技術 新規なプロテアーゼ

0001

本発明は、新規なプロテアーゼに関する。本発明のプロテアーゼは、例えば、筋ジストロフィーに対する治療薬の探索又は診断法の開発に有用である。

0002

筋ジストロフィー〔進行性筋ジストロフィー（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｒｈ：ＰＭＤ）〕は、進行性に筋組織の変性が起こり、筋力の低下と筋萎縮が著しくなり、随意運動が困難となる代表的な遺伝性疾患の一種である。原因には膜異常説、神経原説、血管異常説などがあるが、詳細は不明であり治療法も確立していない。遺伝的進行性筋ジストロフィーの病理学的特徴は、白筋又は赤筋の変性壊死で、筋原繊維の崩壊にはリソソーム性プロテアーゼ（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）が重要な働きをしていると考えられている。例えば、骨格筋のＡＬ帯に局在し、アクチンとミオシンとの間に介在しているタンパク質であるＣ−タンパク質が分解されると、筋原繊維の構造の安定性が弱まり、崩壊壊死が促進されることが予想されており、このようなプロテアーゼの探索は、筋ジストロフィーの発症原因や治療法等の研究において極めて重要な位置を占めている。前記のＣ−タンパク質を分解するプロテアーゼとしては、ニューランド等によりＭＭＣＰ−４（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９４，１２７−１３５，１９９３）が報告されている。

0003

前記のＭＭＣＰ−４は、Ｔ細胞の培養液中の骨髄由来のマスト細胞から見出されたプロテアーゼであるのに対し、本発明者は、筋ジストロフィー症状を示す哺乳動物の骨格筋に特異的に存在し、Ｃ−タンパク質を分解する新規なプロテアーゼを見出した。本発明はこうした知見に基づくものである。

0004

従って、本発明は、アミノ酸残基４５個からなるアミノ末端領域以外の領域に、配列表の配列番号２の配列で表される領域と、配列表の配列番号３〜６の配列のいずれか１つで表される領域とを有することを特徴とするプロテアーゼに関する。

0005

本発明のプロテアーゼは、以下に示す理化学的性質を有する。
（１）分子量
分子量は約２７，０００である。例えば、後述する実施例１及び２に示すように、単離精製した本発明のプロテアーゼを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定して、確認することができる。

0006

（２）作用及び基質特異性
本発明のプロテアーゼは、骨格筋の筋原線維構成成分であるＣ−タンパク質に対して強い分解活性を示す。また、変性カゼインも加水分解する。牛血清アルブミンに対しては、弱い分解活性しか示さない。合成ペプチド基質に対しては、チロシンのカルボキシル末端側のペプチド結合を特によく加水分解するが、プロリン、アラニン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンなどのカルボキシル末端側のペプチド結合に対してはほとんど作用を示さない。合成ペプチド基質（０．１ｍＭ）に対する作用を表１に示す。

0007

表１において使用する略称の意味するところは、次に示すとおりである。Ｓｕｃ：サクシニル基、ＭＣＡ：４−メチルクマリル−７−アミド残基、Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ＯＢｚｌ：オルトベンゾイル基、Ｇｌｔ：グルタリル−（４−カルボキシブチリル−）基、Ｚ：ベンジルオキシカルボニル基、Ｌ：ロイシン残基、Ｖ：バリン残基、Ｙ：チロシン残基、Ｓ：セリン残基、Ｇ：グリシン残基、Ｐ：プロリン残基、Ｉ：イソロイシン残基、Ａ：アラニン残基、Ｍ：メチオニン残基、Ｈ：ヒスチジン残基、Ｑ：グルタミン残基、Ｅ：グルタミン酸残基、Ｋ：リジン残基、Ｔ：スレオニン残基、Ｒ：アルギニン残基、Ｄ：アスパラギン酸残基、及びＦ：フェニルアラニン残基。

0008

基質相対活性（％）
Ｓｕｃ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｙ−ＭＣＡ １００
Ｓｕｃ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−ＭＣＡ ４１．７
Ｓｕｃ−Ｌ−Ｙ−ＭＣＡ ３．００
Ｓｕｃ−Ｇ−Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−ＭＣＡ ０．０１
Ｓｕｃ−Ｉ−Ａ−ＭＣＡ ０．０３
Ｓｕｃ−Ｌ−Ｍ−ＭＣＡ ０．２７
Ｓｕｃ−Ｈ−Ｈ−Ｑ−ＭＣＡ ０．０３
Ｓｕｃ−Ｈ−Ｑ−Ｅ−ＭＣＡ ０．０１
Ｓｕｃ−Ａ−Ｅ−ＭＣＡ ０．００
Ｂｏｃ−Ｅ−Ｋ−Ｋ−ＭＣＡ ０．０７
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０６
Ｂｏｃ−Ａ−Ｇ−Ｐ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０６
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０６
Ｂｏｃ−Ｅ（ＯＢｚｌ）−Ａ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０６
Ｂｏｃ−Ｄ（ＯＢｚｌ）−Ｐ−Ｒ−ＭＣＡ ０．２２
Ｂｏｃ−Ｆ−Ｓ−Ｒ−ＭＣＡ ０．１７
Ｂｏｃ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０７
Ｂｏｃ−Ｇ−Ｋ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０２
Ｂｏｃ−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０５
Ｂｏｃ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０２
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０２
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０２
Ｂｏｃ−Ｑ−Ａ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０９
Ｂｏｃ−Ｇ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０３
Ｇｌｔ−Ｇ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０３
Ｚ−Ｒ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０２
Ｚ−Ｆ−Ｒ−ＭＣＡ ０．０２

0009

（３）酵素活性の測定方法
本発明のプロテアーゼの活性測定には、レゾルフィン若しくはフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと称する）で標識した変性カゼインを基質として測定する方法、又は４−メチルクマリル−７−アミド（以下、ＭＣＡと称する）で標識した合成ペプチド、すなわちサクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシン−ＭＣＡ（以下、Ｓｕｃ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｙ−ＭＣＡと称する）を基質として測定する方法を使用する。

0010

（Ａ）レゾルフィン又はＦＩＴＣで標識した変性カゼインを基質として測定する方法
レゾルフィン又はＦＩＴＣ標識の変性カゼイン０．５ｍｇ／ｍｌ（終濃度）を含むトリス−グリシン緩衝液〔（終濃度）０．１４Ｍトリス−グリシン，ｐＨ８．５及び０．５Ｍ塩化ナトリウム〕８０μｌに、プロテアーゼ（１０μｇ／ｍｌ溶液）１０μｌを加え、３０℃、１時間反応させた後、５０％トリクロロ酢酸溶液１０μｌを添加することにより酵素反応を停止させる。遠心操作後、採取した上清８０μｌを０．７５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）１２０μｌに添加し、レゾルフィン標識変性カゼインを使用した場合には波長５７４ｎｍの吸光度測定から、ＦＩＴＣ標識変性カゼインを使用した場合には励起波長４９５ｎｍによる蛍光波長５２０ｎｍの蛍光強度測定から、分解された変性カゼイン量を定量し、プロテアーゼ活性を求める。

0011

（Ｂ）ＭＣＡで標識した合成ペプチドＳｕｃ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｙ−ＭＣＡを基質として測定する方法
０．５Ｍトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ９）１０μｌ、５Ｍ塩化ナトリウム２０μｌ及び純水５９μｌの混合液８９μｌに、プロテアーゼ（１０μｇ／ｍｌ溶液）１０μｌを加え、引続き直ちに、ジメチルスルフォキシドに溶解した１ｍＭのＳｕｃ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｙ−ＭＣＡを１μｌ（終濃度１０μＭ）添加攪拌し、３０℃、２０分間反応させた後、２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）１．４ｍｌを添加することにより酵素反応を停止させる。遠心操作後、採取した上清の励起波長３８０ｎｍによる蛍光波長４６０ｎｍの蛍光強度を測定し、ＭＣＡの蛍光強度の標準線を使って加水分解された基質量を定量し、プロテアーゼ活性を求める。本明細書中においては、この測定条件を標準反応条件とする。また、２０分間に合成ペプチドＳｕｃ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｙ−ＭＣＡの１ナノモルを分解する酵素量を１単位と定義する。

0012

（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
本発明のプロテアーゼの酵素活性の至適ｐＨは、約ｐＨ９である。例えば、後述する実施例３に示す方法で測定して、確認することができる。中性より酸性領域では酵素活性は弱く、ｐＨ６以下の酸性ではほぼ完全に活性を示さなくなる（図１参照）。緩衝液として、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ酢酸─酢酸ナトリウム、ｐＨ２．８〜４．８）、リン酸緩衝液（０．０５Ｍリン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム、ｐＨ４．９〜７．６）、トリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７．４〜８．５）、トリス−グリシン緩衝液（０．０５Ｍトリス−グリシン、ｐＨ７．８〜９．８）、及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム、ｐＨ８．４〜１０．２）を用いた場合、牛血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で氷冷しておけば、安定ｐＨ範囲はｐＨ４．０〜１０．２である。

0013

（５）作用適温の範囲
本発明のプロテアーゼは、約１５℃〜約５０℃の範囲で作用し、至適温度は約３０〜４０℃である。

0014

（６）失活条件
０．１Ｍ塩酸又は３％酢酸の溶液中では、不可逆的に酵素活性を完全に喪失した。

0015

（７）各種阻害剤、活性化剤及び安定化剤の影響
本発明のプロテアーゼは、各種阻害剤に対して、α−キモトリプシン様のセリンプロテアーゼの性質を示す。合成ペプチドＳｕｃ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｙ−ＭＣＡを基質として使用し、各種阻害剤の効果を調べた結果を表２及び表３に示す。

0016

阻害剤相対活性
阻害剤無添加 １００％
キモスタチン１６μＭ ７
１６０μＭ １

ＰＭＳＦ ０．１ｍＭ ５１
１．０ｍＭ ５
ＡＰＭＳＦ４０μＭ １０７
４００μＭ ９３
アプロチニン０．１５μＭ １１１
１．５０μＭ １０１
ＴＬＣＫ ０．１ｍＭ １０６
１．０ｍＭ ９４
ＴＰＣＫ０．１ｍＭ ６３
１．０ｍＭ ５９

0017

0018

例えば、キモトリプシン又はカテプシンＡ、Ｂ若しくはＤの阻害剤であるキモスタチンにより活性を阻害される。また、トリプシン、キモトリプシンの阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で完全に阻害される。トリプシンの阻害剤であるアプロチニン又はＬ−１−クロロ−３−（４−トシルアミド）−７−アミノ−２−ヘプタノンハイドロクロライド（ＴＬＣＫ）では阻害されない。また、キモトリプシンの阻害剤であるＬ−１−クロロ−３−（４−トシルアミド）−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）で阻害されるが、トリプシン若しくはカテプシンＢの阻害剤であるロイペプチン、トリプシン又はカテプシンＡ若しくはＢの阻害剤であるアンチパイン、カテプシンＤの阻害剤であるペプスタチン、又は血漿セリンプロテアーゼの阻害剤である４−（アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオライド（ＡＰＭＳＦ）は、いずれも活性を阻害しない。更に、チオールプロテアーゼの阻害剤であるＥ−６４、メタロプロテアーゼの阻害剤であるホスホラミドン、金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エクソペプチダーゼの阻害剤であるベスタチン、又は表には示していないがＳＨ基阻害剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）若しくはｐ−クロロ−マーキュリックベンゾイックアシッド（ＰＣＭＢ）は、いずれも活性を阻害しない。

0019

また、ナトリウムイオン又はカリウムイオンは、５０ｍＭ以上の濃度で本発明のプロテアーゼを活性化する。更に、牛血清アルブミンは、０．１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、本発明のプロテアーゼを安定化する。

0020

（８）アミノ末端領域のアミノ酸配列
本発明のプロテアーゼは、アミノ末端領域に配列表の配列番号１の配列で表されるアミノ酸残基４５個からなるアミノ酸配列を有する（なお、配列番号１の配列中でＸａａは、未同定のアミノ酸残基である）。このアミノ酸配列は、アミノ末端の２０アミノ酸残基及びＤＮＡの全塩基配列が確定されている公知のプロテアーゼＭＭＣＰ−４のＮ末端領域のアミノ酸配列と一致する。

0021

（９）アミノ末端領域以外の領域のアミノ酸配列
本発明のプロテアーゼは、前記アミノ酸残基４５個からなるアミノ末端領域以外の領域に配列表の配列番号２の配列で表されるアミノ酸配列を有する。更に、本発明のプロテアーゼは、前記のアミノ末端領域以外の領域に配列表の配列番号３〜６の配列で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを同時に有する。これらのアミノ酸配列は、前記のプロテアーゼＭＭＣＰ−４の塩基配列から推測されるアミノ酸配列とは全く異なる配列であり、更に、その他の公知のアミノ酸配列又はその他の公知の遺伝子配列から推測されるアミノ酸配列のいずれとも異なる配列である。従って、本発明のプロテアーゼは、公知のタンパク質とは明らかに異なる新規なプロテアーゼである。

0022

（１０）精製方法
本発明のプロテアーゼは、例えば、筋ジストロフィー症状を示す哺乳動物、好ましくは、遺伝性筋ジストロフィーマウスの骨格筋から、通常のタンパク質精製に用いられる方法を組み合わせることによって、調製することができる。例えば、後述する実施例１に記載したように、遺伝性筋ジストロフィーマウス骨格筋の破砕懸濁液から、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過を用いることにより、ＳＤＳ─ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって単一バンドとして検出される程度にまで精製することができる。

0023

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：本発明のプロテアーゼの抽出・精製
筋ジストロフィー症状を示す哺乳動物として、ヒトのＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーと同様にジストロフィン遺伝子に異常をもった遺伝性筋ジストロフィーマウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−ＭＤＸ）を用いた。

0024

遺伝性筋ジストロフィーマウスの骨格筋１００ｇを、Ａ緩衝液〔０．６Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）〕２０００ｍｌ中に懸濁し、懸濁液を遠心分離（６５００×ｇ，２０分間）した。沈殿物をＡ緩衝液で洗浄するため、Ａ緩衝液２０００ｍｌに再懸濁し、続いて遠心分離（６５００×ｇ，２０分間）を行なった。この洗浄操作を更に２回繰り返した後、３回目の再懸濁液をナイロンメッシュ（婦人用ナイロンストッキング）で濾過した。この濾過液を再度、遠心分離（６５００×ｇ，２０分間）した。この遠心分離による沈殿物をＢ緩衝液〔２Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ１０．３）〕１００ｍｌに懸濁し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で懸濁液のｐＨを正確にｐＨ１０．３に調整した。この懸濁液を遠心分離（１０００００×ｇ，６０分間）し、上清を氷冷中に保存する一方、沈澱物をＢ緩衝液１００ｍｌに再懸濁してから遠心（１０００００×ｇ，６０分間）し、新たな上清を得た。この新たな上清と、先に氷冷中に保存した上清とを合わせて、粗抽出液とした。

0025

続いて、この粗抽出液を、レマビーン由来トリプシンインヒビターを固定化したアガロース（シグマ社）を充填したカラムに流し込んでアフィニティークロマトグラフィーを行ない、本発明のプロテアーゼ活性画分を得た。以下、この画分を酵素標品として用いた。精製の各ステップの結果を表４に示す。

0026

精製工程 容量タンハ゜ク質量 全活性比活性収率精製倍率

0027

図１本発明のプロテアーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
図２Ｖ８プロテアーゼＧｌｕ−Ｃを用いて酵素消化した本発明のプロテアーゼを、高速液体クロマトグラフィーで処理して得られたクロマトグラムである。