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技術 新規なデオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト及びオリゴヌクレオチドを製造するためのそれらの使用

出願人 カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
発明者 スミス,ロイドエム.ファング,スティーブンカイザー,ロバートジェイ.ジュニア
出願日 1987年6月22日 (33年8ヶ月経過) 出願番号 1995-117654
公開日 1995年11月14日 (25年3ヶ月経過) 公開番号 1995-300494
状態 拒絶査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 糖類化合物
主要キーワード 結合支持体 黄色バンド 粉末状白色固体 アルドリッチケミカルカンパニー ムラヤ ガイガー デテクター アミノプロピルシリカ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1995年11月14日)のものです。
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図面 (1)

目的

構成

下記式を有する新規な保護アミノヌクレオシドホスホルアミダイト:

〔式中、Bはヌクレオシド塩基、ヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護された誘導体から成る群より選択し;R1 、R2 及びR5 はH、OR或はNHR’のいずれかである。但し、R1 、R2 及びR5 の内の1つはNHR’であり、R5 のみがOHになることができる。Rは一価有機基、R’は酸不安定な窒素保護基或はトリフルオロアセチルグリシル、4−トルエンスルホニルエチルオキシカルボニルなどから成る群より選ぶ塩基不安定性保護基である。但し、R1 或はR2 がNHR’である時、R’は前記の基、或はトリフルオロアセチル或は9−フルオレニルメチルオキシカルボニルの内のいずれかである。R6 は低級アルキル或は複素環式基;R7 は低級アルキル、シアノ低級アルキルなどである。〕

概要

背景

概要

新規保護アミノヌクレオシドホスホルアミダイトを提供する。

下記式を有する新規な保護アミノヌクレオシドホスホルアミダイト:

〔式中、Bはヌクレオシド塩基、ヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護された誘導体から成る群より選択し;R1 、R2 及びR5 はH、OR或はNHR’のいずれかである。但し、R1 、R2 及びR5 の内の1つはNHR’であり、R5 のみがOHになることができる。Rは一価有機基、R’は酸不安定な窒素保護基或はトリフルオロアセチルグリシル、4−トルエンスルホニルエチルオキシカルボニルなどから成る群より選ぶ塩基不安定性保護基である。但し、R1 或はR2 がNHR’である時、R’は前記の基、或はトリフルオロアセチル或は9−フルオレニルメチルオキシカルボニルの内のいずれかである。R6 は低級アルキル或は複素環式基;R7 は低級アルキル、シアノ低級アルキルなどである。〕

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

下記式を有する新規保護アミノヌクレオシドホスホルアミダイト

請求項

ID=000003HE=045 WI=035 LX=0425 LY=0500ここで、Bはヌクレオシド塩基、ヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護された誘導体から成る群より選択し;R1 、R2 及びR5 はH、OR或はNHR’のいずれかであり、但し、R1 、R2 及びR5 の内の1つはNHR’であり及びR5 のみがOHになることができ、ここで、Rは一価有機基であり、R’は酸不安定な窒素保護基或はトリフルオロアセチルグリシル、4−トルエンスルホニルエチルオキシカルボニルメチルスルホニルエチル−オキシカルボニル、2−シアノ−t−ブチルオキシカルボニルクロロアセチルアセトアセチル、2−ニトロベンゾイルジチアスクシノイルマレオイルイソニコチニル、2−ブロモエチルオキシ−カルボニル及び2,2,2−トリクロロエチルオキシカルボニルから成る群より選ぶ塩基不安定性保護基であり、但し、R1 或はR2 がNHR’である時、R’は前記の基、或はトリフルオロアセチル或は9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニルの内のいずれかであり;R6 は低級アルキル或は複素環式であり;R7 は低級アルキル、シアノ低級アルキル、ハロ低級アルキル或はニトロフェニル低級アルキルである。

背景技術

0001

オリゴヌクレオチドは定められた順序の4種のヌクレオチド線状配列から成る短かいポリマーである。ヌクレオチドサブユニットは、1ヌクレオチドの3’−ヒドロキシル部分に結合するホスホジエステル結合により次のヌクレオチドの5’−ヒドロキシル部分に結合される。オリゴヌクレオチドの例は5’>ApCpGpTpApTpGpGpC<3’である。文字A、C、G及びTはデオキシリボースの1’−位に結合したプリン或はピリミジン塩基性質を言い、A、アデニン;C、シトシン;G、グアニン;T、チミンである。「p」はホスホジエステル結合を表わす。オリゴヌクレオチドのセクション化学構造を1式に示す。

0002

ID=000004HE=110 WI=047 LX=1265 LY=0300
DNA鎖の一部の構造
この式はダブリュ.エッチフリーマンアンドカンパニールベルトトライヤー(Lubert Stryer) 著テキストブックバイオミスリー」、第1版1975、558頁から採用した。

0003

合成オリゴヌクレオチド近代分子生物学及び組換えDNA研究における強力な道具である。これらの分子について数多くの用途があり、a)遺伝子生成物タンパク質配列に基づく特定の遺伝子の単離用プローブとして、b)所望の遺伝子のインビトロ突然変異誘発に向けること、c)一本鎖テンプレートに関するDNA合成プライマーとして、d)遺伝子の全合成における段階として及びその他多くを含み、ウイリアムアールバール(Wm.R.Bahl) 等、Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol.21、101頁、(1978)に考察されている。

0004

かかるオリゴヌクレオチドの効率的な化学的合成法の発達に、今迄極めて相当量努力が払われてきた。これらの方法が現在にまで発達してきたにつれての簡単な回顧が、クロケット,ジー.シー.(Crockett,G.C.) 、アルドリヒミカアクタ16(3)、47〜55頁(1983)及び「オリゴヌクレオチドシンセシス:アプラクカルアプローチ」、英国、オックスホード、IRLプレスゲイトエム.ジェイ.(Gait,M.J.)編集(1984年)に見られる。現在利用可能な最良方法論は、ヌクレオシドホスホルアミダイト(phosphoramidite)誘導体固相合成手順組合わせて用いる、マッテウッチ,エム.デイ.(Matteucci,M.D.)及びカルサース,エム.エッチ.(Caruthers,M.H.)、ジャーナルオブアメリカケミカルソサイアティ103、3185頁(1981年);及びビューケージエスエル(Beaucage,S.L.) 、及びカルサース,エム.エッチ.、Tet. Lett.22(20)、1858−1862頁(1981年)。この化学では、合成すべき配列の3’−ヌクレオシドを、塩基−不安定なリンカーアームを経て固体支持体に結合させる。次のヌクレオシドを引き続いて前のヌクレオシドに結合させて固体支持体から離れて伸びる規定の配列の線状ポリマーを生成する。デオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイトの一般構造を2式に示す:

0005

ID=000005HE=080 WI=106 LX=0520 LY=0650
及びオリゴヌクレオチド合成の各サイクルにおいて用いられる化学段階を3式に示す:

0006

ID=000006HE=135 WI=108 LX=0510 LY=0300
(この式は、IRLプレスゲイト,エム.ジェイ.編、「オリゴヌクレオチド合成:アプラクチカルアプローチ」(1984年)、37頁から採用した)
40の塩基までの長さのオリゴヌクレオチドをこの方法で日常ベースで作ることができ及び106の塩基程に長い分子が作られた。この化学を採用する機械が今日市販されている。その他の化学種を合成オリゴヌクレオチドに共有結合させる方法を望む理由が多くある。オリゴヌクレオチドに結合させた蛍光染料は、放射性同位体が用いられる研究、診断、臨床方法から放射性同位体を排除し、保存寿命及び利用可能性を向上させることを可能にする。検出のための適当な技術及び計装の発達及び蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用は、他の現在骨の折れる実験室及び臨床技術の自動操作を可能にする。DNA開裂化学薬品、例えばシュルツ(Schultz) 等、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアティ、104、6861頁(1982年);ハーツバーグ,アール.ビー.(Hertzberg,R.P.)及びダーバン,ピー.ビー.(Dervan,P.B.) 、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアティ、104、313頁(1982年)に開示されているものの結合は、合成制限酵素であって、それらの特異性オリゴヌクレオチド配列によって支配されるものを作製することを可能にする。

0007

DNAの誘導体化(derivatization)の文献中にいくつかの報告がある。ビオチン基をウラシルの5位の脂肪族アミノ基に結合させた修飾ヌクレオシドトリホスフェートが開発された、ランガー(langer)等、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.78、6633−6637頁(1981年)。「ニックトランスレーション」と呼ばれるプロセスで、このヌクレオチド誘導体は効率的に二本鎖のDNAに加入される。このヌクレオチド誘導体は、一担DNA中に入れば、抗ビオチン抗体によって結合されることができ、次いで蛍光或は酵素法により検出用に用いることができる。ビオチン結合させたヌクレオシドをランガー等の方法によって中に加入させたDNAを断片化して一層小さい一本鎖及び二本鎖の断片にする。これらの断片はヌクレオシドサブユニットの配列に関して不均一であり及び分子量が変動し得る。ドレイパー(Draper)及びゴールド(Gold)、バイオケミストリー19、1774〜1781頁(1980年)は重亜硫酸塩触媒アミノ基転移反応により脂肪族アミノ基を導入し及びそれらを次いで蛍光標識と反応させることについて報告した。ドレーパー及びゴールドでは、アミノ基を直接ピリミジン塩基に結合させる。そのように位置させたアミノ基は水素結合を阻止し、このため、これらの物質ハイブリダイゼーション等において有用でない。また、この方法ではアミノ基を所望の位置に選択的に挿入することができない。チュ(Chu) 等、NucleicAcidsRes.11(18)、6513−6529頁(1983年)は、アミンをオリゴヌクレオチド或は核酸末端5’−リン酸に結合させる方法を報告した。この方法は、数多くの逐次反応及び精製工程を含み、実施するのに骨が折れ及びスケールアップするのが困難である。この方法は、また、単一のアミノ基をオリゴヌクレオチドの5’−末端に導入することに制限される。タケダ及びイケダ、Nucl. Acids Res. Symp. Series 15、101−104頁(1984年)は、アミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを調製するためのプトレシニルチミジンホスホトリエステル誘導体の合成及び使用について報告した。これらの物質は本明細書において報告するものと、アミノ含有部分が塩基部分に結合され、オリゴヌクレオチドの糖部分に結合されておらず、かつまた用いるDNA合成化学がホスホトリエステルであって、ホスホルアミダイトでなかった点で、異なる。

0008

本発明は1つ又はそれ以上の遊離脂肪族アミノ基を合成オリゴヌクレオチドに導入する一般的な方法を提供する。これらの基をオリゴヌクレオチドの任意の所望の位置に選択的に挿入することができる。それらは種々のアミノ反応官能価と容易にかつ特異的に反応し、それによって広範囲の化学種を位置特異的方法で共有結合させることを可能にする。このことを多数の蛍光性オリゴヌクレオチド誘導体を調製することによって例示する。この方式で調製した物質は、それらをDNA配列分析におけるプライマーとして用いることにより、かつまたDNA二本鎖形成におけるそれらの融解挙動を研究することによって例示する通りにDNAハイブリダイゼーション法において有効である。

0009

本発明に従えば、初めにヌクレオシドの糖部分に結合させた保護された脂肪族アミノ基を含有するヌクレオシド類似体の3’−O−ホスホルアミダイト誘導体を合成して、脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチドに導入する。このホスホルアミダイトを次いで固体支持体上に合成されているオリゴヌクレオチドと反応させる。アミノ保護基が塩基不安定であるならば、固相からのオリゴヌクレオチドの開裂及び塩基部分及び脂肪族アミノ基の脱保護のプロセスは、アミノ誘導体化されたオリゴヌクレオチドを生じる。アミノ保護基が酸不安定ならば、支持体からオリゴヌクレオチドを開裂させ及び塩基部分を脱保護する前に、無水の或は水性の酸で処理して除くことができるか或はオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィー精製を簡単にし及び改良するために開裂及び脱保護する間に、アミノ保護基を保持し、次いで後に水性酸で処理して取り去ることができ、どちらの場合でもアミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを生じる。

0010

より詳細には、本発明は本明細書中に詳細に述べる通りに保護しておいた脂肪族アミノ基をヌクレオシドの糖部分に結合させる修飾デオキシヌクレオシドホスホルアミダイトに関する。代表的なヌクレオシドの化学構造を4式に示す。

0011

ヌクレオシドは、複素環式ピリミジン或はプリン塩基炭素窒素結合によってリボース(R=R’=R”=OH)或はデオキシリボース(R=R’=OH;R”=H)のフラノース(糖)環に結合されていることを特徴とする。糖炭素原子番号付けナンバリング)は式において示す通りに1’〜5’である;すなわち、塩基は糖のC−1’に結合される。脂肪族アミノ基は一般原則として5つの環炭素の内のいずれに結合させてもよく、また、適当なホスフィンを適当に保護したアミノヌクレオシド遊離の3’−ヒドロキシル基と反応させて合成するそれぞれのホスホルアミダイト誘導体を構成する。

0012

簡単に言えば、本発明は下記式を有する新規保護アミノヌクレオシドを含む:

0013

ここで、Bは通常のヌクレオシドプリン或はピリミジン塩基、例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル或はヒポキサンチン或はそれらの保護誘導体、特にDNA化学合成において現在用いられているもの、すなわちN6 −ベンゾイルアデニン、N2 −イソブチリルグアニン、N4 −ベンゾイルシトシン、N6 −ジ−n−ブチルホルムアミジニルアデニン、N6 −(N−メチル−2−ピロリジンアミジニル)アデニン、N6 −スクシニルアデニン、N6 −フタロイルアデニン、N6 −ジメチルアセトアミジニルアデニン或はN2 −ジ−n−ブチルホルムアミジニルグアニン;或は一般的でないプリン或はピリミジン塩基、例えばプリン、イソシトシン或はキサンチン(3,7−ジヒドロ−1H−プリン−2,6−ジオン)或はそれらの保護誘導体;或は置換されたプリン或はピリミジン塩基である。このような置換基は下記を含み、これらに限定されない:シアノ、ハロハロアルキルカルボキシホルミルヒドロキシアルコキシアリールアジドメルカプトニトロ、カルボキシエステル及びカルボキサミド。このような塩基は下記を含み、これらに限定されない:6−クロロプリン、6−クロロ−2−フルオロプリン、2,6−ジアミノプリン、2−フルオロ−N6 −ヒドロキシアデニン、2,6−ジヒドロキシアミノプリン、8−ブロモアデニン、2−クロロアデニン、8−アジドアデニン、8−メルカプトアデニン、8−アミノアデニン、6−チオグアニン、2,6−ジクロロプリン、N,N−ジメチル−6−アミノプリン、N6 −ベンジルアデニン、1,3−ジメチルキサンチン、2−アミノ−6,8−ジヒドロキシプリン、6−メトキシプリン、6−メルカプトプリン、6−(2−ヒドロキシエチル)アミノプリン、N6 −(2−イソペンチル)アデニン、N6 −フルフリルアデニン(カイネチン)、5−ブロモメチルウラシル、5−ジブロモメチルウラシル、5−ヒドロキシメチルウラシル、5−ホルミルウラシル、5−フルオロウラシル5−ブロモウラシル、6−メチル−2−チオウラシル、5−ヒドロキシメチル−6−メチルウラシル、5−ヒドロキシウラシル(イソバルビツール酸)、5−メトキシウラシル、5−メチルシトシン、5−トリフルオロメチルウラシル、5−ニトロウシル、5−アミノウラシル、2−チオシトシン、2−アミノ−4,6−ジヒドロキシピリミジン、4−アミノ−2,6−ジヒドロキシピリミジン、2−アミノ−4−ヒドロキシ−6−メチルピリミジン、或は4−アミノ−6−ヒドロキシ−2−メルカプトピリミジン、或はそれらの保護誘導体。

0014

Bは、また、ヌクレオシド塩基類似体であってもよく、かかる類似体は通常のプリン或はピリミジン塩基をそれらの構造(原子の種類及び配置)が通常の塩基と同様であるが、通常の塩基の機能特性を追加して保持するか或はいくつか欠くかのいずれかになり得る点で、まねる。このような塩基類似体は下記を含み、これらに限定されない:イミダゾール及びその2−、4−、及び/又は5−置換誘導体(置換基は前に規定した通りである)、インドール及びその2−、3−、4−、5−、6−及び/又は7−置換誘導体、ベンズイミダゾール及びその2−、4−、5−、6−及び/又は7−置換誘導体、インダゾール及びその3−、4−、5−、6−及び/又は7−置換誘導体、ヒラゾール及びその3−、4−及び/又は5−置換誘導体、トリアゾール及びその4−及び/又は5−置換誘導体、テトラゾール及びその5−置換誘導体、ベンゾトリアゾール及びその4−、5−、6−及び/又は7−置換誘導体、8−アザアデニン及びその置換誘導体、8−アザグアニン及びその置換誘導体、6−アザチミン及びその置換誘導体、6−アザウラシル及びその置換誘導体、5−アザシトシン及びその置換誘導体、8−アザヒポキサンチン及びその置換誘導体、ピラゾロピリミジン及びその置換誘導体、3−デアザウラシル、オロト酸(2,6−ジオキソ−1,2,3,6−テトラヒドロ−4−ピリミジンカルボン酸)、バルビツール酸、尿酸、エテノアデニン、アロプリノール(4−ヒドロキシ−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン)、或はそれらの保護誘導体。

0015

Bは、また、塩基と糖のC−1’との通常のC−N結合をC−C結合に代えた「C−ヌクレオシド」になることができる。このような塩基は下記を含み、これらに限定されない:ウラシル(C−ヌクレオシドシュードウリジンにおける)、1−メチルウラシル、1,3−ジメチルウラシル、5(4)−カルボメトキシ−1,2,3−トリアゾール、5(4)−カルボキサミド−1,2,3−トリアゾール、3(5)−カルボキシメチルピラゾール、3(5)−カルボメトキシピラゾール、5−カルボエトキシ−1−メチルピラゾールマレイミド(C−ヌクレオシドショウドマイシン(Showdomycin) における)、3(4)−カルボキサミド−4(3)−ヒドロキシピラゾール(C−ヌクレオシドピラゾマイシンにおける)、或はそれらの保護誘導体。

0016

5式において、R1 、R2 、R3 、R4 及びR5 (時には、全体としてRn と呼ぶ)は下記の通りに規定する:R3 =H、R4 =OH、R1 、R2 及びR5 はH、O或はNHR’のいずれかであり、ここでR及びR’は適当な保護基であり;Rは通常低級アルキル或はアリールエーテル、例えばメチル、t−ブチルベンジル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジル、o−ニトロフェニル或はトリフェニルメチル、或は低級アルキル或はアリールエステル、例えばアセチル、ベンゾイル或はp−ニトロベンゾイル、或はアルキルアセタール、例えばテトラヒドロピラニル、或はシリルエーテル、例えばトリメチルシリル或はt−ブチル−ジメチルシリル、或はスルホン酸エステル、例えばp−トルエンスルホニル或はメタンスルホニルであり;R’は任意の通常、標準窒素保護基、例えば通常ペプチド合成において用いられているもの(ニューヨークアカミックプレス,イー.グロス及びジェイ.マイエンファー編集、「ザペプチズ:アナリシス、シンセシス、バイオロジー」、(1981年)、3巻、1〜99頁、アールガイガー(R. Geiger) 及びダブリュ.コーニング(W. Koning))であり;これは下記を含み、これらに限定されない:酸不安定性保護基、例えばホルミル、t−ブチルオキシカルボニル、N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル、2−クロロベンジルオキシカルボニル、4−クロロベンジルオキシカルボニル、2,4−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルオキシカルボニル、t−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、2−フェニルプロピル(2)オキシカルボニル、2−(4−ビフェニルプロピル(2)−オキシカルボニル、トリフェニルメチル、p−アニシルジフェニルメチル、ジ−p−アニシルフェニルメチル、2−ニトロフェニルスルフェニル或はジフェニルホスフィニル;塩基不安定性保護基、例えばトリフルオロアセチルグリシル、4−トルエンスルホニルエチル−オキシカルボニル、メチルスルホニルエチル−オキシカルボニル及び2−シアノ−t−ブチルオキシカルボニル;その他、例えばクロロアセチルアセトアセチル、2−ニトロベンゾイル、ジチアスクシノイルマレオイル、イソニコチニル、2−ブロモエチルオキシカルボニル及び2,2,2−トリクロロエチルオキシカルボニル、但し、R1 或はR2 がNHR’であるとき、R’は前述した基或はトリフルオロアセチル或は9−フルオロエニルメチルオキシカルボニルの内のいずれかであることを条件とする。

0017

R1 、R2 及びR5 の内の精々1つはNHR’になることができ及びR4 のみがOHになることができる。本明細書中上述した「R」保護基は、炭素原子を含有する場合、1〜約25の炭素原子を含有することができる。

0018

ケース
1) R1 =NHR’なら、その場合R2 =H;R5 はORか或はHのいずれかになることができる:この場合の分子を保護2’−アミノ−2’−デオキシアラビノヌクレオシドと呼ぶ。
2) R2 =NHR’なら、その場合R1 =H;R5 はORか或はHのいずれかになることができる;この場合の分子を保護2’−アミノ−2’−デオキシリボヌクレオシドと呼ぶ。
3) R5'=NHR’なら、その場合R1 或はR2 のいずれかはORになることができ、他方はHであり、或は両方がHになることができる;R1 がORであるなら、その分子を保護5’−アミノアラビノヌクレオシドと呼び;R2 がORであるなら、その分子を保護5’−アミノ−リボヌクレオシドと呼び;R1 及びR2 の両方がHであるなら、その分子を保護5’−アミノ−2’−デオキシリボヌクレオシドと呼ぶ。

0019

発明は更に下記式を有する新規なホスホルアミダイトを含む:

0020

5式において「B」によって表わす部分も、また、6式によって表わすホスホルアミダイトを合成する前に、ホスホルアミダイトをDNA鎖アセンブリー化学に適合させるために、適当に保護しなければならないことに注意しなければならない。このような保護は、ゲイト、「オリゴヌクレオチドシンセシス:アプラクチカルアプローチ」において十分に検討されており、通常、「B」の環外(exocyclic)アミノ基をアシル化或はアミノ化することを含み;かかるアミノ基はアセチル、ベンゾイル、イソブチリル、スクシニル、フタロイル或はアニソイルを含み、これらに限定されず;かかるアミジン基はジメチルホルムアミジン、ジ−n−ブチルホルムアミジン或はジメチルアセトアミジンを含み、これらに限定されず;“B”を他の反応性基、例えばカルボキシル、ヒドロキシル或はメルカプトで置換するならば、これらは同様に適当に保護される。本発明は別の面では、オリゴヌクレオチドを6式の保護アミノ誘導体化ヌクレオシドホスホルアミダイトと反応させる、固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成することを含む。

0021

加えて、本発明は少なくとも1つのアミノ誘導体化ヌクレオシドを6式のホスホルアミダイト前駆体を経て中に加入させた新規なオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、なお更に、上述した新規な脂肪族アミノ誘導体化された一本鎖のオリゴヌクレオチドを、発色団蛍光剤タンパク質酵素、I125 のような放射性原子或はその他の「標識」である検出可能な成分に結合させて成る。本発明の目的は新規な保護ヌクレオシドを提供することにある。本発明のなお別の目的は新規なホスホルアミダイトを提供することにある。本発明の別の重要な面では、前述したホスホルアミダイトと反応させた固体支持体に結合させた新規なオリゴヌクレオチドを提供することが目的である。本発明のなお別の目的は、標準の検出手段によって容易に検出し得る新規な標識を付けた(tagged)オリゴヌクレオチドを提供するにある。本発明のこれらや他の目的及び利点は、下記の一層ていねいかつ詳細な説明から当業者に明らかになろう。

0022

詳細な説明
下記の引用は、上記5式の化合物の調製において用いるアミノヌクレオシド出発原料リストを含む。
I)5’−アミノ−5’−デオキシチミジン及び5’−アミノ−5’−デオキシウリジン及び適当な中間体の合成(ケース3の実施態様):
1.ホルビッツ,ジェイ.ピ−.(Horwitz,J.P.)、トムソン,エー.ジェイ.(Tomson,A.J.) 、アーバスキ,ジェイ.エー.(Urbanski,J.A.) 及びチュア,ジェイ.(Chua,J.)ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアテイ27、3045−3048頁(1962)。

0023

II)2’−アミノ−2’−デオキシウリジン及び2’−アミノ−2’−デオキシシチジン及び適当な中間体の合成(ケース2の実施態様):
1.バーヘイドン,ジェイ.ピー.エッチ.(Verheyden,J.P.H.)、ワグナー,ディー.(Wagner,D.) 、及びモファット,ジェイ.ジー.(Moffatt,J.G.)、ジャーナルオブオーガニックケミストリー36、250−254頁(1971年)。
2.イマザワ,エム.,及びエックスタインエフ.(Eckstein,F.) 、ジャーナルオブオーガニックケミストリー44、2039−2041頁(1979年)。
3.ニューヨーク,ジョンウイリーアンドサンズ,タウンゼンド,エル.ビー.及びチブスン,アール.エス.編集、「ニュークリイクアシドケミストリー」(1978)、2巻、977−989頁、トランス,ピー.エフ(torrense,P.F.) 及びウイットコプ,ビー.(Witkop,B.) 。
4.ササキ,テイ.,ミナモト,ケイ.,スギウラ,テイ,及びミワ,エム.,ジャーナルオブオーガニックケミストリー41、3138−3143頁(1976年)。

0024

III) 2’−アミノ−2’−デオキシアデノシン及び2’−アミノ−2’−デオキシグアノシン及び適当な中間体の合成(ケース2の実施態様):
1.イマザワ,エム.及びエックスタイン,エフ,.ジャーナルオブオーガニックケミストリー、44、2039−2041頁(1979年)。
2.ホッブス,ジェイ.ビー.(Hobbs,J.B.)及びエックスタイン,エフ.,ジャーナルオブオーガニックケミストリー、42、714−719頁(1976年)。
3.ランガナサン,アール.(Ranganathan,R.)、テトラヘドロレターズ、15、1291−1294頁(1977年)。
4.メンゲル,アール(Mengel,R.) 及びウィドナー,エッチ(Wiedner,H.)、Chem.Ber. 109、433−443頁(1976年)。
5.ウルフロム,エム.エル(Wolfrom.M.L.)及びウィンクリー,エム.ダブリュ(Winkley,M.W.)、ジャーナルオブオーガニックケミストリー、32、1823−1825頁(1967年)。
6.イケハラ,エム.,ムラヤマ,テイ,及びミキ,エッチ,テトラヘドロンレターズ、49、4485−4488頁(1976年)。
7.イケハラ,エム.及びムラヤマ,テイ.Chem. Pharm. Bull.日本26、240−244頁(1978年)。

0025

IV)天然のヌクレオシドのいくつかのC−ヌクレオシド類似体の合成(全てのケースに関係する):
1.ドラスヘラス(De Las Heras)、エフ,ジー.(F.G.)、タム(Tam) 、S.Y−K.,クライン,アール.エス,ホックス,ジェイ.ジェイ.(Fox,J.J.)、ジャーナルオブオーガニックケミストリー、41、84−90頁(1976年)。
2.トルリッツ,ジー.(Trummlitz,G.)、レプケ,ディー.ビー、(Repke,D.B.)、モファット,ジェイ.ジー,ジャーナルオブオーガニックケミストリー、40、3352−3356頁(1975年)。
3.チュ,シー.ケー.,ライヒマン,ユー.(Reichman,U.) 、ワタナベ,ケー.エー.及びホックス,ジェイ.ジェイ., J.Heterocyclic Chem. 14、1119−1121頁(1977年)。
4.オガワ,ティ.,パーネット,エー.ジー.(Pernet,A.G.) 及びハネシアン,エス.(Hanessian,S.)、テトラヘドロンレターズ、37、3543−3546頁(1973年)。
5.「ヌクレオシズ,ヌクレオチズアンドゼアバイオロジカルアプリケーションズ」、ジェイ.エル.ライドアウト(J.L.Rideout) 、ディー.ダブリュ.ヘンリー及びエル.エム.ビーチャム(L.M.Beacham)III編集、アカデミックプレス、ニューヨーク(1983年)。

0026

V)グリコレーション及びトランスグリコシデーション反応によるアミノ糖及びアミノヌクレオシドの合成(全てのケースに関係する):
1.アズマ,ティ.及びイシヨノ,ケー.Chem.Pharm.,Bull. 日本25、3347−3353頁(1977年)。
2.ハシズメ,ティ.及びイワムラ,エッチ,テトラヘドロンレターズ、35、3095−3102頁(1965年)。
3.アニスザマン,エー.ケイ.エム.(Anisuzzaman,A.K.M.)及びウイッスラー,アール.エル(Whistler,R.L.) 、ジャーナルオブオーガニックケミストリー、37、3187−3189頁(1972年)。
4.ビショップ,シー.ティ.(Bishop,C.T.) 及びクーパー,エフ.ピー.(Cooper,F.P.) 、カナディアンジャーナルオブケミストリー、41、2743−2758頁(1963年)。
5.ウンガー,エフ.エム.(Unger,F.M.)、クリスチャン,アール.及びワルドスタテン,ピー(Waldstatten,P.)、テトラヘドロンレターズ、50、4383−4384頁(1977年)。

0027

6.ウンガー,エフ.エム.,クリスチャン,アール.及びワルドスタッテン,ピー.,テトラヘドロンレターズ、7、605−608頁(1979年)。
7.ボベック,エム.(Bobek,M.)及びマーチンブイ.,テトラヘドロンレターズ、22、1919−1922頁(1978年)。
8.ウルフロム,エム.エル.,シャフィザデー,エフ.(Shafizadeh,F.) 、アームストロング,アール.ケイ.及びシェンハン,テイ.エム(Shen Han,T.M.) 、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアテイ、81、3716−3719頁(1959年)。
9.ウルフロム,エム.エル.,シャフィザデー,エフ.及びアームストロング,アール.ケー.,ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアテイ、80、4885−4888頁(1958年)。
10.ウルフ,ジー.(Wulff,G.)、ローレ,ジー.及びクルーガー,ダブリュ,Angew. Chem.82、455−456頁(1970年)。
11.シュロイダー,エル.アール.(Schroeder,L.R.)及びグリーン,ジェイ.ダブリュ.,ジャーナルオブケミカルソサイアテイC、530−531頁(1966年)。

0028

5式の範囲内の好ましい化合物群を下記によって与える。
物質番号1の組成:下記の一般式を有する5’−アミノ−5’−デオキシチミジンの5’−N−保護した誘導体:

0029

式は、また、化合物(X=H)を活性化された適当に保護されたアミノ酸誘導体と反応させて生成する関連のある化合物群を包含する;この場合、VはX=Y−NH−(CHQ)n −COによって表わされ、ここで、Y=窒素保護基、特に本明細書中前にXについて好ましいとしてリストしたもの、トリフルオロアセチル或は9−フルロエニル−メトキシメチルオキシカルボニル;Q=任意の通常のアミノ酸側鎖;n=1〜約12、通常n<=6;n=1の場合、Qは下記のような部分を含み、これらに限定されない:H(アミノ酸グリシンから)、メチル(アミノ酸アラニンから)、イソプロピルバリン)、ベンジル(フェニルアラニン)、p−ヒドロキシベンジルチロシン)、カルボキシメチルアスパラギン類)、カルボキシエチルグルタミン酸)、4−アミノブチルリシン)、イミダゾリル−メチル(ヒスチジン)、インドリルメチルトリプトファン)、メルカプトメチルシスチン)或はヒドロキシメチル(セリン);n>1の場合、Qは通常Hであり;例えばn=2の時、対応するアミノ酸はベータ−アラニンであり;n=3の時、4−アミノ酪酸;n=5のとき、6−アミノヘキサン酸、QがOH、SH、CO2 H或はNH2 のような反応性部分を含有するならば、これらもまた標準の基で適当に保護する(このような基の十分な記述については、ガイガー及びコーニング、「ザペプチズ:アナラシス、シンセシス、バイオロギー」を参照)。この化合物群では、保護されたアミノ基をヌクレオシドの糖環から空間的に取り去って、その反応性を向上させるか、或はアミノ基に付されるべき「標識」からDNA鎖を空間的に分離する。

0030

式は、また、線状様式で結合された1より多いアミノ酸(ペプチドと呼ぶ)を化合物(X=H)に結合させることによってこの後者の群に関連した化合物群を包含する;この場合、XはX=Y−[NH−(CHQi)n −CO]m によって表わされ、ここで、Y及びnは本明細書中前に規定した通りであり、種々のQiは本明細書中前にQについて規定した通りであり、i=1〜mの最大値、m=1〜約100;m=1は前のパラグラフにおいて規定した群を表わす。

0031


5’−O−p−トルエンスルホニルチミジン、5’−アジド−5’−デオキシチミジン及び5’−アミノ−5’−デオキシチミジン出発原料の合成は、ホルビッツ,ジェイ.ピー.,トムスン,エー.ジェイ.,アーバンスキ,ジェイ.エー.及びチュア,ジェイ.,ジャーナルオブオーガニックケミストリー、27、3045−3048頁(1962年)に示されている。

0032

例1
下記式を有する5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン:

0033

5’−アミノ−5’−デオキシチミジン(2.41g、10ミリモル)を2回無水ピリジン(各回25ml)と共に共蒸発させ(coevaporate) 、次いで無水ピリジン(100ml)中に懸濁させた。トリエチルアミン(2.1ml)、N,N−ジメチルアミノピリジン(0.80mg:アルドリッチケミカルカンパニー)及びp−アニシル−クロロジフェニルメタン(4.68g、15.2ミリモル;アルドリッチケミカルカンパニー)を加えた。反応混合物を水分及び光から保護し及び黄色−オレンジ溶液を室温で一晩撹拌した。反応を次いで中で冷却し及び冷飽和重炭酸ナトリウム水溶液(100ml)を加えて過剰のトリチル化(tritylating) 剤を分解した。30分した後に、混合物を1リットル分液漏斗に移し及びエチルアセテート(200ml分)で2回抽出した。一緒にしたエチルアセテート層を水(100ml分)で2回及び飽和塩化ナトリウム水溶液(100ml)で1回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で回転蒸発乾固させた。ガム状のオレンジ−黄色生成物を次いで無水トルエン(100ml分)と共に2回共蒸発させて残留ピリジンを除いた。残分を最少量のエチルアセテートに溶解し及びヘキサン中に充填した中性アルミナ(活性グレードV、15重量%;ホエルムファーマ(Woelm Pharma GmbHアンドカンパニー)のカラム(100cm×3.0cm)に加えた。カラムを初めにエチルアセテート:ヘキサン(1:1v/v)で、鮮黄色物質が全てカラムから溶出されるまで溶出し、次いで純エチルアセテートで溶出した。生成物を含有する留分をプールし及び回転蒸発乾固させた。無色に近いガム状残分を少容量のエチルアセテートに溶解し及び室温のヘキサン(400ml)中に沈殿させた。生成物を濾過し及び真空デシケータ内で乾燥して結晶化されない白色粉末4.53g(8.8ミリモル、88%)となった。精製した生成物をシリカゲルLQDFプレートピアースケミカルカンパニー)上でアセトニトリル:水(9:1v/v)で展開させるTLC分析は、短波UV検出により1つのスポットRf0.87を示し、これはプレートに過塩素酸エタノール溶液(3:2v/v)を吹付けた後にp−アニシルジフェニルメチルカチオン特有のオレンジ−黄色となった。生成物の構造を更にペルジュウテリウム置換した(perdeuterated)ジメチルスルホキシドメルクアイソトープス)で 1H NMR分光分析法によって確認した。

0034

同様に、下記の化合物を調製する:
1) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイル−アデノシンから5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイルアデノシン。
2) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N2 −イソブチリルグアノシンから5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N2 −イソブチリルグアノシン。
3) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N4 −ベンゾイルシスチジンから5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N4 −ベンゾイルシチジン
4) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジンから5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジン。
5) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシンから5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシン。
6) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシウリジンから5’−N−(p−アニシルジフェニルメチル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシウリジン。
7) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシンから5’−N−(p−アニシルジフェニルメチル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシン。
8) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N6 −ベンゾイル−5’−デオキシアデノシンから5’−N−(p−アニシルジフェニルメチル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N6 −ベンゾイル−5’−デオキシアデノシン。
9) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N4 −ベンゾイル−5’−デオキシシトシンから5’−N−(p−アニシルジフェニルメチル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N4 −ベンゾイル−5’−デオキシシトシン。
10) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシンから5’−N−(p−アニシルジフェニルメチル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシン。

0035

11) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイルアデノシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイルアデノシン。
12) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N2 −イソブチリルグアノシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N2 −イソブチリルグアノシン。
13) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N4 −ベンゾイルシチジンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイルシチジン。
14) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジン。
15) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシン。
16) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシウリジンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシウリジン。
17) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシン。
18) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N6 −ベンゾイル−5’−デオキシアデノシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N6 −5’−デオキシアデノシン。
19) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N4 −ベンゾイル−5’−デオキシシトシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N4 −ベンゾイル−5’−デオキシシトシン。
20) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシンから5’−N−トリフェニルメチル−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシン。

0036

例2
下記式を有する5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン:

0037

5’−アミノ−5’−デオキシチミジン(1.21g、50ミリモル)及びN−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサン酸p−ニトロフェニルエステル(2.12g、5.5ミリモル;下記の注を参照)を無水DMF(25ml)に溶解し及び3日室温で撹拌した。次いで、溶液を減圧下で回転蒸発乾固させて黄色固体を生じ、これを乾燥エチルエーテルを何回か変えて粗粉砕した。白色粉末状生成物を、次いで濾過し、ジエチルエーテルでよく洗浄し、真空デシケーター中で乾燥して2.31g(4.7ミリモル、95%)となった。
注:N−ベンゾイルオキシカルボニル−6−アミノヘキサン酸p−ニトロフェニルエステルは、エチルアセテート溶液中のN−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサン酸(シグマケミカルカンパニー)p−ニトロフェノール(アルドリッチケミカルカンパニー)及びN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(アルドリッチケミカルカンパニー)から標準技法によって合成した。

0038

同様に、下記の化合物を調製する:
1) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイル−アデノシンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N6 −ベンゾイルアデノシン。
2) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N2 −イソブチリルグアノシンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N2 −イソブチリルグアノシン。
3) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N4 −ベンゾイルシチジンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシ−N4 −ベンゾイルシチジン。
4) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジン。
5) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシン。
6) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシン。
7) 5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシン。
8) 5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジンから5’−N−(N−ベンジルオキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル)−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジン。

0039

物質番号2の組成:下記の一般式を有する物質番号1の組成において説明した化合物の3’−O−ホスホルアミダイト:

0040

ここで、X=前のセクション(物質番号1の組成)において規定した通りであり、
R6 =低級アルキル、好ましくはメチル或はイソプロピルのような低級アルキル、或は非芳香族窒素含有複素環、例えばモルホリノピペリジノピロリジノ或は2,2,6,6−テトラメチルピペリジノ、
R7 =メチル、ベータ−シアノエチル、p−ニトロフェネチル、o−クロロフェニル或はp−クロロフェニル。

0041


注:下記のホスホルアミダイト化合物を合成するのに用いたホスフィン出発原料を文献の手順に従がって調製した:
1)マクブリッジ,エル.ジェイ(Mc Bridge) 及びカルザース,エム.エッチ.,テトラヘドロンレターズ24、245−248頁(1983年)。
2)シンハ,エヌ.デイ.(Sinha, N.D.) 、ビアーナト,ジェイ.(Biernat,J.)、マクマナス,ジェイ.(Mc Manus,J.) 及びコスター,エッチ.(Koster,H.),Nucl. AcidsRes.,12、4539−4557頁(1984年)。

0042

例3
下記式を有する5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト:

0043

5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン(0.785g、1.5ミリモル)を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.3ml)を含有するドライジクロロメタン(10mg、五酸化リン、次いで水素化カルシウムから蒸留して乾燥した)に乾燥アルゴン雰囲気下で溶解した。クロロ−N,N−ジ−イソプロピルアミノ−ベータ−シアノエトキシホスフィン(0.70ml、3.0ミリモル)を注射器から溶液に約1分かけて滴下し及び反応を室温で撹拌した。エチルアセテート:トリエチルアミン(99:1v/v)中で展開させたシリカゲル60F−254プレート上のTLCは、反応が30分後に完結したことを示した。次いで、無水メタノール(0.1ml)を加えて過剰のホスフィチル化(phosphitylating) 剤を分解し、反応を更に数分撹拌した。反応混合物を、次いで、エチルアセテート(50ml、あらかじめ10%(w/v)の冷炭酸ナトリウム水溶液50mlで洗浄した)による分液漏斗に移し、10%(w/v)の冷炭酸ナトリウム水溶液(80ml分)で2回及び飽和冷塩化ナトリウム水溶液(80ml分)で2回洗浄した。有機溶液を、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で回転蒸発させて透明なフォームになった。フォームをドライエチルアセテート(10−15ml)に溶解し、この溶液を−78℃(ドライアイスアセトン浴)のヘキサン(200ml)に滴下した。沈降した生成物を濾過し、−78℃のヘキサンでよく洗浄し、真空デシケーター内で乾燥して白色粉末状固体0.932g(1.31ミリモル、87%)を生じた。生成物の構造を更にペルジュウテリウム置換したアセトニトリル中の 1H NMR分光分析法によって確認した。ペルジュウテリウム置換したアセトニトリルにおける31P NMR分光分析法は、ジアステレオマーホスホルアミダイト生成物について予期される通りの147.74及び147.53ppmにおける2つの一重線シングレット)(ペルジュウムテリウム置換したアセトニトリル中のリン酸に対して)及び微量のみ(<5%)の他のリン含有不純物を示した。シリカゲルLQ6DFプレート上の上記溶媒系におけるTLCは、ジアステレオマー生成物により、短波UV検出下で2つの密接に移動するスポット、Rf 0.87及び0.92を示した。これらのスポットは、過塩素酸:エタノール溶液(3:2v/v)に暴露した際に、p−アニシルジフェニルメチルカチオンに特有の黄−オレンジ色となった。

0044

クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノ−ベータ−シアノエトキシホスフィンの代りにクロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィンを用いて上記の例を繰り返した場合に、5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを得た。

0045

同様に下記の化合物を調製する:
1) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
2) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
3) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチルモルホリノホスホルアミダイト。
4) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−ベータ−シアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。
5) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
6) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
7) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
8) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−2’,5’−ジデオキシイノシン−3−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
9) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’,5’−ジデオキシアデノシン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0046

10) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’,5’−ジデオキシシトシン−3’−O−メチルモルホリノホスホルアミダイト。
11) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’,5’−ジデオキシアデノシン−3’−O−ベータ−シアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。
12) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシウリジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
13) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−2’−テトラヒドロピラニル−5’−デオキシイノシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
14) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−2’−テトラヒドロピレニル−N6 −ベンゾイル−5’−デオキシアデノシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
15) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−2’−テトラヒドロピレニル−N4 −ベンゾイル−5’−デオキシシトシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
16) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル5’−アミノ−2’−テトラヒドロピレニル−N2 −イソブチリル−5’−デオキシグアノシン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0047

物質番号3の組成:下記の一般式を有する、5式の範囲内の好ましい化合物群である5’−O−保護された2’−アミノ−2’−デオキシウリジン及び5’−O−保護された2’−N−アミノアシル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジンの2’−N−保護された誘導体:

0048

ここで、R=トリフェニルメチル(トリチル)、p−アニシルジフェニルメチル(モノメトキシトリチル、MMT)、ジ−p−アニシルフェニルメチル(ジメトキシトリチルDMT)9−フェニルキサンテニル(ピキシル)、ジ−O−アニシル−1−ナフチルメチル、p−アニシル−1−ナフチルフェニルメチル等:
X=5式に伴なう発明の一般的な説明において規定した通りの標準の窒素保護基;好ましくは、X=トリフルオロアセチル(Tfa)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、トリフェニルメチル(トリチル)或はp−アニシルジフェニルメチル(また、モノメトキシトリチル、MMTとも呼ばれる)。

0049

式は、また、化合物(X=H)を活性化された適当に保護されたアミノ酸誘導体と反応させて生成する関連のある化合物群を包含する;この場合、XはX=Y−NH−(CHQ)n −COによって表わされ、ここで、Y=本明細書中前にXについて規定した通りの標準の窒素保護基、特に本明細書中前にXについて好ましいとしてリストしたもの;Q=任意の通常のアミノ酸側鎖;n=1〜約12、通常n<=6;n=1の場合、Qは下記のような部分を含み、これらに限定されない:H(アミノ酸グリシンから)、メチル(アミノ酸アラニンから)、イソプロピル(バリン)、ベンジル(フェニルアラニン)、p−ヒドロキシベンジル(チロシン)、カルボキシメチル(アスパラギン酸)、カルボキシエチル(グルタミン酸)、4−アミノブチル(リシン)、イミダゾリル−メチル(ヒスチジン)、インドリルメチル(トリプトファン)、メルカプトメチル(シスチン)或はヒドロキシメチル(セリン);n>1の場合、Qは通常Hであり;例えばn=2の時、対応するアミノ酸はベータ−アラニンであり;n=3の時、4−アミノ酪酸;n=5のとき、6−アミノヘキサン酸。QがOH、SH、CO2 H或はNH2のような反応性部分を含有するならば、これらもまた標準の基で適当に保護する(このような基の十分な記述については、ガイガー及びコーニング、「ザヘプチズ:アナラシス、シンセシス、バイオロギー」を参照)。この化合物群では、保護されたアミノ基をヌクレオシドの糖環から空間的に取り去って、その反応性を向上させるか、或はアミノ基に付されるべき「標識」からDNA鎖を空間的に分離する。

0050

式は、また、線状様式で結合された1より多いアミノ酸(ペプチドと呼ぶ)を化合物(X=H)に結合させることによってこの後者の群に関連した化合物群を包含する;この場合、XはX=Y−[NH−(CHQi)n −CO]m によって表わされ、ここで、Y及びnは本明細書中前に規定した通りであり、種々のQiは本明細書中前にQについて規定した通りであり、i=1〜mの最大値、m=1〜約100;m=1は前のパラグラフにおいて規定した群を表わす。

0051


出発原料2’−アジド−2’−デオキシウリジン、2’−アミノ−2’−デオキシウリジン、2’−N−(N−ベンジルオキシ−カルボニルグリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン、2’−N−グリシル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン及び2’−トリフルオロアセトアミド−2’−デオキシウリジンの合成は下記に示されている:バーヘイドン,ジェイ.ピー.エッチ.,ウェイジナー,デイ.(Wagener,D)及びモファット,ジェイ.ジー.,ジャーナルオブオーガニックケミストリー、36、250−254頁(1971年)。シャーマ,アール.エー.(Sharma,R.A.) ,ボベク,エム.(Bobek,M.)及びブロック,エー.(Bloch,A.), J.Med.Chem. 18、955−957頁(1975年)。イマザワ,エム.及びエックスタイン,エフ.,ジャーナルオブオーガニックケミストリー、44、2039−2041頁(1979年)。

0052

下記の他は、些細な点に小さい変更のみを行ない、全般的に上記文献に見られる手順に従がった:
1) 2’−アジド−2’−デオキシウリジンをシリカゲルの代りにメタノールアセトン(1:1v/v)中の中性アルミナのカラムで精製した;
2) 2’−アミノ−2’−デオキシウリジンは、トリフェニルホスフィン及びアンモニアを使用する代りに、炭素上にパラジウム5%を付着した触媒の存在において2’−アジド−2’−デオキシウリジンを水素還元して得た;
3) 2’−アミノ−2’−デオキシウリジンのN−トリフルオロアセチル化はp−ニトロフェニルトリフルオロアセテートを用いた後に、S−エチルチオールトリフルオロアセテートを使用する代りに、クロロホルム−メタノール(6:1v/v)中のシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって行なった。

0053

例4
下記式を有する5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン:

0054

2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン(1.25g、3.8ミリモル)を無水ピリジン(50ml)に溶解し、ジ−p−アニシルフェニルメチルクロリド(1.42g、4.2ミリモル;アメリカンバイオニュークリアーコーポレーション)を加えた。

0055

オレンジ溶液を、次いで、くらがりで室温において一晩撹拌した。水(10ml)を加え、混合物を更に1時間撹拌した。溶媒を40℃で回転蒸発させて除いて樹脂状生成物とし、これをトルエン(100ml分)で2回共蒸発させた。フォーム状生成物を水(50ml)とエチルアセテート(100ml)との間に分配させ、層を分離し、有機層を水(50ml)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50ml)で抽出した。エチルアセテート溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて黄色フォームになった。このフォームを少容量のエチルアセテート:トリエチルアミン(9:1v/v)に溶解し及び同じ溶媒中に注入したシリカゲルのカラム(3cm×25cm)にかけた。カラムをエチルアセテート:トリエチルアミン(9:1v/v)で溶出し:生成物を含有する留分をプールし及び蒸発させて透明なガラス状固体になった。生成物を最少容量のエチルアセテート(約10ml)に溶解し及び室温のヘキサン(100ml)に沈殿させた。ゼラチン状の沈殿を濾過し及び真空デシケーター内で乾燥して結晶化されない白色粉末2.06g(3.3ミリモル、86%)となった。クロロホルム:エタノール(9:1v/v)で展開させたシリカゲル60F−254プレート上の精製した生成物のTLC分析は短波UV検出により1つのスポット、Rf0.60を示し、これはプレートに過塩素酸:エタノール溶液(3:2v/v)を吹付けた後に、ジ−n−アニシルフェニルメチルカチオン特有の鮮オレンジ色となった。生成物の構造を更にペルジュウテリウム置換したジメチルスルホキシド中の 1H NMR分光分析法によって確認した。ジュウテリウム置換したクロロホルム(アルドリッチケミカルカンパニー)中のフッ素(19F)NMR分光分析法は、単一のトリフルオロアセチル基について予期される通りに6.03ppmに1つの一重線を示した(ジュウテリウム置換したクロロホルム中のトリフルオロ酢酸に対して)。

0056

同様に、下記の化合物を調製する:
1) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン。
2) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン。
3) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン。
4) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン。
5) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン。
6) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン。
7) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン。
8) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン。
9) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン。

0057

例5
下記式を有する5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチルグリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン:

0058

2’−N−グリシル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン(1.2g、4.0ミリモル)及びp−ニトロフェニルトリフルオロアセテート(1.2g、5.1ミリモル;アルドリッチケミカルカンパニー)を無水DMF(20ml)に溶解し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を次いで50℃で回転蒸発乾固させ、ガム状の黄色残分をエチルアセテート:メタノール(95:5v/v)中のシリカゲル60のカラム(2.5cm×10インチ(25cm))でフラッシュクロマトグラフィーにかけた(スチル,ダブリュ.シー.(Still,W.C.),カーン,エム.(Kahn.M.) 及びミトラ,エー.(Mitra,A.)ジャーナルオブオーガニックケミストリー、43、2923−2925頁(1978年)を参照)。生成物を含有する留分を蒸発乾固させて白色フォーム(1.5g、3.7ミリモル、93%)となり、これを結晶化させずに直接次の工程で使用した。

0059

上記の物質(1.5g、3.7ミリモル)をドライピリジン(30ml分)で2回蒸発させ、残分をドライピリジン(50ml)に溶解した。N,N−ジメチル−ラミノピリジン(2.3mg、0.19ミリモル)、トリエチルアミン(0.8mg、5.2ミリモル)及びジ−p−アニシルフェニルメチルクロリド(1.54g、4.4ミリモル)を加え、オレンジ混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、重炭酸ナトリウム水溶液(5%w/v、50ml)を加え、混合物をもう15分撹拌した。混合物をエチルアセテート(100ml分)で2回抽出し、一緒にしたエチルエセテート層を1度飽和塩化ナトリウム水溶液(50ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。トルエン(100ml分)と2回共蒸発させた後に、フォーム状黄色生成物を、クロロホルム:メタノール:トリエチルアミン(89:10:1v/v)を溶離剤として用いてシリカゲルのカラム(3cm×25cm)のクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する留分をプールし及び蒸発乾固させて透明なガラス状固体になった。この物質を最少のエチルアセテート(約10ml)に溶解し及び室温のヘキサン(300ml)に沈殿させた。生成物を濾過し及び真空デシケーター内で乾燥して粉末状白色固体となり、これはベンゼン/ヘキサンから結晶化することができた。ジクロロメタン:メタノール(92:8v/v)中で展開させたシリカゲル60F−254プレート上の精製した生成物のTLC分析は短波UV検出により1つのスポット、Rf0.33を示し、これはプレートに過塩素酸:エタノール溶液(3:2v/v)を吹付けた後に、ジ−n−アニシルフェニルメチルカチオン特有の鮮オレンジ色となった。生成物の構造を更にペルジュウテリウム置換したジメチルスルホキシド中の 1H NMR分光分析法によって確認した。ジュウテリウム置換したクロロホルム中の19F NMR分光分析法は、単一のトリフルオロアセチル基について予期される通りに5.98ppmに1つの一重線を示した(ジュウテリウム置換したクロロホルム中のトリフルオロ酢酸に対して)。

0060

同様に、下記の化合物を調製する:
1) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロ−アセチルグリシル)−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン。
2) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロ−アセチルグリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン。
3) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロ−アセチルグリシル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシシアデノシン。
4) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロ−アセチルグリシル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシトノシン。
5) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン。
6) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン。
7) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン。
8) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン。
9) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−9−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン。

0061

物質番号4の組成:下記の一般式を有する、物質番号3の組成において説明した化合物の3’−O−ホスホルアミダイト:

0062

ここで、R=前のセクション(物質番号3の組成)において規定した通りである;X=前のセクション(物質番号3の組成)において規定した通りである;R6 =低級アルキル、好ましくはメチル或はイソプロピルのような低級アルキル、或は非芳香族窒素含有複素環、例えばモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ或は2,2,6,6−テトラメチルピペリジノ,R7 =メチル、ベータ−シアノエチル、p−ニトロフェネチル、o−クロロフェニル或はp−クロロフェニル。

0063


このセクションで説明する手順は、「物質番号2の組成」なる表題のセクションで説明したのと本質的に同じである。下記のホスホルアミダイト化合物を合成するのに用いたホスフィン出発原料は、そのセクションで挙げた文献参考資料に従がって調製した。

0064

例6
下記式を有する5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト:

0065

5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン(0.95g,1.5ミリモル)を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.3ml,5.0ミリモル)を含有するドライジクロロメタン(10ml、五酸化リン、次いで水素化カルシウムから蒸留して乾燥した)に溶解した。溶液を乾燥アルゴン雰囲気下室温で撹拌し及びクロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン(0.45ml,2.4ミリモル)を注射器から約1分かけて滴下した。エチルアセテート:トリエチルアミン(99:1v/v)において展開させたシリカゲル60F−254プレート上のTLCは、反応が30分後に完結したことを示した。次いで、無水メタノール(0.1ml)を加えて過剰のホスフィチル化剤を分解し、反応を更に数分撹拌した。反応混合物を、次いで、エチルアセテート(50ml,あらかじめ10%(w/v)の冷炭酸ナトリウム水溶液50mlで洗浄した)による分液漏斗に移し、10%(w/v)の冷炭酸ナトリウム水溶液(80ml分)で2回及び飽和冷塩化ナトリウム水溶液(80ml分)で2回洗浄した。有機溶液を、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で回転蒸発させて透明なフォームになった。フォームをドライエチルアセテート(10−15ml)に溶解し、この溶液を−78℃(ドライアイス−アセトン浴)のヘキサン(200ml)に滴下した。沈降した生成物を濾過し、−78℃のヘキサンでよく洗浄し、真空デシケーター内で乾燥して白色粉末状固体1.04g(1.3ミリモル,87%)を生じた。生成物の構造をペルジュウテリウム置換したアセトニトリル中の 1H NMR分光分析法によって確認した。ペルジュウテリウム置換したアセトニトリルにおける31P NMR分光分析法は、ジアステレオマーホスホルアミダイト生成物について予期される通りの152.11及び150.43ppmにおける2つの一重線(ペルジュウテリウム置換したアセトニトリル中のリン酸に対して)及び極めて微量のみ(<1%)の他のリン含有不純物を示した。ジュウテリウム置換したクロロホルムにおける19F NMR分光分析法も、また、隣接するキラルリンのわずかな影響により、0.42及び0.38ppmにおいて2つの一重線を示した(ジュウテリウム置換したクロロホルム中のトリフルオロ酢酸に対して)、シリカゲルLQ6DFプレートの上記溶媒系におけるTLCは、短波UV検出下で1つだけのスポット、Rf0.96を示した。このスポットは、過塩素酸:エタノール溶液(3:2v/v)に暴露した際に、ジ−p−アニシルフェニル−メチルカチオンに特有の鮮オレンジ色となった。

0066

同様に、下記の化合物を調製する:
1) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
2) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
3) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−モルホリノホスホルアミダイト。
4) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。
5) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
6) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
7) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

0067

8) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
9) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−メチル−モルホリホスホルアミダイト。
10) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−3’−O−ベータ−シアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。
11) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−ベータシアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
12) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニルメチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
13) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
14) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0068

15) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−モルホリノホスホルアミダイト。
16) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。
17) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
18) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
19) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
20) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
21) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−メチル−モルホリノホスホルアミダイト。
22) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。
23) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(−9−フルオレニル−メチル−オキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0069

例7
下記式を有する5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチルグリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト:

0070

5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン(1.07g,1.5ミリモル)を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.3ml,5.0ミリモル)を含有するドライジクロロメタン(10ml、五酸化リン、次いで水素化カルシウムから蒸留して乾燥した)に溶解した。溶液を乾燥アルゴン雰囲気下室温で撹拌し及びクロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン(0.45ml,2.4ミリモル)を注射器から約1分かけて滴下した。エチルアセテート:トリエチルアミン(99:1v/v)において展開させたシリカゲル60F−254プレート上のTLCは、反応が30分後に完結したことを示した。無水メタノール(0.1ml)を加えて過剰のホスフィチル化剤を分解し、反応を更に数分撹拌した。反応混合物を、次いで、エチルアセテート(50ml、あらかじめ10%(w/v)の冷炭酸ナトリウム水溶液50mlで洗浄した)による分液漏斗に移し、10%(w/v)の冷炭酸ナトリウム水溶液(80ml分)で2回及び飽和冷塩化ナトリウム水溶液(80ml分)で2回洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で回転蒸発させて透明なフォームになった。フォームをドライエチルアセテート(10−15ml)に溶解し、この溶液を−78℃(ドライアイス−アセトン浴)のヘキサン(200ml)に滴下した。沈降した生成物を濾過し、−78℃のヘキサンでよく洗浄し、真空デシケーター内で乾燥して白色粉末状固体1.23g(1.4ミリモル、93%)を生じた。生成物の構造をペルジュウテリウム置換したアセトニトリル中の 1H NMR分光分析法によって確認した。ペルジュウテリウム置換したアセトニトリルにおける31P NMR分光分析法は、ジアステレオマーホスホルアミダイト生成物について予期される通りの151.25及び148.96ppmにおける2つの一重線(ペルジュウテリウム置換したアセトニトリル中のリン酸に対して)及び極めて微量のみ(<2%)の他のリン含有不純物を示した。ジュウテリウム置換したクロロホルムにおける19F NMR分光分析法は0.66ppmにおける1つの一重線を示した(ジュウテリウム置換したトリフルオロ酢酸に対して)。シリカゲルLQ6DFプレート上の上記溶媒系におけるTLCは、短波UV検出下で1つのみのスポット、Rf0.91を示した。このスポットは、過塩素酸:エタノール溶液(3:2v/v)に暴露した際に、ジ−p−アニシルフェニル−メチルカチオンに特有の鮮オレンジ色となった。

0071

同様に、下記の化合物を調製する:
1) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
2) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
3) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−モルホリノホスホルアミダイト。
4) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。
5) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
6) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
7) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
8) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0072

9) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−メチルモルホリホスホルアミダイト。
10) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
11) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
12) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−ベータ−シアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。
13) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(N−9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
14) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(N−9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
15) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(N−9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
16) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’N−(N−9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−ベータ−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。

0073

発明の用途
1) 5’−アミノ末端を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成。保護5’−アミノ−ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いて5’−アミノ末端を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するのに含まれる段階を例8の式に示し及び下記のテキストにおいて説明する。標準のホスホルアミダイトDNA合成技法(英国、オックスホード、IRLプレス、ゲイト、エム.ジェイ.,「オリゴヌクレオチドシンセシス:アプラクチカルアプローチ」(1984)、35−82頁、アトキンソンテイ.(Atkinson T.) 及びスミス,エム及びその中に引用されている参考文献を参照)を用いて、保護5’−アミノ−ヌクレオシド−3’−O−ホスホルアミダイト、好ましくはBn=チミン、X=MMT、R6 =イソプロピル、R7 =メチル或はベータ−シアノエチル、最も好ましくはベータ−シアノエチルであるものを、固体支持体に結合された成長オリゴデオキシリボヌクレオチドの5’−ヒドロキシルにカップリングさせる。簡単に言えば、この手順は無水のアセトニトリル溶液中の保護5’−アミノ−ヌクレオシド3’−O−ホスホルアミダイトを支持体に結合したオリゴヌクレオシドと、不活性雰囲気下1H−テトラゾールの存在において反応させ、支持体上の生成物から過剰の反応体を洗い去り、次いで、塩基性テトラヒドロフラン水溶液中のヨウ素溶液ホスファイト生成物を酸化して所望のホスフェートにすることから成る。支持体に結合したオリゴヌクレオチドに対し、10〜20倍過剰のホスホルアミダイト及び50〜100倍過剰のテトラゾールを用いるのが普通であり;保護5’−アミノホスホルアミダイトを用いて合成する場合、20倍過剰のホスホルアミダイト及び100倍過剰のテトラゾールが好ましい。これらの条件下で、MMT−保護された(例3)ホスホルアミダイトは常習的に90%より良好な収率で、通常95%より良好な収率でカップリングする。カップリングは6分のカップリング反応時間及び3分の酸化反応時間を用いて手動により行なうか、或は随伴するプレプログミ合成サイクルを用いてアプライドバイオシステムモデル380A自動操作DNA合成装置(或はホスホルアミダイト化学に適応させるように設計された同様の器械)により行なうことができる。

0074

5’−アミノオリゴヌクレオチドは、次いで、濃水酸化アンモニウム溶液で室温において少なくとも4時間処理して支持体からDNAを開裂させた後に、DNA塩基を同じ溶液中55℃において12〜16時間脱保護することによって得る。R7 =メチルである時、DNAを支持体から開裂させる前に、ジオキサン中のトリエチルアンモニウムチオフェンオキシドで室温において1時間処理することも必要とする。X=MMTである時、水酸化アンモニウムにおける開裂及び脱保護処理は、塩基不安定、酸不安定のMMTアミノ保護基に影響を与えない。これより、所望の生成物はMMT部分を5’−アミノ基上に保護する。このMMT基は所望の生成物DNAに増大した疎水性を付与し、C18カラムによるRPHPLC間の保持時間を著しく増大させることになる。不純物混入破損DNAシーケンスは所望のオリゴヌクレオチドよりずっと早くカラムから溶出し、次いで後者が清浄な、よく分離された様式で溶出する。MMT保護基を、次いで、酢酸/水(80:20v/v)溶液で室温において20〜30分間温和酸処理して除き、極めて精製された遊離アミノオリゴヌクレオチドを生ずることができる。

0075

例8
5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを用いた3’>HO−CpApTpGpCpTpGpT−NH2 <5の合成

0076

オリゴデオキシリボヌクレオチド
3’>HO−CpApTpGpCpTpG−OH<5’を、標準のホスホルアミダイトDNA合成技法(ニューヨーク,プレナムプレス,セトロウ,エー、及びホランダー,ジェイ.ケイ.編集「ジェネチックエンジニアリン」(1982年),4巻,1−77頁,カルザース,エム.エッチ.,ビューケージ,エス.エル(Beaucage,S.L.) ,ベッカー,シー.,エフカビッチ,ダブリュ.(Efcavitch,W.),フィッシャー,イー.エフ.,ガルピ,ジー.(Gallupi,G.),ゴールドマン,アール.,ドハーゼス,エフ.(de Haseth,F.),マーチン,エフ.,マテウッチ,エム.,スタビスキー,ワイ.(Stabinsky,Y.)) を用いて、手動でアミノプロピルシリカ支持体(結合5’−O−ジメトキシトリチル−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシチジン約4マイクロキルを含有する)上に合成した。5’−O−ジメトキシトリチルチミジン、5’−O−ジメトキシトリチル−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−ベンゾイル−2’−デオキシシトシン及び5’−O−ジメトキシトリチル−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシンの3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを公表された手順(マクブリッジ,エル.ジェイ.及びカルザース,エム.エッチ.,テトラヘドロンレターズ,24,245−248頁(1983年))に従がって合成した。合成の各サイクルの後にジメトキシトリチルカチオンの収率を分光分析法で分析して、ヘプタイマーについて総括収率88.8%、段階収率97.7%を示した。支持体をMMT−保護されたホスホルアミダイトで処理した。担体結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドに対して20倍過剰のホスホルアミダイト及び100倍過剰の1H−テトラゾールを用い、カップリング反応時間を6分及び酸化反応時間を3分にした。

0077

洗浄し及び乾燥した後に、支持体をジオキサン中のトリエチルアンモニウムチオフェノキシドで1時間処理し、よく洗浄し、乾燥し、しっかりキャップをしたコニカル遠心管濃水酸化アンモニウムで室温において4時間処理した。次いで、上澄水を支持体からデカントし、濃水酸化アンモニウムの別のアリコートを加え、溶液をしっかりシールした管(ゴム隔壁)内で55℃において16時間加熱した。DNA含有溶液を、次いで、1.5mlエッペンドルフ(Eppendorf) 管にアリコートし、凍結乾燥し、生成したペレットを水に溶解した。オリゴヌクレオチド溶液のアリコートを、次いで、2つのアルテックス(Altex) 110Aポンプデュアルチャンバーグラジエントミキサーレオダイン(Rheodyne)インジェクタークレイトス(Kratos)757UV−VISデテクターアクシオム(Axxiom)710コントローラーから成るRPHPLCシステムでクロマトグラフィーにかけた。Vydac C18カラム(5ミクロン,25cm)を使用した。

0078

MMT保護された5’−アミノ−5’−デオキシチミジンホスホルアミダイトから誘導したアミノオリゴヌクレオチドを、初めに、20%緩衝液B/80%緩衝液Aの60%緩衝液B/40%緩衝液Aへの線状勾配を40分にわたって用いて(緩衝液A及びBは前で説明した通りである)、ジメトキシトリチル化付加体としてクロマトグラフィーにかけた。これらの条件下で、生成物が39分に溶出した(流量1ml/分)。MMT生成物の調製運転を行ない、生成物を捕集し及び凍結乾燥し、ペレットを酢酸/水(80:20v/v)で室温において20分間処理した。凍結乾燥し及び水に再溶解した後に、アリコートをFmoc誘導オリゴヌクレオチドの場合と同じ条件を用いてクロマトグラフィーにかけた。生成物が17.5分に溶出した。精製したアミノオリゴヌクレオチドはDNAを象徴するUVスペクトル(260nmにおける主ピーク)を有していた。

0079

下記の化合物を同様の方式で用いて対応する5’−アミノオリゴヌクレオチドを作ることができる:
1) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
2) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
3) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−メチルモルホリノホスホルアミダイト。
4) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−ベータ−シアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。
5) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
6) 5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−ベータシアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0080

2) 5’−末端に蛍光部分を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの水溶液における合成。
オリゴヌクレオチドの5’−末端上に求核的な脂肪族アミノ基が存在することは、アミノDNAと種々の求電子性試薬、とりわけアミノ反応性蛍光染料誘導体とのそれ以上の反応を可能にさせる。このような染料誘導体は下記を含み、これらに限定されない:フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートエオシンイソチオシアネートエリスロシンイソチオシアネート、ローダミンXイソチオシアネート、リサミン(lissamine)ローダミンBスルホニルクロリドテキサスレッドルシファーイエローアクリジン−9−イソチオシアネート、ピレンスルホニルクロリド、7−ジエチルアミノ−4−メチルクマリンイソチオシアネート、4−フルオロ−及び4−クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール及びそれらの誘導体、例えばスクシンイミジル12−(N−メチル−N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル))アミドデカノエート。生成した染料オリゴヌクレオチド結合体(conjugate) を、次いで、種々の診断或は検出用に使用することができる。

0081

染料分子をアミノオリゴヌクレオチドに結合させるのに用いる基本的な手順は、アミノDNA及び染料をpH9に緩衝した水性(或は水性/有機性)溶液中で結合させ、室温において数時間静置させ、次いで生成物を2段階で精製することである。過剰の未反応染料を染料−DNA結合体から除き及び未反応のDNAをゲル濾過によって除く。凍結乾燥した後に、RPHPLCを用いて純染料−DNA結合体を得る。

0082

例9
フルオレセイン−5−イソチオシアネートと3’>HO−CpApTpGpCpTpGpT−NH2 <5’との結合

0083

5’−アミノオリゴヌクレオチドを例8に記載する通りにして合成した。精製したアミノオリゴヌクレオチド(水中1200μg/ml溶液の75μl)を水(105μl)及び1Mの重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム緩衝水溶液、pH9(50μl)で希釈する。フルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC)をDMFに溶解した溶液(20mg/ml,20μl)を加え、黄色溶液をよく混合し及び暗がりで室温において一晩静置させる(約12−16時間)。次いで、反応混合物を、10mlの使い捨て可能なプラスチックピペット内の水に充填したセファデックス(Sephadex)G−25(ファーマシファインケミカルズ)のカラム(10ml)に加え、カラムを水で溶出した。カラムの空隙容積により溶出した早く移動する黄色バンド長波UV下で蛍光性)を捕集した。未反応染料はカラムの頂部でほとんど不動のままであった。粗製染料−DNA結合体を次いで凍結乾燥し、水に溶解し、RPHPLCを行なった。例8に記載した系において、クレイトス(Kratos)FS970LC蛍光計UV検出器と共に使用して所望の生成物を同定した。30分にわたる10%緩衝液B/90%緩衝液Aの30%緩衝液B/70%緩衝液Aへの線状勾配を用いた(緩衝液A及びBは例8に記載した通りである)。少量(<10%)の出発アミノオリゴヌクレオチドを17.5分で溶出し(流量1ml/分)、次いで少量の蛍光性種を29分で溶出し、所望の蛍光性生成物(主生成物)を33分で溶出した(260nmにおけるUV検出、240nmにおける蛍光励起、525nmバンドパスフィルターを用いた検出)。精製した蛍光性オリゴヌクレオチドは260nmにUV吸光度最大(DNAに特有)及び496nmに可視吸光度最大(フルオレセインに特有)を有していた。

0084

同様の結合体は、テキサスレッド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、ローダミンXイソチオシアネート、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ピレンスルホニルクロリド、7−ジエチルアミノ−4−メチルクマリンイソチオシアネート、ルシファーイエロー、アクリジン−9−イソチオシアネート、4−フルオロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール、4−クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾールを用いて得ることができる。

0085

3)固体支持体を用いた5’末端に蛍光性部分を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成。
蛍光染料を、遊離5’−アミノ基を含有するオリゴヌクレオチドと直接、オリゴヌクレオチドを支持体に依然共有結合させながら、反応させることによって、例9に記載する2段階精製を回避することができる。この場合、経験では、ベータ−シアノエチルリン保護ホスホルアミダイトモノマーを用いてオリゴヌクレオチドを組立てなければならないことを決めた。これは、塩基性無水条件、例えば無水ピリジン中20%(v/v)の第三アミン或は無水ピリジン中0.5Mの1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU)下、室温においてオリゴヌクレオチドホスフェートトリエステルからベータ−シアノエチル基を取り去ってホスフェートジエステルとすることができるので、必要である。厳密に無水状態観測されるならば、このような処理はDNAに他の影響を与えたり、支持体から認め得る量を開裂したりしない。遊離アミノ基を有するトリエステル含有オリゴヌクレオチドは、染料との迅速な反応を行なうのに必要とする塩基性の条件下で不安定であり及び分解して今までのところ未識別の(uncharacteriged) DNA様になり、もはや実施し得るアミノ末端をもたなくなるので、ジエステルの生成は臨界性である。ジエステル形への転化はこの分解を阻止する。

0086

また、酸不安定な保護基、例えばp−アニシルジフェニルメチル(MMT)を5’−アミノ−5’−デオキシチミジンホスホルアミダイト上に用いてオリゴヌクレオチドに5’−アミノ末端を導入することが必要である。これは、MMT基が、前述したDNAの塩基性分解を防止することを必要とする、ホスフェート保護基を除くのに必要とする塩基性条件に安定であり、次いで、DNAが支持体に結合されたままである温和な酸性条件を用いて取り去り、こうして染料と反応するための遊離アミノオリゴヌクレオチドとすることができるので、必要とする。

0087

アミノオリゴヌクレオチドへの染料結合は、無水のN,N−ジメチルホルムアミイト/第三アミン、好ましくはN,N−ジイソプロピルエチルアミン(90:10v/v)或はトリエチルアミン(80:20v/v)中過剰の染料(10〜100倍)を濃溶液で用いて行なう。12〜24時間の後に、過剰の染料を洗い去り、染料−DNA結合体を支持体から開裂し、及び例8に記載した標準の条件下で濃水酸化アンモニウムを用いて塩基保護基を取り去る。生成物を次いでRPHPLCによって精製する。

0088

例10
固体支持体上でのエオシン−5−イソチオシアネート及びテキサスレッドと3’>HO−TpTpTpTpTpTpT−NH2 <5’との結合

0089

0090

オリゴデオキシリボヌクレオチド
3’>HO−TpTpTpTpTpT−OH<5’を、ベータ−シアノエチル保護ホスホルアミダイト(アメリカンバイオニュークリアコーポレーションから得るか或は例3に記載した通りにして合成した)を用いて例8に記載する通りにして1マイクロモルスケールで制御された細孔ガラス支持体上に合成した。各サイクルの後のジメトキシトリチルカチオンの収率の分析は、ヘキサマーについて総括収率89.6%、段階収率97.8%を示した。5’−N−p−アニシルジフェニルメチル−5’−アミノ−5’−デオキシチミジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトの最終付加を例8に記載する通りにして行なった。

0091

DNA約0.5uモルを含有する、完全に保護され、支持体結合されたアミノオリゴヌクレオチド(支持体約20mg)のアリコートを、次いで、無水ピリジン(500μl)中N,N−ジメチルアミノピリジン(アルドリッチケミカルカンパニー)の5%(w/v)溶液と無水ピリジン(500μl)中p−アニシルジフェニルメチルクロリドの10%(w/v)溶液との混合物で室温において1時間処理した。これは、全ての末端アミノ基を保護することを確実にするために行なったもので、染料結合をオリゴヌクレオチド合成のすぐ後で行なうことができるならば、おそらく不必要である。支持体を、次に、ドライピリジンでよく洗浄し、無水ピリジン中0.5M DBUで室温において2時間処理した。支持体を再びピリジンで、次いでジエチルエーテルでよく洗浄し及び風乾した。対照と同じように通常の通りにして、アルコート(約4mg)を採取して開裂し、脱保護し、RPHPLCを行なった。

0092

ドライ支持体結合MMT保護アミノオリゴヌクレオチドを酢酸/水(80:20v/v)で室温において20分間脱トリチル化(detritylate) した。支持体を、次いで、水及びメタノールで洗浄し及びトリエチルアミンを無水ピリジンに溶解したもの(20:80v/v)で20分間処理してアセテート塩から遊離アミンを発生させた。これをピリジン及びエーテルで洗浄し、空気及び真空乾燥した。対照と同じように通常の通りにしてアリコート(4mg)を採取し、開裂し、脱保護し、RPHPLCを行なった。染料結合反応を1.5mlエッペンドルフ管内で行なった。染料はオレゴン、ジャンクションシティ、モレキュラープローブインコーポレーテッドから得た。約0.10モルの支持体結合アミノオリゴヌクレオチド(4−5mg)を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン10%(v/v)を含有する無水DMF(50μl)中のエオシン−5−イソチオシアネート(3.5mg,50倍過剰)か或はテキサスレッド(2.4mg,38倍過剰)のいずれかで処理した。反応を暗がりで室温において12〜16時間進行させた。反応混合物を、次いで、小さいガラスフリッテド漏斗に移し、DMF、メタノール及びエーテルでよく洗浄し、風乾した。この時点で、エオシン結合支持体ピンク色で、テキサスレッド結合支持体は紫色であった。両方の支持体は長波UV光下で強い蛍光を発した。

0093

各染料−DNA結合体を例8に記載した通りにして(濃水酸化アンモニウム中室温において4時間)支持体から開裂させ及び塩基脱保護条件(濃水酸化アンモニウム中55℃において12時間)に暴露させた。ポリ−Tオリゴヌクレオチドについては不必要であるが、この後者の処理を行なって染料部分及び染料−DNA結合に対する処理の効果を試験した。蛍光性の強いオレンジ(エオシン)及びピンク−赤色(テキサスレッド)染料−DNA溶液を、次いで、凍結乾燥し、水に溶解し及び各蛍光性オリゴヌクレオチドを、10分にわたる10%緩衝液B/90%緩衝液Aの30%緩衝液B/70%緩衝液Aへの、次いで10分にわたる30%緩衝液B/70%緩衝液Aの60%緩衝液B/40%緩衝液Aへの線状勾配(緩衝液A及びBは例8に記載した通りである)を用いたRPHPLCによって精製した。

0094

2つの染料−オリゴヌクレオチド結合体のHPLC分析は、エオシン−5−イソチオシアネートの場合、出発アミノオリゴヌクレオチドの消失から判断して、反応は約80%の完結まで進行していたが、一方テキサスレッド、スルホニルクロリドの場合、反応は約20〜30%の完結にまで進行していたにすぎないことを示した。各クロマトグラムにおいて、非誘導体化アミノオリゴヌクレオチドを表わすピークを16分に観測した。所望のエオシン−DNA結合体はカラムから25分に溶出し、テキサスレッド−DNA結合体は29.5分に溶出した。例5に記載した溶液法を用いて別々に合成した出発アミノオリゴヌクレオチド及び各蛍光性オリゴヌクレオチドの対照HPLC分析は、上記の割り振りアサインメント)を確認した。加えて、テキサスレッド−オリゴヌクレオチドは脱保護条件によってそこなわれずに出現したが、エオシン−オリゴヌクレオチドは少量の分解を受けたようであった。しかし、両方の場合において、固相法を用いた染料−DNA結合体の総括収率は溶液法を用いた場合と同じ程に良好であるか或はそれより一層良好であり、仕上げ及び精製はずっと簡単であった。各々の精製した染料−DNA結合体のUV可視スペクトル予想される通りに2つの主ピークを示した:エオシン−オリゴヌクレオチドの場合、262nmにおけるピーク(DNA吸光度)及び524nmにおけるピーク(染料吸光度);及びテキサスレッド−オリゴヌクレオチドの場合、262nmにおけるピーク(DNA吸光度)及び596nmにおけるピーク(染料吸光度)。

0095

同様の結合体は、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、ローダミンXイソチオシアネート、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ピレンスルホニルクロリド、7−ジエチルアミノ−4−メチル−クマリンイソチオシアネート、4−フルオロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール、4−クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール、アクリジン−9−イソチオシアネート、ルシファーシエローを用いて得ることができる。

0096

4) 1つ又はそれ以上のインターナル脂肪族アミノ基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成。
「物質番号4の組成」なる表題のセクションにおいて記載したトリフルオロアセチル保護(Tfa−保護)2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ホスホルアミダイトを用いてDNAオリゴマー中の内部位置に1つ又はそれ以上の遊離アミノ基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成することができる。これは、これらの化合物におけるアミノ基の位置(すなわち、糖環の2’−炭素原子上)がDNA鎖の3’,5’−ホスホジエステル主鎖の形成において含まれないので、可能である。それ故に、例8に記載した標準のホスホルアミダイトDNA合成技法を用いてこれらの化合物を、固体支持体に結合させた成長オリゴデオキシリボヌクレオチドの5’−ヒドロキシルにカップリングさせることができる。保護5’−アミノ−5’−デオキシチミジン化合物であって、それらの使用は5’−末端上のアミノ基の存在により成長DNA鎖を停止させるものと異なり、Tfa保護2’−アミノ−2’−デオキシウリジン化合物の5’−ヒドロキシル上に存在する5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル基を合成の次のサイクルで除いて、通常の手順によって合成オリゴヌクレオチドを更に伸長させるのを可能にすることができる。Tfa保護2’−アミノ−2’−デオキシウリジンユニットは鎖の任意の位置に挿入することができ、生成したオリゴマーは任意の所望数の反応性アミノ基を含有することができる。

0097

これらの化合物は、例8に概略した化学を用いて成長DNA鎖にカップリングすることができるが、2’位に水素と異なる基が存在することは、通常のデオキシリボヌクレオチドホスホルアミダイトを用いて観測されるのと同様のカップリング効率を達成するのに一層長いカップリング時間を用いることを必要とする。もう一度、支持体結合オリゴヌクレオチドに対して10〜20倍過剰のホスホルアミダイト及び50〜100倍過剰の1H−テトラゾールを必要とし、この場合、過剰が大きい程強く好ましい。これらの量を使用したカップリング時間は、通常のホスホルアミダイトカップリングについて6分を用いるのに対して、1〜1.5時間にするのが普通である。Tfa保護2’−アミノ−2’−デオキシウリジンホスホルアミダイトはこの一層長いカップリング時間の間にある程度の分解を受けるようであるので、1つの伸長カップリングに2或は3短かいカップリング(各々20〜30分)が好ましい。これらの条件下で、Tfa保護2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ホスホルアミダイト(例6及び7)は、常習的に80%より良好な収率で、通常85%より良好な収率でカップリングする1つ又はそれ以上のインターナルアミノ基を含有するオリゴヌクレオチド生成物を、次いで、例8に略述する標準の開裂及び脱保護条件を用いて得る。Tfa基は塩基不安定であるので、濃水酸化アンモニウム処理する間に容易に除去されて、所望数の遊離アミノ基を含有するオリゴヌクレオチド生成物を生じる。生成物DNAは、凍結乾燥した後に、上述した通りにRPHPLCか或はゲル電気泳動のいずれかによって精製することができる。その上、粗製生成物DNAは5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル基を含有して得ることができ、こうして5’−N−p−アニシルジフェニルメチル基について記載したのと同様の方法でRP HPLC精製を簡単にすることができる。

0098

例11
5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを用いた
3’>HO−CpApTpGpCpU(2’−NH2 )pGpT−OH<5’及び5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチルグリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを用いた
3’>HO−CpApTpGpCpU(2’−NHCOCH2 −NH2 )pGpT−OH<5’の合成

0099

0100

オリゴデオキシリボヌクレオチド
3’>HO−CpApTpGpC−OH<5’を例8に記載した通りにして手動でアミノプロピルシリカ支持体上に合成した。次いで、支持体を2つの等しい部分に分けた。一方の部分を5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン(DMT−TfaNHdU)ホスホルアミダイトとのカップリングに用い及び他方を5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン(DMT−TfaGlyNHdU)ホスホルアミダイトとのカップリングに用いた。各々の場合において、各々30分の2つの逐次カップリングを酸化反応の前に行ない、支持体をカップリングの間に無水のアセトニトリルでよく洗浄した。各々のカップリングにおいて、20倍過剰のホスホルアミダイト及び100倍過剰の1H−テトラゾールを用いた。これらの条件下で、DMT−TfaNHdUホスホルアミダイト及びDMT−TfaGlyNHdUホスホルアミダイトは共に収率83〜85%(このサイクルの後にジメチオキシトリチルカチオンの収率で判断して)でカップリングした。3分の酸化反応及び3分のキャッピング反応の後に、最後の2つのヌクレオチドホスホルアミダイトをアミノウリジン含有オリゴヌクレオチドにカップリングさせた。各々の場合において、これら2つのカップリングの内の初めは98%より良好な収率で進行し、RPHPLC精製を簡単にするために、最終のジ−p−アニシルフェニルメチル基を各オリゴヌクレオチドの5’−末端上に保持した。

0101

洗浄し及び乾燥した後に、支持体結合オリゴヌクレオチドの各アリコートを例8に記載した標準の開裂及び脱保護条件下で処理し、凍結乾燥し、水中に溶解した。各溶液のアリコートに、次いで、例8に記載した系を用いてRPHPLC分析を行なった。40分にわたる20%緩衝液B/80%緩衝液Aの60%緩衝液B/40%緩衝液Aへの線状勾配(緩衝液A及びBは例8に記載した通りである)を用いて各トリチル化付加体を精製した。これらの条件下で(流量1ml/分)、U(2’−NH2 )含有オリゴヌクレオチド及びU(2’−NHCOCH2 NH2 )含有オリゴヌクレオチドは共に39分で溶出した。各オリゴヌクレオチドについて予備精製を行ない、生成物を捕集し及び凍結乾燥し、ペレットを酢酸/水(80:20v/v)で室温において30分間処理して5’−ジ−p−アニシルフェニルメチル基を除いた。凍結乾燥し及び水に再溶解した後に、各溶液のアリコートを、30分にわたる10%緩衝液B/90%緩衝液Aの30%緩衝液B/70%緩衝液Aへ線状勾配を用いてクロマトグラフィーにかけた。これらの条件下(流量1ml/分)で、U(2’−NH2 )含有オクタマーは清浄に18分で溶出し(260nmにおけるUV検出)、他方U(2’−NHCOCH2NH2 )含有オクタマーはわずかに清浄性に劣って19分で溶出した。この後者のクロマトグラムでは18分に溶出するピークが見られなかった。このことは、グリシン部分はあるとしてもほとんど合成する間の化学処理によってDNAから加水分解されなかったことを示す。両方の精製した2’−アミノオリゴヌクレオチドはDNAを象徴するUVスペクトル(260nmにおける主ピーク)を有していた。

0102

下記の化合物を同様の方式で用いて対応する2’アミノオリゴヌクレオチドを調製することができる:
1) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
2) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
3) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
4) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
5) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−トリフルオロアセチル−2’−アミノ−2’−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
6) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

0103

7) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
8) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
9) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−モルホリノホスホルアミダイト。
10) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。
11) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−p−ニトロフェネチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。
12) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−ベータ−シアノエチル−N,N−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

0104

13) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシイノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
14) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N6 −ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
15) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N4 −ベンゾイル−2’−デオキシシトシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
16) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−トリフルオロアセチル−グリシル)−2’−アミノ−N2 −イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。
17) 5’−O−ジ−p−アニシルフェニルメチル−2’−N−(N−9−フルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル)−2’−アミノ−2’−デオキシウリジン−3’−O−メチル−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

0105

5)インターナル2’位に1つ又はそれ以上の蛍光性部分を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの水溶液における合成。
セクション2で説明した通りに、オリゴヌクレオチドに脂肪族アミノ基が存在することは、DNAと種々の試薬とのそれ以上の反応を可能にする。蛍光染料の場合、1つより多い染料分子をオリゴヌクレオチドに結合させることによって、高められた検出感度を達成することができ、これよりオリゴマー当り蛍光量を増大させることができる。任意の所望数のアミノ基を2’−アミノ−2’−デオキシウリジンホスホルアミダイトを経てオリゴヌクレオチドに加入させ得ることを利用してこの増大を達成することができる。蛍光染料を2’−アミノオリゴヌクレオチドに結合させる基本的な手順は、例9に記載したのと同じである。

0106

例12
フルオレセイン−5−イソチオシアネートと、3’>HO−CpApTpGpCpU(2’−NH2 )pGpT−OH<5’及び3’>HO−CpApTpGpCpU(2’−NHCOCH2 NH2 )pGpT−OH<5’との結合

0107

0108

2’−アミノオリゴヌクレオチドを例11に記載する通りにして合成した。精製したアミノオリゴヌクレオチドの各々(水中600−1000μg/ml溶液の75μl)を1.5mlのエッペンドルフ管内で水(105μl)及び1Mの重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム緩衝水溶液、ph9(50μl)で希釈した。フルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC)をDMFに溶解した溶液(20mg/ml,20μl)を加え、黄色溶液をよく混合し及び暗がりで室温において一晩静置させた(約12−16時間)。次いで、各々の反応混合物を、10mlの使い捨て可能なプラスチックピペット内の水に充填したセファデックスG−25の分離カラム(10ml)に加え、カラムを水で溶出した。各々の場合において、カラムの空隙容積により溶出した早く移動する黄色バンド(長波UV下で蛍光性)を捕集した。粗製染料−DNA結合体を次いで凍結乾燥し、水に溶解し、例9に記載した系を用いてRPHPLCを行なった。30分にわたる10%緩衝液B/90%緩衝液Aの30%緩衝液B/70%緩衝液Aへの線状勾配を用い(緩衝液A及びBは例8に記載した通りである)及び流量1ml/分であった。

0109

U(2’−NH−FITC)含有オリゴヌクレオチドの場合、2つの主ピークを観測した。出発2’−アミノオリゴヌクレオチドは予想される通りに18分に溶出し、他方、蛍光生成物染料−オリゴヌクレオチド結合体は26分に溶出した(260nmにおけるUV検出、240nmにおける蛍光励起、525nmバンドパスフィルターを用いた検出)。蛍光生成物はサンプル中に存在するアミノ含有DNAの全量の約50%の割合になった。U(2’−NHCOCH2 NH−FITC)含有オリゴヌクレオチドの場合、3つのピークを観測した。出発2’−アミノオリゴヌクレオチドは予想される通りに20分に溶出した。また、20.5分における第2の主ピークが出発2’−アミノオリゴヌクレオチドのクロマトグラムにおける汚染物として観測された。蛍光生成物染料−オリゴヌクレオチド結合体が28分に溶出した。しかし、この場合、蛍光生成物はサンプル中のアミノ含有DNAの全量の少なくとも90%の割合になった。相当に高い結合度は2’−アミノ基上にグリシン成分が存在することに起因し得る。驚くべきことではないが、糖環から反応性アミノ基を移し去り、こうして染料が接近する立体障害を減ずることが、得られる染料−DNA結合体の量を増大させる。よって、スペーサーの長さを調節し、こうして糖環からの距離を調節することによってアミノ基の反応性の度合を制御することが可能である。

0110

両方の精製蛍光性オリゴヌクレオチドは260nmにUV吸光度最大(DNAに特有)及び496nmに可視吸光度最大(フルオレセインに特有)を有していた。上記は、また、テキサスレッド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、ローダミンXイソチオシアネート、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、ルシファーイエロー、アクリジン−9−イソチオシアネート、ピレンスルホニルクロリド、7−ジエチルアミノ−4−メチルクマリンイソチオシアネート、4−フルオロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール、4−クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾールを用いて行なうことができる。発明を十分に説明したが、発明は単に添付した請求の範囲の適法な範囲によってのみ制限されるつもりである。

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