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技術 アンモニア測定方法および測定用試薬組成物

出願人 東洋紡株式会社
発明者 服部静夫本郷徳幸山本和巳手嶋真一
出願日 1994年6月6日 (26年6ヶ月経過) 出願番号 1994-123883
公開日 1995年12月19日 (25年0ヶ月経過) 公開番号 1995-327695
状態 拒絶査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード アンモニア測定 尿素態窒素 クレアチニンデイミナーゼ 液状試薬 アンモニア量 界面活性化剤 クレアチニン測定用試薬 電極法
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この項目の情報は公開日時点(1995年12月19日)のものです。
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図面 (5)

目的

活性化剤および安定化剤として必要であったADPを必要としない、安定性に優れたアンモニア測定用試薬組成物を提供する。

構成

ADPによる活性化を受けず、かつNAD依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼα−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有すること特徴とするアンモニア測定用試薬組成物および該試薬組成物を使用して試料中のアンモニアを測定する方法ならびに該試薬組成物中にさらにウレアーゼまたはクレアチニンデイミナーゼを添加して試薬組成物ならびに該試薬組成物を使用する尿素態窒素またはクレアチニン測定方法

効果

高価なNADを必要としない安定性に優れた試薬組成物が得られる。

概要

背景

アンモニア、特に血中アンモニアの測定は肝障害診断指標として必須である。また尿素態窒素量は蛋白摂取量、蛋白代謝機能腎機能などの状態を知る上で重要であり、腎不全浮腫閉塞性尿路疾患糖尿病甲状腺機能抗進症、肝不全等の診断の指標として有用である。更にクレアチニン尿毒症慢性肝炎急性腎炎巨人症強直性筋異栄養症等を診断するのに非常に有用である。

アンモニアの定量は電極法比色法酵素法UV法)等に分類することができる。この中で酵素法は除蛋白を必要とせず、微量の試料でアンモニアだけを特異的に定量する方法であり、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法が主流である。(Clin. Chim. Acta., 39, 472 (1972)) 。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの反応には、NADHまたはNADPHが必要であり、340nmにおけるNAD(P)Hの吸光度の減少を測定してアンモニア量を求める。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは酵素由来によりNADHに特異的な酵素、NADPHに特異的な酵素、NADHおよびNADPHを利用する酵素に分けられる。

尿素態窒素測定またはクレアチニン測定において、UV法は正確さ、安価な点で好まれている。一般に、尿素態窒素測定法ウレアーゼを添加することより、クレアチニン測定法はクレアチニンデイミナーゼを添加することにより、アンモニアを生成させ、次いでグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法に連結させている。(臨床化学第8巻第1号 93頁 (1979)および検査と技術 vol.19 No.12,P.1019 (1991))。

概要

活性化剤および安定化剤として必要であったADPを必要としない、安定性に優れたアンモニア測定用試薬組成物を提供する。

ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有すること特徴とするアンモニア測定用試薬組成物および該試薬組成物を使用して試料中のアンモニアを測定する方法ならびに該試薬組成物中にさらにウレアーゼまたはクレアチニンデイミナーゼを添加して試薬組成物ならびに該試薬組成物を使用する尿素態窒素またはクレアチニンの測定方法

高価なNADを必要としない安定性に優れた試薬組成物が得られる。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

試料ADPによる活性化を受けず、かつNAD依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼα−ケトグルタル酸またはその塩およびNADHを反応させ、消費されるNADH量を測定することを特徴とする試料中のアンモニアを測定する方法。

請求項2

ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、シュードモナス属に属する菌株によって生産される酵素であることを特徴とする請求項1記載の試料中のアンモニアを測定する方法。

請求項3

ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有すること特徴とするアンモニア測定用試薬組成物

請求項4

試料にウレアーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびNADHを反応させ、消費されるNADH量を測定することを特徴とする試料中の尿素態窒素を測定する方法。

請求項5

ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、シュードモナス属に属する菌株によって生産される酵素であることを特徴とする請求項4記載の試料中の尿素態窒素を測定する方法。

請求項6

ウレアーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有することを特徴とする尿素態窒素測定用試薬組成物。

請求項7

試料にクレアチニンデイミナーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびNADHを反応させ、消費されるNADH量を測定することを特徴とする試料中のクレアチニンを測定する方法。

請求項8

ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、シュードモナス属に属する菌株によって生産される酵素であることを特徴とする請求項7記載の試料中のクレアチニンを測定する方法。

請求項9

クレアチニンデイミナーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有することを特徴とするクレアチニン測定用試薬組成物。

技術分野

0001

本発明は試料中のアンモニア測定法ならびにその測定用試薬組成物、および試料中の成分、例えば尿素態窒素クレアチニンなどに由来するアンモニアを測定することにより、試料中の該成分を測定する方法ならびにその測定用試薬組成物に関するものである。

背景技術

0002

アンモニア、特に血中アンモニアの測定は肝障害診断指標として必須である。また尿素態窒素量は蛋白摂取量、蛋白代謝機能腎機能などの状態を知る上で重要であり、腎不全浮腫閉塞性尿路疾患糖尿病甲状腺機能抗進症、肝不全等の診断の指標として有用である。更にクレアチニンは尿毒症慢性肝炎急性腎炎巨人症強直性筋異栄養症等を診断するのに非常に有用である。

0003

アンモニアの定量は電極法比色法酵素法UV法)等に分類することができる。この中で酵素法は除蛋白を必要とせず、微量の試料でアンモニアだけを特異的に定量する方法であり、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法が主流である。(Clin. Chim. Acta., 39, 472 (1972)) 。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの反応には、NADHまたはNADPHが必要であり、340nmにおけるNAD(P)Hの吸光度の減少を測定してアンモニア量を求める。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは酵素の由来によりNADHに特異的な酵素、NADPHに特異的な酵素、NADHおよびNADPHを利用する酵素に分けられる。

0004

尿素態窒素測定またはクレアチニン測定において、UV法は正確さ、安価な点で好まれている。一般に、尿素態窒素測定法ウレアーゼを添加することより、クレアチニン測定法はクレアチニンデイミナーゼを添加することにより、アンモニアを生成させ、次いでグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法に連結させている。(臨床化学第8巻第1号 93頁 (1979)および検査と技術 vol.19 No.12,P.1019 (1991))。

0005

従来、汎用されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼとしては、肝臓由来の酵素があり、NADHおよびNADPHの両方利用できる。しかしながら該酵素には活性化剤としてADPが必要であり、該酵素を含むアンモニア測定試薬には活性化剤および安定化剤としてADPが必要であることは広く知られている通りである。一方、ADPを必要としないグルタミン酸デヒドロゲナーゼも知られており、これらはプロテウス属の細菌や酵母より得られる。またこれらはNADPHに特異的であることより試料中の酵素類の影響を受けにくいとされている。しかしながらNADPHはNADHと比較して高価であり、また安定性も良くないことより、近年普及している液状試薬中では保存安定性に欠ける等の欠点があった。

0006

本発明者らは正確さに優れ、また保存安定性に優れたアンモニア測定用試薬を安価に作製するために鋭意研究を重ねた結果、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いることを見い出し、本発明に到達した。

0007

すなわち本発明は試料にADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびNADHを反応させ、消費されるNADH量を測定することを特徴とする試料中のアンモニアを測定する方法である。

0008

また本発明はADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有すること特徴とするアンモニア測定用試薬組成物である。

0009

本発明は試料にウレアーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびNADHを反応させ、消費されるNADH量を測定することを特徴とする試料中の尿素態窒素を測定する方法である。

0010

また本発明はウレアーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有することを特徴とする尿素態窒素測定用試薬組成物である。

0011

本発明は試料にクレアチニンデイミナーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびNADHを反応させ、消費されるNADH量を測定することを特徴とする試料中のクレアチニンを測定する方法である。

0012

また本発明はクレアチニンデイミナーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有することを特徴とするクレアチニン測定用試薬組成物である。

0013

本発明は以下の反応を利用する。

0014

0015

本発明に使用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼはADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性である酵素であれば、いずれの起源のものを用いても良い。好適なものとしてはシュードモナス(Pseudomonas)属のグルタミン酸デヒドロゲナーゼがある。例えばシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)433ー3(FERM−14092)由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼが例示される(特願平6−19448号)。該酵素の理化学的性質は以下の通りである。
(1)次の反応を触媒する

0016

また本発明のアンモニア測定用試薬組成物中、各成分の好ましい量はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ約0.5〜100U/ml、α−ケトグルタル酸1〜50mM、NADH0.1〜1mMである。

0017

試料中のアンモンアは、該試料に上記グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸、NADHを含む試薬組成物を作用させ、消費されるNADHの吸光度を測定することにより測定する。

0018

本発明の試料中の尿素態窒素の測定法は、試料にウレアーゼを作用させ、生成するアンモニアに上記グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸、NADHを作用させ、消費されるNADHを測定する。

0019

本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物は、ウレアーゼ、ADPによる活性化を受けず、かつNADH依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびNADHを含有する。

0020

本発明に使用するウレアーゼとしては、ナタマメ起源の酵素が一般的であり、市販されている。

0021

本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物中、各成分の好ましい量はウレアーゼ約1〜30U/ml、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ約0.5〜100U/ml、α−ケトグルタル酸1〜50mM、NADH0.1〜1mMである。

0022

また本発明のクレアチニン定量法は、試料にクレアチニンデイミナーゼを作用させ、生成するアンモニアにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸、NADHを作用させ、消費されるNADHを測定する。

0023

本発明に使用するクレアチニンデイミナーゼとしては、バチルス属コリネバクテリウム属微生物より生産されるものがある。

0024

本発明のクレアチニン測定用試薬中、各成分の好ましい量はクレアチニンデイミナーゼ約0.5〜10U/ml、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ約0.5〜100U/ml、α−ケトグルタル酸1〜50mM,NADH0.1〜1mMである。

0025

本発明のアンモニア測定用試薬組成物または尿素態窒素測定用試薬組成物またはクレアチニン測定用試薬組成物は、通常、pH約7〜10の緩衝液とともに使用する。例えばトリス塩酸緩衝液トリエタノールアミン塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。

0026

本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物およびクレアチニン測定用試薬組成物には必要によりアンモニア消去用試薬を添加しても良い。このような試薬としてイソクエン酸イソクエン酸デヒドロゲナーゼまたATPグルタミン酸グルタミン酸合成酵素等が挙げられる。更に本発明の試薬組成物には酵素反応を円滑に行わせるために他の化合物を添加しても良い。このような化合物として例えば安定化剤、界面活性化剤賦形剤等が挙げられる。

0027

NADHの測定は、通常、340nmの波長吸光度測定で行うが、副波長を用いても良い。更には340nmを含む2波長で測定しても良い。アンモニア測定、尿素態窒素およびクレアチニン測定ともに、エンド法およびレート法のいずれかで行われる。本発明のアニニア測定法は、生体試料中の尿素態窒素またはクレアチニンに限らず、他の成分に由来するアンモニアを測定する方法も包含する。

発明の効果

0028

本発明の試薬組成物は従来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼが必要であったADPを必要とせず、しかも高価なNADをも必要としない。しかも長期保存安定性に優れたアンモニア測定用試薬組成物、尿素態窒素測定用試薬組成物およびクレアチニン測定用試薬組成物が得られる。液状化試薬が広まりつつある現在、このように液状で安定な試薬は非常に有用である。

0029

以下、実施例および比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例1
下記組成を有する試液を調製した。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Pseudomonas sp.433-3) 0.3U/ml
ウレアーゼ(東洋紡製) 10U/l
α−ケトグルタル酸10mmol/l
NADH 0.3mmol/l
トリトンX−100 0.1%
トリス塩酸緩衝液50mmol/l、pH8.5
上記試液3mlを37℃、5分間予備加温後、尿素態窒素100mg/dlを10系列希釈した試料を0.05ml添加し、37℃で3分間反応させ340nmにおける1分間あたりの吸光度の減少を測定した。その結果は図1に示す通りであり、尿素態窒素100mg/dlまで直線性を有していた。

0030

実施例2
実施例1の組成の試液を25℃、1週間保存して10系列に希釈した試料を測定した。その結果は図2に示す通りであり、25℃、1週間保存後も尿素態窒素100mg/dlまで直線性を有していた。

0031

実施例3
下記組成を有する試液を調製した。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Pseudomonas sp.433-3由来) 20U/ml
クレアチニンデイミナーゼ(東洋紡製) 10U/ml
α−ケトグルタル酸12mmol/l
NADH 0.4mmol/l
トリス塩酸緩衝液50mmol/l、pH8.3
上記試液3mlを30℃、5分間予備加温後、クレアチン50mg/dlを10系列に希釈した試料を0.1ml添加し、30℃で反応させ、3分後の340nmにおける吸光度より1分後の340nmにおける吸光度を減少した値を求めた。その結果は図3に示す通りであって、クレアチニン50mg/dlまで比例関係成立した。

0032

比較例1
下記組成を有する試液を調製した。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(牛肝臓由来) 0.3U/ml
ウレアーゼ(東洋紡製) 10U/l
α−ケトグルタル酸10mmol/l
NADH 0.3mmol/l
トリトンX−100 0.1%
トリス塩酸緩衝液50mmol/l、pH8.5
上記試液3mlを37℃、5分間予備加温後、尿素態窒素100mg/dlを10系列に希釈した試料を0.05ml添加し、37℃で3分間反応させ340nmにおける1分間あたりの吸光度の減少を測定した。その結果は図4に示す通りであり、尿素態窒素100mg/dlまで直線性を有していた。

0033

上記の組成の試液を25℃、1週間保存して10系列に希釈した試料を測定した。その結果は図5に示す通りであり、25℃、1週間保存後の直線性は尿素態窒素60mg/dlまでであり、牛肝臓由来の酵素はADPなしでは不安定であるためそれ以上で定量性を有さなかった。

図面の簡単な説明

0034

図1本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物を使用した尿素態窒素希釈直線性を表すグラフである。
図2本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物を25℃で1週間保存後に、尿素態窒素希釈直線性を調べたグラフである。
図3本発明のクレアチニン測定用試薬組成物を使用したクレアチニン希釈直線性を表すグラフである。
図4比較例1の尿素態窒素測定用試薬組成物を使用した尿素態窒素希釈直線性を表すグラフである。
図5比較例1の尿素態窒素測定用試薬組成物を25℃で1週間保存後に、尿素態窒素希釈直線性を調べたグラフである。

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