反応イン
ィケーター赤血球の固体表面への付着によって示される。この反応をマイクロ
レート上でまたは凹面のある他の表面で行う場合には、インディケーター細胞
適当な重力および時間条件下にてその表面上に遠心して、陽性反応の場合には、
赤血球の単層ウェル/凹面の周囲に形成され、陰性反応では赤血球がボタン状
となってウェル底部に形成される。反応はインディケーター赤血球の視覚検査
よって検出されるが、その際、赤血球パターンの主観的解釈が要求される。イン
ディケーター赤血球パターンの自動客観読み取りではイメージ分析器が必要とな
り、得られるパターンは用いた遠心条件によって変わる。

0006

しかしながら、水性物質で標識した、例えば酵素標識した、二次抗体をインデ
ィケーター赤血球で標識した二次抗体の代わりに赤血球抗原に対する抗体の検出
系に用いると、バックグラウンドシグナル許容不可能なほど高くなる。従って
客観的であるという利点があるにせよ、このような系が提供する自動読み取り
には、非特異的に結合した免疫グロブリンが検出されることによりバックグラ
ンドが許容不可能なほど高くなるという問題が残る。

0007

固相法の利点にもかかわらず、非特異的結合による許
容不可能なほどバックグラウンドが高くなるという問題点が残る。更に、検定
一定の結果を保証できるような均一の特性を備えた赤血球の提供も難しい。

0008

本出願人は、意外にも、標的抗体の結合対(a binding partner for the targ
et antibody )を担持する標識ラテックスを検出系として用いることによって、
バックグラウンドシグナルを有意に減少させることができることを見出した。

0009

従って、本発明は一つの態様では、血清または血漿試料中における細胞表面抗
原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する固相法であって、前
試料を前記抗原を担持する固定化細胞調製体と接触させ、それに結合した抗体
をインディケーターを用いて検出または検定する方法であり、前記インディケー
ターが、標識されたラテックス粒子に結合された、前記抗体に対する結合対から
なるものである、方法を提供する。

0010

この方法は、血液、特にヒト血液の固相抗体のスクリーニングに好適であって
、本発明の好ましい態様を形成している。この場合、多数の標的抗体に対応する
抗原を有する赤血球を固定したパネルを、抗体のスクリーニングに最も好都合
固定して用いることができる。

0011

本明細書で用いる用語「細胞」は、特に断らない限り、完全な細胞の表面抗原
を有するが、乾燥した形態で保存できる利点のある細胞膜かまたは「ゴースト
ghosts)」
を含む意味で用いられるものとする。

0012

固定する表面は、プレートチューブスティックビーズ粒子膜フィル
ターまたはゲルなどの任意の通常の形態をとることができる。しかしながら、自
動化した系に適用できる表面が好ましく、特にマイクロプレートが好ましい。

0013

支持体構成材料は、プラスティック材料またはニトロセルロースなどの通常
のものであることがきるが、ポリスチレンおよびポリ塩化ビニルが好ましい。

0014

抗原調製物は、細胞、好ましくは血液細胞、更に好ましくは赤血球を含んでな
るものであり、またはそのような細胞から誘導される膜調製物、例えば赤血球ゴ
ースト(すなわち、溶解した赤血球の膜)を含むことができる。

0015

この方法を、特に患者の血清中に標的抗体が含まれているかどうかを輸血前に
スクリーニングするのに適用する場合には、2種類の固定した試験細胞であって
、通常のABO血液型分類法両方共O型であることが確認された細胞を用いる
系で、平行して試験を行うことが望ましい。また、低頻度抗原、すなわち通常の
母集団頻度が1%未満の抗原を発現する細胞を除外することが望ましい。下記
の抗原が、試験細胞の少なくとも1つで発現されることが望ましい:
C c D E e K k Fya Fyb Jka JkbS s M N
P LeaおよびLeb。

0016

試験細胞を適宜選択すれば、本発明の方法を用いて、不規則抗体のスクリーニ
ングだけでなく、既知の表現型の他の試験細胞のより幅広いパネルを用いてこれ
らの抗体の特異性を分類することもできる。

0017

好適なスクリーニング細胞は、例えばBPL、Elstree、Hertsな
どから市販されている。

0018

この赤血球細胞は、様々な方法で表面に固定することができ、例えば細胞表面
に発現した非血液型抗原に対する抗体により、またはポリ−L−リジン有機
料またはレクチンを用いて付着させることにより固定することができる。しかし
ながら、用いる試薬が細胞表面に適合するものであって、細胞または膜を検定中
ずっと安定して表面に結合させることができるものであるのが望ましい。

0019

レクチン、特にAgaricus bisporus 、Agaricuscampestris またはBauhinia pu
rpurea レクチンのようなガラクトシル残基に特異性を有するものが好ましく、
これも本発明の一つの態様を構成している。

0020

赤血球をこのようなレクチンを介してプラスティックに付着させると、化学
質(ポリ−L−リジンまたは有機染料)または抗体を用いる方法よりも赤血球を
一層均一で強固にコーティングできることが示された。これは、様々な条件下で
赤血球をコーティングしたマイクロプレートの顕微鏡による視覚検査、および完
全法(entire
method)で試験を行った場合には、限界希釈した抗体から得られる反応強度によ
り評価した。抗体を限界希釈した場合、得られるシグナルの程度は利用可能な抗
原部位の数に依存する。

0021

細胞またはゴーストは、例えば重力下での沈降によるなどの単なる接触により
固体支持体表面をコーティングすることができ、または細胞を表面に遠心するこ
となどによりコーティングを補助し且つコーティングの速度を増加させることが
できる。全細胞よりもゴーストを用いることが好ましいのは、本出願人が保存上
、ゴーストの方が固相上で安定であることを見出したことによる。ゴーストは、
固体表面上に固定された赤血球を溶解させることによって固相上のin situ で調
製することも、または懸濁液中に調製した後に表面上に沈降させるかまたは遠心
することで調整することができる。

0022

細胞調製物としてゴーストを用いるもう一つの利点は、ゴーストをプレート上
で乾燥させて保存できることである。このようにして、試験プレートを多量に調
製し、将来の使用に備えて保存することができる。ゴーストは、既知の技術を用
いてプレート上で乾燥させることができ、例えば糖の存在下で、場合によっては
タンパク質と共に周囲温度で乾燥することができる。当然ながら、乾燥技術は抗
原を変質させないことが望ましい。これらの技術は、EP−A−140489号
明細書およびEP−A−
367468号明細書に記載されている。

0023

更に、本出願人は、線状構造糖アルコールであるキシリトールを用いて有利
赤血球膜を乾燥および保存できることを見い出した。これは本発明の新規な態
様を構成しており、赤血球膜の乾燥貯蔵の間の好ましい保存法である。

0024

調製したプレートは、4℃にて袋入り乾燥剤を入れた遮光性気密容器密閉
保存ができる。

0025

試験抗体、例えば血清を含んだ溶液は、固定した細胞膜と接触させてから、適
切なインキュベーション時間を経た後に未結合抗体洗浄により除去することが
できる。

0026

次に、陽性反応をインディケーター試薬を用いて検出する。この試薬は、標的
抗体の結合対が結合しているラテックス粒子の懸濁物からなり、このインディケ
ーターは検出できるよう標識されている。

0027

このラテックス粒子の直径は0.8〜6.4ミクロンであることができ、好ま
しくは2〜2.4ミクロンである。ラテックス粒子は任意の好適な材料を含んで
いることができるが、ポリビニルトルエンが好ましい。非磁化性または磁化性の
ラテックスを用いることができる。結合対は、任意の好都合な手段、例えば溶液
からの受動的吸収、によって粒子に結合させることができ、次いで洗浄し、残っ
ている反応性部位を通常の手段、例えばアルブミンなどの不活性タンパク質でブ
ロックする。この検
出系は、好ましくは結合対への予備結合によって粒子に結合される。

0028

標的抗体の結合対は、様々な形態をとることができ、例えば、抗グロブリン抗
体またはそのフラグメントプロテインAまたはプロテインGを含んでなること
ができる。検出される抗体がヒトの抗体である場合、二次抗−ヒト抗体は、ウサ
ギ、ヤギまたはヒツジなどの種においてポリクローナル的に産生させることがで
き、または好適なモノクローナル抗体は超歯類から誘導することもできる。

0029

インディケーター粒子は、好ましくは、酵素、例えばペルオキシダーゼアル
カリホスファターゼまたはグルコースオキシダーゼ蛍光標識、例えばフルオレ
セインまたはフィコエリスリン;放射能標識、例えば 125I、または発光分子
例えばルミノールのような例えば任意の客観検出が可能な手段で標識されること
が好ましい。用いる標識、特に酵素標識は、使用する抗原調製物の種類に合わせ
て適切に選択し、抗原調製物中の内因性酵素によって生じる擬似的な結果を避け
る必要がある。従って、赤血球はペルオキシダーゼを含んでいるため、全赤血球
を固定して用いる場合は、検出用標識にペルオキシダーゼを用いるべきではなく
アルカリホスファターゼが好適な代替酵素になる。いずれも、固定したゴース
トを用いたスクリーニングに好ましく用いることができる。
更に、全赤血球をスクリーニングする場合には、選択された酵素は、便宜的に細
胞の赤色と区別できる検出用色生成物を生成するものであることができる。し
かし、ゴーストを用いる場合には適用されない。

0030

臨床試験に関する限りでは酵素を検出用標識に用いる利点があるが、これは抗
体のスクリーニングを臨床検査室で日常的に行っている他の標準的なELISA
法に組み込むことができるからである。更に、マイクロプレートを用いて行う完
全なスクリーニング技術は、利用可能な方法および装置を用い、更に特別な道具
および熟練者の技術に負うことなく、容易に自動化に適用できる。酵素標識を用
いることにより、反応を簡単な分光光度測定で客観的に評価できるようになる。

0031

通常の試験では、本発明の方法に用いる反応物キットの形態で供給すること
ができる。

0032

従って、本発明のもう一つの態様では、血清または血漿試料中における細胞表
面抗原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する固相での検出ま
たは検定用のキットであって、
a)固体支持体に固定した前記抗体に対する抗原を与える少なくとも一種類の細
胞膜調製物、
b)ラテックス粒子に結合した前記標的抗体の結合対を含んでなる検出可能に標
識したインディケーター試薬を含んでなるキットが提供される。

0033

また、このようなキットには、適切な緩衝液および酵素基質、更に陽性および
陰性両方のコントロール血清を含むこともできる。

0034

本発明を、次に実施例によって説明するが、これらの実施例は発明を制限する
ものではない。
実施例1
ヒト赤血球に対する未知の血液型特異抗体の検出用免疫検定法
a)固定した赤血球の調製

0035

Agaricus bisporusレクチン(Sigma L-5640)の溶液を、1mM NaClを
含む20mMリン酸緩衝液pH7.0で10μg/mlの濃度で調製した。75
μlずつをポリスチレン製のU型ウェルマイクロプレート(Sterilin 611U96)
のウェルに加えた。プレートを室温(18〜25℃)で1時間インキュベーショ
ンした。次にプレートを、0.055%w/v Tween 20を含む10m
リン酸緩衝した0.15M食塩水(pH7.2)(PBS/Tween)で
3回洗浄した。

0036

赤血球(検出しようとする抗体に対する抗原を網羅するように選択したもの)
を、PBSで3回洗浄し、最後にPBS中に0.5%の濃度に懸濁し、プレート
に加えた。マイクロプレートを230gで1分間遠心するか、または赤血球を1
時間沈降させた。次に、マイクロプレートをPBS/Tweenで3回洗浄し、
ウェル周辺
赤血球単層を残して、過剰な赤血球を除去した。細胞単層集結度は、この時点
で顕微鏡によって観察することができる。穴や裂け目のない、均一な細胞の単層
見える。

0037

検定にゴースト単層が必要ならば、次にpH7.6の5mMリン酸緩衝液を加
えて赤血球を溶解させることができる。ウェルにこの緩衝液を入れてマイクロプ
レートを室温で1分間インキュベーションした後、ウェルを同じ緩衝液で2回洗
浄した。

0038

保存には、1Mキシリトール75μlを0.15NaClに溶解したものをウ
ェルに加え、マイクロプレートを室温で3分間インキュベーションした。ウェル
から液体を除去し、プレートを室温で3時間かけて乾燥した。次に、このマイ
ロプレートを好適な気密、防湿、遮光性の袋にシリカゲル乾燥剤の袋と一緒に密
閉し、4℃で保存した。
b)インディケーターの調製

0039

ラテックス検出試薬は、アルカリホスファターゼ結合抗ヒトIgGを直径2μ
mのポリビニルトルエンラテックス粒子に受動的に付着させて調製した。このラ
テックスは、10%懸濁液として供給された。ラテックス粒子を遠心分離によっ
ペレット状にした後、最初の5倍容量の1mM NaClを含む20mMリン
酸緩衝液(pH8.0)に再懸濁した。ラテックス粒子を再度ペレッ
ト状にした。最初の6/10倍容量の、適当に希釈したアルカリホスファターゼ
標識した抗ヒトIgGを同じリン酸緩衝液に溶解したものをラテックスに加え、
ラテックスをこの溶液に懸濁した。混合物を室温(18〜25℃)で2時間イン
キュベーションし、次にラテックスをペレット状にしてからPBSに4回再懸濁
した。最後に、ラテックスを10mMトリ緩衝化1mM MgCl2、1%ウ
血清アルブミンおよび0.1%アジ化ナトリウムを含む0.15M NaCl
に適当な濃度(通常1/150)に再懸濁した。この検出試薬を4℃で保存した

c)スクリーニング検定

0040

抗体についての血清/血漿試料のスクリーニングに系を用いるため、保存した
マイクロプレートを保存袋から取り出した。50μl/ウェルのLISS(低イ
オン強度溶液、0.24Mグリシン、0.03M NaCl、0.003Mリ
ン酸緩衝液pH6.7)を、用いるウェルに加えた。次に、25μlの試験血清
/血漿試料を加えた。マイクロプレートを37℃で15分間インキュベーション
した後、PBS/Tweenで3回洗浄した。75μl/ウェルのラテックス検
出試薬を加え、マイクロプレートを230gで1分間遠心し、続いて930gで
2分間遠心した。あるいはこのラテックスは、遠心せずに室温(18〜25℃)
で1時間インキュベーションすることもできる。次にマイクロプレートをPBS
/T
weenで4回洗浄した。次に、75μ1/ウェルの発色性の酵素基質を加えた
。アルカリホスファターゼに用いる基質溶液は、p−ニトロフェニルホスフェ
トの錠剤を0.1Mジエタノールアミン緩衝液pH9.8に溶解して調製した。
マイクロプレートを室温に15分間(18〜25℃)に保持した後、ウェルの吸
光度を405nmでプレート透過分光光度計で読み取った。プレートの読み取り
を直ちに行えない場合には、50μl/ウェルの3M NaOHを加えて反応を
中止させた。プレートを暗所に4℃で保存すれば、2日以内ならば結果は随時読
み取れる。試料について記録した吸収値を、平行して陽性および陰性のコントロ
ール血清から得られた結果と比較した。記録された吸収値が陰性コントロール
それを有意に上回る場合は、試料中に抗体が存在することを示している。

0041

調製したマイクロプレート、インディケーター試薬、LISS溶液およびアル
カリホスファターゼ基質の錠剤および緩衝溶液は、キットの成分を形成すること
ができる。
実施例2
ラテックス結合抗グロブリン試薬および水性酵素結合抗グロブリン試薬を検出系
としての使用した場合の比較

0042

第1図は、前記の方法を用い、R1r(Rh(D)抗原陽性)およびrr(R
h(D)抗原陰性)赤血球に対
し、弱い抗Rh(D)血清を一連希釈率で得た結果を示す。抗原陽性赤血球と
抗原陰性赤血球では、記録されたシグナルに明らかな差が見られる。抗Rh(D
)は、1IU/mlの抗−Dを含んでいた。第2図は、同じアルカリホスファ
ーゼを結合したがラテックスへのカップリングを行わない抗ヒトIgG試薬を用
いた場合に得られた結果を示す。抗原陽性赤血球と抗原陰性赤血球で記録された
シグナルに差はない。これらの結果は、本検出系でラテックスを使用する必要性
を示したものである。
実施例3
レクチン、ポリ−L−リジンおよびアルシアンイエローの、赤血球のプラスティ
クマクロプレートへの結合に関する比較

0043

ポリスチレンおよびポリ塩化ビニルの異なる部分を、最適な濃度のAgaricus b
isporusレクチン、ポリ−L−リジンまたはアルシアンイエローでコーティング
した。(事前実験を行い、これらの物質の各々の最適なコーティング濃度を定
めた)。表現型R1R1(Rh(D)抗原陽性)およびrr(Rh(D)抗原陰
性)を、前記のようにウェル上にコーティングした。ウェルを顕微鏡を用いて赤
血球の単層の集結について調べた。前記と同様に一連の希釈率の弱い抗−Dを、
検出系としてラテックス結合させたペルオキシダーゼ結合抗グロブリンを使って
前記の方法に従って用いた。

0044

結果は、両方の型のマイクロプレート上で、レクチンおよびポリ−L−リジン
が穴のない完全な赤血球単層を生じたことを示した。アルシアンイエローでコー
ティングしたしたウェルには、数個の穴が見られた。記録された吸光度を、抗−
Dの1/64(限界希釈)で下記に示す。

0045

この結果は、レクチンが全体として最良の性能を与えることを示している。ポ
リ−L−リジンは、PVCプレート上で生ずるバックグラウンドが高く、2回測
定を行っても通常その性能は一定していない。アルシアンイエローは、レクチン
よりも低い結果を示しており、これは検定中にゴースト単層が幾らか失われたた
めと推察される。
実施例4
キシリトール、グルコースおよび食塩水の、固定赤血球
乾燥用保存溶液としての比較

0046

1Mキシリトールおよびグルコースを0.15MNaClに溶解したものおよ
びNaClのみを前記における乾燥保存溶液として比較した。(これらのモル
度は、予め最適であることが示されていた)。抗原陽性細胞および抗原陰性細胞
を、抗−Rh(D)、抗−Fya、抗−K、抗−s、抗−Jkaを含む血清の評
価用に選択した。各血清をそのままでおよび限界希釈で、2週間後乾燥した様々
な溶液中に入れた細胞に対して、および乾燥しなかったが全血を保存しておき新
たに固定した同種の細胞に対して試験した。結果(下記)は、グルコースおよび
キシリトールの両方とも、試験した赤血球抗原の好適な乾燥保存料であることを
示している。

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