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課題

甲虫類に対する新規殺虫組成物の提供。

解決手段

ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ(Diabroticaundecimpunctata)、ピラルタ・ルテオラ(Pyrrhalta luteola)、ハリチカ・トンシナ(Halitica tombacina)、オチオリンクススルカツス(Otiorhynchus sulcatus)及びテネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)から成る群から選択されたコレオテラ(Coleoptera)目の甲虫類の成長阻害し、又は殺すために使用するのに適する生きた微生物であって、前記甲虫類に対して毒性の異種性バシルス・ツリンジエンシス(Bacillusthuringiensis)毒素の該微生物中で発現される遺伝子を含有する微生物を含んで成る、甲虫類の成長を阻害し又はそれを殺すための組成物

概要

背景

概要

甲虫類に対する新規殺虫組成物の提供。

ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ(Diabroticaundecimpunctata)、ピラルタ・ルテオラ(Pyrrhalta luteola)、ハリチカ・トンシナ(Halitica tombacina)、オチオリンクススルカツス(Otiorhynchus sulcatus)及びテネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)から成る群から選択されたコレオテラ(Coleoptera)目の甲虫類の成長阻害し、又は殺すために使用するのに適する生きた微生物であって、前記甲虫類に対して毒性の異種性バシルス・ツリンジエンシス(Bacillusthuringiensis)毒素の該微生物中で発現される遺伝子を含有する微生物を含んで成る、甲虫類の成長を阻害し又はそれを殺すための組成物

目的

効果

実績

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請求項1

ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ(Diabrotica undecimpunctata)、ピラルタ・ルテオラ(Pyrrhalta luteola)、ハリチカ・トンシナ(Halitica tombacina)、オチオリンクススルカツス(Otiorhynchus sulcatus)及びテネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)から成る群から選択されたコレオテラ(Coleoptera)目の甲虫類成長阻害し、又は殺すために使用するのに適する生きた微生物であって、前記甲虫類に対して毒性の異種性バシルス・ツリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)毒素の該微生物中で発現される遺伝子を含有する微生物を含んで成る、甲虫類の成長を阻害し又はそれを殺すための組成物

請求項2

前記微生物が、シュードモナス(Pseudomonas)、アゾトバクター(Azotobacter)、エルウィニア(Erwinia)、セラティア(Serratia)、クレシーラ(Klebsiella)、リゾビウム(Phizobium)、ロードシュードモナス(Rhodopseudomonas)、メチロフィルス(Methylophillus)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)又はアルカリゲネス(Alcaligenes)の種である、請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記微生物が着色されており、又はピロプラン(phylloplane)付着性である、請求項1又は2に記載の組成物。

請求項4

前記毒素が、バシラススリンギエンシスサンディエゴ株NRRL B−15939のパラスホラル(parasporal)結晶性毒素の全体又は毒性断片である、請求項1に記載の組成物。

請求項5

前記遺伝子が、配列番号:2に示すアミノ酸配列又は毒性活性を有するその部分をコードしている、請求項1に記載の組成物。

請求項6

ディアブロチカ・ウンデシンプンクタタ(Diabrotica undecimpunctata)、ピラルタ・ルテオラ(Pyrrhalta luteola)、ハルチカ・トンバシナ(Haltica tombacina)、オチオリンクス・スルカツス(Otiorhynchus sulcatus)及びテネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)から成る群から選択されたコレオプテラ(Coleoptera)目の甲虫類の成長を阻害し、又は殺すために使用するのに適する生きた微生物であって、前記甲虫類に対して毒性の異種性バシルス・ツリンジエンシス(Bacillusthuringiensis)毒素の該微生物中で発現される遺伝子を含有する微生物を含んで成る、甲虫類の成長を阻害し又は殺すための組成物を、植物に適用することを含んで成る、コレオプテラ目の甲虫類に対して植物を保護する方法。

技術分野

Ile Pro Val Asn

0001

本発明は殺虫性組成物及びその使用に関する。

0002

胞子形成微生物バシラススリンギエンシス(Bacillus thuringiensis,Bt)は、最もよく知られた昆虫毒素をつくる。この毒素は、δ−エンドトキシンと指定された蛋白質である。これはBtの胞子形成細胞によって合成される。感受性のある昆虫幼虫が毒素の結晶型を摂取すると、毒素は昆虫の腸液プロテアーゼにより生物学的活性のある部分に転化される。主要標的は昆虫の腸上皮細胞であって、これが急激に破壊される。Bt毒素の活性は非常に高く、感受性のある幼虫を殺すのにナノグラム単位の量しか必要でないことが経験からわかっている。

0003

Btの報告された活性範囲は、農林業で大きな問題となっている昆虫である鱗翅類(Lepidoputera)の範囲内の昆虫種を包含する。活性範囲はまた双し類(Diptera)の昆虫も包含する。これにはとブヨ(blackfly)の幾つかの種が含まれる。コーチティーエル(Couch,T.L.)(1980年)「バシラス・スリンギエンシス・バラティイスラエレンシスの蚊病源性」Developments in lndustrial Microbiology 22巻61−67頁;ビーグル・シー・シー(Beegle,C.C.)(1978年)「農業生態系における昆虫性細菌の利用」Developments in lndustrial Microbiology 20巻97−104頁を参照のこと。

0004

クリーグ(Kreig)ら(Z.ang.Ent.(1983年)96巻500−508頁)はバシラス・スリンギエンシス・バラエティ・テネブリオニス(B.thringiensisvar.tenebrionis)と名付けられたBt分離体について記述しているが、これは鞘翅目の2種類の甲虫に対して活性があると言われている。これらはコロラドポテトビートルレプチノタルサ・デセムリネアータ(Leptinotarsa decemlineata)とアゲラスチカ・アルニ(Agelastica alni)である。このような活性をもつと報告された既知のBt分離体はこれだけである。すでに確認されたBt菌株はすべて、いも虫(鱗翅類)やハエの幼虫(双翅類)に対して活性をもつものであった。

課題を解決するための手段

0005

クリーグらのBt分離体は、本発明の新規なBt遺伝子源として使用されるBt分離体との並行比較のため入手できない。従って、クリーグらのBt分離体が公衆の手に入らない以上、クリーグらの公告は合衆国法の下で法的に有効な特許法の参照ではない。

0006

鞘翅目の甲虫に有毒な毒素遺伝子のクローン化及び発現が明らかにされ、特許請求されている。クローン化された遺伝子でつくられる毒素は、鞘翅目の甲虫に対して活性があるが、トリプルシア・ニ(Trichoplusia ni)、スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exigua)、又はネッタイシマ蚊(Aedes aegypti)に対しては活性がない。鞘翅目に含まれるものとして、農業上大きな損害をもたらす種々のディアブロティカ(Diabrotica)種(ハムシ科Chrysomelidae)がある。

0007

例えば、ディー・ウンデシプンクタータ(D.undecimpunctata)(西部班点ウリハムシ)、ディー・ロンコーニス(D.longicornis)(ノーザンコーンルートワーム)、ディー・バージテラ(D.virgitera)(ウエスタン・コーン・ルートワーム)、及びディー・ウンデシムプンクタータ・ハワーディ(D.undecimpunctata howardi)(サザンコール・ルートワーム)がある。

0008

「M−7」で指定される本発明の毒素遺伝子給源として使用されるバシラス・スリンギエンシス分離体は、独特パラ胞子体(結晶)をもつ点で異例である。これは位相差顕微鏡下に外観が暗色で、平らな角型の外形を呈する。現在バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ(B.t.sd)として知られるバシラス・スリンギエンシスM−7の二次培養基は、1985年2月27日、合衆国イリノイ州ピオリア、合衆国農務省部研究所の永久保存施設寄託された。

0009

培養基は、保存施設からNRRL B−15939の寄託番号を指定された。この寄託物は、これを開示した特許の授与により一般に入手できる。寄託物はまた、本出願又はその後代の対応出願がなされている国の外国特許法での要求に応じて入手できる。しかし、寄託物が入手できるからといって、政府決定によって授与される特許権侵害してまで、本発明の実施権を構成するものではないことを了解されたい。

0010

バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B−15939はこの技術の標準的な培地及び醗酵手法を使用して培養できる。醗酵周期の完了後、この技術に周知の手段により、まずBt胞子と結晶を醗酵液から分離することによって、細菌を収穫できる。細胞からのDNA(染色体プラスミド)を標準手順によって単離し、この技術で周知の手順によって精製できる。例えば、このような標準手順はマニアティス(Maniatis)ら、分子クローン化(1982年)、コールドスプリングハーバー研究所、に明らかにされている。精製DNAを次に適当な制限エンドヌクレアーゼ消化させることができる。

0011

次にB.t.sd DNAのジーンバンク構築することができる。本発明では、上記のように得られる精製B.t.sd DNAを制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化させ、周知の入手できるプラスミドpBR322のBamHI位置へクローン化した。B.t.sdのDNAのジーンバンクが構築されたら、次にこのジーンバンクを選別するためにDNAプローブを構築する必要がある。この臨床的DNAプローブの構築は、B.t.sd培養基からM−7毒素結晶を単離することによって開始された。

0012

回収されたM−7毒素結晶を標準手順によって精製し、次にトリプシンで消化させるとペプチド断片がつくられる。これらのトリプシン性の断片の幾つかのもののアミノ酸配列は標準手順によって決定された。続いて、ある配列の選択後、プローブを既知手段により化学的に合成した。生ずるプローブに標識を付け、この技術で知られた手順によって交雑ハイブリダイゼーション)させた。その結果、陽性クローン、すなわち構築されたプローブへ交雑したものが検出された。

0013

陽性クローンの代表を、標準手順によって開発されたうさぎの抗M−7結晶抗血清を使用してウエスタン・ブロットにかけた。M−7毒素のクローン化と発現は、陽性クローン及びM−7毒素結晶に対する抗体で陽性反応が見られた時に、成功の確認が得られた。代表的な陽性クローンから単離された組替えプラスミドは、BamHI位置へ挿入された5.8kbDNA断片をもつことがわかった。この5.8kb DNA断片は、BamHIによって代表的陽性クローン(pCH−B3)から切断、精製され、次に既知の入手できるプラスミドpRO1614のBamHI位置へ二次クローン化された(J.Bact.〔1982年〕150巻60頁;合衆国特許第4,374,200号)。

0014

プラスミドpRO1614は、下記の住所の北部研究所から入手でき、その寄託番号はNRRL B−12127である。プラスミドはpBR322から誘導され、特異なHindIII ,BamHI,SalI、及びPvuII制限位置をもつ。PstI挿入物カルベニシリン抵抗遺伝子と緑膿菌(P.aeruginosa)複製系を包含している。シュードモナスフルオレッセンスはこの構築されたシャトルベクターによって形質転換され、M−7毒素の発現はウエスタン・ブロットでの確認により証明された。

0015

プラスミドpCH−B3、又は5.8kbの断片挿入物をもつプラスミドpRO1614は、周知の手順、例えば透明溶菌液密度勾配平衡手順を使用して、細菌宿主から回収できる。所望によりBam−HIでの消化により、5.8kb断片をpRO1614から切り取り、別の宿主への形質転換のため異なるベクターへクローン化できる。これらの手順はいずれも当業者に周知である。

0016

大腸菌宿主中のプラスミドpCH−B3は、61604イリノイ州ピオリア、北部研究センター、培養基保存研究/醗酵研究所、ARS特許保存施設に寄託された。寄託物は、同施設の手で少なくとも30年間、永久保存施設内に保存される。寄託は1985年7月18日に行なわれ、NRRL B−15981の寄託番号を付された。二次培養基は、寄託物を明らかにした特許の授与により、一般に入手できる。寄託物はまた、本出願又はその後代の対応出願がなされている国の外国特許法での要求に応じて入手できる。しかし、寄託物が入手できるからといって、政府決定によって授与される特許権を侵害してまで、本発明の実施権を構成するものではないことを了解されたい。

0017

本発明の毒素遺伝子は、広範囲微生物宿主中に導入できる。毒素遺伝子(M−7)の発現の結果、直接又は間接的に殺虫剤が細胞内に生産され、維持される。適当な宿主、例えばシュードモナスの場合、鞘翅目の甲虫が生息する場所に微生物を施用すると、これらは増殖し、感受性のある甲虫に摂取される。その結果、望んでいない甲虫が防除される。その代りに、毒素M−7遺伝子の宿主となった微生物を、細胞内につくられる毒素の活性を持続させるような条件下に処理できる。次に処理細胞を目標害虫の環境に施用できる。生ずる生成物は、M−7毒素の毒性を保持している。

0018

M−7毒素遺伝子を適当なベクター経由で微生物宿主に導入し、宿主を生きた状態で環境に施用する場合、ある宿主微生物を使用することが必須である。選択されるのは、対象となる一つ以上の作物の「植物領域」(=フィトスフェア)(葉面フィプレイン、葉周辺=フィロスフェア、根周辺=リゾスフェア、及び/又は根表面=リゾプレイン)を占めることがわかっている微生物宿主である。これらの微生物は、特定環境(作物と他の昆虫の生息環境)で野性型微生物と順調に競合でき、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定な維持と発現をもたらし、また望ましくは環境上の劣化不活性化からの殺虫剤の改良された保護を提供するようなものが選択される。

0019

広範囲の重要作物の葉面や根周辺に生息する微生物は、多数知られている。これらの微生物は細菌、藻類、及びカビを包含する。特に興味ある微生物は次のようなものである。細菌では、属名でシュードモナス(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwinia)、セラティア(Serratia)、キサントモナス(Xanthomonas)、ストレプトミセス(Streptomyces)、リゾビウム(Rhizobium)、ロードシュードモナス(Rhodopseudomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、アースロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター(Azotobacter)、リューコノストック(Leuconostoc)、及びアルカリゲネス(Alcaligenes)。

0020

カビ、特に酵母では、属名でサッカロミセス(Saccharomyces)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、スポロボロミセス(Sporoboromyces)、ロードトルラ(Rhodotorula)、及びアウレオバシジウム(Aureobasidium)。

0021

特に興味あるのは、次のような植物領域細菌種である。シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、セラチアマルセンス(Serratia marcescens)、アセトバクター・キシリヌム(Acetobacter xylinum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、ロードシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium melioti)、アルカリゲネス・エントロフス(Alcaligenes entrophus)、及びアゾトバクター・ヴィンランジイ(Azotobacter vinlandii)。

0022

また、興味ある植物領域の酵母種は次のものである。ロードトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルチニス(R.glutinis)、R.マリナ(R.marina)、R.アウラチアカ(R.aurantiaca)、クリプトコッカス・アルビヅス(Cryptococcus albidus)、C.ジフルエンス(C.diffluens)、C.ラウレンチイ(C.laurentii)、サッカロミセス・ロゼイ(Saccharomyces rosei)、S.プレトリエンシス(S.pretoriensis)、S.セレヴィシアエ(S.cerevisiae)、スポロボロミセス・ロゼウス(Sporobolomyces roseus)、S.オドルス(S.odorus)、クルイヴェロミセス・ヴェロナエ(Kluyveromyces veronae)、及びアウレオバシジウム・ポルランス(Aureobasidium pollulans)。有色素微生物が特に興味がある。

0023

遺伝子の安定な維持と表現を可能にするような条件下に、毒素を表現するM−7遺伝子を微生物宿主中に導入するには、多様な方法が広く利用できる。例えば、毒素遺伝子の表現のため転写及び翻訳調節信号を包含するDNA構築物を提供できる。また、組み込みが起こるように、調節制御下の毒素遺伝子と、宿主生物中の配列と相同DNA配列とを提供できる。及び/又は、組み込み又は安定な維持が起こるように、宿主中で機能的な複製系を提供できる。

0024

転写開始信号はプロモーターと転写開始スタート位置を包含する。ある場合には、毒素の調節的な発現を提供するのが望ましい。その場合、毒素の発現は環境への放出後にのみ生ずることになる。これはオペレーターで、又は微生物の物理的ないし化学的環境の変化により誘導可能なアクチベーターエンハンサーへの領域結合で達成できる。例えば、感温性調節領域を使用すると、生物は毒素の発現なしに実験室で生育できるが、環境への放出により発現が始まる。他の手法は毒素の発現を抑制するような特定的な栄養培地を実験室で使用し、環境中の栄養培地で毒素の発現が可能になる。翻訳開始には、リボゾームの結合位置と翻訳開始コドンが存在する。

0025

伝令の表現を強化するには活性オプロモーターを使用するか、又は伝令RNAの安定性を強化するような配列を使用するなど、種々の操作を利用できる。イニシエーション領域と翻訳終了領域は、停止コードン、ターミネーター領域、及び任意付加的にポリアデニル化信号を包含する。

0026

転写方向、すなわちコーディングないしセンス配列の5′から3′への方向で、構築物転写調節域があればこれと、調節域がプロモーターの5′又は3′のいずれかでありうる場合はプロモーター、リボゾーム結合位置、イニシエーションコドン、イニシエーションコドンと同フェイズオープンリーディングフレームをもつ構造遺伝子停止コドン、もしあればポリアデニル化信号配列、及びターミネーション領域を包含する。2本鎖としてのこの配列は、それ自体、微生物宿主の形質転換のために使用できるが、通常は、マーカーに関係するDNA配列に含まれており、その場合第二のDNA配列は毒素発現構築物に加わるか、又はDNAの宿主への導入中に、別個のDNA断片として毒素発現構築物と一緒にできる。

0027

マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選択に用いる構造遺伝子のことである。マーカーは、通常、選択的な利点を提供するもので、例えば、抗生物質重金属抵抗性などの殺生物抵抗性栄養要求宿主に原栄養性を与えるような相補性などを提供する。変更宿主が選択できるだけでなく、で競合できるように、相補性を使用するのが好ましい。構築物の開発ならびに宿主変更のため、一つ以上のマーカーを使用できる。

0028

畑での他の野性型微生物に対する競合的な利点を提供することによって、生物を更に変更できる。例えば、金属キレート化剤、例えば担鉄細胞を発現する遺伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と共に宿主に導入できる。こうして、担鉄細胞の強化された発現により、毒素生産宿主に競合的な利点が得られ、宿主が野性型微生物と効果的に競合し、保護しようとする植物の環境に生態的地位を安定に占めることができる。

0029

機能的な複製系が存在しない場合、構築物は宿主中の配列と相同な、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも約100bp、及び通常約1000bpまでの配列をも包含する。こうすると、正当な組替えの確率が強化されるため、遺伝子が宿主中に組み込まれ、宿主によって安定に維持される。毒素遺伝子が、相補性を提供する遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子と近接していることが望ましい。従って、毒素遺伝子が失われるような場合は、生ずる生物は相補性の遺伝子や競合的利点を提供する遺伝子も失う可能性があり、このため無傷の構築物を保持している遺伝子と環境中で競合できなくなる。

0030

細菌、バクテリオファージ、シアノ細菌、藻類、カビ等のような広範囲の微生物宿主から、多数の転写調節域が入手できる。種々の転写調節域は、trp遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左右プロモーター、Tacプロモーター、宿主中で機能的な場合、毒素遺伝子と関連した天然に生ずるプロモーターを包含する。例として、合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832号、及び第4,356,270号を参照のこと。終了域は、転写開始域と通常関連した終了域か、又は二つの領域が宿主中で両立し機能的である限り、異なる転写開始域と関連する終了域でもよい。

0031

安定なエピゾームの維持又は組み込みを望んでいる場合は、宿主中で機能的な複製系をもつプラスミドが使用されよう。複製系は、染色体、宿主又は別の宿主中に通常存在するエピソーム要素、又は宿主中で安定なウィルスからの複製系から誘導される。プラスミドは、pBR322,pACYC184,RSF1010,pRO1614等多数が利用できる。例として、オルソン(Olson)ら(1982年)J.Bacteriol.150巻6069頁、及びバグダサリアン(Bagdasarian)ら、(1981年)Gene 16巻237頁、及び合衆国特許第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を参照のこと。

0032

M−7遺伝子は、開始域の調節制御下に置かれるように、転写・翻訳開始域と転写・翻訳終了域との間に導入できる。この構築物はプラスミド中に含まれるものであって、プラスミドは少なくとも一つの複製系を包含するが、プラスミド開発中のクローン化に一つの複製系を使用し、最終宿主中での機能化に第二の複製系が必要な場合は、一つ以上の複製系を包含できる。更に、すでに述べた一つ以上のマーカーが存在しうる。組み込みを望んでいる場合は、プラスミドが宿主ゲノムと相同の配列を包含するのが望ましい。

0033

形質転換体は、慣用方法に従って単離できる。通常、選択的手法を使用し、望んでいる生物を未変更生物から選び出し、存在していれば、これを移し替える。次に形質転換体の殺虫活性試験できる。好ましい宿主、特に植物領域(フィトスフェア)中のものは、宿主中で毒素の環境的安定性を強めるようなある特性をもっていよう。保護的性質は、低水準蛋白分解的劣化、厚い細胞壁、色素保有等を包含する。宿主向けに興味ある他の性質は、葉親和性、対哺乳類毒性の欠如、摂取害虫への誘引力、取扱いと保存の容易さ、畑での増殖速度競合性等を包含する。

0034

畑施用においては、形質転換体菌株は、害虫から保護しようとする植物の根周辺や葉面のような、害虫の自然な生息環境に施用されよう。形質転換体菌株は、M−7毒素を生産しつつ、その自然な生息環境中で生育し、M−7毒素は幼虫又は成虫に吸収及び/又は摂取されるか、に有毒な効果をもつであろう。微生物の持続性植生長期保護をもたらすが、時どき投与を繰り返す必要があるかもしれない。生物は、噴霧、浸漬、地中への注入種子被覆苗木被覆又は噴霧等によって施用できる。畑への投与の場合、生物濃度は、一般にml当り細胞数で106 ないし1010個、ヘクタール当り施用容量は一般に約0.1オンスないし2lb以上であろう。植物部分に投与される場合、生物濃度は通常、cm2 当り細胞数で103 ないし106 個であろう。

0035

目標害虫の環境に死菌を施用する時に細胞中の毒素の活性を持続させるために殺虫剤含有細胞を処理する場合は、適当な宿主細胞原核細胞又は真核細胞のいずれかを包含するが、通常、哺乳類のような高等生物に有毒な物質を生産しないものに限定される。しかし、毒素が不安定であったり、施用水準哺乳類宿主への毒性の可能性を避けられるほど十分に低い場合は、高等生物に有害な物質をつくる生物も使用できる。宿主として、特に興味あるものは、原核生物と、カビのような低級真核生物である。

0036

グラム陰性及びグラム陽性双方の原核生物の例はエシェリキア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmonella)及びプロテウス(Proteus)のような腸内細菌科(Enterobacteriaceae);バシラス科(Bacillaceae);リゾビウム(Rhizobium)のようなリゾビウム科(Rhizobiaceae);発光細菌(photobacterium)、ザイモモナス(Zymomonas)、セラチア(Serratia)、アエロモナス(Aeromonas)、ビブリオ(Vibrio)、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)、スピリルム(Spirillum)のようならせん菌科(Spirillaceae);乳酸かん菌科(Lactobacillaceae);シュードモナス(Pseudomonas)やアセトバクター(Acetobacter)のようなシュードモナス科(Pseudomonadaceae);アゾトバクター科(Azotobacteraceae)、及びニトロバクター科(Nitrobacteraceae)である。

0037

真核生物ではサッカロミセス(Saccharomyces)とシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)のような酵母を含めた、藻菌類(Phycomycetes)と子嚢菌類(Ascomycetes)のようなカビ類(fungi);及びロードトルラ(Rhodotorula)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)等のような担子菌類(Basidiomycetes)酵母がある。

0038

生産を目的として宿主細胞を選択する際に特に興味ある性質は、宿主へのM−7遺伝子導入の容易さ、表現系の入手性、表現効率、宿主中における殺虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミクロカプセル用に興味ある性質は厚い細胞壁、色素保有、及び細胞内包装又は封入体の形成のような殺虫剤保護性;葉親和性;対哺乳類毒性の欠如;摂取害虫への誘引力;毒素へ損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。他の考慮としては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等がある。

0039

特に興味ある宿主生物は、ロードトルラ種、アウレオバシジウム種、サッカロミセス種、及びスポロボロミセス種のような酵母;シュードモナス種、エルウィニア種及びフラボバクテリウム種のような葉面性の生物;又はエシェリキア種、ラクトバシラス種バシラス種等の他の生物を包含する。特定的な生物は緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、サッカロミセス・セレビシアエ、バシラス・スリンギエンシス、大腸菌、枯草菌等を包含する。

0040

細胞は通常、無傷であり、殺菌時に胞子型よりは実質的に増殖型にあるが、場合によっては胞子も使用できる。細胞増殖を種々の方法で抑制できるが、但しその手法が殺虫剤の性状に悪影響したり、殺虫剤を保護する際に細胞能力を消したりしてはならない。方法としては、物理的処理や化学的処理、細胞の物理的性状を変える、又は細胞の物理的性質を無傷で残すなどがある。

0041

宿主細胞を不活性化する種々の方法は、通常50℃ないし70℃の加熱;凍結UV照射凍結乾燥;毒素、例えば抗生物質;フェノール類アニリド類、例えばカルバニリドサリチルアニリドヒドロキシユリア;第4級類;アルコール類抗菌染料EDTA及びアミジン類ハロゲン化剤、例えば塩素化剤臭素化剤又はヨウ素化剤のような非特異的有機及び無機化学物質;アルデヒド類、例えばグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒド;オゾンやエチレンオキシドのような有害ガス過酸化物プソラレン類;乾燥剤等。これらを個々に、又は組合わせて使用できる。薬剤の選択は特定殺虫剤、宿主細胞の性質、架橋剤による細胞壁の固定及び保存のような細胞構造の変更の性質などによって変わる。

0042

細胞には、概して強化された構造的安定性があり、これが畑での環境劣化抵抗性を強化している。殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型への加工を抑制するように不活性化方法を選択すべきである。例えばホルムアルデヒドは蛋白質を架橋するから、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制できる。不活性化又は殺菌方法は毒素の生体利用効率又は生物活性の少なくとも実質部分を保持する。

0043

M−7殺虫剤遺伝子を含有する細胞宿主は、DNA構築物が選択的利点をもつ場合、任意好都合な栄養培地で生育でき選択培地を与えるので、細胞の全部又は実質的に全部がM−7遺伝子を保持する。次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り入れることができる。その代りに、取り入れる前の細胞を固定することもできる。

0044

毒素を含有する宿主生物の処理方法は、幾つかの役割を果たすものとなっている。第一に、処理は構造的一体化を強めている。第二に、蛋白分解性の劣化に対する感受性を減らすように毒素を変更し、かつ又は細胞中に天然に存在するプロテアーゼの蛋白分解活性を低下させることによって、処理は毒素の強化された蛋白分解安定性を提供できる。細胞を無傷の段階で変更するのが好ましく、また毒素蛋白質の実質的な蓄積があった時も変更するのが好ましい。これらの変更は、広範囲の化学的反応性をもつ化学試薬を使用するなど、種々の方法で達成できる。約−10ないし60℃の範囲の温度で、かきまぜを加えて、又は加えずに、化学試薬を含有する液体試薬媒体と無傷の細胞を一緒にする。反応時間は経験的に決定でき、試薬及び反応条件により大幅に変わる。細胞濃度は約102 から1010の範囲にある。

0045

化学試薬として特に興味あるものは、ハロゲン化剤、特に原子番号17−80のハロゲン類である。更に詳しくは、温和な条件下で、望んでいる結果を達成するのに十分な時間に、ヨウ素を使用できる。他の適当な手法としては、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類での処理;塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤イソプロパノールエタノールのようなアルコール類;ブアン固定剤ヘリー固定剤のような種々の組織学的固定剤〔フマソン(Humason)、グレッチェン・エル(Gretchen,L.)、Animal Tissue Techniques(動物組織技法)、ダブリュー・エッチフリーマン社、1967年、を参照のこと〕;又は目標害虫環境へ細胞を施用する時に細胞中に生産される毒素の活性を持続させる物理的処理(加熱)と化学的薬剤との組合わせがある。

0046

ヨウ素でのハロゲン化には、温度は一般に約0ないし50℃の範囲にあるが、反応は室温で都合よく実施できる。酸性水性媒体、特に約0.5〜5Mの範囲のカルボン酸水溶液中における0.5ないし5%の三ヨウ素化物又はヨウ素を使用してヨウ素化を行なうのが好都合である。酢酸を都合よく使用できるが、概して約1−4個の炭素原子の他のカルボン酸も使用できる。反応時間は、一般に1分未満から約24時間、通常約1−6時間の範囲であろう。

0047

ジチオナイトチオ硫酸ナトリウムのような還元剤や、畑での最終使用適合した他の還元剤との反応により、任意の残留ヨウ素を除去できる。更に、変更した細胞を、当業者に周知のように、全反応媒体を除去するための洗浄や、乾燥型での単離、典型的な粘着剤展着剤、及び農業用に一般に利用される助剤での処方といった処理に、なおもかけることができる。

0048

特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬である。この目的には、幾つかの試薬が知られている。その処理によって、殺虫剤の安定性が強化される。すなわち、畑条件下に殺虫剤の持続性ないし残留活性が強化されなければならない。こうして、未処理細胞の殺虫活性が消滅するような条件下に、処理細胞の活性は1〜3倍長い期間にわたって持続する。

0049

細胞を種々の方法で処方できる。無機材料(フィロ珪酸塩炭酸塩硫酸塩、燐酸塩等)や植物材料とうもろこし芯粉末もみ殻くるみ殻等)のような種々の不活性材料と混合することによって、これらを水和剤粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤は、展着粘着助剤、安定化剤、その他の殺虫添加剤、又は表面活性剤を包含しうる。液体処方剤は、水性基盤でも非水性でもよく、フォームゲル、懸濁液、乳化出来る濃縮物等として使用できる。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤分散剤、又は重合体を包含しうる。

0050

殺虫剤濃度は、特定処方剤の性質、特に処方剤が濃厚液か直接使用のものかによって大幅に変わる。殺虫剤は少なくとも1重量%、及び100重量%でも存在しうる。乾燥処方剤は約1−95重量%の殺虫剤をもつが、液体処方剤は液相中に概して1−60重量%の固形分をもっている。概して処方剤は、mg当り約102 ないし約104 個の細胞をもつ。これらの処方剤は、ヘクタール当り約50mg(液体又は固体)ないし1kg以上の率で投与される。

0051

処方剤を害虫環境へ、例えば植物、土壌又は水へ、噴霧、散布散水等によって施用できる。以下は、最良の態様を含めた本発明の実施手順を示す実施例である。これらの実施例は、限定的に考えられてはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、溶媒混合物の割合はすべて容量による。

0052

実施例1バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B−15939の培養
バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴNRRL B−15939の二次培養基又は出発培養基を使用して、LBブロスとして知られる次の培地に摂取できる。

0053

0054

標準的な微生物学的手法などによって、上の培地を接種前に滅菌し、無菌手順を用いて接種を行なう。M−7細胞を30℃で3−4日生育させる。詳細な手順は以下のとおりである。無菌のPWYE培地(水1リットルペプトン5.0%、酵母エキス0.1%,NaCl 0.5%,pH7.5に調整)を含有する一連の150ml三角フラスコに、バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B−15939をペトリ皿培養基から接種する。フラスコを回転振とう機(200rpm )上、30℃で一夜培養する。この出発培養基から、その7.5mlを用いて2リットルフラスコ中のLBブロス300mlに接種する。LBブロスのフラスコを出発培養基と同じ条件下に培養するが、4日後に取り入れる。

0055

上の手順は、この技術で周知の手順により、大醗酵容器まで容易に規模拡大できる。上の醗酵で得られるBt胞子及び結晶を、この技術で周知の手順により単離できる。しばしば使用される手順は、取り入れた醗酵液を分離手法、例えば遠心分離にかけることである。

0056

実施例2 M−7毒素遺伝子のクローン化及び発現
全体のDNA(染色体DNAとプラスミド)を実施例1のM−7細胞から単離し、標準手順によって精製した。生ずる精製DNAを、供給者の指示を用いて制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化させた。消化されたDNAを周知のプラスミドpBR322のBamHI位置にクローン化すると、M−7 DNAのジーンバンクが得られた。このクローン化手順を、周知の標準的な手順に従って行なった。

0057

ジーンバンクを選別するためのDNAプローブは、次のように得られた。NYSM培地トリプトン10g,NaCl 5g、酵母エキス5g,MgSO4 ・7H2 O 2g、水1000ml,pH7.5)中30℃で一夜生育させた培養基から、M−7結晶を単離した。精製した結晶を8M尿素、0.1Mグリシン、pH8.2に溶解し、室温で一夜、トリプシンで消化させた。生ずるペプチド断片をC4逆相多孔カラム上で、アセトニトリル中0.1%トリフルオロ酢酸中の91%溶液A(0.1%トリフルオロ酢酸水溶液)から40%溶液Aまでの180分勾配によって分離した。幾つかのトリプシン断片のアミノ酸配列が得られ、32の重剰性をもつ長さ17塩基混合プローブの合成に6アミノ酸の配列を選んだ。

0058

ポリヌクレオチドキナーゼと〔γ−32P〕ATPでプローブに末端標識を付け、M−7ジーンバンク用に構築された組替えプラスミドを含有する細菌集落ハイブリダイズさせた。集落フィルターは、ハナハン(Hanahan)及びメセルソン(Meselson)(1980年)Gene 10巻63−67頁に従ってつくられた。陽性集落は、オートラジオグラフィによって確認された。七つの陽性クローン(代表としてpCH−B3)から単離された組替えプラスミドは、BamHI位置に挿入された5.8kb(キロ塩基対)のDNA断片をもつことがわかった。

0059

pCH−B3のウェスタン・ブロット〔バーネット・ダブリュー・エヌ(Burnette,W.N.)〔1981年〕Anal.Biochem.112巻195頁〕は、ウサギ抗M−7結晶抗血清を用いて、一夜培養基のSDS−PAGEで行なった。約86キロダルトンの蛋白質が確認された。従って、クローンpCH−B3は、M−7からの結晶蛋白質による血清学的身元証明のある蛋白質に対するコードをもつM−7DNA断片を含有している。組替え蛋白質は、所定のプラスミド構築で転写及び/又は翻訳の停止信号が入手できないため、溶解化されたM−7結晶からの毒素より大きいこともありうる。

0060

B.t.sd毒素遺伝子を暗号化したヌクレオチド配列を配列番号:1に示す。演えき的に導かれたアミノ酸配列を配列番号:2に示す。この技術で周知のように、蛋白質のアミノ酸配列はDNAのヌクレオチド配列によって決まる。遺伝暗号縮重性のため、すなわち蛋白質をつくるために用いられるアミノ酸のほとんどに対して、一つ以上の暗号化ヌクレオチドトリプレットコードン)を使用できるため、ある特定のアミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列が暗号化できる。このため、遺伝暗号を次のように表わすことができる。

0061

0062

かぎ:各3文字デオキシヌクレオチドトリプレットは、左に5′−末端、右に3′−末端をもつmRNAトリヌクレオチドに対応している。本明細書に記載のDNA配列は、いずれもmRNAの配列に対応する配列のDNA鎖のものであって、但しウラシルにはチミンが置き変わる。文字はデオキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を表わしている。

0063

0064

以上は、M−7毒素又は他の有用な蛋白質の新規なアミノ酸配列が、蛋白質の同じアミノ酸配列を暗号化した同等なヌクレオチド配列によってつくられることを示す。従って本発明は、このような同等なヌクレオチド配列を包含している。更に、アミノ酸配列を変更しても蛋白質の二次構造が変化しないならば、確認された構造と機能の蛋白質をこのような変更によって構築できることがわかった〔カイザー・イー・ティー(Kaiser,E.T.)及びケズディ・エフ・ジェイ(Kezdy,F.J.)〔1984年〕Science 223巻249−255頁〕。このように本発明は、蛋白質の二次構造を変更しないか、又は構造が変更される場合でも生物活性が同程度に保持されるような、本明細書に記載のアミノ酸配列の突然変異物を包含している。

0065

実施例3クローンpCH−B3によるM−7毒素蛋白質の生産
pCH−B3培養基20リットル(アンピシリン70μg/mlを含有するL−ブロス)を醗酵容器中で生育させ、OD600=3.35で取り入れた。細胞ペレット水洗し、リゾチーム2g,1mMPMSF(弗化フェニルメチルスルホニル)、1mMTPCK(1−トシルアミド−2−フェニルエチルクロロメチルケトン)及びDNase I500μgを含有するグリシン緩衝液(0.1Mグリシン、トリス塩基によりpH8.0)500mlに再懸濁し、室温で30分培養した。次にpHをNaOHで10に上げ、ビードビーターバイオスペック・プロダクツ社、オクラホマ州バートルスビル)により、上で30秒の打撃を5分間隔で4回与えて細胞を破裂させた。次に抽出液を10,000xGで30分遠心分離した。

0066

実施例4クローンpCH−B3でつくられるM−7毒素蛋白質の単離及び精製
アフィニティークロマトグラフィ〔クァトレカサ・ビー(Cuatrecasa,P.)及びアンフィンセン・シー・ビー(Anfinsen,C.B.)〔1971年〕Meth.Enzymology,22巻〔ダブリュー・ビー・ジャコビー編、アカミックプレス社、ニューヨーク〕を用いて、pCH−B3からの蛋白質を次のように精製した。クァトレカサ及びアンフィンセンの記述のとおりに、臭化シアンセファロースを活性化した。

0067

活性化したセファロースにうさぎ抗M−7結晶血清を添加し、たえずかきまぜながら室温で一夜培養した。アフィニティー樹脂を1%エタノールアミン、3MNaCl,pH9.2で洗い、次に0.02%ナトリウムアジドを含有するTBS(0.02Mトリス−HCl,0.07M NaCl,pH7.5)で洗った。1mMEDTA(エチレンジアミン四酢酸)、1mMPMSF,1mMTPCK、及び0.02%ナトリウムアジドを含有するpH10(トリス塩基で)の0.1Mグリシン中でカラムを平衡化した。

0068

上のように調製した大腸菌抽出液をカラムに装填し、4℃で64時間再循環させた。抽出液を1M NaCl及び0.1Mグリシン−トリス(pH10)でカラムから洗い、結合M−7毒素を3M過塩素酸ナトリウム、0.1Mグリシン−トリス(pH10)でカラムから除去した。次にM−7毒素を水に対して透析濃縮した(マイクロプロD:コンピアースケミカル社、イリノイ州ロックフォード)。植生を保護するため、精製されたM−7毒素を、出没する鞘翅目の甲虫に感受性のある植生に投与(施用)できる。この技術で周知の適当な被覆剤を用いて、M−7毒素を環境的に安定化させるのが有利である。

0069

実施例5シュードモナス・フルオレッセンスへのM−7毒素遺伝子の二次クローン化及び発現
M−7毒素遺伝子をもつ5.8kbDNA断片をプラスミドpCH−B3からBamHIで切り取り、精製し、プラスミドpRO1614のBamHI位置へ二次クローン化した。シュードモナス・フルオレッセンスをこのプラスミドで形質転換した。組み替えシュードモナス細胞によるM−7毒素の発現は、ウェスタン・ブロットでの確認によって証明された。

0070

実施例6バシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B−15939、の胞子及び結晶の試験
上に記述されたとおりに得られるバシラス・スリンギエンシス菌株サンディエゴ、NRRL B−15939、の胞子と結晶を種々の昆虫に対して試験した。試験された昆虫種と結果の要約は、表4に一覧されている。

0071

D.ウンデシムプンクタータ(西部班点ウリハムシ、Western spotted cucumber beetle,WSCB)の活性についての試験に使用される方法は、噴霧塔装置内でレタス葉のディスクへ胞子/結晶懸濁液を噴霧することからなる。(この昆虫種の幼虫はレタス葉で生育する。)層流フード内で噴霧液を乾燥し、容器内の湿ったろ紙上に置いた。WSCBの幼虫10匹を加え、容器を25℃,14時間の光周期で培養した。新しく処理したディスクを必要に応じて加えた。食物接種の抑制が認められ、5日と7日に死亡率を記録した。2回の生物検定の結果を第2表に示す。

0072

ピラルタ・ルテオラ(Pyrrhalta luteola、ニレハムシ)に対するM−7毒素の活性を試験するために、M−7結晶から溶解化された蛋白質をニレの葉に施用した。次に乾燥した葉を容器内の湿った砂の上に置いた。P.ルテオラ幼虫5〜10匹を加え、容器を室温で培養した。3日と5日に死亡率を記録した。葉表面のcm2当り毒素120ngのLC50をこれらの検定から計算した。

0073

0074

0075

0076

0077

配列番号:1
配列の長さ:1932
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
配 列
ATGAATCCGA ACAATCGAAG TGAACATGAT ACAATAAAAA CTACTGAAAA TAATGAGGTG 60
CCAACTAACCATGTTCAATA TCCTTTAGCG GAAACTCCAA ATCCAACACT AGAAGATTTA 120
AATTATAAAG AGTTTTTAAG AATGACTGCA GATAATAATACGGAAGCACT AGATAGCTCT 180
ACAACAAAAG ATGTCATTCA AAAAGGCATT TCCGTAGTAG GTGATCTCCT AGGCGTAGTA 240
GGTTTCCCGT TTGGTGGAGC GCTTGTTTCG TTTTATACAA ACTTTTTAAA TACTATTTGG 300
CCAAGTGAAG ACCCGTGGAA GGCTTTTATG GAACAAGTAG AAGCATTGAT GGATCAGAAA 360
ATAGCTGATT ATGCAAAAAA TAAAGCTCTT GCAGAGTTAC AGGGCCTTCA AAATAATGTC 420
GAAGATTATG TGAGTGCATT GAGTTCATGG CAAAAAAATC CTGTGAGTTCACGAAATCCA 480
CATAGCCAGG GGCGGATAAG AGAGCTGTTT TCTCAAGCAG AAAGTCATTT TCGTAATTCA 540
ATGCCTTCGT TTGCAATTTC TGGATACGAG GTTCTATTTC TAACAACATA TGCACAAGCT 600
GCCAACACAC ATTTATTTTT ACTAAAAGAC GCTCAAATTT ATGGAGAAGA ATGGGGATAC 660
GAAAAAGAAG ATATTGCTGA ATTTTATAAA AGACAACTAA AACTTACGCA AGAATATACT 720
GACCATTGTG TCAAATGGTA TAATGTTGGA TTAGATAAAT TAAGAGGTTC ATCTTATGAA 780
TCTTGGGTAA ACTTTAACCG TTATCGCAGA GAGATGACAT TAACAGTATT AGATTTAATT 840
GCACTATTTC CATTGTATGA TGTTCGGCTA TACCCAAAAG AAGTTAAAAC CGAATTAACA 900
AGAGACGTTT TAACAGATCC AATTGTCGGA GTCAACAACC TTAGGGGCTA TGGAACAACC 960
TTCTCTAATA TAGAAAATTA TATTCGAAAA CCACATCTAT TTGACTATCT GCATAGAATT 1020
CAATTTCACA CGCGGTTCCA ACCAGGATAT TATGGAAATG ACTCTTTCAA TTATTGGTCC 1080
GGTAATTATG TTTCAACTAG ACCAAGCATA GGATCAAATG ATATAATCAC ATCTCCATTC 1140
TATGGAAATA AATCCAGTGA ACCTGTACAA AATTTAGAAT TTAATGGAGA AAAAGTCTAT 1200
AGAGCCGTAG CAAATACAAA TCTTGCGGTC TGGCCGTCCG CTGTATATTC AGGTGTTACA 1260
AAAGTGGAAT TTAGCCAATA TAATGATCAA ACAGATGAAG CAAGTACACA AACGTACGAC 1320
TCAAAAAGAA ATGTTGGCGC GGTCAGCTGG GATTCTATCG ATCAATTGCC TCCAGAAACA 1380
ACAGATGAAC CTCTAGAAAA GGGATATAGC CATCAACTCA ATTATGTAAT GTGCTTTTTA 1440
ATGCAGGGTA GTAGAGGAAC AATCCCAGTG TTAACTTGGA CACATAAAAG TGTAGACTTT 1500
TTTAACATGA TTGATTCGAA AAAAATTACA CAACTTCCGT TAGTAAAGGC ATATAAGTTA 1560
CAATCTGGTG CTTCCGTTGT CGCAGGTCCT AGGTTTACAG GAGGAGATAT CATTCAATGC 1620
ACAGAAAATG GAAGTGCGGC AACTATTTAC GTTACACCGG ATGTGTCGTA CTCTCAAAAA 1680
TATCGAGCTA GAATTCATTA TGCTTCTACA TCTCAGATAA CATTTACACT CAGTTTAGAC 1740
GGGGCACCAT TTAATCAATA CTATTTCGAT AAAACGATAA ATAAAGGAGA CACATTAACG 1800
TATAATTCAT TTAATTTAGC AAGTTTCAGC ACACCATTCG AATTATCAGG GAATAACTTA 1860
CAAATAGGCG TCACAGGATT AAGTGCTGGA GATAAAGTTT ATATAGACAA AATTGAATTT 1920
ATTCCAGTGA AT 1932

0078

配列番号:2
配列の長さ:644
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配 列
Met Asn Pro Asn Asn Arg Ser Glu His Asp Thr Ile Lys Thr Thr Glu
5 10 15
Asn Asn Glu Val Pro Thr Asn His Val Gln Tyr Pro Leu Ala Glu Thr
20 25 30
Pro Asn Pro Thr Leu Glu Asp Leu Asn Tyr Lys Glu Phe Leu Arg Met
35 40 45
Thr Ala Asp Asn Asn Thr Glu Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys Asp
50 55 60
Val Ile Gln Lys Gly Ile Ser Val Val Gly Asp Leu Leu Gly Val Val
65 70 75 80
Gly Phe Pro Phe Gly Gly Ala Leu Val Ser Phe Tyr Thr Asn Phe Leu
85 90 95
Asn Thr Ile Trp Pro Ser Glu Asp Pro Trp Lys Ala Phe Met Glu Gln
100 105 110
Val Glu Ala Leu Met Asp Gln Lys Ile Ala Asp Tyr Ala Lys Asn Lys
115 120 125
Ala Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Gln Asn Asn Val Glu Asp Tyr Val
130 135 140
Ser Ala Leu Ser Ser Trp Gln Lys Asn Pro Val Ser Ser Arg Asn Pro
145 150 155 160
His Ser Gln Gly Arg Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu Ser His
165 170 175
Phe Arg Asn Ser Met Pro Ser Phe Ala Ile Ser Gly Tyr Glu Val Leu
180 185 190
Phe Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Thr His Leu Phe Leu Leu
195 200 205
Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Gly Glu Glu Trp Gly Tyr Glu Lys Glu Asp
210 215 220
Ile Ala Glu Phe Tyr Lys Arg Gln Leu Lys Leu Thr Gln Glu Tyr Thr
225 230 235 240
Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Asn Val Gly Leu Asp Lys Leu Arg Gly
245 250 255
Ser Ser Tyr Glu Ser Trp Val Asn Phe Asn Arg Tyr Arg Arg Glu Met
260 265 270
Thr Leu Thr Val Leu Asp Leu Ile Ala Leu Phe Pro Leu Tyr Asp Val
275 280 285
Arg Leu Tyr Pro Lys Glu Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Asp Val Leu
290 295 300
Thr Asp Pro Ile Val Gly Val Asn Asn Leu Arg Gly Tyr Gly Thr Thr
305 310 315 320
Phe Ser Asn Ile Glu Asn Tyr Ile Arg Lys Pro His Leu Phe Asp Tyr
325 330 335
Leu His Arg Ile Gln Phe His Thr Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Tyr Gly
340 345 350
Asn Asp Ser Phe Asn Tyr Trp Ser Gly Asn Tyr Val Ser Thr Arg Pro
355 360 365
Ser Ile Gly Ser Asn Asp Ile Ile Thr Ser Pro Phe Tyr Gly Asn Lys
370 375 380
Ser Ser Glu Pro Val Gln Asn Leu Glu Phe Asn Gly Glu Lys Val Tyr
385 390 395 400
Arg Ala Val Ala Asn Thr Asn Leu Ala Val Trp Pro Ser Ala Val Tyr
405 410 415
Ser Gly Val Thr Lys Val Glu Phe Ser Gln Tyr Asn Asp Gln Thr Asp
420 425 430
Glu Ala Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Ser Lys Arg Asn Val Gly Ala Val
435 440 445
Ser Trp Asp Ser Ile Asp Gln Leu Pro Pro Glu Thr Thr Asp Glu Pro
450 455 460
Leu Glu Lys Gly Tyr Ser His Gln Leu Asn Tyr Val Met Cys Phe Leu
465 470 475 480
Met Gln Gly Ser Arg Gly Thr Ile Pro Val Leu Thr Trp Thr His Lys
485 490 495
Ser Val Asp Phe Phe Asn Met Ile Asp Ser Lys Lys Ile Thr Gln Leu
500 505 510
Pro Leu Val Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Ser Gly Ala Ser Val Val Ala
515 520 525

Gly Pro Arg Phe Thr Gly Gly Asp Ile Ile Gln Cys Thr Glu Asn Gly
530 535 540
Ser Ala Ala Thr Ile Tyr Val Thr Pro Asp Val Ser Tyr Ser Gln Lys
545 550 555 560
Tyr Arg Ala Arg Ile His Tyr Ala Ser Thr Ser Gln Ile Thr Phe Thr
565 570 575
Leu Ser Leu Asp Gly Ala Pro Phe Asn Gln Tyr Tyr Phe Asp Lys Thr
580 585 590
Ile Asn Lys Gly Asp Thr Leu Thr Tyr Asn Ser Phe Asn Leu Ala Ser
595 600 605
Phe Ser Thr Pro Phe Glu Leu Ser Gly Asn Asn Leu Gln Ile Gly Val
610 615 620
Thr Gly Leu Ser Ala Gly Asp Lys Val Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Phe
625 630 635 640

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