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技術 モノクローナル抗体およびハイブリドーマ

出願人 株式会社サンギ
発明者 久保木芳徳松山敏勝平敏夫
出願日 1994年6月3日 (25年3ヶ月経過) 出願番号 1994-145606
公開日 1995年12月19日 (23年9ヶ月経過) 公開番号 1995-330798
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 適宜解析 洗浄原液 静置処理 レントゲン装置 初期緩衝液 室温状態 通常レベル デシメータ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1995年12月19日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (1)

目的

人体の主たるカルシウム貯蔵組織である骨の組成の変化、骨組織代謝異常、並びに骨組織の減少傾向血液試料分析することによって診断可能とすることを目的とする。

構成

本発明に係るモノクローナル抗体は、牛骨から精製した骨シアロタンパク質マウスに免疫し、その脾臓細胞骨髄腫ミエローマ細胞ハイブリッド(融合)させて得られる。

概要

背景

人口構成比高齢化に伴い、近時、骨粗鬆症等、骨が弱まる各種の病気報告されている。人体カルシウムに関するこれらの病気は、まず、の曲がりや間接の傷み、容易な骨折、歯病などの外形的症状として現れるが、とくに骨の病気として代表的な骨粗鬆症の進行は、従来、レントゲン写真超音波診断装置による骨映像画像分析によって診断された。

一方、血液中の成分から骨代謝の程度を知るためのマーカーとしてオステオカルシンが報告されており、また尿中のピリジノリンが検討されている。人体のカルシウム分は99%が骨と歯とに蓄積されているが、血中カルシウム分は殆ど一定であり、この血中カルシウム分を補うために、カルシウムが不足するときには骨からのカルシウム溶出代謝が発生することから、血中オステオカルシンあるいは尿中ピリジノリンが注目されたわけである。

概要

人体の主たるカルシウム貯蔵組織である骨の組成の変化、骨組織代謝異常、並びに骨組織の減少傾向血液試料分析することによって診断可能とすることを目的とする。

本発明に係るモノクローナル抗体は、牛骨から精製した骨シアロタンパク質マウスに免疫し、その脾臓細胞骨髄腫ミエローマ細胞ハイブリッド(融合)させて得られる。

目的

そこで本発明の目的は、人体の主たるカルシウム貯蔵組織である骨の組成の変化、骨組織の代謝異常、並びに骨組織の減少傾向を血液試料を分析することによって診断することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

ヒト血中に存在する骨特有タンパク質またはその代謝物を認識するモノクローナル抗体

請求項2

前記モノクローナル抗体は、牛骨から精製した骨シアロタンパク質を免疫として得ることを特徴とする請求項1のモノクローナル抗体。

請求項3

前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ

技術分野

0001

本発明は、骨組織特有蛋白質に反応するモノクローナル抗体および当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。

背景技術

0002

人口構成比高齢化に伴い、近時、骨粗鬆症等、骨が弱まる各種の病気報告されている。人体カルシウムに関するこれらの病気は、まず、の曲がりや間接の傷み、容易な骨折、歯病などの外形的症状として現れるが、とくに骨の病気として代表的な骨粗鬆症の進行は、従来、レントゲン写真超音波診断装置による骨映像画像分析によって診断された。

0003

一方、血液中の成分から骨代謝の程度を知るためのマーカーとしてオステオカルシンが報告されており、また尿中のピリジノリンが検討されている。人体のカルシウム分は99%が骨と歯とに蓄積されているが、血中カルシウム分は殆ど一定であり、この血中カルシウム分を補うために、カルシウムが不足するときには骨からのカルシウム溶出代謝が発生することから、血中オステオカルシンあるいは尿中ピリジノリンが注目されたわけである。

発明が解決しようとする課題

0004

ところでレントゲン写真や超音波撮像装置による骨症診断は、骨に、目で見える(映像として捕捉し得る)程度の欠損が出来てはじめて診断が可能であり、診断可能な時点ではすでに深刻な疾患となっていることが少なくない。

0005

また実験の結果、血中オステオカルシンは必ずしも良好な骨代謝マーカーとはなり得なかった。現在、このタンパク質生理役割未解決のようであり、また骨代謝速度との相関性も良好とはいえないからである。

0006

一方の尿中ピリジノリンは、骨代謝特有マーカーではあるが、やはり代謝速度との相関性が良好ではなく、臨床診断には向かないと考えられる。しかも尿サンプル採取が煩しい上、組成安定のための静置処理など時間がかかり、即時診断の面でも疑問がある。

0007

そこで本発明の目的は、人体の主たるカルシウム貯蔵組織である骨の組成の変化、骨組織の代謝異常、並びに骨組織の減少傾向血液試料分析することによって診断することにある。

課題を解決するための手段

0008

前記目的を達成して課題を達成するため本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒト血中に存在する骨特有タンパク質を認識することを特徴とする。また、このモノクローナル抗体は、牛骨から精製した骨シアロタンパク質マウスに免疫し、その脾臓細胞骨髄腫ミエローマ細胞ハイブリッド(融合)させて得られる。

0009

血中の骨特有タンパク質を認識するモノクローナル抗体は、骨組織の代謝溶出が正常を越えて進んでいる場合に、血中の当該蛋白を捉えることにより骨代謝の異常を検出することができる。検出法としては、例えば、免疫染色法ELISA法による観察、フローイメトリー放射性免疫分析法、免疫沈澱法、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法酵素消化法その他の適宜解析手法がある。

0010

このモノクローナル抗体は、牛骨から精製した骨シアロタンパク質(ボーンシアロプロテイン;以下、BSPと略す)を免疫として得ることが出来る。骨シアロタンパク質は骨にのみ由来する血中成分であり、牛骨由来BSPを免疫して得たモノクローナル抗体であっても人骨由来のBSPに反応し、また骨蛋白以外の組織由来のタンパク質には反応しない。

0011

このモノクローナル抗体を産生するため、動物骨を用いて目的とするBSPを抽出し、このBSPを定法に従って動物免疫することにより所期のハイブリドーマBSPのモノクローナル抗体を得る。BSPの抽出に際しては例えば脱灰骨粉を使用できる。抽出培養技術およびスクリーニング、或いはクローニング等のハイブリドーマ作成技術は、各種腫瘍マーカー作製技術として公知の手段を使用することが出来る(例えば特公平4−252195,特公平3−103189,特開平4−248992号の記載事項等)。

0012

BSPにはふたつの分子種BSPIとBSPIIが存在する(例えばFranzen,A,Heinegard,D.(1985)Isolation and characteviation of two sialoproteinspresent only in bone calcified matrix. Biochem.J.232;12723-12727)。本発明でいうBSPは主としてBSPIIである。本明細書におけるBSPは、主としてこのBSPIIを意味する。BSPは、分子量57300で比重比13%のシアル酸を含み、骨の非コラーゲンタンパク質の約12%を占める(Kinne,R,W,Fisher,L.W.(1987) Keratan sulfate proteoglycan in rabbit compact bone sialoprotein II. J.Biol.Cchem.262:10206-10211)。象牙質(歯)にも少量の存在が認められるが、ヒトの皮膚、軟骨その他の細胞部位では発見されておらず、BSPは現在のところヒトの骨または歯に特有のタンパク質であると考えられる。尚、BSPはその一次構造として分子内にArg−Gly−Aspの細胞接着配列をもつ。

0013

以下本発明の実施例を説明する。
抗原の精製;抗原となる骨シアロタンパク質(BSP)は、例えば牛脱灰骨粉末を用いて精製することが出来る。ウシとヒトとのBSPは免疫学的に殆ど差がないからである。精製の方法は、例えばFisherらの方法に準じる。純度検定は、例えばSDS−PAGEで行うことが出来る。

0014

具体的には、牛脱灰骨粉末を4M塩酸グアニジンを用いて抽出するが、その手順は以下の通りである。まず、液体窒素下で粉砕した牛骨骨粉(20〜100メッシュ)をプロテアーゼインヒビターを含むトリ緩衝食塩水(1.0M NaCl,0.05M Tris-HCl(pH 7.4))を用いて洗浄し、クロロホルムメタノール脱脂を行った後、塩酸脱灰して脱灰骨基質を得る。得られた脱灰骨基質を4M塩酸グアニジン、0.05M Tris−HCl(pH7.4)溶液を用いて、4℃にて撹拌する。このようにして得た4M塩酸グアニジン抽出液限外濾過器(MW: 1000 cut off)を用いて濃縮し、0.1M KH2 PO4 KOH(pH6.8),6MUrea溶液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに添加する。添加後、段階的濃度勾配法(リン酸濃度0.1M → 0.4M の順に溶出)にて溶出させる。リン酸濃度0.4M にて溶出された画分(G-HAP-0.4)を0.1M NaCl,0.05M Tris-HCl(pH 7.0),6MUrea溶液で平衡化したヘパリンセファロースCL-6Bカラムに供する。溶液は段階的濃度勾配法(塩化ナトリウム濃度0.1M → 0.15M → 0.5M の順に溶出)にて行い、NaCl濃度0.1Mにて溶出された画分(GH-HEP-0.1)を4M塩酸グアニジン、0.05M Tris-HCl(pH7.4)溶液で平衡化されたセファクリルS−300ゲル濾過カラムに供し、その後7MUrea,0.1M Sodium Acetate,10mM Tris-HCl(pH 6.0)で平衡化されたDE−52カラムに供する。Sodium Acetate 0.1M→1.0M の直線的濃度勾配法にて溶出させ、0.4M溶出画分逆相HPLC(C18)にて精製した。各カラムにおけるBSPの存在は、SDSゲル電気泳動にて確認した。尚、次のカラムへ進むにあたり、試料限外濾過膜(MW: 1000 cut off)を用いて濃縮後、ハイドロキシアパタイトカラムの場合を除いて、更に次のカラムの初期緩衝液に濃縮置換する。またカラム操作は室温で、濃縮操作は4℃で行った。

0015

免疫;このようにして得られた骨シアロタンパク質を抗原として、マウスを通常の方法で免疫する。具体的には、マウス一匹あたり一回に10〜50μgの抗原をそのまま完全又は不完全アジュバンドとともに皮下(または腹腔)に免疫する。アジュバンドを加えずに静脈免疫しても良い。免疫間隔は1週間から2週間おき、免疫回数は3〜15回程度である。感作マウスから採決し、血中抗体値を分析することによって免疫成立を確認する。

0016

ハイブリドーマの作成(細胞融合);ハイブリドーマは、定法に従い、骨髄細胞腫抗体産生細胞とを融合することによって製造する。抗体産生細胞は、免疫されたマウスの脾細胞またはリンパ節細胞を用いる。骨髄細胞腫は、同一種マウスのものを使用した。融合効率の高いBalb/cマウス由来のP3X36−Ag8−653が望ましい。P3X63Ag8U1、YB2/0(ラット)、SP2/0Ag14等も使用可能である。

0017

作成は、ジー・ケーラの手法またはこれに準じた手法に基づいて行う。具体的には、摺潰した細胞をポリエチレンチューブを用いて混合し、遠心分離して培地を除去し、例えばポリエチレングリコール等の細胞融合促進物質を用いて骨髄細胞腫と抗体産生細胞とを融合させ、再度の遠心分離後、上清を除去して適当な培地(例えばHAT培地)で育成する。尚、骨髄腫細胞に対して1〜10倍、好ましくは2〜3倍の抗体産生細胞を用いた。脾細胞濃度は5×10-5細胞数/mlになるよう調整した。融合しなかった細胞は培地中で死滅した。

0018

ハイブリドーマの選択;抗原をコートした96穴マイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を加え、通常の固相ELISA法を行った。この過程で、抗原特異的なハイブリドーマを選択し、限界希釈法によってクローニングを行うことによって、安定したハイブリドーマを得た。

0019

より具体的には、所謂96穴プレートの各ウェルにハイブリドーマ培養上清を200μlを分注し、室内培養(好ましくは37℃、5%炭酸ガスを含む培養器を使用する)を行い、3〜4日毎(または2〜3日おき)に培地の半量を吸引除去し、HAT培地を加え、さらに培地を代える。このような操作により、細胞融合後7〜10日後に約半数のウェルにハイブリドーマの増殖を認めた。抗体活性は例えば酵素抗体法等により測定し、陽性クローンは48穴プレート、さらに24穴プレートに移し、培養した。クローン拡張し、抗体産生を続けた細胞は、例えばRPMI-1640mediam−10%DMSOに懸濁し、液体窒素で冷凍した。また単クローン性保証するため、このクローンは限界希釈法によって順次クローニングを行った。こうして得たハイブリドーマとして例えばAnti−BSP−Hybridoma(工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号;FERM P−14294号)などがある。

0020

目的とするモノクローナル抗体は、選択されたハイブリドーマ培養上清から、塩析イオン交換クロマトグラフィープロテインA−カラム等の分離精製操作により回収する。尚、選択ハイブリドーマを組織適合性動物の腹腔内で増殖させても良い。

0021

診断方法検体としては血液を使用するのが望ましい。分析法としては例えばELISA法、RIAウエスタンブロッティング等を用いた。

0022

ELISA法による抗体活性の特性;これは、アンチボディーキャプチャーアッセイ法に基づく96ウェルプレートを用いた固相酵素免疫測定であり、概略次のようなステップを踏んで行った。
A.試薬の調製
1)1次抗体
抗体および標準液調整用希釈液2.5mlに1次抗体原液を10μlを加え希釈する(250倍)。
2)2次抗体液
抗体および標準液調整用希釈液10mlに2次抗体を10μlを加え希釈する。
3)標準液の調製
マイクロテストチューブを用いて抗体および標準液調整用希釈液390μlにBSPII標準原液10μlを加え希釈し撹拌する。次にこの溶液200μlの希釈液の入ったチューブに加え、順次2倍希釈し標準液12本を用時調製する。
4)洗浄液
洗浄原液50mlに蒸留水を加えて全量500mlとする。
B.検体の調製
マイクロテストチューブに血清100μl取り、希釈液100μlを加える。
C.標準操作
1.BSPII固相化プレートのブロッキング
BSPII固相化プレートに希釈液200μlを各ウェルに入れ、湿潤室温で2時間放置する。
2.1次抗体反応
サンプルおよび標準液(200μl)に50μlの1次抗体液を加え撹拌し、湿潤室温状態で2時間放置する。
3.1でブロッキング処理をしたBSPII固相化プレートからブロッキング液抜き取り、各ウェルに2で調製した1次抗体反応後の液100μlを入れ、 室温で4時間反応させる。
4.洗浄
洗浄液300μlを各ウェルに入れ、3回洗浄する。
5.2次抗体反応
2次抗体液を100μlづつ各ウェルに添加し、室温で1時間反応させる。
6.洗浄
4と同様に3回洗浄する。
7.発色液を100μlづつ各ウェルに入れ、1時間放置する。
8.反応停止液50μlづつ各ウェルに入れ、撹拌後マイクロプレート用吸光度計を用いて490nmで吸光度を測定する。
9.標準液の吸光度から標準曲線を作成し、この標準曲線から各サンプル中のBSPII濃度を読みとる。
尚、操作1,2は同時並行で行うのが望ましい。

0023

測定結果図1は、吸光度測定値と血中BSP濃度との相関を示す標準グラフ図である。測光波長は490nmである。血中BSP濃度が高くなるにつれ、吸光度計測値が低下する。血中BSPが高いということは、骨代謝が活発に進んでいることを意味し、骨組織の代謝(生成と分解があるが、主として後者が考えられる)が異常に進行していることを意味する。具体的な測定結果を次表に示す。

0024

0025

このうちBSP濃度が9ng/mlを越える検体を異常と判定する一方、全員について超音波診断を行ったところ、*印を附した患者において骨粗鬆症であることが判明した。この場合、例えばNo.5の患者は、血中BSP濃度が9ng/mlに達しているにも拘らず、従来のレントゲン超音波装置では骨粗鬆症として診断が出来なかった。このことは、本発明に係るモノクローナル抗体を用いた測定に誤りがあるのではなく、従来のレントゲン−超音波診断装置では、当該患者の異常を初期段階で認識できないことを示している。レントゲン−超音波による撮像により骨組織異常を認識できる段階では、骨に空洞が生じて組織が脆くなっているが、異常はその前から進行しているわけで、レントゲン装置等による見かけの画像では、進行を始めている骨代謝異常を発見できない。

0026

このため、No.7の患者のように血中BSP濃度が5ng/mlになっている場合には、たとえレントゲン−超音波診断によって骨組織に異常が認められなくとも、その疑いが少なくないということを知らせ、異常の初期段階からカルシウム摂取を促し、或いは女性ホルモン投与する等の適切な処置を講ずることを可能とする。尚、この実験で被検者高齢女性が多いのは、骨組織と女性ホルモンとが相関し、とくに閉経後の高齢女性に骨組織異常が多いという報告を確認するためである。

0027

ウエスタンブロッティング;血漿、血清等の被検体をSDSバッファ煮沸処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。次に、このゲル転写バッファ中で平衡化した後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース等のフィルタ電気的に転写した。このフィルタをTTBS溶液中で、BSA等によりブロッキングし、本発明に係るモノクローナル抗体と一定時間反応させた。

0028

反応後フィルタを洗浄し、2次抗体として酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体を加え、本発明に係るモノクローナル抗体と反応させた。次にこれを洗浄し、酵素に対する基質を加えフィルタ上で反応させた。尚、2次抗体としてHRP標識抗体を用いた場合は、基質として4−クロロナフトール等を用いた。デシメータを用い、フィルター上の発光度を計測することにより検体中に含まれている抗原量を検出した。尚、酵素は1次抗体に結合していても良く酵素標識抗体の代わりに放射性同意元素で標識された抗体を用いても良い。この場合はRIAによる計測ができる。このブロッティングの結果も、前記ELISA法の測定結果と相関一致した。

発明の効果

0029

以上説明したように本発明に係るハイブリドーマおよびその産生モノクローナル抗体によれば、ヒトの体液(血液、唾液、尿)に基づき、骨粗鬆症その他の骨代謝異常症を確実容易に診断することが可能となる。診断装置としては、従来より使用されている吸光度測定に基づいた自動分析装置があり、骨代謝の状況を即時診断することが出来る。

0030

健常人と異なる測定値閾値以下のカットオフ値)がみられるときは、骨代謝速度が速いこと、すなわち骨組織が通常レベルを越えて血中に代謝されていることを意味するから、初期段階における異常も検出可能となる。骨代謝異常は、エストロゲン等のホルモンバランス崩れた場合やビタミンD不足など、その原因によって進行速度が異なるが、いずれにしてもレントゲンなど従来の撮像診断に較べ外観上明かな異常が発生する前の段階で(異常発生と同時に)当該異常を検出でき、カルシウム投与や女性ホルモン注入など適切な治療手段を早期に施すことが出来る。

0031

本発明に係るハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体は骨組織特有のマーカーであるから、他の骨組織以外の細胞種との誤認は生じない。将来的に骨シアロタンパク質が他の臓器細胞から検出されることがあっても、その含有率は無視し得る程度に低いと考えられ、骨代謝異常の診断結果には殆ど影響がないと考えられる。

図面の簡単な説明

0032

図1吸光度測定値と血中BSP濃度との相関を示す標準グラフ図である。

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