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技術 新規なタンパク質

出願人 三菱化学株式会社
発明者 埜中征哉加茂功菊池愛子近藤淳高橋和展山田英
出願日 1994年7月7日 (25年8ヶ月経過) 出願番号 1994-155929
公開日 1996年1月23日 (24年1ヶ月経過) 公開番号 1996-020599
状態 未査定
技術分野 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード モノヨード酢酸 筋様細胞 pH調節剤 腹腔浸出細胞 紫外吸収 骨萎縮 マクロファージ系細胞 周期性好中球減少症
関連する未来課題
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この項目の情報は公開日時点(1996年1月23日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (3)

構成

胸腺筋様細胞から、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約60,000ダルトンで、胸腺のマクロファージ系細胞及び脳ミクログリア細胞を単独で増殖誘導させる活性を有する新規タンパク質を分離・精製し、その部分アミノ酸配列を決定した。

効果

本発明のタンパク質は、胸腺のマクロファージ系細胞を特異的に増殖誘導させることから、マクロファージの有する殺腫瘍作用破骨細胞増殖活性等の種々の免疫担当細胞機能亢進に利用できることが期待される。また、脳ミクログリア細胞に当該タンパク質を与えたところ、特徴的な増殖形態を示すので、本発明のタンパク質は脳ミクログリア細胞の分化増殖因子としても機能することが示唆される。従って本発明のタンパク質は、脳損傷等の治療にも適用できる。さらに、骨変形あるいは骨髄腔狭小化などを伴う骨萎縮症である大理石病では、従来のM−CSFによる治療が困難と考えられており、これらの疾患に本願のタンパク質が適用できる可能性も考えられる。

概要

背景

概要

胸腺筋様細胞から、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約60,000ダルトンで、胸腺のマクロファージ系細胞及び脳ミクログリア細胞を単独で増殖誘導させる活性を有する新規タンパク質を分離・精製し、その部分アミノ酸配列を決定した。

本発明のタンパク質は、胸腺のマクロファージ系細胞を特異的に増殖誘導させることから、マクロファージの有する殺腫瘍作用破骨細胞増殖活性等の種々の免疫担当細胞機能亢進に利用できることが期待される。また、脳ミクログリア細胞に当該タンパク質を与えたところ、特徴的な増殖形態を示すので、本発明のタンパク質は脳ミクログリア細胞の分化増殖因子としても機能することが示唆される。従って本発明のタンパク質は、脳損傷等の治療にも適用できる。さらに、骨変形あるいは骨髄腔狭小化などを伴う骨萎縮症である大理石病では、従来のM−CSFによる治療が困難と考えられており、これらの疾患に本願のタンパク質が適用できる可能性も考えられる。

目的

効果

実績

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請求項1

下記の理化学的性質を有することを特徴とする新規タンパク質。1. SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が、約60,000ダルトンである。2.胸腺マクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞を単独で増殖誘導させる活性を有する。

請求項2

その部分アミノ酸配列配列表の配列番号1に記載の配列で表されることを特徴とする請求項1記載のタンパク質。

請求項3

その部分アミノ酸配列が配列表の配列番号2に記載の配列で表されることを特徴とする請求項1記載のタンパク質。

請求項4

その部分アミノ酸配列が配列表の配列番号3に記載の配列で表されることを特徴とする請求項1記載のタンパク質。

請求項5

その部分アミノ酸配列が配列表の配列番号4に記載の配列で表されることを特徴とする請求項1記載のタンパク質。

請求項6

その部分アミノ酸配列が配列表の配列番号5に記載の配列で表されることを特徴とする請求項1記載のタンパク質。

請求項7

請求項1〜6のいずれかに記載のタンパク質および薬学的に許容され得る担体を含有してなることを特徴とする医薬組成物

技術分野

0001

本発明は、胸腺マクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞分化増殖を促す作用を有する新規タンパク質に関する。

0002

近年、好中球の分化増殖を誘導する顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージの増殖を促進する顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子GM−CSF)およびマクロファージの分化誘導を促すマクロファージ・コロニー刺激因子(M−CSF)の存在が発見され、それぞれの役割が明らかにされつつある。

0003

例えばヒト由来のG−CSFは、174アミノ酸残基からなる分子量が約1.8〜2.2万のタンパクで、抗ガン剤放射線療法副作用である顆粒球減少症免疫不全症などの治療薬として有用であること、ヒト由来のGM−CSFは、125個のアミノ酸残基よりなる分子量1.4〜3.5万の糖タンパクで、G−CSFと同様、ガン化学療法や放射線療法による副作用や、甲状腺機能亢進症に伴う顆粒球減少症の治療薬としての有用性が期待されている。

課題を解決するための手段

0004

一方、マクロファージ系細胞とは、骨髄幹細胞より分化増殖し、貪食作用を行い、微生物等の侵襲から生体防御する一群細胞である。これらの細胞は、肝臓ではクッパー細胞ではマクロファージというように臓器固有な細胞に分化し、臓器特有な機能に関与する。胸腺では胸腺マクロファージ系細胞として存在し、自己抗原を認識したT細胞を選択的に除外する“ネガティブセレクション”に関係していることが知られている。しかし、そのような臓器特異的なマクロファージ系細胞に対して分化増殖を促すような因子の存在は全く知られていなかった。

0005

本発明者らは新規な分化増殖因子につき探索、研究を進めてきた結果、胸腺間質系細胞である筋様細胞が胸腺マクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞に対する分化増殖因子を産生していることを始めて見出し、当該因子を単離、精製して本発明を完成するに至った。

0006

すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする新規なタンパク質に存する。
1. SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が、約60,000ダルトンである。
2.胸腺のマクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞を単独で増殖誘導させる活性を有する。

0007

以下、本発明につき詳細に説明する。胸腺由来マクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞の増殖誘導を促す作用を有する本発明の新規なタンパク質(以下、「60K−CSF」と称することがある)は、例えば後述の実施例に詳述するように、胸腺由来筋様細胞の培養上清DEAEセファロースCL−6B(ファルマシア社製)等によるイオン交換クロマトグラフィーにより分画した後、ハイドロキシアパタイトカラムおよびブルーセファロース−conAカラムによるアフィニティクロマトグラフィー、TSKG4000SW(トーソー社製)等による分子ふるいクロマトグラフィーによりさらに分画した後、YMCPack C4カラムクロマトグラフィー(ワイエムシー社製)等により精製することによって得ることができる。

0008

精製された本発明のタンパク質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が、約60,000ダルトンであり、胸腺のマクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞を単独で増殖誘導させる活性を有する。当該タンパクには、G−CSF活性およびGM−CSF活性が見られなかった。またM−CSFは腹腔浸出細胞の増殖をよく刺激しても胸腺細胞に対しては作用しないのに対し、本発明の60K−CSFは胸腺のマクロファージ系細胞の分化増殖に作用する。これらのことから、当該因子は従来にないCSF様活性を有する新規な因子であることが判明した。

0009

また本発明の60K−CSFは、配列表の配列番号1に示すようなアミノ酸配列N末端に、さらに配列表の配列番号2〜5に示すようなアミノ酸配列を中間部フラグメントとして含むものである。かかる60K−CSFは、胸腺のマクロファージ系細胞および脳ミクログリア細胞を増殖誘導させるという機能を損なわない範囲において、一部のアミノ酸を除去、置換、修飾または追加する等の改変を行うことができる。

0010

本発明の60K−CSFを医薬品として使用するに当たっては、好ましくはこれを適当な希釈剤や他の添加剤と共に適当な製剤形態剤型調合され、使用に供される。剤型としては、一般に非経口的投与に適する剤型が用いられる。好ましくは、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤(バイアル)等を挙げることができる。

0011

上記各種剤型への調製は、この技術分野で慣用されている通常の手法を用いて行うことができる。製剤化する際に用いられる製剤担体としては、各種剤型への調製に慣用されている希釈剤や添加剤等が用いられる。例えば注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された60K−CSFの有効量を例えば蒸留水生理食塩水ブドウ糖水溶液等の希釈剤に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセルロースアルギン酸ナトリウム等の賦形剤ベンジルアルコール塩化ベンザルコニウムフェノール等の保存剤ブドウ糖グルコン酸カルシウム塩酸プロカイン等の無痛化剤塩酸酢酸クエン酸水酸化ナトリウム等のpH調節剤等を加え、常法に従い凍結乾燥することにより調製される。

0012

また注射用アンプル剤は、60K−CSFの有効量を例えば蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等の希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウムマンニトール等の溶解補助剤クエン酸ナトリウムグリセリン等の緩衝剤、ブドウ糖、転化糖等の等張化剤ポリエチレングリコール等の安定化剤、上記保存剤、上記無痛化剤、上記pH調節剤等の添加剤を加え、これを通常の加熱滅菌無菌ろ過等により無菌化して調製される。

0013

かかる医薬組成物は、これを必要とする患者に対して非経口的に、一般には皮下、筋肉内または静脈内注射により、その所定量を単回もしくは複数回に分けて投与するか、または連続的に投与する。薬剤としての投与量は、単回もしくは複数回投与の場合には、通常有効成分(60K−CSF)として成人日当たり約10μg〜10mg/kgの範囲で、これを投与すべき患者の静脈内、皮下、筋肉内に投与するのが好ましく、患者の病理状態栄養状態年齢、体重、併用薬剤等に応じて適宜増減させることができる。また連続投与の場合には、成人1時間当たり約0.1〜50μg/kgの範囲で、上記1日量に相当する量を投与することができる。

0014

投与方法としては、注射用アンプル剤の場合はそのまま皮下、筋肉内または静脈内に投与することができるが、静脈内投与の場合には、必要に応じて輸液用ミニポンプを用いて投与することもできる。また注射用凍結乾燥粉末剤の場合には、当該粉末剤を使用時に蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等の希釈剤に溶解した上、アンプル剤の場合と同様にして投与する。

発明の効果

0015

さらに本発明の医薬組成物は、治療の際にブドウ糖等の糖輸液に予め所定量を混合して投与するか、または該糖輸液の投与と同時にその有効量を単独で末梢静脈等から投与することも可能である。

0016

本発明の新規なタンパク質60K−CSFは、胸腺のマクロファージ系細胞を特異的に増殖誘導させることから、マクロファージの有する殺腫瘍作用破骨細胞増殖活性等の種々の免疫担当細胞機能亢進に利用できることが期待される。具体的には、化学療法や放射線療法後の顆粒球減少症、再生不良性貧血骨髄異形成症候群骨髄移植に伴う顆粒球減少症、周期性好中球減少症エイズ関連症候群の顆粒球機能亢進、高齢者日和見感染症血小板減少症抗腫瘍剤との併用、高脂肪症等の治療が挙げられる。

0017

また、脳ミクログリア細胞に当該タンパク質を与えたところ、特徴的な増殖形態を示すので、本発明のタンパク質は脳ミクログリア細胞の分化増殖因子としても機能することが示唆される。従って本発明のタンパク質は、脳損傷等の治療にも適用できる。さらに、骨変形あるいは骨髄腔狭小化などを伴う骨萎縮症である大理石病では、従来のM−CSFによる治療が困難と考えられており、これらの疾患に本願の60K−CSFが適用できる可能性も考えられる。

0018

以下、本発明につき実施例をあげてより具体的に説明するが、その要旨を超えない限り、以下に限定されるものではない。
実施例1 60K−CSFの精製
Immunology,79,103−106(1993)に記載の方法に従ってRPMI1640培地で培養したラット胸腺由来筋様細胞(871207B)の培養上清を、0.05Mリン酸緩衝液(pH7.3)で平衡化したDEAE−セファロースCL−6Bカラムに添加し、同緩衝液中0から1.3MNaClの直線濃度勾配溶出法で溶出し、電導度0.7mmhoから1.6mmhoまでの画分を集め、ハイドロキシアパタイト(10mM,PB,pH7.0)に通液し、通過画分をブルーセファロース−conAアガロースゲルに通液し、0.3M α−メチルマンノシド溶出画分回収した。次に分子量30,000カット濃縮装置セントリコンアミコン)で濃縮後、0.05M リン酸緩衝液(pH7.3)へ置換した後、同緩衝液で平衡化したTSKG4000SW(トーソー社製)カラムに添加し、同緩衝液にて流速1ml/分で溶出し、45分から55分の溶出画分を分取した。次に、本画分を0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルイソプロピルアルコール(3/7,v/v)混液で平衡化したYMC C4カラム(YMC−Pack C4−AP,0.46×15cm)に添加し、0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル/イソプロピルアルコール(3/7,v/v)混液で20から80%、30分間の直線濃度勾配法により流速1ml/分で溶出し、各ピークを分取した。215nmの紫外吸収測定による溶出パターンを、図1に示した。このうち15.5分に溶出した画分に目的とする活性が認められ、同画分を真空状態で乾燥した後、0.15MNaClを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.4)に溶解し、30% アセトニトリルで平衡化したYMC C8カラム(YMC−Pack C8−AP,0.46×15cm)に添加し、0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルで30から60%、30分間の直線濃度勾配法により流速1ml/分で溶出し、各ピークを分取した。215nmの紫外吸収測定による溶出パターンを、図2に示した。このうち14.2分に溶出した画分に目的とする活性が認められ、同画分を真空状態で乾燥した。精製した60K−CSFをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析したところ、その分子量は約60,000ダルトンであることが明らかとなった。この標本を用いてアミノ酸配列の解析を行った。

0019

なお、上記した各精製工程においては、後述する実施例に記載の方法で骨髄細胞へのサイミジン取り込み活性指標として、60K−CSFを分画精製した。
実施例2 60K−CSFのアミノ酸配列分析
実施例1で精製した60K−CSFを、50%トリフルオロ酢酸60μLに溶解し、ポリブレン処理したグラスフィルターに添加し、Applied Biosystems社製470Aシークエンサーエドマン分解し、N末端域のアミノ酸配列を決定した。かかる配列を、配列表の配列番号1に示す。

0020

また、精製標本をモノヨード酢酸にてS−カルボキシメチル化した後、4M尿素を含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)に溶解し、リジルエンドペプチダーゼ和光純薬製)により、酵素基質=1:200で、37℃、6時間作用させた後、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡化したBakerbondC8カラム(BakerbondTM WP Octyl,0.46×25cm)に添加し、アセトニトリル濃度0%から60%まで60分間の直線濃度勾配溶出を行い、各ピークを分取した。215nmの吸光度による溶出パターンを、図3に示す。このうち、29.5分、40.7分、42.2分および45.0分に溶出したピークを真空状態で乾燥した後、同様にシークエンサーによりエドマン分解した。その結果、29.5分、40.7分、42.2分および45.0分に溶出したピークの内部部分配列は、それぞれ配列表の配列番号2、3、4および5に示す通りであった。

0021

実施例3 60K−CSFの活性評価
イスター系ラットの脳ミクログリア細胞を、精製した60K−CSFの存在下、マイクロプレートを用いたトリチウムサイミジンの取り込み法により、増殖活性を測定した。細胞増殖の同定には、マーカーとしてOX42(macrophage,granulocyte,dendritic cell)、ED1(monocyte)、ED2(macrophage)、ED3(macrophage)等のモノクローナル抗体を用いた間接蛍光抗体法を使用した。結果を下記表に示す。

0022

───────────────────────────
マーカー培養0日目 培養7日目
───────────────────────────
OX42 + +
ED1 − +
ED2 − +
ED3 − +
───────────────────────────
+:細胞の約8割が反応
−:反応せず

0023

上記の結果より、本願の60K−CSFは、脳ミクログリア細胞に作用して上記のようなマーカーを有するマクロファージ様細胞を分化させる能力を有することがわかる。

0024

また前記ウィスター系ラットの骨髄細胞を用いて、加茂らの方法(Cell.Immunol.,94,587(1985))に従ってコロニーアッセイ(8日間培養)を試みたところ、軟寒天上で散在性(scattered type)のコロニー形成が認められた。これより本願の60K−CSFは、骨髄細胞に作用してマクロファージ様細胞を分化させる能力を有することがわかる。

0025

配列番号:1
配列の長さ:21
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:N末端フラグメント
起源
生物名:ラット
組織の種類:胸腺
配列
Ser Met Val Ser Asn Arg Pro Phe Ile Thr Val Trp Asn Ala Asp Thr
1 5 10 15
His Trp Asp Leu Lys
20

0026

配列番号:2
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:ラット
組織の種類:胸腺
ID=000002HE=015 WI=048 LX=0360 LY=1200

0027

配列番号:3
配列の長さ:18
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:ラット
組織の種類:胸腺
配列
Glu Gln Asn Phe Gln Gly Xaa Xab Met Thr Ile Phe Tyr Arg Glu Glu
1 5 10 15
Xac Gly
Xaa, Xab, Xac は、カルボキシメチルシステインを含む20アミノ酸から選ばれる未同定のアミノ酸

0028

配列番号:4
配列の長さ:11
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:ラット
組織の種類:胸腺
ID=000003HE=015 WI=073 LX=0235 LY=2150

図面の簡単な説明

0029

配列番号:5
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:ラット
組織の種類:胸腺

0030

図1本発明の60K−CSFを、215nmの紫外吸収を指標として逆相HPLCで精製した際の溶出パターンを表す図面である。
図2図1活性画分を、さらに215nmの紫外吸収を指標として逆相HPLCで精製した際の溶出パターンを表す図面である。
図3リジルエンドペプチダーゼ処理した60K−CSFを、215nmの紫外吸収を指標として逆相HPLCで精製した際の溶出パターンを表す図面である。

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