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目的

難治性皮膚欠損創効力を有する治療剤を提供する。

構成

配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有する難治性皮膚欠損創治療剤。該ポリペプチドは配列の長さ274アミノ酸残基を有し、フィブロネクチン系のポリペプチドである。投与量は5μg〜1g/回でよく、外用剤として頻回投与が好ましい。

概要

背景

フィブロネクチン(以下、FNと略す)は、動物の種々の組織細胞表面、血液中などに存在する高分子量多機能糖タンパク質であり、細胞の接着伸展、移動、分化、増殖、貪食作用などの生理作用を示し、組織修復癌転移抑制、生体防御などに関与している。FNは、分子量約25万のポリペプチドを単位とする接着性糖タンパクで、C末端付近でS−S結合により二量体又は四量体を形成している。分子内は、更に、種々の機能を有するドメイン構造を有し、コラーゲンヘパリン及びフィブリン等に対する結合活性をもち、細胞を接着・伸展させる働きを示す。これらのドメインのうち、細胞接着ドメインの基本構造については、その最小必要単位としてR−G−D−S配列が明らかにされており〔ネーチャー(Nature) 、第309巻、第30〜33頁(1984)〕、この配列を含む配列表の配列番号1で表されるポリペプチドの製造方法が、特開平2−97397号公報に記載されている。このポリペプチドの利用法に関しては、癌転移防止剤(特開平3−127742号公報)、脈管形成抑制剤(特開平3−173828号公報)、角膜障害治療剤(特開平3−291238号公報)、皮膚化粧料(特開平3−197411号公報)、抗炎症剤(特開平3−291235号公報)、制ガン剤(特開平4−59734号公報)、歯根膜並びに歯槽骨組織再生修復促進剤(特開平4−74132号公報)が知られている。しかし、糖尿病性皮膚潰瘍重度褥瘡などの難治性皮膚欠損創回復する治療剤としての利用法については知られていない。近年、合成材料生体材料、あるいは両者を組合せた種々のタイプの創傷被覆材が開発され、熱傷外傷等の治療に適用されている。更に、高機能を付与する目的で、生理活性物質を、これらの創傷被覆材に含有させる試みが注目されている。創面には、感染のない状態と感染の徴候を示す状態、あるいは壊死組織の存在しない状態と介在する状態があり、適用症例に応じて最適な機能を有する創傷被覆材の選択が重要である。

概要

難治性皮膚欠損創に効力を有する治療剤を提供する。

配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有する難治性皮膚欠損創治療剤。該ポリペプチドは配列の長さ274アミノ酸残基を有し、フィブロネクチン系のポリペプチドである。投与量は5μg〜1g/回でよく、外用剤として頻回投与が好ましい。

目的

糖尿病性皮膚潰瘍や重度の褥瘡などは治癒しにくい創面であり、これらの難治性皮膚欠損創に適用できる治療剤の開発が望まれている。本発明の目的は難治性皮膚欠損創に効力を有する治療剤を提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする難治性皮膚欠損創治療剤

技術分野

Thr Glu Ile Asp

背景技術

0001

本発明は、フィブロネクチンの機能性ポリペプチドを配合してなる難治性皮膚欠損創治療剤に関する。

発明が解決しようとする課題

0002

フィブロネクチン(以下、FNと略す)は、動物の種々の組織細胞表面、血液中などに存在する高分子量多機能糖タンパク質であり、細胞の接着伸展、移動、分化、増殖、貪食作用などの生理作用を示し、組織修復癌転移抑制、生体防御などに関与している。FNは、分子量約25万のポリペプチドを単位とする接着性糖タンパクで、C末端付近でS−S結合により二量体又は四量体を形成している。分子内は、更に、種々の機能を有するドメイン構造を有し、コラーゲンヘパリン及びフィブリン等に対する結合活性をもち、細胞を接着・伸展させる働きを示す。これらのドメインのうち、細胞接着ドメインの基本構造については、その最小必要単位としてR−G−D−S配列が明らかにされており〔ネーチャー(Nature) 、第309巻、第30〜33頁(1984)〕、この配列を含む配列表の配列番号1で表されるポリペプチドの製造方法が、特開平2−97397号公報に記載されている。このポリペプチドの利用法に関しては、癌転移防止剤(特開平3−127742号公報)、脈管形成抑制剤(特開平3−173828号公報)、角膜障害治療剤(特開平3−291238号公報)、皮膚化粧料(特開平3−197411号公報)、抗炎症剤(特開平3−291235号公報)、制ガン剤(特開平4−59734号公報)、歯根膜並びに歯槽骨組織再生修復促進剤(特開平4−74132号公報)が知られている。しかし、糖尿病性皮膚潰瘍重度褥瘡などの難治性皮膚欠損創を回復する治療剤としての利用法については知られていない。近年、合成材料生体材料、あるいは両者を組合せた種々のタイプの創傷被覆材が開発され、熱傷外傷等の治療に適用されている。更に、高機能を付与する目的で、生理活性物質を、これらの創傷被覆材に含有させる試みが注目されている。創面には、感染のない状態と感染の徴候を示す状態、あるいは壊死組織の存在しない状態と介在する状態があり、適用症例に応じて最適な機能を有する創傷被覆材の選択が重要である。

課題を解決するための手段

0003

糖尿病性皮膚潰瘍や重度の褥瘡などは治癒しにくい創面であり、これらの難治性皮膚欠損創に適用できる治療剤の開発が望まれている。本発明の目的は難治性皮膚欠損創に効力を有する治療剤を提供することにある。

0004

本発明を概説すれば本発明は難治性皮膚欠損創治療剤に関し、配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

0005

難治性皮膚欠損創治療剤の開発を行うには、該皮膚欠損創の動物実験モデル作出が必要であるが、糖尿病性皮膚潰瘍や重度の褥瘡にみられるような慢性不良肉芽組織創を動物実験において厳密に再現することは不可能である。しかし、本発明者は臨床的な該組織創に最も近い不良肉芽組織モデルを新たに作製し、該モデルを用いてスクリーニングをした結果、配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが顕著な創面の収縮を伴う治癒効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。

0006

本発明の難治性皮膚欠損創治療剤中の、上記ポリペプチドの含有量は任意とすることができるが、治療剤中に0.00001〜30重量%、好ましくは0.0001〜10重量%含有させるのがよい。

0007

本発明の治療剤は、水や生理食塩水PBS軟膏等に溶解、分散した形態で、創面に直接塗布して適用しても良いが、含水性創傷被覆材を創面に適用した際に、上記ポリペプチドを含有する溶液を該被覆材含浸させる使用法が最も効果的である。

0008

配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば特開平1−80900号、同1−206998号、同2−97397号、同2−152990号、同2−311498号各公報に記載の各ポリペプチドがある。

0009

配列表の配列番号1で表されるポリペプチド(以下、C−274と呼称する)の製造方法は前出特開平2−97397号公報に示されており、以下具体的に説明する。なお、本明細書において、アミノ酸に付された肩数字は、EMBLデータバンク(EMBLDATA BANK) のFNアミノ酸に付与されたN末からのアミノ酸残基数を示す。C−274(Pro1239−Asp1512)は、既に特許出願している279アミノ酸残基ポリペプチド(Pro1239−Met1517)(特開平1−206998号)のC末端5アミノ酸残基を欠失させたものである。C−274(Pro1239−Asp1512)を遺伝子工学的に調製する方法としては、上述した279アミノ酸残基ポリペプチド(Pro1239−Met1517)をコードするプラスミドpTFD707を用いるのが好都合である。279アミノ酸残基ポリペプチドのC末端より5残基目のLys1513のコドンAAAを終止コドンTAAに変換することによりC−274(Pro1239−Asp1512)をコードするプラスミドを調製することができる。この塩基の変換は、部位特異的変異の導入により行うことができる。C−274(Pro1239−Asp1512)を発現するプラスミドを導入した大腸菌は、 Escherichia coli JM 109/pTF 7221 と命名、表示し、既に工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第1915号(FERM BP−1915)として寄託されている。組換体からのこの細胞接着ポリペプチド・C−274の精製は、例えば次のようにする。菌体ペレットバッファーに懸濁し、超音波処理により可溶性画分不溶性画分に分ける。後者は更に7M尿素を含むバッファーで可溶化する。可溶性画分を集めて、FNの細胞接着ドメインに特異的な抗体を結合させたセファロース4Bのカラムにかけ、アフィニティ精製を行う。溶出にはpH2.3付近のバッファーを用いる。イムノブロッティング目的画分を集めることにより、細胞接着活性ポリペプチド・C−274を得ることができる。必要とあれば、FPLC又はHPLCで更に精製することができる。

0010

上記ポリペプチドは糖鎖を有しても、有さなくとも良い。投与量は、投与方法患者年令、体重、症状、治療目的により決定されるが、一般に成人の場合、一回につき5μg〜1gが好ましい。本発明の治療剤は局所投与が望ましく、外用剤として頻回投与が好ましい。

0011

本発明に使用するポリペプチドは100mg/kgをマウス静脈内投与しても毒性は全く示さず、局所投与においても安全性の高いポリペプチドである。

0012

適用の形態は上記のほかに、例えば懸濁剤乳剤ペースト剤等の形態で用いることができる。また創傷被覆材に含有させて適用しても良い。創傷被覆材の材質としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、キチン等公知のものが使用でき、膜状、スポンジ状等に成型し、使用すれば良い。また、皮膚細胞を含有する培養皮膚と併用しても良い。なお、適用形態はこれらに限定されるものではない。本発明の難治性皮膚欠損創治療剤中には、通常この使用目的に用いられる原料、例えば界面活性剤アルコール類保湿剤増粘剤賦形剤防腐剤酸化防止剤キレート剤pH調整剤香料色素等をC−274の機能を損わない範囲で配合可能である。

0013

薬理試験
1)不良肉芽組織創面の作製
治癒が遅延した不良肉芽組織創に対する治療剤の評価を行うための、不良肉芽組織のモデルの作製を次のように行った。5週令のSDラット背部に直径30mmの全層皮膚欠損創を作製して、外径30mm内径25mmのポリスチレンリングを創の周辺に沿って縫合固定し、リング上にエポキシ系接着剤塗り直径35mmのナイロン網あるいはゴアテックス膜(ゴア社)を接着固定して、この上にガーゼを当てステンレス網で保護して弾性テープで固定した。このナイロン網あるいはゴアテックス膜は、創面に接着しない状態で固定してあり空気の透過性を維持できる状態であり、半開放創に近い環境を提供できる。この状態で3、6、9日後に1匹ずつラットを犠死させ創面の状態を組織学的に観察した。全層皮膚欠損創にナイロン網を非接触的被覆した場合には、創面上に浸出液が一時的に貯留されることなく外側のガーゼに吸収された。また、ナイロンの中央部が創面と接触し、動物の動きに伴う摩擦により創面に機械的な刺激を与える結果となった。HE染色による組織学的な観察によれば、3日間被覆した場合には、強い炎症反応を示す組織構造を呈しており、6日間以上被覆した場合には、強い炎症反応は持続し、密な基質構造を有する肉芽組織の形成が開始されていた。一方、全層皮膚欠損創にゴアテックス膜を非接触的に被覆した場合には、外側のガーゼに浸出液を吸収した形跡はみられなかった。ゴアテックス膜は、空気は透過するが浸出液は透過しない特性をもつため創面上に浸出液が一時的に貯留する環境を提供できた。3日間被覆した場合には、炎症反応の弱い組織構造を呈しており、6日間被覆した場合に、炎症反応は弱く、浮腫を伴うルーズな基質構造を有する肉芽組織の形成が観察された。しかし、9日間以上被覆した場合には密な基質構造を有する組織構造に変化した。以上の結果、ゴアテックス膜を6日間非接触的に適用した場合が浮腫を伴う不良肉芽組織創のモデルの作製に適しており、ゴアテックス膜を6日間適用する条件を選択し、本発明の治療剤の評価試験を行った。

0014

2)肉芽組織創面におけるC−274の評価
ラット背部全層皮膚欠損創にゴアテックス膜を6日間非接触的に適用して作成した肉芽組織創面にヒアルロン酸スポンジを適用し、該スポンジに1mlのC−274水溶液(120μg/ml)を含浸させ、その上に被覆材を適用して周辺を縫合固定し、この上にガーゼを当てて弾性テープで包帯固定した。ここで、C−274水溶液を含浸させない場合を対照群とした。5日目に被覆材を除去して創面を観察した(適用5日目)。新たに、1mlのC−274を含浸したヒアルロン酸スポンジあるいはC−274を含浸しないヒアルロン酸スポンジを適用し、同様にして包帯固定して5日目に、再度被覆材を除去して創面を観察した(適用10日目)。新たに1mlのC−274を含浸したヒアルロン酸スポンジあるいはC−274を含浸しないヒアルロン酸スポンジを適用し、同様にして包帯固定し、更に5日目に被覆材を除去して創面を観察した(適用15日目)。ヒアルロン酸スポンジは含水保水性に優れており、C−274水溶液の適用に適していた。5日ごとの被覆材の貼り換え時点では、ヒアルロン酸スポンジは、肉眼的には残存は認められなかった。ヒアルロン酸自身、創傷治癒をかなり促進する傾向があるが、適用10日目、及び15日目の時点で、C−274含有ヒアルロン酸スポンジの方が顕著な創面の収縮を伴う創の治癒が観察された。結果を表1に示す。

0015

表 1
────────────────────────────────────
被 覆 材 被 覆 材 適 用 日 数
0日 5日 10日 15日
────────────────────────────────────
創面積(被覆前の創面積との比率
C-274含有
ヒアルロン酸9.62cm2 4.95cm2(51.5%) 2.33cm2(24.2%) 1.51cm2(15.7%)
スポンジ
ヒアルロン酸 9.62cm2 6.73cm2(70.0%) 5.05cm2(52.5%) 2.90cm2(30.1%)
スポンジ
────────────────────────────────────

0016

次に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものでは無い。

0017

製剤例1
C−274の12mgをPBSに加え、全量を100mlとしてこれを溶解後、ミリポアフィルターGSタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液1mlを10mlのバイアル瓶により凍結乾燥し、1バイアル瓶にC−274を120μg含む凍結乾燥物を得た。

0018

製剤例2
分子量180万〜220万のヒアルロン酸(紀文フードケミファ製)の1%水溶液(pH5.9)に水溶性エポキシド化合物デナコールEX810(ナガセ化成製)をヒアルロン酸の繰返し単位二糖)の分子量に対して1/10モル量添加して充分かくはんした後、ポリスチレン容器(10cm×18cm)に90ml注入し、50℃に設定した乾燥機内に5時間静置した後、−80℃の冷凍庫内急冷凍結して真空乾燥によりスポンジ状シートを作製した。所定のサイズに裁断した後、エチレンオキシドガスにより滅菌してヒアルロン酸スポンジを作製した。該ヒアルロン酸スポンジにC−274水溶液を用時含有させ、C−274含有ヒアルロン酸スポンジを作製した。

発明の効果

0019

製剤例3
スポンジシートの作製には、牛皮由来のコラーゲンを酵素処理して調製したアテロコラーゲン(高研製)を使用した。1%のアテロコラーゲン水溶液をpH4に調整してホモジナイザーで15000rpmで3分間かくはんしてクリーム状にし、この溶液60mlをポリスチレン容器(10cm×18cm)に流し込アンモニア雰囲気下に1時間静置させてゲル化させた。流水にて1昼夜水洗した後、これを−80℃で急速凍結させ、真空乾燥させてスポンジ状シートを作製し、更に、紫外線照射により分子間架橋を導入した。所定のサイズに裁断した後、エチレンオキシドガスにより滅菌してコラーゲンスポンジを作製した。該コラーゲンスポンジにC−274水溶液を用時含有させ、C−274含有コラーゲンスポンジを作製した。

0020

本発明により、局所的な血行不良に起因する難治性皮膚欠損創に対して有効なC−274を含有する治療剤が提供できる。C−274は生体由来生理活性ポリペプチドで安全性も高く、遺伝子工学的に大量に供給可能であり、皮膚欠損創の有力な治療剤となりうる。

0021

配列番号:1
配列の長さ:274
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35 40 45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80 85 90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110 115 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185 190 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200 205 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260 265 270

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