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図面 (1)

目的

本発明は、転写因子NFκBの活性阻害することにより、NFκB結合配列を有するDNA遺伝子のRNAへの転写及びタンパク質への翻訳を阻害し、その遺伝子がコードするタンパク質などの産生を抑制するNFκBの活性阻害剤を提供することを目的とする。

構成

化1

又は

化2

で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする組成物

概要

背景

概要

本発明は、転写因子NFκBの活性阻害することにより、NFκB結合配列を有するDNA遺伝子のRNAへの転写及びタンパク質への翻訳を阻害し、その遺伝子がコードするタンパク質などの産生を抑制するNFκBの活性阻害剤を提供することを目的とする。

又は

で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする組成物

目的

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
1件

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請求項1

請求項

ID=000004HE=030 WI=047 LX=0365 LY=0450または

請求項

ID=000005HE=035 WI=039 LX=0405 LY=0850で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκBの活性阻害剤

請求項2

請求項

ID=000006HE=030 WI=047 LX=0365 LY=1400または

請求項

ID=000007HE=035 WI=039 LX=0405 LY=1800で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκBの活性阻害作用が有効な疾患の治療予防剤

請求項3

請求項

ID=000008HE=030 WI=047 LX=0365 LY=2400または

請求項

ID=000009HE=035 WI=039 LX=1305 LY=0300で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκB活性阻害作用に基づく、炎症性疾患治療予防剤

請求項4

請求項

ID=000010HE=030 WI=047 LX=1265 LY=0900または

請求項

ID=000011HE=035 WI=039 LX=1305 LY=1300で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκB活性阻害作用に基づく、自己免疫性疾患治療予防剤。

請求項5

請求項

ID=000012HE=030 WI=047 LX=1265 LY=1900または

請求項

ID=000013HE=035 WI=039 LX=1305 LY=2300で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκB活性阻害作用に基づく、ウイルス性疾患治療予防剤。

請求項6

請求項

ID=000014HE=030 WI=047 LX=0365 LY=0400または

請求項

ID=000015HE=035 WI=039 LX=0405 LY=0800で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκB活性阻害作用に基づく、インターロイキン-1,腫瘍壊死因子,インターロイキン-2,インターロイキン-6,インターロイキン-8,顆粒球コロニー刺激因子インターフェロンβ,インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト主要組織適合抗原系クラスI ,主要組織適合抗原系クラスII,β2マイクログロブリン免疫グロブリン軽鎖血清アミロイドAアンジオテンシノーゲン補体B ,補体C4,C-myc 、ヒューマンミュデフィシェンシィーウイルスシミアンウイルス40サイトメガロウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる1又は2以上の物質の遺伝子の発現抑制剤

技術分野

0001

本発明は、NFκB の活性阻害剤又はNFκB活性阻害作用に基づく、抗炎症,抗自己免疫疾患及び抗ウイルス剤等に関する。

0002

〈発明の背景〉遺伝子の本体であるDNA は、様々な因子により調節を受けており、遺伝情報発現が制御されている。例えばDNA からmRNAへの転写は、その遺伝子上の数個から数十個の塩基配列を認識し結合する複数個のDNA結合タンパク質により制御を受けている。このようなDNA 結合タンパク質の一つとして知られるNFκB は、抗体産生細胞であるB細胞の核抽出液中に存在し、免疫グロブリンκ軽鎖(Igκ) 遺伝子のエンハンサーに結合する因子として同定された。その後研究が進むと、刺激誘導される多くの遺伝子の発現誘導などに関与する転写因子であり、広く生命現象の制御に関わることが明らかになってきた。

0003

このNFκB は、通常細胞質内分子量50kDのタンパク質ホモダイマーまたは分子量50kDのタンパク質と分子量65kDのタンパク質のヘテロダイマーが、I κBという活性を抑制するタンパク質と結合して存在している。そして細胞に一定の刺激が与えられるとI κB が修飾を受けて複合体からはずれてNFκB が活性化され、そのダイマーが核内へ移行することによりDNA結合活性が検出されるようになる。この活性はセカンドメッセンジャーなど別の遺伝子の発現を介さない直接的な活性化の結果生じることがわかっている。

0004

また、DNA 上のNFκB結合配列は様々な遺伝子に見出されており、実際に遺伝子の機能発現に重要であることが示されている。その結合配列(κBモチーフ)は、約10塩基より構成され、共通するのはG(ク゛アニン)のクラスターで始まりC(シトシン) のクラスターで終ることである。ところで、炎症タンパク質として知られているインターロイキン-1(IL-1)や腫瘍壊死因子(TNF) の遺伝子上にも多くのDNA結合タンパク質が結合する配列が存在するが、その中にNFκB の結合配列も存在することがわかっており(Clark,B.D.et al.,Nucl.AcidsRes.,14,7898,1984;Nedospasov,S.A.et al.,Cold SpringHarb. Symp. Quant. Biol.,51,611,1986) 、実際にNFκB の結合がmRNAへの転写を制御していることが報告されている(Hiscott,J.et al.,Mol. Cell. Biol.,13,6231,1993;Collart,M.A.et al.,Mol. Cell. Biol.,10,1498,1990) 。

0005

〈従来技術〉従来NFκB の転写活性阻害する物質としては、NFκB結合性タンパク質ヨーロッパ特許公開公報第584238号に開示されている。

0006

また、以下の式で表される化合物(1),(2)はIL-1とTNF 産生をそれぞれのmRNAの産生レベルで抑制することが報告されている(Goto,M.et al.,Agents Actions.,32,225,1991;Miyamoto,K.et al,Agents Actions.,37,297,1992)。

0007

0008

発明が解決しようとする課題

0009

生体膜を構成するリン脂質は、種々の刺激により誘導されるホスホリパーゼによってアラキドン酸遊離する。このアラキドン酸がリポキシゲナーゼシクロオキシゲナーゼ等の酵素系で代謝されることによりロイコトリエントロンボキサンプロスタグランジン等が産生される。これらの物質は複雑な生理活性を示し、生体の維持・調節に重要な働きを有している。例えば、ロイコトリエンB4は白血球遊走リソゾーム酵素分泌活性酸素産生などに関与する一方、免疫系に対して促進的に作用し、インターロイキン1 ,2 の産生を促進したり、リンパ球の活性化を増強することが知られている。 トロンボキサンB2はトロンボキサンA2の安定代謝物で、トロンボキサンA2は細動脈収縮作用血小板凝集作用により局所微小循環に関与する。またプロスタグランジンE2は血管拡張作用血管透過性抗進作用を有し、炎症作用に寄与する。また、免疫系に対しては抑制的に作用しさらに、サイトプロテクションにより細胞を種々の刺激から保護することも報告されている。

0010

生体は外からの様々な刺激を受けることにより、種々のサイトカインが遊離され炎症反応を生じる。従来の薬物は、ヒスタミン等のメディエーターレセプターへの拮抗作用やいわゆるアラキドン酸カスケード中のリポキシゲナーゼまたはサイクロオキシゲナーゼ等の代謝酵素を阻害することによりヒスタミンやロイコトリエンB4若しくはプロスタグランジンE2等の炎症タンパクの発現を抑制するものである。しかし、非ステロイド系の薬物ではその効果は対症療法を期待するものであり根本治療としては十分なものとはいえず、ステロイド系の薬物は有効ではあるが副作用が強く、長期投与ができないという問題があった。特に自己免疫疾患等の炎症性の疾患は、慢性化することが多く、長期療養が必要となり副作用のある薬物の使用には向いていない。また、ヨーロッパ特許公開公報第584238号に開示されている物質は蛋白質であり、その安定性から薬物として投与するときにさまざまな障害がある。本発明者等は、炎症性疾患に対する原因療法確立すべく、各種炎症性のサイトカインを根本的に抑制する方法や物質について永年にわたり鋭意検討を重ね、転写因子NFκB の活性阻害作用に基づき、各種サイトカイン等を遺伝子レベルで抑制する化合物を見いだし本発明を完成した。

課題を解決するための手段

0011

すなわち本発明は、式

0012

0013

または

0014

0015

で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκB の活性阻害剤、及び、式

0016

0017

または

0018

0019

で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするNFκB の活性阻害作用が有効な疾患の治療予防剤、並びに、NFκB 活性阻害作用に基づく、抗炎症,抗自己免疫疾患及び抗ウイルス剤、及び、炎症性疾患,自己免疫性疾患及びウイルス性疾患治療予防剤である。

0020

前記式で表される化合物(3),(4)は転写因子NFκB の活性を阻害することにより、NFκB認識配列を有するDNA の転写を阻害する。従ってNFκB 認識配列を有する遺伝子であれば、その遺伝子に対応するタンパク質の発現を有効に阻害することが可能である。従ってIL-1,TNF を始めインターロイキン-2(IL-2),インターロイキン-6(IL-6),インターロイキン-8(IL-8) ,顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),インターフェロンβ(INF- β) 等のサイトカインを始め、インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト(IL-1RA)等の炎症性サイトカインのレセプターアンタゴニストおよび、その他の主要組織適合抗原系(MHC)クラスI ,MHC クラスII,β2マイクログロブリン免疫グロブリン軽鎖血清アミロイドAアンジオテンシノーゲン補体B ,補体C4タンパクの遺伝子や、オンコジーンの一つであるC-myc 遺伝子、ヒューマンミュデフィシェンシィーウイルス(HIV) ,シミアンウイルス40(SV40),サイトメガロウイルス(CMV) ,アデノウイルス等ウイルスの遺伝子等の発現を抑制することにより、これらが関連する疾患を予防・治療することができる。以下にその疾患を例示する。慢性関節リウマチ全身性エリテマトーデス全身性強皮症ベーチェット病結節性動脈周囲炎潰瘍性大腸炎活動性慢性肝炎糸球体腎炎などを初めとする各種自己免疫疾患;変形性関節症痛風アテローム硬化症乾癬アトピー性皮膚炎肉芽腫を伴う肺疾患、各種脳炎など炎症症状病態の基本になっている難治性各種疾患、エンドトキシンショック敗血症炎症性大腸炎糖尿病急性骨髄芽球性白血病肺炎心臓移植脳脊髄炎食欲不振急性肝炎慢性肝炎薬物中毒肝障害アルコール性肝炎ウイルス肝炎黄疸肝硬変肝不全心房粘液腫キャッスルマン症候群多発性骨髄腫レンネルトTリンパ腫メサンギウム増殖性腎炎腎細胞癌、サイトメガロウイルス性肺炎、サイトメガロウイルス性網膜症、アデノウイルス性感冒、アデノウイルス性プール熱、アデノウイルス性眼炎エイズなどの疾患の治療及び予防に効果を示す。

0021

本発明における式

0022

0023

または

0024

0025

で表される化合物の製造方法は特に限定されないが、例えば、それぞれ特開平2-256645号公報、特開平3-188042号公報に示される方法により合成することができる。また、本発明にかかる化合物は、その構造式から明らかなように二重結合を有するので、シス,トランス幾何異性体が存在しうるが、いかなる異性体も本発明の範囲に包含される。

0026

本発明化合物をこれらの疾患の治療・予防剤として投与する場合は、錠剤散剤顆粒剤カプセル剤シロップ剤などとして経口的に投与してもよいし、また坐剤注射剤外用剤点滴剤などとして非経口的に投与してもよいが、本発明の場合は、経口剤として投与することが望ましい。投与量は、疾患の種類、症状の程度、年齢などにより著しく異なるが、例えば経口剤としてヒトに投与する場合は、0.001 〜20mg/kg 、好ましくは0.01〜15mg/kg であり、更に好ましくは0.1 〜10mg/kg を1日1〜数回に分けて投与する。経口・非経口投与のための製剤化は、通常の製薬的に許容できる担体を用い、常法により製造する。

0027

すなわち経口用固形製剤を調製する場合は、主薬賦形剤、さらに必要に応じて結合剤崩壊剤滑沢剤着色剤矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。賦形剤としては、例えば乳糖コーンスターチ白糖ブドウ糖ソルビット結晶セルロース二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコールポリビニルエーテルエチルセルロースメチルセルロースアラビアゴムトラガントゼラチンシェラックヒドロキシプロピルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロースクエン酸カルシウムデキストリンペクチン等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウムタルクポリエチレングリコールシリカ硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末ハッカ脳芳香酸、ハッカ油、龍脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差し支えない。また必要に応じて防腐剤抗酸化剤等を添加することができる。

0028

注射剤、点滴剤などを調製する場合は、主薬に必要によりpH調製剤緩衝剤安定化剤可溶化剤などを添加し、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法により皮下・筋肉静脈内用注射剤、点滴注射剤とする。以下に、本発明の具体的な代表的実施例を挙げるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

0029

実験
実験例1ゲルシフトアッセイ
TNF-αとHIV-1 のNFκBプローブを用いてゲルシフトアッセイを行った。TNF-αのNFκB プローブとしては、転写開始位置からそれぞれ634番目のNFκB 様サイト[下線部]( κB-1,5'-GGGTCTGTGAATTCCCGGGGGTGA-3') を用いた。HIV-1 NFκB プローブとしては、転写開始位置からそれぞれ103 番目と90番目(5'-GGCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGG-3') のNFκB 様サイトを用いた。DNA は二本鎖で用い、[ α-32P]dCTPクレノウフラグメント(Klenow Fragment) を用いて常法により標識し、NAP-5カラムゲルろ過カラム) で精製した。核抽出物2 μg と32P-標識したTNF-α又はHIV-1 のNFκB プローブ(10,000-20,000cpm)を結合緩衝液(10mMTris-HCl,40mMNaCl,10%glycerol ,1mMEDTA ,1mMDTT,1%NP-40 ,1%デオキシレイト,3 μg/mlpoly[dI-dC] )中、室温で30分間結合反応させた。DNA-NFκB複合体と遊離のオリゴヌクレオチドを分離するために5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲル減圧乾燥後、富士BAS2000イメージアナライザーにて核抽出物中のNFκB とこれに結合したオリゴヌクレオチド複合体のバンド黒化度)を定量した。同様に試験化合物の効果を試すために核抽出物はヒト単球を10ng/ml のLPSで2 時間刺激して得たものを用いた。そして、2 μg の抽出物又はヒト組換えp50タンパクとTNF-α又はHIV-1 のNFκB プローブを前記化合物(1)の存在、非存在下で室温で反応させ、比較した。ヒト単球のLPS 刺激によるNFκB結合活性化に対する化合物(1)の作用(抑制率%)を表1に示した。

0030

0031

実験例2トランスフェクション実験
HIV-1 のロングターミナルリピート(LTR) 上に存在するNFκB 配列を4個組み込み、分泌型ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ(PLAP)を連結させたプラスミド(HIV-1- κB-PLAP) 、HIV-1 LTR にPLAPを連結させたプラスミド(HIV-1 LTR-PLAP :NIH より入手) 、ヒトTNF-α遺伝子の転写開始部位から1.4kb上流領域配列にPLAPを連結させたプラスミド(TNF- α-PLAP)、SV40のpromoterをPLAPに連結したプラスミド(pSV2-PLAP) を作成した。前者3 つのプラスミドはNFκB 配列を有している。これらのプラスミドを、それぞれマウスマクロファージ細胞株のRaw264.7にDEAE-デキストラン法を用いてトランスフェクトした。これらの細胞を前記化合物(1)の存在下、非存在下にLPS(1 μg/ml) で48時間刺激後、培養上清中に放出されたアルカリフォスファターゼを蛍光検出試薬ルミステイン(商標:住友金属社製) を用いてMicroLumat LB96P (EG&G,BERTHOLD)にて蛍光を測定した。化合物(1)非存在下で得られた蛍光に対する抑制率を、図2に示した。

0032

0033

実験例3 ヒト末梢血単球リポポリサッカライド(LPS)刺激により活性化されるNFκB の核内移行に対する作用
健常成人男子静脈血よりフィコールパック比重遠心法により単核球画分を得た。このうち、プラスチックシャーレに付着した細胞を単球として用いた。前記化合物(1)又は(2)で細胞を30分処理した後、LPS10ng/mlで細胞を2 時間刺激した。回収した細胞から核抽出物を部分精製した。この核抽出物を[ α-32P]dCTP(デオキシシチジン三リン酸)で標識したNFκB認識配列を有するオリゴヌクレオチドと室温で30分、結合反応を行った。なお、NFκB 認識配列を有するオリゴヌクレオチドは、各遺伝子の5'-上流域に存在する固有の配列で、IL-1βは、5'-GGGAAAATCC-3'、TNF-αは、5'-GTGAATTCCC-3'、IL-6は、5'-GGGATTTTCC-3'、IL-8は、5'-GGAATTTCCT-3'、IL-1RAは、5'-GGGTATTTCC-3'という配列でありそれぞれのオリゴヌクレオチドを核酸合成機にて調製した。核抽出物中のNFκB とこれに結合したオリゴヌクレオチド複合体を、遊離のオリゴヌクレオチドを分離するために5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルを減圧乾燥後、富士BAS2000イメージアナライザーにて核抽出物中のNFκB とこれに結合したオリゴヌクレオチド複合体のバンド(黒化度)を定量した。化合物(1)及び(2)の核抽出物中のNFκB への移行の抑制率を表3に示した。

0034

0035

実験例4 ヒト末梢血単球のリポポリサッカライド(LPS)刺激によるIL-1β、TNF-α、IL-6の産生に対する作用
ヒト末梢血単球を、前記化合物(1)または化合物(2)で細胞を30分処理した後、LPS10ng/mlで細胞を18時間刺激した。培養上清中のIL-1β、TNF-α、IL-6をELISAキット(R&D社) にて測定した。化合物(1)及び(2)のIL-1β、TNF-α、IL-6産生抑制率を、表4に示した。

0036

0037

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