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構成

昆虫特異毒素であるアンドクトヌス・オーストラリス昆虫毒素(AaIT)を暗号化するコドン最適化DNA配列構成体

効果

コドン最適化配列が挿入された昆虫ウイルスを摂取する感受性昆虫はAaIT遺伝子が欠けている野生型の昆虫ウイルスより早い時期に毒素−誘発性麻痺のために植物上で食べることを止めるので、昆虫被害から植物を保護するのに有用である。

概要

背景

概要

昆虫特異毒素であるアンドクトヌス・オーストラリス昆虫毒素(AaIT)を暗号化するコドン最適化DNA配列構成体

コドン最適化配列が挿入された昆虫ウイルスを摂取する感受性昆虫はAaIT遺伝子が欠けている野生型の昆虫ウイルスより早い時期に毒素−誘発性麻痺のために植物上で食べることを止めるので、昆虫被害から植物を保護するのに有用である。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

配列が配列同定番号3に記載されているものである、分離されたアンドクトヌス・オーストラリス(Androctonus australia)昆虫毒素(AaIT)を暗号化するコドン最適化核酸配列。

請求項2

請求項1に記載の核酸配列を含有する発現ベクター

請求項3

バキュロウイルス伝達ベクター中に挿入されている請求項1に記載の核酸配列を含んでなる発現ベクター。

請求項4

請求項1に記載の核酸配列で形質転換された宿主細胞

請求項5

宿主細胞を請求項1に記載の核酸配列で形質転換させるかまたは宿主細胞に該配列を感染させ、そして宿主細胞により該核酸配列の発現を可能にさせる条件下で宿主細胞を培養することを特徴とするAaITの製造方法。

請求項6

配列同定番号:3のコドン最適化核酸配列を含有する昆虫ウイルスを植物に投与することを特徴とする植物を昆虫による被害から保護する方法。

技術分野

0001

本発明は、昆虫−特異毒素AaITを暗号化する(eneording)コドン最適化DNA配列、該毒素の発現、および該毒素を暗号化する昆虫ウイルス生体内毒性の証明に関するものである。

背景技術

0002

下記の略語を本明細書中で使用する:
A.cal. −オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)
AcMNPV− オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病(nuclear polyhedrosis)ウイルス
AaIT −アンドクトヌス・オーストラリス(Androctonus australis)昆虫毒素
bp −塩基対
CPU −収縮性麻痺単位
CV細胞外ウイルス
GV −グラニュローシス(granulosis)ウイルス
kD −キロダルトン
LT致死時間
MOI感染多重度
NPV −核多角体病ウイルス
OB −吸蔵体
Occ− −吸蔵陰性ウイルス(類)
Occ+ − 吸蔵陽性ウイルス(類)
PCRポリメラーゼ鎖反応
PDV −多面体誘導ウイルス
PFUプラーク形成単位
p.i. − 感染後
PIB −多面封入体(polyhedron inclusion body)(OBとしても知られている)
ST −生存時間
バキュロヴィリデ(Baculoviridae)として知られている科のDNA昆虫ウイルスには、核多角体病ウイルス(NPV)およびグラニュローシスウイルス(GV)が包含される。これらのウイルスはそれらの寿命サイクルにおいて吸蔵体(OB)を製造する。また、それらの寿命サイクルにおいてOBを製造しない非吸蔵ウイルス(NOV)も包含される。他の科のDNA昆虫ウイルスは、エントモポックスウイルスである。

0003

他の400種のバキュロウイルス無脊椎動物中に存在していることが同定されている。NPVには、リマントリア・ジスパル(Lymantria dispar)NPV(ジプシーモスNPV)、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)MNPV、シングラファ・ファルシフェラ(Syngrapha falcifera)NPV(セロリルーパーNPV)、スポドプテラリッツラリス(Spodoptera litturalis)NPV、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)NPV、ヘリオシス・アルミゲラ(Heliothis armigera)NPV、マメストラ・ブラシケ(Mamestra brassicae)NPV、コリストネウラ・フミフェラナ(Choristoneura fumiferana)NPV、トリプルシア・ニ(Trichoplusia ni)NPVおよびヘリコヴェルパ・ゼア(Helicoverpa zea)NPVなどが包含される。GVの例には、シディア・ポモネラ(Cydia pomonella)GV(コドリング・モスGV)、ピエリス・ブラシケ(Pieris brassicae)GV、トリコプルシア・ニGVなどが包含される。NOVの例は、オルシテス・リノセロス(Orcytes rhinoceros)NOVおよびヘリオシス・ゼア(Heliothis zea)NOVである。エントモポックスウイルスの例には、メロロンサ・メロノサ(Melolontha melnotha)EPV、アンサクタ・ムーレイ(Amsacta moorei)EPV、ロクスタ・ミグラトリア(Locusta migratoria)EPV、メラノプルス・サングイニペス(Melanoplus sanguinipes)EPV、シストセルサ・グレガリア(Schistocerca gregaria)EPV、エーデス・エジプチ(Aedes aegypti)EPVおよびキロノムス・ルリジュス(Chironomus luridus)EPVなどが包含される。

0004

バイオ昆虫剤(bioinsecticides)としてのバキュロウイルスおよびエントモポックスウイルスの使用は非常に将来性がある。農業におけるそれらの広範囲の用途に関する主な障害は、昆虫の初期感染と昆虫の死亡の間の時間的な遅れである。この遅れは2、3日間〜5、6週間の範囲である。この遅れの間に、昆虫は食べ続けて、植物にさらに被害を与える。ウイルスゲノム中に異種遺伝子を挿入して例えば毒素の如き昆虫調節または修飾物質を発現させることによりこの欠点を克服しようとする多くの研究が試みられている(文献目録番号1、2、3)。AcMNPVにより例示されるバキュロウイルスの寿命サイクルは二段階を含む。寿命サイクルの各段階は特異形態のウイルス、すなわち吸蔵されていない細胞外ウイルス粒子および吸蔵されているウイルス粒子(OB)により代表される(4、5)。細胞外および吸蔵ウイルス形態は同一ゲノムを有するが、異なる生物的性質を示す。これらの二形態のウイルスのそれぞれの成熟ウイルス遺伝子オーバーラップセットにより指定され、それらの一部はそれぞれの形態に関して非反復性である。

0005

それの自然に起きる昆虫感染形態では、多重ウイルス粒子が吸蔵体(OB)として知られている準結晶性蛋白質マトリックスの中に埋められていることが見いだされており、該吸蔵体は多面封入体(PIB)とも称される。蛋白質様ウイルス吸蔵体は多面体(polyhedra、複数形)と称される(多面体(polyhedon)は単数語である)。29kDの分子量を有するポリヘドリン蛋白質は、ウイルス吸蔵体の主要なウイルス−暗号化された構造蛋白質である(4、6)。(同様に、GVはポリヘドリンよりむしろ主としてグラヌリンからなるOBを製造する)。

0006

ウイルス吸蔵体は天然バキュロウイルス寿命サイクルの重要部分であり、感受性昆虫種の中での水平的(昆虫から昆虫)伝播手段を供するものである。該環境中では、感受性昆虫(一般的には幼虫段階)は例えば植物の如き汚染食料源からウイルス吸蔵体を摂取する。結晶性吸蔵体が感受性昆虫の腸の中で解離して感染性ウイルス粒子を放出する。これらの多面体誘導ウイルス(PDV)は中腸組織細胞中侵入しそして複製する(4)。

0007

ウイルス粒子はエンドサイトーシスまたは融合により細胞内に入り、そしてウイルスDNAは核孔のところまたは核中では被覆されていない。ウイルスDNA複製は6時間以内に検出される。感染後(p.i.)10−12時間までに、細胞の表面からの細胞外ウイルス(ECV)の分芽により二次感染が他の昆虫組織に拡散する。ウイルスのECV形態は個々の感染された昆虫内でのウイルスの細胞から細胞への拡散並びに細胞培養中の伝播感染の原因となる。

0008

感染サイクルの後半(感染後12時間)に、ポリヘドリン蛋白質を感染細胞から検出できる。ポリヘドリン蛋白質が感染細胞の核の中で組み立てられるのは感染後18−24時間以後であり、そしてウイルス粒子は蛋白質様吸蔵体の中に埋められる。ウイルス吸蔵体は細胞が溶解するにつれて4−5日間で多数になる。これらの多面体は幼虫内の感染拡散では活性役割を有していない。血リンパ中のECVは増加しそして拡散して、幼虫の死をもたらす(4、5、6)。

0009

感染した幼虫が死んだ時には、数百万の多面体が衰退している組織の中に残存しているがECVは分解されている。他の幼虫を例えば汚染された植物または他の食料物質の摂取により多面体に呈する時には、サイクルが繰り返される(4)。

0010

まとめると、吸蔵された形態のウイルスは腸による昆虫の初期感染並びにウイルスの環境安定性の原因となる。PDVは注射により投与される時には本質的に感染性ではないが、経口的投与では高感染性である。非−吸蔵形態のウイルス(すなわちECV)は二次感染および細胞から細胞への感染の原因となる。ECVは培養中の細胞または注射による内部昆虫組織に対しては高感染性であるが、経口的投与によると本質的に感染性でない。

0011

昆虫に対して毒性である異種蛋白質を発現する組み換えバキュロウイルスの使用は、これらのウイルスが脊椎動物や植物に対して病原性でないという事実のために、促進される。さらに、バキュロウイルスは一般的に狭い宿主範囲を有する。多くの菌株が1種または2、3種の昆虫種に限定される。

0012

オートグラファ・カリフォルニカ核多面分解ウイルス(AcMNPV)は、バキュロヴィリデ科のプロトタイプウイルスである。AcMNPVウイルスは最初は、一般的にはアルファルファ・ルーパーとして知られている鱗翅目ノクチュード(lepidopteran noctuid)(それの成長段階では夜行性蛾である)であるオートグラファ・カリフォルニカ(A.cal.)から分離された。このウイルスは、鱗翅目(Lepidoptera)昆虫目の中の12種類の科およびに30種類以上の種に感染する(7)。この目以外の種には増殖感染することは知られていない。最も広く研究されているバキュロウイルスはAcMNPVである。このウイルスは高級真核細胞中で起きる多くの蛋白質成熟および移送システムを利用している。

0013

本発明では、昆虫特異毒素を暗号化する遺伝子をウイルスゲノム中の適当な位置に挿入する。AcMNPV中に挿入される異種遺伝子は感染昆虫細胞中で生物学的に活性な蛋白質を製造する。これらの蛋白質は、ほとんどの部分に関して、移植後処理を受けて、真性蛋白質のものと同一でないとしても非常に似ている組み換え生成物分泌する。このようにして発現された毒素はウイルスのバイオ殺昆虫剤効果を増加させる。

0014

そのような毒素の1種はAaITであり、それはフリカサソリであるアンドロクトヌス・オーストラリス・ヘクターの毒により製造される。この毒素は70個のアミノ酸長さであり、そして昆虫内のナトリウム経路と結合しそして昆虫幼虫中でナノグラムないしマイクログラム範囲において収縮性麻痺を引き起こす。AaITは哺乳動物のナトリウム経路とは結合しないため、AaITはバイオ殺昆虫剤としての使用の候補となり、人間により摂取される作物を保護する。

0015

AaIT遺伝子の暗号化領域上流領域は、細胞からのAaITの分泌を指示するシグナル配列を含んでいる。特に、該シグナル配列は細胞表面への分泌経路中で毒素を指示し、該表面でそれが細胞から分泌される。移送中に、酵素がシグナル配列を分割させて成熟AaITを残す。

0016

感染宿主中で異種毒素を発現する遺伝子的に処理された組み換え昆虫ウイルスに対する要望が引き続いて存在している。これらの組み換えウイルスによる感染は野生型ウイルスと比べた時に殺害速度を増加させる。

発明の要旨

0017

本発明は、昆虫特異毒素であるAaITを暗号化するコドン最適化DNA配列の構成体(construction)を提供するものである。コドン最適化配列を次に例えばバキュロウイルスAcMNPVの如き昆虫ウイルス中に挿入する。

0018

バキュロウイルスは特異的な感受性昆虫目標種に感染して、昆虫の幼虫段階で昆虫を事実上死亡させる。サソリにより製造される毒素であるAaITも感受性昆虫目標種に関して特異的であり(しかし脊椎動物ではそうでない)、そして昆虫の麻痺を引き起こして最終的には死亡させる。

0019

AaITを暗号化する遺伝子のバキュロウイルス中への挿入が、毒素の発現をもたらす。そのような修飾されたバキュロウイルスを摂取する感受性昆虫は、AaIT遺伝子が欠けている野生型バキュロウイルスを摂取する昆虫より早い時期に毒素誘発性麻痺のために植物上で食べるのを止めるであろう。時間の短縮が大きくなればなるほど、幼虫が食べる期間が短くなるため、作物被害が大きく減じられる。従って、本発明は植物に(噴霧または他の投与手段により)AaITを製造するためのこのコドン最適化核酸配列を加える発現ベクターを投与することにより昆虫被害から植物を保護する方法を提供する。

0020

遺伝子暗号の縮重により、先天的DNA配列により暗号化されたポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造しながら、核ペプチド配列を変動させることができる。

0021

種アミノ酸類に関する個々の同義コドン頻度真核生物および原核生物の中でゲノム毎に広く変動する。コドン選択パターンにおけるこれらの差はペプチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝子の全体的な発現水準によるようである。

0022

本発明は、バキュロウイルス発現システム中で使用するためのAaIT遺伝子の設計を含んでいる。この合成遺伝子に好適なコドン使用頻度組み換え蛋白質発現用に使用する細胞/有機体のゲノムから誘導される遺伝子のコドン使用に反映させるということが最初に試みられた。しかしながら、DNA配列情報は少数の遺伝子からしか入手できなかったため、信頼性のあるコドン使用表を作成するための鱗翅目遺伝子配列および昆虫ウイルス遺伝子配列の両者の適当な代表は本発明の時点では入手できなかった。

0023

従って、コドン使用表は充分な数(少なくとも10)の既知の遺伝子配列を有するドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)から得られている。これらのコドン使用表を使用してAaITを暗号化するコドン最適化遺伝子を設計する。この方法により、制限酵素認識部位の保存または破壊希望による)も可能となる。AaITのそれぞれのアミノ酸に関するコドン使用頻度はドロソフィラ・メラノガスター・コドン使用表中の頻度を反映している。

0024

本発明のAaITを暗号化するコドン最適化遺伝子は配列同定番号:3に示されている210のヌクレオチドの配列を有する。この配列は210のヌクレオチドの中の58で野生型(先天的)AaIT遺伝子配列(配列同定番号:1)のものと異なる(図1参照)。

0025

本発明は、昆虫−特異毒素であるAaITを暗号化するコドン最適化DNA配列の構成体を提供するものである。この分離された核酸配列を次に、毒素を内部で製造しようとする宿主細胞または有機体に適している発現ベクター中に挿入する。この毒素は先天的AaITと同じアミノ酸配列を有する。DNA配列は発現ベクター中に直接挿入することもでき、または伝達ベクターを用いて挿入することもできる。

0026

昆虫ウイルス中へのAaIT暗号化遺伝子の挿入は毒素の発現をもたらし、それはウイルスが幼虫を無能力化および死亡させるのに必要な時間の短縮に寄与する。そのような修飾された昆虫ウイルスを摂取する感受性昆虫は、AaITが欠けている野生型昆虫ウイルスを摂取する昆虫より早い時期に、植物上で食べることを止めるであろう。時間の短縮が大きくなればなるほど、幼虫の食べる期間が短縮されるため、作物被害が大きく減じられる。

0027

先天的DNA配列により暗号化されるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを依然として製造しながら、遺伝子暗号の縮重によりヌクレオチド配列の変動が可能になる。コドン最適化として知られている工程は、そのような変更されたDNA配列を設計する手段を含む工程である。

0028

コドン最適化遺伝子の設計に際しては、有機体中でのコドン使用の頻度、最も近い隣接頻度、DNA安定性、二次構成体生成能力合成方式および遺伝子の意図するその後のDNA操作などを含む種々の因子考慮すべきである。

0029

遺伝子暗号の縮重により、同じアミノ酸配列を多種の方法で暗号化しそして翻訳することができる。例えば、ロイシンセリンおよびアルギニンは6種のコドンによりそれぞれ暗号化されるが、バリンプロリンスレオニンアラニンおよびグリシンは4種のコドンによりそれぞれ暗号化される。

0030

しかしながら、そのような同義コドンの使用頻度は真核生物および原核生物の中ではゲノム毎に広く変動する。例えば、哺乳動物の中では同義コドン−選択パターンは非常に似ているが、例えば酵母(S.セレヴィシエ(S. cereisiae)、バクテリア(例えば大腸菌(E. coli))および昆虫類(例えばD.メラノガスター(D. meranogaster))の如き進化的に特徴のある有機体は明らかに異なるゲノムコドン使用頻度を示す(8−13)。

0031

コドン選択パターンにおけるこれらの差は、ペプチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝子の全体的な発現水準に寄与するようである。二系統実験証拠がこの議論を支持する。第一に、ポリペプチド合成速度は翻訳しようとするコドンの性質並びに伝達RNA(「tRNA」)三重複合体生成用の初期運動に依存する(13−18)。第二に、細胞の伝達RNA分布メッセンジャーRNA(「mRNA」)プールの同種コドン頻度に従う傾向がある(18−21)。

0032

これらの理由のために、コドン頻度が同種細胞tRNA頻度を反映する昆虫ウイルス発現システムを意図する遺伝子を設計することが望ましく且つ有用である。これは特に、1個のmRNA種が細胞翻訳能力の半分にわたり使用されるようなポリヘドリンプロモーターを用いるバキュロウイルス発現システムのような発現システム用に望ましい。従って、組み換え蛋白質を高水準で発現する時にはコドン頻度は真に同種細胞tRNA頻度を反映するはずである。

0033

合成遺伝子用の好適なコドン使用頻度は組み換え蛋白質発現用に使用する細胞/有機体のゲノムそのもの(またはできるだけ関連性のあるもの)から誘導される遺伝子のコドン使用に反映するはずである。

0034

本発明では、初期実験用の信頼性のあるコドン使用表を作成するための鱗翅目遺伝子配列および昆虫ウイルス遺伝子配列の両者の適当な代表は利用できなかった。

0035

例えば、AaIT遺伝子の設計用には、本発明の時点では二種だけの特異化された蛋白質、すなわちAcMNPVポリヘドリンおよびAcMNPVp10、からのDNA配列情報しかなかった(22、23)。イケムラ(Ikemura)他は、信頼性のあるコドン選択パターンには異なる機能を有する10種以上の遺伝子から得られるコドン頻度の集積が必要であると注意している(10、24)。このコドン最適化配列はAcMNPVにより感染されたものだけでなく種々の昆虫類において発現させる意図を有する。従って、まず重要なことはコドン最適化が種々の昆虫細胞中のtRNAプール分布と相容性であることである。

0036

この理由のために、充分な数の既知遺伝子配列を有する昆虫種が選択される。ドロソフィラ・メラノガスターは合計20,451のコドンの中の44の核遺伝子から誘導されるコドン使用表を有する(11)。これらのコドン使用表を使用してシグナル配列および本発明のAaIT毒素配列を暗号化するコドン最適化遺伝子を設計する。

0037

全長シグナル配列用の遺伝子をコドン最適化AaIT毒素ペプチド配列と融合させる。以下で詳細に論じられている如く、シグナル配列はAaITシグナル配列であってもまたは異種シグナル配列を暗号化する先天的なもしくはコドン最適化ヌクレオチド配列であってもよい。

0038

これらのアミノ酸配列は全ての可能なヌクレオチド縮重(最大のあいまいさ)を示すDNA配列中に逆翻訳される。(コドン縮重理由のために)確定的なおよび可能性のある制限酵素認識部位のリストが作成される。遺伝子合成並びに追加的DNA操作にとって重要な制限酵素部位が選択されそして保存される。最適化遺伝子の設計中にコドンに付与される重要な一利点は、制限酵素部位を当技術の専門家都合よく容易に保存または破壊することができて、遺伝子構成および操作を促進させることである。

0039

AaITおよびそれぞれのシグナル配列中で生ずるそれぞれのアミノ酸を多数回記録するリストを作成する。コドンは、ドロソフィラ・メラノガスター・コドン使用の相対的頻度を反映する配列中に存在するアミノ酸残基の数を基にして、割り当てられる。(11)
例えば、ドロソフィラ・メラノガスター中のシステイン・コドン頻度は配列TGCに関しては76%でありそして配列TGTに関しては24%である。ADKシグナル−AaIT遺伝子構造中には8個のシステイン残基がある(全てが成熟AaIT蛋白質を暗号化する遺伝子中にある(配列同定番号:3))。従って、6個のコドンはTGT(残基の75%)としてそして2個のコドンはTGT(残基の25%)として割り当てられる。この分布を基にして、次にそれぞれのシステイン・コドンが正確な明白な配列を割り当てられる。隣接しているイソコドンの変更に関しては注意が払われる。例えば、AaITペプチド中の2個の隣接しているシステイン残基(アミノ酸37および38)は、2個の同一コドン配列が続いて割り当てられるのを避けるために、配列TGT TGCと割り当てられる。

0040

この方法を全ての20個のアミノ酸および終止コドンに関して繰り返す(しかし、終止コドン配列TAAはこの工程では変更されない)。さらに、全ての重要な制限酵素部位は保存されそして望まれない部位は破壊されない。

0041

本発明のコドン最適化核酸配列は一般的技術を用いて合成および組み立てられる。下記の実施例2は、その後に結合されて完全な暗号配列を形成する一連合成オリゴヌクレオチド断片を使用するそのような一方法を記載する。

0042

本発明の完全なコドン最適化配列(配列同定番号:3)は、210のヌクレオチドの中の58で、AaITを暗号化する先天的cDNA配列(配列同定番号:1)と異なっている。しかしながら、先天的cDNAおよびコドン最適化cDNAにより製造されるAaITは同一のアミノ酸配列を有する。希望により、AaIT用のシグナル配列も上記と同じ工程によりコドン最適化することもできる。コドン最適化核酸配列を含有する合成遺伝子が構成される時に、該遺伝子を例えば1種以上の適当な制限酵素を用いる消化後のベクター中でのクローニングの如き一般的技術により適当な発現ベクター中に挿入する。スミス(Smith)およびサマーズ(Summers)の米国特許4,745,051(6)はバキュロウイルス発現ベクターの構造を記載しており、それらは別の遺伝子用の暗号配列がウイルス性ポリヘドリン遺伝子の代わりにバキュロウイルスプロモーターの後方に挿入されている。ポリヘドリン遺伝子は細胞間の生産的なウイルス感染に関して必須ではない。

0043

伝達ベクターは別の遺伝子をウイルスゲノム中に伝達するための手段として使用される。伝達ベクターは一般的には、同種組換えによるウイルスゲノム中への別の遺伝子の挿入を促進させるのに充分なウイルス配列を含有しているバクテリア性プラスミドである。

0044

培養された細胞中での組み換えバキュロウイルスの構成方法はM.D.サマーズおよびG.E.スミスのバキュロウイルスベクター方法および昆虫細胞培養工程のためのマニュアル(A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and InsectCell Culture Procedures)、テキサス農業実験場会報番号1555(1987)(25)中に示されている。好適な細胞系はSf9細胞系(ATCC受け入れ番号GRL1711)であり、それらはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodopterafrugiperda)21(Sf21)と指定された細胞系の誘導体である。望ましい昆虫ウイルスの増殖用に適する他の昆虫細胞系には、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)(TN368)、シルクウォームであるボンビックス・モリ(Bombyx mori)(BM)およびヘリヴェコヴェルパ・ゼア(Helicoverpa zea)(BCIRL−Hz−Aml、BCIRL−Hz−Am3)から誘導されるものが包含される。

0045

適当な昆虫ウイルスには、以上の本発明の背景中で挙げられているものが包含される。好適な昆虫ウイルスはバキュロウイルスAcMNPVである。E2と指定されているAcMNPVの特定菌株が実施例で使用されている。当技術の専門家は他のバキュロウイルス菌株も使用できることを認識するであろう。これらには、トリコプルシア・ニMNPV、ラキプルシア・オウ(Rachiplusia ou)MNPV、ガレリア・マロネラ(Galleria mallonell)MNPV、スポドプテラ・フルギペルダNPV、並びにプラーク−精製菌株、例えばスミス,G.E.およびサマーズ,M.D.、J. Virol.、33、311−319(1980)(26)中で分離および同定されているプラーク−精製菌株、例えばAcMNPVのM3、R9、S1およびS3菌株、並びにボンビックス・モリNPVが包含される。これもスミス,G.E.およびサマーズ,M.D.、J. Virol.、89、517−527(1978)(27)を参照のこと。

0046

上記の如く、昆虫ウイルスによるAaITの発現は幼虫を無能力にするのに必要な時間を短縮する。また、機能性毒素の成熟および分泌もシグナルペプチドにより促進される。

0047

蛋白質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後処理段階のためには、シグナル配列が必要である。無傷のシグナル配列が存在しているなら、発現するであろう蛋白質は粗面小胞体内腔中に入りそして次にゴルギ器官を通って分泌小胞に移送されそして最後に細胞外に移送される。一般的には、シグナル配列は開始コドンにすぐ続いており、そして分泌しようとする蛋白質のアミノ末端においてシグナルペプチドを暗号化する。ほとんどの場合、シグナル配列はシグナルペプチダーゼと称されている特異プロテアーゼにより分割される。好適なシグナル配列はウイルス発現ベクターを使用する組み換え蛋白質発現のプロセシングおよびエクスポート効率を改良する。適当な異種シグナル配列を使用する毒素の最適化発現により、野生型昆虫ウイルスより急速な死亡が得られる。

0048

サマーズの米国特許5,155,037(28)は、DNAベクター形質転換されたかまたはトランスフェクションされた鱗翅目昆虫細胞中の例えば脂肪運動ホルモンおよびクチクラの如き昆虫シグナル配列の使用を記載しており、そこでは該シグナルが昆虫細胞からの異種蛋白質の分泌を指示している。開示されている少数の別の蛋白質はCD4、インターロイキン−2およびベータインターフェロンである。これらの蛋白質の全ては哺乳動物の蛋白質であり、いずれも昆虫毒素ではない。米国特許5,155,037以前は、昆虫細胞中で別の蛋白質を分泌する唯一の方法は別の遺伝子の先天的シグナルペプチドを使用する方法であった。別の遺伝子は一般的には非−昆虫性であるため、それらのシグナルは昆虫細胞では劣悪認識性であるかもしれず、発現の最適でない水準をもたらす。シグナル配列は一般的には別の遺伝子の翻訳開始部位にすぐ続く(5′〜3′)DNA配列により暗号化される。細胞から分泌される蛋白質は疎水性N−末端信号ペプチドを含有している先駆分子として合成される。

0049

分泌シグナル配列は三領域、すなわち塩基性N−末端領域(n−領域)、中央の疎水性領域(h−領域)、およびさらに極性のC−末端領域(c−領域)、を含有する(29)。エクスポートが進行している時の成熟蛋白質シグナルからのシグナル配列の分割はn−およびh−領域中の構造に依存しているようであるが、分割部位(c−領域中)に関しては−3および−1位置が最も重要であると示唆されている(29)。−1位置における残基は小さくなくてはならない(アラニン、セリン、グリシン、システイン、スレオニンまたはグルタミン)が、−3位置における残基は芳香族フェニルアラニンヒスチジンチロシンもしくはトリプトファン)でなければならないか、荷電されていなければならないか(アスパラギングルタミン酸リシンもしくはアルギニン)、または大きく且つ極性でなければならず(アスパラギンもしくはグルタミン)、ここでプロリンは領域−3〜+1には存在しい。これらの要素のいくつかの例外許容される(29)。

0050

この−3、−1原則は哺乳動物システム中の分割部位の75−80%の予測値であるが(29)、昆虫システムでは確認されていない。

0051

サマーズの米国特許5,155,037(28)は、鱗翅目(マンジュカ・セクスタ(Manduca sexta))脂肪運動ホルモンシグナルペプチドを暗号化する配列を記載している。これは、昆虫におけるエネルギー基質運動および代謝を調節する遮断された神経ペプチド用の短いシグナルペプチド(19個のアミノ酸)である。該特許の図2Bはシグナルペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。

0052

該特許はまた、ドロソフィラ・メラノガスターのクチクラシグナルペプチドを暗号化する配列も記載している。該特許の図2Aは、クチクラ遺伝子CP1リーダーペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。ヌクレオチド配列は16個のアミノ酸シグナルペプチドを暗号化する。

0053

コドン最適化AaIT遺伝子と共に使用される異種シグナル配列を同定する研究で、異種シグナル配列を有する8種の構成体が出願人により製造された。これらのシグナル配列を暗号化するDNA配列は、シグナル配列を暗号化する先天的DNA配列またはこれらのシグナル配列を暗号化するコドン最適化DNA配列のいずれであってもよい。

0054

これらのシグナル配列を次にブルースクリプト・プラスミド(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)中で前記のコドン最適化AaIT遺伝子と組み合わせる。それぞれのそのような遺伝子をバキュロウイルス伝達ベクター中に挿入しそして培養細胞中での同種DNA組み換えによりAcMNPVゲノム中に移動させる(25)。異種シグナル配列は下記の如くである:インターロイキン−2、エステラーゼ−6、脂肪運動ホルモン、クチクラ、pBMHPC−12、漿膜アポリポフォリン、および性特異種。

0055

インターロイキン−2はヒトシナル配列(T−細胞成長ファクター用)であり、AaITと一緒のそれの使用はすでに記載されている(30)。脂肪運動ホルモンシグナル配列(神経ペプチド用)はマンジュカ・セクスタからのものでありそして−3、−1原則(29)に良く合致する。ボンビックス・モリからの漿膜シグナル配列(卵殻構造蛋白質用)およびドロスフィラ・メラノガスターのクチクラシグナル配列(骨格外蛋白質用)は両者とも大量のそれらの関連成熟蛋白質を分泌する。マンジュカ・セクスタからのアポリポフォリンシグナル配列(血漿脂質輸送蛋白質用)、ボンビックス・モリの性特異シグナル配列(主要成体血漿貯蔵蛋白質用)およびボンビックス・モリからのpBMHPC−12シグナル配列(30kD幼虫血漿リポ蛋白質用)は脂肪体細胞中で見いだされ且つそれぞれが血リンパ蛋白質を分泌するため、それらは全て選ばれる。最後に、エステラーゼ−6シグナル配列はドロスフィラ・メラノガスターからのセリンヒドロラーゼの分泌用に使用される。アポリポフォリン以外のこれらのシグナル配列のそれぞれは分割部位を予測する−3、−1原則(29)に従う。

0056

それぞれのシグナル配列を暗号化するcDNAはそれの先天的配列または上記の如くして製造されたコドン最適化配列のいずれを有することもできる。個々のコドン最適化シグナル配列は下記の実施例2に記されている如くして構成される。

0057

コドン最適化シグナル配列は先天的配列と下記の点で異なっている:pBMHPC−12 − 48個のヌクレオチドの中の7個(配列同定番号:5(コドン最適化)を配列同定番号:7(先天的)と比較すること);脂肪運動ホルモン− 57個のヌクレオチドの中の6個(配列同定番号:9(コドン最適化)を配列同定番号:11(先天的)と比較すること);アポリポフォリン−69個のヌクレオチドの中の14個(配列同定番号:13(コドン最適化)を配列同定番号:15(先天的)と比較すること);漿膜− 63個のヌクレオチドの中の10個(配列同定番号:17(コドン最適化)を配列同定番号:19(先天的)と比較すること)、クチクラ− 48個のヌクレオチドの中の6個(配列同定番号:21(コドン最適化)を配列同定番号:23(先天的)と比較すること);エステラーゼ−6 − 63個のヌクレオチドの中の15個(配列同定番号:25(コドン最適化)を配列同定番号:27(先天的)と比較すること);性−特異種 − 45個のヌクレオチドの中の15個(配列同定番号:29(コドン最適化)を配列同定番号:31(先天的)と比較すること)。しかしながら、異なる核酸配列により暗号化されるシグナル配列のアミノ酸類はコドン最適化および先天的配列の両者に関して同一である。

0058

AaITを暗号化するコドン最適化DNA配列と結合されそしてバキュロウイルス伝達ベクター中に挿入される異種クチクラシグナル配列を暗号化するコドン最適化DNA配列の一例は、pAC0055.1と表示される伝達ベクターである(下記の実施例1、2および4を参照のこと)。この伝達ベクターpAC0055.1を固定する大腸菌(E. coli)菌株HBの試料は出願人により米国20852、メリーランドロックヴィルパークレーンドライブ、12301のアメリカン・タイプ・カルチャーコレクション預託された。この預託された物質を使用して、当技術の専門家は該プラスミド中に含まれているクチクラ配列を異なるシグナル配列で置換することができる。

0059

特に、第一段階は下記の特徴を有する合成二重ストランドDNA断片を構成することである:(i)5′末端Bam HI−相容性付着末端、(ii)ATG開始コドンを暗号化する配列および新しいシグナルペプチドのアミノ酸配列、並びに(iii)コドン最適化AaIT遺伝子の頂部ストランド中の最初の19のヌクレオチドおよび底部ストランド中の最初の23のヌクレオチドを包含する配列。そのような断片の3′末端はSal I−相容性付着末端を含有する。この断片による対応するpAC0055.1のBam HI/Sal I断片の置換は、DNAリガーゼの存在下で下記の三断片を結合させることにより行われる:(1)上記のBam HI/Sal I合成断片、(2)コドン最適化AaIT毒素遺伝子中のコドン6−7におけるSal I部位から3′フランキングポリヘドリン遺伝子配列に伸びるSal I/Kpn I断片、および(3)pAC0055.1中に含まれる最大のKpn I/Bam HI断片。pVL985(31)から誘導されるこの断片はpUC8クローニングベクター並びにポリヘドリン遺伝子の5′および3′末端をフランキングするAcMNPVを含有する。当技術の専門家は、生ずる構成体がpAC0055.1とはシグナルペプチドの性質においてのみ異なるということを認識するであろう。

0060

コドン最適化遺伝子を含有する組み換えウイルスが製造された時に(上記の議論並びに下記の実施例1、2、4および5を参照のこと)、それらを試験してコドン最適化AaIT遺伝子の存在を確認する。コドン最適化遺伝子はバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子を置換するため、毒素遺伝子を有する組み換えウイルスは多面体を製造できずそしてそのようにして吸蔵−陰性プラークを製造できない。プラーク精製を用いてAaIT遺伝子を含有する組み換えウイルスをトランスフェクション上澄み液からサマーズおよびスミスの方法(25)の方法により分離する(実施例5参照)。

0061

次に、ウイルス感染細胞をAaIT遺伝子に特異的な放射標識付きDNAプローブハイブリッド形成する核酸に関するドットブロットハイブリッド形成法により検定する。放射活性は自動放射計により検出され、陽性結果はウイルス分離体中のAaIT遺伝子の存在を確認するものである(実施例6参照)。

0062

下記の実施例1、2、4および5に記載されているものと同様な方法を使用して、陰性AaIT遺伝子および先天的AaITシグナル配列を暗号化する先天的核酸配列を含有するバキュロウイルス伝達ベクターを構成し、そして次にそれから組み換えウイルスを製造する(下記の実施例3−5参照)。ポリメラーゼ鎖反応を使用して組み換えウイルスがAaIT遺伝子を含有する正確な寸法の挿入体を含有するように変える(下記の実施例7参照)。異種シグナル配列を有するコドン最適化AaIT遺伝子を含有する組み換えウイルスの生物学的活性に関する検定では、先天的AaIT遺伝子を含有する組み換えウイルスを陽性対照として使用する。

0063

コドン最適化ウイルスまたは先天的AaIT−ウイルスのいずれかが感染している昆虫細胞中のAaIT遺伝子の発現は、ウイルス−感染細胞から分離された合計細胞RNAのノザーン・ブロット分析により推定される(下記の実施例8参照)。分析は、感染後24時間に高水準のRNAを暗号化する毒素を示している(実施例8参照)。

0064

上記の如く、バキュロウイルスは広範囲の昆虫に感染するが、哺乳動物には無害である。試験された昆虫の全種類はAaITにより引き起こされる麻痺に対して感受性であるが、哺乳動物は毒素により悪影響を受けない。

0065

野生型バキュロウイルス、先天的AaIT遺伝子を含有しているウイルス、およびコドン最適化AaIT遺伝子を含有するウイルス(これはまた異種シグナル配列も含有しているかもしれない)の比較するための生物学的活性を昆虫幼虫を用いる二種の生体内試験、すなわち注射検定および飼育検定、により検査する。予備検定では、コドン最適化AaIT−ウイルス株の製造中に得られる培養媒体および細胞ペレット緩衝溶液中再懸濁されている)をムスカドメスチカ(Musca domestica)(一般的なイエハエ)幼虫に注射してこれらの試料が検出可能量の生物学的に活性なAaITを含有しているかどうかを測定する。

0066

幼虫を注射から5秒後に体節不随意収縮兆候に関して試験した。検定からの結果(下記の実施例9中の表を参照のこと)は、生物学的に活性なAaITが異種シグナル配列(エステラーゼ−6、脂肪運動ホルモンおよびクチクラ)を有する14のコドン最適化AaIT−ウイルス単離物の中の13が感染培養媒体中で検出されることを示している。IL2−AaIT−ウイルス構成体では、毒素遺伝子暗号化領域中の断片移動相互関係の存在のために陰性結果が予測される。細胞培養上澄み液のいずれにも検出可能なAaIT活性が欠けていることは、生物学的に活性な分泌された毒素の水準が約0.2μg/mlより少ないことを示している。

0067

投与量−応答注射検定は、コドン最適化AaIT遺伝子の挿入が目標昆虫種を死滅させるのに必要な時間を短縮することによりバキュロウイルスの性能を強化させることを示している。下記の実施例10および図5中に示されている如く、コドン最適化クチクラ−AaIT−AcMNPV構成体から製造されたおよびAaIT遺伝子なしでAcMNPVの野生型E2菌株から製造された発ウイルスを第4齢中の幼虫の別群に幼虫当たり102、103および104PFUの投与量で注射する。

0068

試験した投与量のそれぞれにおいて、クチクラ−AaIT−AcMNPVは野生型AcMNPVより早くそれの宿主を死亡させる。104PFUでは、野生型ウイルスに関するLT50は約97時間であるが、クチクラ−AaITAcMNPVに関する対応するLT50は67時間である。この結果は、AaIT遺伝子およびクチクラシグナル配列のAcMNPV中への挿入が生物学的に活性な毒素の発現により死亡速度を促進させることを示している。

0069

7種のコドン最適化異種シグナル−AaIT−AcMNPV構成体、陰性AaITシグナル−先天的AaIT遺伝子−AcMNPV構成体、およびAaIT遺伝子なしのAcMNPVの野生型E2菌株を用いて、それより成長した幼虫(初期第5齢)を使用して注射検定処方を繰り返した。104PFUの投与量をそれぞれの構成体の発芽ウイルスを幼虫の別群に注射する。

0070

下記の実施例11に記載されている如く、コドン最適化異種シグナル−AaIT−AcMNPV構成体のそれぞれ(並びに先天的AaITシグナル−先天的AaIT遺伝子−AcMNPV構成体)はそれの宿主を野生型AcMNPVより早く死亡させる。野生型ウイルスに関するLT50は約126時間であるが、7種のシグナル−AaIT−AcMNPV構成体に関する対応するLT50は約68−89時間の範囲でありそして先天的AaIT−AcMNPV構成体は約74時間のLT50を有する。これらの結果は、AaIT遺伝子および異種シグナル配列のAcMNPV中への挿入が生物学的に活性な毒素の発現により死亡速度を促進させるという実施例10の結果を確認するものである。

0071

ポリヘドリン製造の欠点であるこれらの組み換えウイルスの経口的毒性を試験するために、培養中に細胞に組み換えAaIT−ウイルスおよび野生型ヘルパーウイルス(例えばAcMNPVのE2菌株)と共に感染させることにより野生型および組み換えウイルス粒子の混合物を含有する多面体を製造する。この方法は、1個の多面体(吸蔵体)が数百のウイルス粒子を含有しているため、可能となる。

0072

従って、宿主細胞を種々の量の組み換えAaIT−ウイルス並びに野生型ウイルスと共に感染させる。生ずる感染細胞は野生型および組み換えウイルス粒子の混合物を含有する多面体を有する。下記の実施例12に示されている如く、野生型ウイルスのMOIが細胞当たり少なくとも2PFUである時には、組み換えウイルスのMOIが増加するにつれて、ウイルス吸蔵体を有する細胞の百分率および細胞当たりの多面体の平均数は相当減少する。従って、それぞれ3のMOIにおいて吸蔵−陰性組み換えウイルスおよび野生型ウイルスを用いる共−吸蔵研究が行われた。これにより多面体製造の許容可能水準において多面体中の組み換えウイルス粒子の有効な代表となり得る。

0073

最後に、希望する量のPIBを含有している昆虫飼料小滴を幼虫に供することにより経口的毒性検定を行う。野生型ウイルスを除いて、それぞれのPIBは野生型および組み換えウイルス粒子の混合物を含有する。組み換えウイルス粒子は先天的AaIT遺伝子(および先天的シグナル配列)または異種シグナル配列と結合されたコドン最適化遺伝子をのいずれかを暗号化することができる。

0074

幼虫を次に麻痺および死亡に関して監視する。検定の結果は実施例13および図6−15に示されている。

0075

一種を除いて全ての組み換えウイルスが野生型AcMNPV(これはAaIT遺伝子が欠けている)より早い罹病開始を示す。例外は、AaITを暗号化するコドン最適化配列と結合されたpBMHPC−12シグナル配列を含有するAcMNPV構造であり、それは野生型AcMNPVとほぼ同じように機能する。組み換えウイルスは、野生型ウイルスにより引き起こされる病因とは容易に識別される特徴的な麻痺応答を示す。多面体中および感染昆虫中の野生型対組み換えウイルスの実際の比は分析されない。

0076

本発明をさらに良く理解するために、下記の実施例を示す。該実施例は説明目的のためだけでありそして本発明の範囲を限定しようとするものではない。

0077

サムブルーク(Sambrook)他(32)中に記載されている処方に従い標準的な分子生物学的技術を使用した。

0078

実施例1
AaITを暗号化するコドン最適化cDNA配列の決定
AaIT用のコドン最適化遺伝子の設計は、組み換え蛋白質発現用に使用する細胞/有機体の正確な(またはできるかぎり近い関係の)ゲノムから誘導される核遺伝子のコドン使用を反映するという試みで始まる。しかしながら、ここでは鱗翅目およびバキュロウイルス遺伝子配列の両者に関する適切な発現はこれらの初期実験に関する信頼性のあるコドン使用表を作成するために利用できなかった。

0079

イケムラ(Ikemura)他は、信頼性のあるコドン−選択パターンには異なる機能を有する10以上の遺伝子からのコドン頻度の集計を必要とすると注意している(10、24)。しかしながら、本発明の時点では、2種の特定蛋白質すなわちAcMNPVポリヘドリンおよびAcMNPVp10だけからのDNA配列情報しかなかった(22、23)。

0080

この理由のために、ドロソフィラ・メラノガスターのコドン使用表は20,451のコドンを合計した44の核遺伝子から誘導されているため、ドロソフィラ・メラノガスターが選択される(11)。これらのコドン使用表を使用して、本発明のシグナル配列およびAaIT毒素配列を暗号化するコドン最適化遺伝子を設計する。

0081

それぞれの全長シグナルペプチド配列をAaIT毒素ペプチド配列と融合させる。これらのアミノ酸配列をインテリゲネティックスートTMソフトウエアアージョン1988、パラアルト、カリフォルニア)を用いて全ての可能なヌクレオチド縮重(最大のあいまいさ)を示すDNA配列に逆−翻訳する。インテリゲネティック・スートTMソフトウエアは全てのコンピューター使用核酸配列分析用に使用される。

0082

確定的および可能性のある(コドン縮重の理由のため)制限酵素認識部位のリストを作成する。遺伝子合成用に並びに追加的DNA操作用に重要な制限酵素部位が選択されそして保存される。例えば、Bam HIおよびAva I制限酵素部位はブルースクリプトSK/KSベクター(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)を用いる遺伝子合成用に必要である。Sal IおよびApa I制限部位が追加的遺伝子操作に柔軟性を与えるのに望ましい。

0083

インテリゲネティック・スートTMソフトウエアを用いて、AaITおよびそれぞれのシグナル配列中でそれぞれのアミノ酸が製造される時間数を記録するリストが作成される。コドンは、ドロソフィラ・メラノガスター・コドン使用の相対的頻度を反映する配列中に存在しているアミノ酸残基の数を基にして割り当てられる(11)。

0084

例えば、ドロソフィラ・メラノガスター中のシステイン・コドン頻度は配列TGCに関しては76%でありそして配列TGTに関しては24%である。ADKシグナル−AaIT遺伝子構成体には8個のシステイン残基がある(全てが成熟AaIT蛋白質を暗号化する遺伝子中にある(配列同定番号:3))。従って、6個のコドンがTGCとして(残基の75%)そして2個のコドンがTGTとして(残基の25%)割り当てられる。この分布を基にして、それぞれのシステイン・コドンに次に正確なあいまいでない配列が割り当てられる。隣接イソコドンの変更に注意をすること。例えば、AaITペプチド中の2個の隣接システイン残基(アミノ酸37および38)は配列TGT TGCを割り当てられて、2個の同一コドン配列が続いて割り当てられるのを避ける。

0085

この方法を全部で20個のアミノ酸および終止コドン(終止コドン配列TAAはこの工程により変化されないが)に関して繰り返す。さらに、全ての重要な制限酵素部位は保存されそして望ましくない部位は破壊される。

0086

プラスミドベクター並びに伝達ベクターに関するフランキングDNA配列を完成したイソ配列と融合させて、切断−結合境界に望ましくない制限酵素部位がないということを確認する。

0087

実施例2
異種シグナル配置およびAaITを暗号化するコドン最適化cDNA配列を含有する遺伝子カセットの構成
8個の異種シグナル配列−コドン最適化AaIT毒素カセットを、二部分、すなわち8個の異種シグナル配列の1個を暗号化するDNAおよび毒素暗号化領域のアミノ末端部分(全ての構成に共通)からなるそれぞれの構成に関する「B」断片、並びにそれぞれの構成に関して同一でありそして毒素暗号化領域の残部を暗号化する「A」断片、で合成しそして組み立てる。

0088

断片AおよびBのそれぞれは、ニューイングランド・バイオラブス(ベヴェリー、マサチュセッツ)から購買した15bpオーバーラップを含有する一対のオリゴマーアニーリングすることにより、製造される。DNAポリメラーゼであるセクエナーゼTM2.0(ユナイテド・ステーツ・バイオケミカルコーポレーションクリーブランド、オハイオ)を使用して二重標準分子を完成し、それは異種シグナル配列およびAaITを暗号化するコドン最適化cDNA配列を含有する。下記のものは、これらの8個の構成体の構成で使用されるオリゴマーのリストである:
断片A

0089

0090

(配列同定番号:33)

0091

0092

(配列同定番号:34)
断片B1−8
共通

0093

0094

(配列同定番号:35)

0095

0096

(配列同定番号:36)

0097

0098

(配列同定番号:37)
漿膜

0099

0100

(配列同定番号:38)
エステラーゼ−6

0101

0102

(配列同定番号:39)
アポリポフォリン

0103

0104

(配列同定番号:40)
性−特異種

0105

0106

(配列同定番号:41)
クチクラ

0107

0108

(配列同定番号:42)

0109

0110

(配列同定番号:43)
図2は、ドロソフィラ・メラノガスター・クチクラ・シグナル配列を含有するAaIT遺伝子カセットに関する構成方法を示している。残りの7個の異種シグナル配列−AaIT遺伝子カセットはシグナル配列に関する特異オリゴを用いて上記と同じ方法で構成される。

0111

第一段階では、B断片に関するシグナル配列−特異オリゴおよび共通Bオリゴをアニーリングし、そして単独ストランド領域をセクエナーゼTM2.0を用いて充填する。それぞれのシグナル配列−特異オリゴはクローニング用に必要なBam HI部位を含有する同一の12ヌクレオチド上流非暗号化領域、シグナル配列用の暗号化領域、およびAaITの最初の5個のアミノ末端アミノ酸を暗号化する最初の15個のヌクレオチドからなっている。二重ストランドDNAのこの短い部分はBam HIおよびAva Iで消化されそしてすでにXam IおよびBam HIで消化されているpブルースクリプトSK+(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)にサブクローニングされる。陽性サブクローンは、pブルースクリプトSK+だけの中に存在している445bp断片より大きいPvu II断片の存在により証明される。Ava IおよびXma I部位に関するオーバーラップの間に1個の塩基対不適合がある。この不適合を補正してAva I部位を作成しそしてXma I部位をなくすクローンが適当な制限酵素消化により選択される。図2では、生ずるプラスミドはpBSクチクラB7と指定される。

0112

AaIT暗号化領域の大部分を暗号化するA断片を構成するために、オリゴE1およびE2をアニーリングしそしてセクエナーゼTM2.0を使用して単独ストランド領域に充填する。この結果、5′末端にAva I部位をそして毒素暗号化領域の3′端部の次に入れられたBam HIおよびAsp 718部位を含有する。クローニングを促進させるために、Bam HIおよびAsp 718部位が加えられる。断片Aを次にAva IおよびAsp 718で消化させる。断片B−含有プラスミドであるpBSクチクラB7もAva IおよびAsp 718で消化させ、そして断片Aは消化されたプラスミド中にサブクローニングされる。図2の場合、生ずるプラスミドはpBSクチクラ−AaITと指定される。断片AおよびBをこの目的のためだけにAaIT配列中に設定されている非反復性Ava I部位で結合させる。断片Aの断片B−含有プラスミド中への連結反応後に、連結反応されたDNAを使用して競合DHα大腸菌(E. coli)を形質転換させる。生じたバクテリアコロニーからプラスミドDNAのミニプレップを製造する。制限酵素分析を使用して、どのコロニーが希望する組み換えDNAを含有しているかを決定する。別の制限酵素分析およびその後のDNA配列順序決定を使用して、AaITを暗号化するコドン最適化cDNAを含有する8個のプラスミドの一体性を確認する。

0113

実施例3
AaITを暗号化する先天的cDNA配列を含有する遺伝子カセットの構成
AaITを暗号化する先天的cDNA配列を含有する遺伝子カセットを、実施例2のコドン最適化遺伝子の構成とは異なる方法で、二部分で構成した。遺伝子を構成するためのオーバーラップの短領域だけを有する長いオリゴを用いる代わりに、完全にオーバーラップするオリゴのセットを使用する。構成方法における第二の差は、AaITシグナル配列および暗号化領域の両者に関する先天的DNAが使用されることから、必然的に生ずるものである。人工的な制限酵素部位はDNA配列中に設定されていない。従って、シグナル配列およびAaIT遺伝子の暗号化領域を結合させる異なる方法が必要である。この方法では、非対称的に切断する制限酵素を使用して遺伝子の機能的に別個な領域を互いにきちんと融合させることができる。これにより、いずれの将来の構成体においても予備製造された領域を混合しそして適合させることができる。先天的AaIT遺伝子の構成用に使用される1−10の番号が付けられたオリゴマーの配列は下記のリストに示される:
オリゴ1

0114

0115

(配列同定番号:44)
オリゴ2

0116

0117

(配列同定番号:45)
オリゴ3

0118

0119

(配列同定番号:46)
オリゴ4

0120

0121

(配列同定番号:47)
オリゴ5

0122

0123

(配列同定番号:48)
オリゴ6

0124

0125

(配列同定番号:49)
オリゴ7

0126

0127

(配列同定番号:50)
オリゴ8

0128

0129

(配列同定番号:51)
オリゴ9

0130

0131

(配列同定番号:52)
オリゴ10

0132

0133

(配列同定番号:53)
先天的AaIT毒素遺伝子カセットのクローニングを促進させるために、修飾されたブルースクリプトSKプラスミドを作成する。pBSSK Bsm Iと指定されたこのベクターは、ブルースクリプト地図上の330bpに位置するNae I中に挿入されているBgl IIリンカー(CAGATCTG)を有する。このリンカー挿入がNae I部位を破壊する。さらにこのベクターは図3で頂部に示されている修飾されたポリリンカーを含有する。この修飾されたプラスミドはpBS SK Bsm Iと指定される。このポリンカーはBsm Iと隣接配置されているNae I部位を、Nae I部位がBsm I制限酵素の使用およびその後のDNAポリメラーゼIのレナウ(Klenow)断片(ギブコBRLガイザースブルグ、メインランド)によりの付着末端中への充填による平滑末端分子として明白に切り出されるような方法で、含有する。

0134

カセットの先天的シグナル配列部分を構成するために、オリゴ1および2をアニーリングする。これらの2個のオリゴが適切にアニーリングされた時に、それらは平滑3′末端およびBamSK付着末端を5′末端に含有する。プラスミドpBSSK Bsm IをBam HIおよびNae Iで消化させる。アニーリングされたオリゴを次に消化されたプラスミドに連結反応させる。生ずるプラスミドサブクローンはpBSGIII sigと指定される。

0135

AaIT毒素の暗号化領域はDNAの二部分として構成される。オリゴ4、5、8および9の5′末端をT4キナーゼを用いてホスホリル化する。オリゴ3、6、7および10は終止ホスフェートなしで残される。2回のアニーリング反応およびその後のT4DNAリガーゼ(ニューイングランド・バイオラブス、ベヴェリー、マサチュセッツ)を用いる連結反応を行う。AaIT毒素のアミノ終止部分を暗号化するオリゴ3、4、5および6を図3に示されている如くアニーリングしそして連結反応させる。AaIT毒素のカルボキシ末端を暗号化するオリゴ7、8、9および10を図3に示されている如くアニーリングしそして連結反応させる。

0136

これらの2個のオリゴ断片を、TAE(40mMトリス−アセテート、pH7.8、1mMEDTA)を含有する2.5%低融点アガロースゲル(バイオ−ラドリッチモンド、カリフォルニア)上での電気泳動により精製する。断片が汚染断片から充分に分離された時点で、それらをゲル切片として切断しそして個別管の中に入れる。断片はサンブルーク(Sambrook)他(32)中に記載されている如きフェノール抽出により下記の点を改変して精製される:(1)塩化ナトリウムをゲル切片に加熱前に1.5Mの最終的濃度となるまで加える。その後の段階中ではそれ以上の塩の添加は必要ない。(2)エタノール沈澱の前に液化されそして希釈されたゲル切片上でフェノール抽出を2回だけ行う。

0137

プラスミドpBSGIII sigをBsm Iで消化し、そして付着末端を充填し且つDNAポリメラーゼIのレナウ(Klenow)断片(ギブコ/BRL、ガイザースブルグ、メインランド)を用いて平滑化する。上記の如く、この結果として、シグナル配列の最後の塩基対のところのプラスミドの解放が生ずる。プラスミドを次にEcoRIで消化する。次に三方向連結反応をゲル精製されたオリゴ断片および消化されたプラスミドの間で設定する。陽性のサブクローンが制限酵素分析およびその後のDNA配列分析により証明される。pBS GIII−AaITと指定されている1個の陽性クローンは先天的シグナル配列およびAaITの全長先天的暗号化領域を含有する(図3)。

0138

実施例4
バキュロウイルス伝達ベクター中へのAaIT遺伝子構成の挿入
実施例2の異種シグナル配列−コドン最適化AaIT遺伝子カセットをpBSシグナル−AaITクローンからBam HI断片として分離する(図2中のpBSクチクラ−AaIT例を参照のこと)。これらのBam HI断片を、Bam HIで消化されたpVL 985バキュロウイルス伝達ベクターDNA(31)中にサブクローニングする。挿入体の制限酵素分析およびその後の配列分析を使用して、pVL異種シグナル配列−コドン最適化AaITクローンの正確な配向および一体性を確認する。

0139

例えば、プラスミドpBSクチクラ−AaITをpVLバキュロウイルス伝達ベクターにサブクローニングして、pAC0055.1と指定されるプラスミドを生成する。

0140

実施例3の先天的AaIT遺伝子カセットをpBSGIII−AaITクローンからBam HI〜EcoRI断片として分離する(図3参照)。これらのBam HI〜Eco RI断片を、Bam HIおよびEco RIで消化されたpVL 1393バキュロウイルス伝達ベクターDNA(33)にサブクローニングする。挿入体の制限酵素分析およびその後の配列分析を試用して、pVL先天的AaITクローンの一体性を確認する。

0141

実施例5
AaITを暗号化する組み換えウイルスの作成
M.D.サマーズおよびG.E.スミス(25)により記載されている培養されたSf9細胞中での同種DNA組み換えにより、AcMNPVポリヘドリンプロモーターの調節下で先天的およびコドン最適化AaIT遺伝子を含有する組み換えウイルスを作成する。Sf9細胞(ATCC受け入れ番号CRL1711)は、スポドプテラ・フルギペルダ21(Sf21)の誘導体である。

0142

この工程では、2.0×106個のSf9細胞を60mm培養皿中で5mlの補充TNM−FH媒体(0.33%TCラクトアルブミンヒドロリゼート(ジフコ、デトロイトミシガン)および0.33%TCイーストレート(ジフコ)、10%胎牛血清、0.1%プルロニックTMF−68(ギブコ/BRL)が補充されているグレース昆虫媒体(34))中で接種する。細胞がしっかり結合された時点で(2−16時間)、媒体を除去しそして10%胎牛血清が補充されている0.75mlのグレース昆虫媒体で置換した。1マイクログラムのAcMNPV(E2菌株)DNAを0.75mlのトランスフェクション緩衝液(25mMHEES、pH7.05、140mM NaCl、125mM CaCl2)中で2μgの実施例4からのAaIT−伝達ベクターDNAと混合し、そして細胞に滴々添加する。細胞を次に27℃において4時間培養した。培養期間の終了時に、トランスフェクション媒体を除去しそして細胞をTNM−FHで1回洗浄し、再び5mlの補充TNM−FHを供給し、そして27℃の培養器中に入れた。5日後に、媒体を細胞から除去し、ベックマンGPR遠心器中で2000rpmにおける10分間の遠心により透明とし、そして4℃で貯蔵する。これが最初のトランスフェクション上澄み液を構成する。

0143

先天的およびコドン最適化AaIT遺伝子はAcMNPVポリヘドリン遺伝子を置換するため、これらの毒素遺伝子を有する組み換えウイルスは多面体を生成できず、従って吸蔵−陰性プラークを与えることができない。このフェノタイプを同定用の基礎として用いて、AaIT遺伝子を含有する組み換えウイルスが最初のトランスフェクション上澄み液から3回のプラーク精製によりM.D.サマーズおよびG.E.スミス(25)のプラーク検定方法を用いて分離される。

0144

この工程では、1.5−2.0×106個のSf9細胞を補充TNM−FH中の60mm培養物の中に接種する。細胞が結合した後に(2−16時間)、媒体を除去しそして0.001−0.1%の最初のトランスフェクション上澄み液を含有する1mlの補充TNM−FHで置換する。ウイルスを27℃において1−2時間にわたり放置して細胞に吸着させ、その後にそれを除去しそして抗生物質および1.5%の低ゲル化温度アガロースを含有する4mlの溶融された(39℃)補充TNM−FHで置換する。アガロースがゲル化した時に、細胞を湿った27℃の培養器に4−6日にわたり移す。吸蔵−陰性プラークを次にステレオ顕微鏡下での視覚的検査により同定し、そしてそれぞれの希望するプラークに重なっているアガロースプラグを取り出しそして1mlの補充TNM−FH中で希釈する。

0145

プラーク精製工程をそれぞれのプラークから回収された合計ウイルスの1−10%を使用してさらに2回繰り返す。第3回の終了時に、1個のプラークから回収されたウイルスの全て(すなわち1ml)を25cm2フラスコ中で接種された2×106個のSf9細胞に加え、そしてフラスコを27℃において1−2時間にわたり培養する。ウイルスを次に除去しそして3mlの補充TNM−FHで置換し、そしてフラスコを培養器に戻す。5日間の終了時に、継代1すなわち「P1」ウイルス株と指定され、ベックマンGPR遠心器中で2000rpmで10分間の遠心により透明にされる。P1株の保管試料を−150℃に保ち、そしてウイルスの残部を4℃において貯蔵する。

0146

吸蔵−陰性ウイルスが希望するAaIT遺伝子を含有しているということは、コドン最適化AaITウイルスに関するドットブロット・ハイブリッド形成(下記の実施例6)および先天的AaIT−ウイルスに関するポリメラーゼ鎖反応(PCR)(下記の実施例7)により、確認される。

0147

実施例6
ドットブロット・ハイブリッド形成による組み換えウイルスの確認
吸蔵−陰性ウイルス中のコドン最適化AaIT遺伝子の存在を確認するために、実施例5からのウイルス−感染Sf9細胞をAaIT遺伝子に特異的な放射標識DNAプローブにハイブリッド形成する核酸に関するドットブロット・ハイブリッド形成により検定する。この方法のためには、ウイルス性P1株の透明化中に得られる細胞ペレットをそれぞれ1mlのダルベッコホスフェート緩衝食塩水(D−PBS)中に再懸濁させそして100μlの部分試料をハイブリッド形成用に除去する。細胞をエッペンドルフ遠心器中で最高速度で15秒間にわたりペレット化しそして次に0.5mlの0.5M NaOH中に溶解させる。室温における10分後に、それぞれの試料を50μlの10M NH4OHで中和する。96ウエル・ドットブロット装置を用いて、10〜100μlの溶解された細胞ペレットを、1M NH4OH、0.02M NaOHで平衡化されているニトロセルロース膜(シュライヘル(Schleicher)およびシュエル(Schuell)BA85(キーン(Keene)、NH)上で直径が3mmのサークル中に通す。ブロット装置のウエルを次に0.5mlの1M NH4OH、0.02M NaOHで洗浄する。フィルターを装置から除去し、SSPE(0.9M NaCl、50mM NaH2PO4、16.25mM NaOH、5mMEDTA)で5回すすぎ、そして核酸を真空炉の中で膜の上で80℃において2−3時間にわたりベーキングする。使用前に、膜をポリハイブリッド形成緩衝液(5×SSPE、50(容量/容量)%のホルムアミド、0.2%のSDS、5×デンハーズ(0.1(重量/容量)%のポリビニルピロリドン、0.1(重量/容量)%のフィコル400TM(ファーマシアLKBピスカタウェイ、ニュージャージー)、0.1(重量/容量)%の牛血清アルブミン)の中で42℃において一夜培養する。

0148

コドン最適化AaIT遺伝子構成に関するハイブリッド形成プローブは、オリゴヌクレオチドE1およびE2(実施例2に記載されている)をアニーリングしそして次に32P−標識dATP並びに未標識dCTP、dGTPおよびTTPの存在下でファージT7DNAポリメラーゼを有する単独ストランド領域中に充填することにより、製造される。放射標識付きプローブを加熱により変性させ、そして次にハイブリッド形成緩衝液(100μg/mlの共用されそして変性された鮭精子DNAが補充されているプレハイドブリッド形成緩衝液)の中で希釈する。膜をプローブ−含有ハイブリッド形成緩衝液の中に入れ、そして37℃において16時間にわたり培養する。ハイブリッド形成されていないプローブを次に4回の連続的な20−30分間の洗浄、すなわち室温における2×SSPE、0.2%のSDS中での2回、および65℃における0.2×SSPE、0.2%のSDS中での2回、により除去する。過剰の流体を膜から除去し、そして膜と結合されている放射活性をデュポンクロネックスTM(ウィルミントン、デラウェア)のライトニング・プラス・インテンファイング・スクリーンの存在下でのコダックXAR医学用X線フィルムを用いる自動放射写真により検出する。この検定を用いて、試験した推定コドン最適化AaIT−ウイルス分離体の93%でAaIT遺伝子の存在が確認される。

0149

実施例7
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用いる組み換えウイルスの確認
推定先天的AaIT組み換えウイルスが正確な寸法の挿入体を含有していることを立証するために、AaIT遺伝子挿入体をフランキングしている2個の既知のマーカー部位の間の距離を発芽ウイルスのPCR分析により測定する。工程は、B.マリツシェク(Malitschek)およびM.シャトル(Scahrtl)(35)により記載されている工程の変法である。この分析用プライマーは、AcMNPVポリヘドリン遺伝子翻訳開始部位の84〜110塩基上流(5′−CAATATATAGTTGCTGATATCATGGAG−3′、PVL前進)および205〜226塩基下流(5′−GGATTTCCTTGAAGAGAGTGAG−3′、PVL復帰)である。

0150

分析用のウイルス試料を製造するために、4μlのそれぞれのP1株および対照としての野生型AcMNPVE2菌株の部分試料をそれぞれ、ジーンアンプ管(パーキン−エルマー/セツス、ノルウォークコネチカット)中で200μg/mlのストレプトマイセスグリセウス(Streptomyces griseus)からの非−特異プロテアーゼが補充されている21μlの緩衝液A(10mMのトリス−HCl(pH8.3)、40mMのKCl、0.1mg/mlのゼラチン、0.45(容量/容量)%のノニデットTMP40(シェルオイルカンパニー)、0.45(容量/容量)%のツイーンTM20(ICIアメリカズ))と混合する。それぞれの管を次に単独サイクル3温度プログラム:(1)60分間にわたる55℃、(2)12分間にわたる95℃、および(3)4℃におけるソーキング、で操作されているパーキン−エルマー/セツスDNAサーマルサイクラー中で培養する。このプログラムの機能は、ウイルス性DNAを発芽ウイルスから遊離させそしてPCR増殖段階前にプロナーゼを破壊する。

0151

1×緩衝液A、3.0mMのMgCl2、400μMのdATP、400μMのdGTP、400μMのdCTP、400μMのTTP、50pモルのプライマー1(PVL前進)、50pモルのプライマー2(PVL逆)を含有する24.5μlの溶液を加えることにより、それぞれの試料を増殖反応用に製造する。0.5μl(2.5単位)のAmpliTaqポリメラーゼ(パーキン−エルマー/セツス)を加えそして25−35温度サイクルからなる熱サイクルプログラムを始めることによりPCRを開始し、そこではそれぞれのサイクルは(1)94℃における1分間、(2)55℃における1.5分間、および(3)72℃における2.5−3.0分間からなっている。最後のサイクルでは、72℃における培養時間はさらに7分間延長され、そして試料を次に4℃においてソーキングする。それぞれのPCR反応の部分試料を次にDNA寸法マーカーの適当なセットの存在下でゲル電気泳動により分析する。

0152

この方法により試験された4種の推定先天的AaIT組み換えウイルスのそれぞれが単独PCR生成物を生成し、それの運動性は異なる試料間で同一でありそして増殖しようとする断片に関して493bpの予測寸法同量である。この断片は遺伝子挿入体の部位をフランキングするプライマーを含有する。同様に、野生型AcMNPV菌株E2ウイルスを有する単独PCR生成物が得られ、そしてそれの運動性は337bpの予測寸法と良く合致する。

0153

実施例8
ウイルス−感染細胞中のRNA水準の分析
コドン最適化ウイルスおよび先天的AaIT−ウイルスを感染させたSf9細胞中でのAaIT遺伝子の発現は、ウイルス−感染細胞から分離される合計細胞RNAのノザーンブロット分析により推定される。合計細胞RNAはチオシアン酸グアニジン/CsCl工程(36、37)により分離される。

0154

この工程では、Sf9細胞(150cm2フラスコ中の5×107)にウイルスを5PFU/細胞のMOIで感染させそして27℃において24時間にわたり培養する。細胞を次に遠心(ベックマンGPR遠心器中で2000rpmで10分間)により収穫し、そして細胞ペレットを10mlの4Mチオシアン酸グアニジン溶液(50(重量/容量)%のチオシアン酸グアニジン、0.5(重量/容量)%のN−ラウリルサルコシン、0.7(容量/容量)%のβ−メルカプトエタノール、25mMのクエン酸ナトリウム(pH7.0))の中に再懸濁させる。合計RNAを次に60,000rpmで回転されているベックマン70.1Tiローター中で5.7MのCsCl、0.1MのEDTAパッドを通す沈澱により4.5時間にわたり部分的に精製する。RNAペレットを2mlのTES緩衝液(10mMのトリス−HCl(ペレット7.5)、5mMのEDTA、1(重量/容量)%のSDS)の中に再溶解させそして55℃において5−10分間にわたり培養して試料の溶解を助ける。溶液を次に0.15MのNaClに調節しそして水を飽和させてあるフェノールで1回抽出する。水相を除去しそして有機相を2mlのTES、0.15MのNaClで2回以上抽出する。次に水相を一緒にしそしてRNAをエタノールを用いて沈澱させる。RNAペレットを2mlのH2O中に再溶解させ、そして4℃において等量の4MのLiClを用いて再沈澱させる。ペレットを次に氷冷2MのLiClで1回洗浄し、そして0.5mlのH2O中に再溶解させる。残存LiClを次に1回の最終的なエタノール沈澱により除去しそして最終的なペレットを0.2mlのH2O中に再溶解させる。RNA収率紫外線分光計により測定する。

0155

ノザーン分析のために、20μgのそれぞれのRNAを2.7Mのホルムアルデヒド、40mMのMOPS(4−モルホリンプロパンスルホン酸)(pH7.0)、10mMのクエン酸ナトリウム、1mMのEDTAを含有する1%アガロースゲル上での電気泳動により寸法で分別する。RNAを次に毛管ブロット法により20×SSC(3MのNaCl、0.3Mのクエン酸ナトリウム、NaOHでpH7.0に調節されている)の存在下でニトロセルロース膜(シュレイヘルおよびシュエルBA85)に移す。膜をハイブリッド形成緩衝液(50(容量/容量)%のホルムアミド、0.9MのNaCl、50mMの燐酸ナトリウム(pH7.0)、5mMのEDTA、0.1(重量/容量)%のSDS、4×デンハーズ、0.4mg/mlのtRNA、0.25mg/mlの胸腺)の中で短時間でプレハイブリッド形成し、そして次に3′のすぐ次にある464bp Bam HI〜Kpn I制限断片をAcMNPVポリヘドリン遺伝子中のAaIT遺伝子挿入体の部位に対する不規則プライミング(38)により製造される32P−標識付きDNAプローブを含有する同一緩衝液中で42℃において16時間にわたりハイブリッド形成する。ハイブリッド形成後に、結合されていないプローブを0.25×SSC、0.1%のSDSを用いる65℃における4回の連続的な30分間にわたる洗浄により除去する。モレキュラーダイナミックスフォスフォイメージャーTMを用いる自動放射写真を用いて膜と結合されているプローブのデジタル化された像を作成し、そして個々の帯をイメージアントTMv3.15ソフトウエア(モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア)を用いて定量化する。

0156

図4は、野生型AcMNPV(「野生型」と標識が付けられている)並びにコドン最適化(特異的な異種シグナル配列と標識が付けられている)および先天的(grp III AaITと標識が付けられている)組み換えウイルスを感染させてあるSf9細胞中のAaIT/ポリヘドリンRNA水準の分析をまとめている。ポリヘドリン−含有RNAの一種だけがそれぞれの試料中で検出され、そして全てがポリヘドリンの構造またはウイルス中に存在しているAaIT/ポリヘドリン遺伝子の構造体に関して適切な寸法を有する。コドン最適化AaIT−ウイルス−感染細胞中で検出されるAaIT/ポリヘドリンRNAの量は野生型AcMNPV−感染細胞中で集計されるポリヘドリンRNAの水準の45−67%の範囲である。先天的AaIT−ウイルス−感染細胞に関する対応する値は30%である。この分析は、AaIT/ポリヘドリン遺伝子が正確に利用されそしてAaIT−ウイルス−感染Sf9細胞中で高活性であることを示している。

0157

実施例9
ウイルス−感染Sf9細胞中での生物学的に活性なAaITの製造
1ng以上をサルコファガ・アルギロストマ(Sarcophaga argyrostoma)(フレッシュフライ)幼虫(39)の側背部分中に注射する時に、AaITが急性興奮性麻痺(収縮)を引き起こす。ムスカ・ドメスチカ(イエハエ)の幼虫を用いる同様な検定を使用して、検出可能量(1ng)の生物学的に活性なAaITが培養媒体中またはコドン最適化AaITウイルス性P1株の製造中に得られる細胞ペレット中のいずれかに存在しているかどうかを決定する。

0158

培養媒体を検定するために、2−6μlのそれぞれのP1株(600−1000細胞当量/μl)をムスカ・ドメスチカ幼虫の側背部分中に26ゲージ針が備えられているハミルトン注射器を用いて注射する。幼虫を注射から5分後に体節の不随意的収縮の兆候に関して試験する。それぞれのウイルスに対して5匹の幼虫を検定する。

0159

細胞ペレット中のAaIT活性を検定するために、ウイルス−感染Sf9細胞を遠心により1回洗浄し、そしてダルベッコホスフェート緩衝食塩水(D−PBS)中で1マイクロリットル当たり30,000個の細胞の密度で再懸濁させる。2マイクロリットルの凍結解凍溶解産物(すなわち、60,000細胞当量)を次にムスカ・ドメスチカ幼虫に上記の如く注射しそして体節の急性収縮に関して試験する。

0160

下表は、インターロイキン−2シグナル−AaIT−ウイルス変異体フレームシフト変異体)および3種の異種シグナル−コドン最適化AaIT−ウイルス分離体を用いて得られる結果をまとめている。生物学的に活性なAaITはこの検定で試験されたいずれのP1株(細胞培養上澄み液)中でも検出されず、そのことは活性毒素の濃度は上澄み液中では0.2ng/μl以下の範囲であることを示している。対照的に、17種の細胞ペレット溶解産物の中の13種ではAaITが容易に検出される。4種の陰性溶解産物の中の3種は、領域を暗号化する毒素遺伝子中の位置265におけるフレームシフト変異を含有する変異体IL2−AaIT−ウイルス単離体から誘導される。他の陰性は、AaIT遺伝子挿入体に関するドットブロット・ハイブリッド形成により陰性分離体T9.4.1(推定クチクラ−AaIT)を用いて得られる。他の4種の推定クチクラ−AaIT構成体は陽性結果を与え、エステラーゼ−6−AaITおよび脂肪運動ホルモン−AaIT構成体の9種全部もそうである。

0161

0162

実施例10
幼虫への注射によるウイルス性能の分析
AaIT遺伝子の挿入体がAcMNPV性能を強化するかどうかを試験するために、コドン最適化クチクラ−AaITからおよびAaIT遺伝子のないAcMNPVの野生型E2菌株から製造された発芽ウイルスを第4齢中のヘリオシス・ヴィレセンス(Heliothis virescens)(タバコバッド・ウォーム)幼虫への注射により生物学的に検定する。それぞれのウイルスをM.D.サマーズおよびG.E.スミス(25)により記載されているようなプラーク検定方法により滴定し、そして次に0.5(容量/容量)%の赤色染料番号5が補充されているTNM−FH媒体中で2×107、2×106、および2×105PFU/mlに希釈する。それぞれの幼虫を二酸化炭素を用いて2−5分間にわたり麻酔をかけ、そして次に26ゲージ針が備えられているハミルトン注射器を用いて0.5μlの希釈されたウイルスを注射する。針を最後の2本の前足の間に縦に挿入しそして次に注射前に2〜3個の体節に前方に移動させる。注射後に、それぞれの幼虫を染料−着色された血リンパの放出に関して検査しそして試料損失が明らかであるかまたは疑われるなら廃棄される。幼虫を次に27℃において被覆された4cm2の飼料細胞(1個の細胞当たり1匹の幼虫)の中に保ちそして1日に2−3回死亡または生存に関して検査する。背中に曲げた後に0.5−2分以内に自身で直せないなら、その個体は瀕死であると記録される。

0163

図5は、ヘリオシス・ヴィレセンス幼虫に102、103および104PFUのそれぞれのウイルスを注射する時に得られる結果をまとめている。それぞれのウイルス投与量に関して48匹の幼虫が使用される。80匹の昆虫(「ウイルスなし」)にはTNM−FHだけを陰性対照として注射する。結果は、試験した投与量のそれぞれにおいてクチクラ−コドン−AcMNPVはそれの宿主を野生型AcMNPVより早く死亡させることを示している。104PFUにおいては、野生型ウイルスに関するLT50は約97時間であるが、クチクラ−AaITAcMNPVに関する対応するLT50は約67時間である。さらに、野生型AcMNPV以外のクチクラ−AaITを感染させた事実上全ての対応する幼虫は死亡前に収縮性麻痺にかかる。この結果は、AaIT遺伝子およびクチクラシグナル配列のAcMNPV中への挿入体が生物学的に活性な毒素の発現により死亡速度を促進させることを示している。

0164

実施例11
幼虫への注射によるウイルス性能の別の分析
初期第4齢のヘリオシス・ヴィレセンス幼虫の別群に、AaIT遺伝子なしのAcMNPVの野生型E2菌株、先天的AaITシグナル−先天的AaIT遺伝子−AcMNPV構成体、または7種のコドン最適化異種シグナル−AaIT−AcMNPV構成の中の1種から製造された104PFUの発芽ウイルスを注射することにより、実施例10の工程を繰り返す。1種のウイルスが32匹の幼虫に投与される。3回の別個の検定が行われる。注射理由により損傷された幼虫は分析には含まれていない。データを集め、そして結果を下表に示す。

0165

0166

表において、「n」は3回の検定からの幼虫の合計数を表しており、「N/A」は適用不能を意味し、そして「L1(95%)」および「L2(95%)」は検定が等数の幼虫を用いて再試験される場合に95%の信頼水準となってL1およびL2に示されている値以内に入るであろうデータの信頼限度を表している。結果は、コドン最適化異種シグナル−AaIT−AcMNPV構成体(並びに先天的AaITシグナル−先天的AaIT遺伝子−AcMNPV構成体)のそれぞれがそれの宿主を野生型AcMNPVより早く死亡させることを示している。野生型ウイルスに関するLT50は約126時間であるが、7種の異種シグナルAaIT−AcMNPV構成体に関する対応するLT50は約68−89時間の範囲でありそして先天的AaIT−AcMNPV構成体は約74時間のLT50を有する。これらの結果は、AaIT遺伝子および異種シグナル配列のAcMNPV中への挿入が生物学的に活性な毒素の発現により死亡速度を促進させるという実施例10の結果を確認するものである。

0167

実施例12
ウイルス多面体中での野生型および吸蔵−陰性組み換えウイルスの共−吸蔵
組み換えAaIT−ウイルスはポリヘドリンの製造用にはないため、Sf9細胞に組み換えAaIT−ウイルスおよび野生型ヘルパーウイルス(すなわち、AcMNPVのE2菌株)を共−感染させることにより野生型および組み換えウイルス粒子の混合物を含有する多面体を製造する。共−感染用に使用するそれぞれのウイルス量を決定するために、2×107個のSf9細胞を150cm2のフラスコ中に接種し、そして種々の量の野生型および組み換えウイルスをそれぞれ1個の細胞当たり少なくとも1プラーク生成単位(PFU)の感染多重度(MOI)で感染させる。4日後に、細胞を計数しそして細胞核中に明らかに認識可能なウイルス吸蔵体を有する細胞の百分率を顕微鏡観察により測定する。0.2%のトリトンX−100および2(重量/容量)%のSDSで処理された試料中で多面体を計測することにより、麻痺の合計数も測定される。野生型E2AcMNPVおよびクチクラ−AaIT組み換えAcMNPVの共−吸蔵体を含むそのような一分析の結果が下表にまとめられている。

0168

────────────────────────────────────
培養MOI合計細胞吸蔵体のある 合計多面体1個の細胞当
番号 [重量:切断-AaIT] ×107 細胞の百分率×108 たりの多面体
────────────────────────────────────
1 10:0 2.15 94% 4.10 19.0
────────────────────────────────────
2 10:1 1.85 92% 3.65 19.7
────────────────────────────────────
3 10:2 2.30 89% 3.30 14.3
────────────────────────────────────
4 5:5 1.85 74% 2.15 11.6
────────────────────────────────────
5 2:10 2.00 36% 0.55 2.75
────────────────────────────────────
6 2:20 2.10 23% 0.12 0.57
────────────────────────────────────
これらの結果は、野生型ウイルスのMOIが1個の細胞当たり少なくとも2PFUである時でさえウイルス多面体(吸蔵体)を有する細胞の百分率および1個の細胞当たりの多面体の平均数は組み換えウイルスのMOIが増加するにつれて相当減少することを示している。1個の多面体当たりの組み換えウイルス粒子の大部分を多面体の収率における許容不能な犠牲なしに保つために、全てのその後の共−吸蔵実験はウイルス(すなわち野生型および吸蔵−陰性組み換え)の両者を用いてそれぞれ3のMOIで行われる。

0169

実施例13
野生型AcMNPVと共に多面体中に共−吸蔵されているコドン最適化および先天的配列組み換えAaIT−ウイルスの経口的活性を測定するための小滴生物学的検定
ITを暗号化するコドン最適化または先天的配列を含有する組み換えAcMNPVの経口的毒性を試験するために、それぞれのウイルス(検定されなかったIL−2/AaIT組み換えを除く)を野生型AcMNPVと共にウイルス性多面体(実施例12参照)の中に共−吸蔵させ、そして下記の如き小滴生物学的検定工程を用いて第2齢ヘリオシス・ヴィレッセンス幼虫に供する。個々の第2齢ヘリオシス・ヴィレッセンス幼虫をあらかじめ湿らされている円形濾紙を含有する空の検定ウエルの中に移す。幼虫を次に26℃、50%相対的湿度において12〜20時間(一夜)にわたり保つ。

0170

翌日に、15mlのストーンヴィル昆虫飼料(40)部分試料を加熱沸騰させる。5mlの水を溶融飼料に加える。この混合物を再び加熱沸騰させ、そして直ちに低速で遠心する。上澄み液を除去しそして2、3滴の食品染料を透明な上澄み液に飼料の視覚化助剤として加える。溶融飼料をマイクロフュージ管の中で部分試料とし、ベックマンマイクロフュージ中で再回転させ、そして透明になった上澄み液を新しいマイクロフュージ管の中に移す。この溶融飼料を必要となるまで遮熱器の中に入れておく。

0171

飼料が54℃に冷えた後に、希望量のPIBを加える。典型的には、これはμl当たり10〜250FIBの範囲である。良く混合した後に、1μlの処理された試料滴をパラフィルムTM(アメリカン・ナショナル・キャングリーンウィッヒ、コネチカット)の上で部分試料とすると、そこでそれらは硬化する。硬化した滴を個別幼虫を含有しているウエルに、1匹の幼虫当たり1滴ずつ、急いで移す。幼虫は2時間にわたり飼料が与えられ、そして全部の小滴を消費する幼虫を標準量の未処理のストーンヴィル飼料を含有する新しい検定ウエルの中に入れる。次に幼虫を26℃、50%相対的湿度に入れ、そして1日に2回麻痺および死亡に関して監視する。幼虫を背中の上に曲げそして30秒間観察することにより、麻痺が測定される。幼虫が背中の上にあるままなら、それは瀕死であると考えられる。瀕死の幼虫は一般的には診断後24時間内に死亡する。試験期間は一般的に8日間である。

0172

幼虫を1日に2〜3回検査しそして生存および死亡の兆候に関して記録する。死亡および瀕死の両者の幼虫は処理に対応して記録される。図6−15はそれぞれのウイルスを用いて得られた結果をまとめている。

0173

1個の例外を除いて全ての組み換えウイルスは野生型AcMNPV(これはAaIT遺伝子が欠けている)より早い応答開始を示す。例外はAaITを暗号化するコドン最適化cDNAと結合されているpBMHPC−12シグナル配列を含有するAcMNPV構成であり、それは野生型AcMNPVと大体同じように機能する。多面体中および感染昆虫中の野生型対組み換えウイルスの実際の比は分析されていない。

0174

文献目録
1.トマルスキイ(Tomalski),M.D.およびミラー(Miller),L.K.、ネーチャー(Nature)、352、82−85(1991)。

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0213

本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。

0214

1.配列が配列同定番号3に記載されているものである、単離されたアンドロクトヌス・オーストラリス昆虫毒素(AaIT)を暗号化するコドン最適化核酸配列。

0215

2.上記1の核酸配列を含有する発現ベクター。

0216

3.発現ベクターが昆虫ウイルスである上記2の発現ベクター。

0217

4.昆虫ウイルスが核多角体病ウイルス、グラニュローシスウイルス、非吸蔵ウイルスおよびエントモポックスウイルスよりなる群から選択される上記3の発現ベクター。

0218

5.昆虫ウイルスが(a)リマントリア・ジスパルNPV(ジプシー・モスNPV)、オートグラファ・カリフォルニカMNPV、シングラファ・ファルシフェラNPV(セロリ・ルーパーNPV)、スポドプレテ・リッツラリスNPV、スポドプテラ・フルギペルダNPV、ヘリオシス・アルミゲラNPV、マメストラ・ブラシケNPV、コリストネウラ・フミフェラナNPV、トリコプルシア・ニNPVおよびヘリオコヴェルガ・ゼアNPVよりなる群から選択される多角体病ウイルス、(b)シディア・ポモネラGV(コドリング・モスGV)、ピエリス・ブラシケGVおよびトリコプルシア・ニGVよりなる群から選択されるグラニュローシスウイルス、(c)オルシテス・リノセロスNOVおよびヘリオシス・ゼアNOVよりなる群から選択される非吸蔵ウイルス、または(d)メロロンサ・メロノサEPV、アンサクタ・ムーレイEPV、ロクスタ・ミグラトリアEPV、メロプルス・サングイニペスEPV、シストセルカ・グレガリアEPV、エーデス・エジプチEPVおよびキロノムス・ルリジュスEPVよりなる群から選択されるエントモポックスウイルスである上記4の発現ベクター。

0219

6.核多角体病ウイルスがオートグラファ・カリフォルニカMNPVである上記5の発現ベクター。

0220

7.バキュロウイルス伝達ベクター中に挿入されている上記1の核酸配列を含んでなる発現ベクター。

0221

8.上記1の核酸配列で形質転換された宿主細胞。

0222

9.宿主細胞が昆虫細胞である上記8の宿主細胞。

0223

10.宿主細胞を上記1の核酸配列で形質転換させるかまたは宿主細胞に該配列を感染させ、そして宿主細胞により該核酸配列の発現を可能にさせる条件下で宿主細胞を培養することを含んでなる、AaITの製造方法。

0224

11.宿主細胞が昆虫細胞である、上記10の方法。

0225

12.配列同定番号:3のコドン最適化核酸配列を含有する昆虫ウイルスを植物に投与する(deliver)ことを含んでなる、植物を昆虫による被害から保護する方法。

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図面の簡単な説明

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図1AaITを暗号化する先天的およびコドン最適化遺伝子のヌクレオチド配列の比較を、AaITのアミノ酸配列と一緒に示す。
図2異種クチクラシグナル配列およびAaITを暗号化するコドン最適化cDNA配列を含有するプラスミドpBSクチクラ−AaITの詳細構造を示す。
図3先天的シグナル配列およびAaITを暗号化する先天的cDNA配列を含有するプラスミドpBSGIII−AaITの詳細構造を示す。
図4野生型AcMNPVが感染しているSf9細胞中に集まるポリヘドリンRNAの百分率としての毒素暗号化RNAの水準を示す。
図5ウイルス注射検定におけるH.ヴィレッセンス(H. virescens)幼虫の応答時間のグラフを示す。
図6ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、図7−10の対照として使用される野生型AcMNPV(菌株E2)を示す。
図7ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、エステラーゼ−6−AaIT−ウイルス構成体を示す。
図8ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、脂肪運動ホルモン−AaIT−ウイルス構成体を示しす。
図9ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、クチクラ−AaIT−ウイルス構成体を示す。
図10ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、先天的シグナル−先天的AaIT−ウイルス構成体を示す。
図11ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、図12−15の対照として使用される野生型AcMNPV(菌株E2)を示す。
図12ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、pBMHPC−12−AaIT−ウイルス構成体を示す。
図13ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、漿膜−AaIT−ウイルス構成体を示す。
図14ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、アポリポフォリン−AaIT−ウイルス構成体を示す。
図15ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百分率として表すもので、性特異体−AaIT−ウイルス構成体を示す。

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