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図面 (1)

目的

毒性の低いリポソーム形成用乾燥組成物を提供する。

構成

a)次の式(I):

化1

(式中R1 及びR2 はC10〜C20アルケノイル基であり、nは1〜3の整数であり、そしてY+ は医薬として許容される塩基陽イオンである)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、b)式

化2

(式中、R1 はC10〜C20アルカノイル基であり、R2 はC10〜C20アルケノイル基であり、Ra ,Rb 及びRc は水素原子又はC1 〜C4アルキル基であり、そしてnは2〜4の整数である)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、並びにc)生物学的活性をもつ物質又は物質混合物、を含有する乾燥調製物

概要

背景

リポソームは多数の刊行物中の文献に記載されてきている。多くの研究はそれらの構造及び使用に関するものである。1つの脂質二重層をもつ単膜リポソームとタマネギ外皮に似た態様で配置されている幾つかの脂質二重層をもつ多重膜リポソームとの間の区別がなされている。特に、可能なかぎむらのない大きさで直径が約2.0×10-8〜5.0×10-6m、好ましくは約2.0×10-8〜3.0×10-6mである集団をもつリポソームは製薬用途に適している。

その球状シエル脂質成分、例えば両親媒性脂質、例えばリン脂質、例えばレシチンセファリン又はホスファチジン酸でできた、又は、場合によってはこれらの脂質と天然脂質、例えばコレステロールとでできた1つ以上の二重層からなる。これらの二重層は封入すべき化合物を含んだ水性相を収容している内部空間を取り囲んでおり、封入すべき化合物に関してはその化合物の構造及びその他のパラメーター、例えば温度又は濃度に依存して、その水性相中及び(又は)二重層中に存在することが可能である。

広範囲の種類の活性物質のための担体としてのリポソームの治療用途にはたいへんな感心がある。従ってリポソームは蛋白質(例えば抗体又は酵素)、ホルモンビタミン又は遺伝子のための担体として、又は分析の目的で標識化合物のための担体として提案されてきている。

リポソームに基いた医薬投与ステムはグレゴリアイス(G.Gregoriadis )(編集者)の総観著作物、リポソームテクノロジイ、第II巻、インコーポレーションオブドラッグス、プロテインアンドジエネティックマテリアル(Liposome Technology, vol. II, Incorporation of Drugs, Proteins and Genetic Material )、シーアールプレスCRCPress )、1984年発行に記載されている。ナイト(C.G.Knight)(編集者)の総観著作物、リポソームス:フロフィズィカルトラクテアートウセラピューティックアプリケーション(Liposomes :From Physical Structure to Therapeutic Applications )、エレセビエール(Elsevier)、1981年発行の第16章166頁にはリポソームに基いた医薬投与形態の利益が次のように要約されている:

1.リポソームは生物学的膜浸透し、それで普通には不浸透性であるバリヤーを通しての活性物質の移送を容易にする。特に、リポソームは包封された化合物による細胞内浸透を容易にする。
2.リポソームはあるタイプの細胞組織との特定の相互作用の観点から、増加した選択性及び低下した毒性を目的として使用することができる。

3.活性物質の薬物動態はリポソームによって、例えば解放分布及び体循環からの除去をいくぶん変えることによって有益に影響され得る。
4.化学的影響及び代謝によって引起される変化に対して敏感な活性物質はリポソームにより失活に対して保護される。
5.リポソームに包封された抗原免疫反応刺激することによって免疫調節効果を得ることができる。

これらはその上の利益、例えば治療効果を達成するのに、遊離の活性物質を用いる時に比べて、リポソームを用いた時に必要とされる活性物質の量を減少させること、又は活性物質の投与回数を減少させることをもたらす。リポソームに基いた投与システム物質エンドサイテイシング細胞(endocytising cell )中に、特に細網内皮系統のエンドサイテイシング細胞中に導入する時に特別の有益をもつ。例えば、エンドサイテイシング細胞中への抗生物質の移送の促進及びこれらの細胞中に存在する原因として働く生体との改良された戦いが観察されている。エンドサイテイシング細胞は又炎症過程に伴なわれる。リポソームに包封された抗リウマチ性活性物質が周囲の組織中へよりも上記のような細胞中へ一層迅速に導入されることが観察されている。

リポソームの形態で内包された細胞増殖抑制物質は細胞内皮系統の特定の器官肝臓脾臓骨髄)中に導入することができ、又は、において、肺の毛細管中での濾過及びそれに続く遊走血液単核細胞による移送の結果として、活性物質は肺胞マクロファージ中に富化することができ、それ故に肺又は肝臓の腫瘍に対する作用の改良を達成することが可能であり、一方同時に毒性を低下させる。

免疫モジュレーターを包封しているリポソームは免疫系の反応(免疫刺激免疫抑制)における調節された変化を成し遂げることができる。例えば、カンサーリサーチ(Cancer Research )39、881(1979)において、ポステ(G. Poste)等はリポソームに包封されたリンフォカインによるマウスマクロファージ抗腫瘍特性活性化を観察している。ソーン(S. Sone )及びフィドラー(I.J.Fidler)はセルイムノル(Cell. Immunol.)57、42(1981)において、リポソーム中に包封された合成ムラミルジペプチドによるラットの肺胞マクロファージの抗腫瘍特性の生体外活性化を報告している。

免疫モジュレーター(例えばムラミルジペプチド及びムラミルトリペプチド)ヒトγ−インターフェロン又はマクロファージ活性化因子(MAF)をもつリポソームは、感染、特にウイルス感染に対する防衛のために、また血液中及びリンパ液中の一次腫瘍組織中の腫瘍細胞との戦いのために、そしてまた転移との戦いのために、細胞性免疫系、例えば単核細胞系の細胞、例えば血液単核細胞、肺胞マクロファージ又は腹腔マクロファージを活性化するのに適している。

概要

毒性の低いリポソーム形成用乾燥組成物を提供する。

a)次の式(I):

(式中R1 及びR2 はC10〜C20アルケノイル基であり、nは1〜3の整数であり、そしてY+ は医薬として許容される塩基陽イオンである)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、b)式

(式中、R1 はC10〜C20アルカノイル基であり、R2 はC10〜C20アルケノイル基であり、Ra ,Rb 及びRc は水素原子又はC1 〜C4アルキル基であり、そしてnは2〜4の整数である)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、並びにc)生物学的活性をもつ物質又は物質混合物、を含有する乾燥調製物

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
3件

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請求項1

a)次の式(I):

請求項

ID=000004HE=030 WI=114 LX=0480 LY=0400(式中R1 及びR2 はそれぞれ他方とは無関係に偶数個炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基であり、nは1〜3の整数であり、そしてY+ は医薬として許容される塩基陽イオンである)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、b)式

請求項

ID=000005HE=030 WI=110 LX=0500 LY=0900(式中、R1 は偶数個の炭素原子をもつC10〜C20アルカノイル基であり、R2は偶数個の炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基であり、Ra ,Rb 及びRc は水素原子又はC1 〜C4アルキル基であり、そしてnは2〜4の整数である)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、並びにc)生物学的活性をもつ物質又は物質混合物、を含有する乾燥調製物

請求項2

式(I)のリン脂質対式(II)のリン脂質の混合比が10:90〜約50:50モル%で実質的に純粋な合成リン脂質を含有し、また消炎薬抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの医薬的に活性な物質又は物質混合物を含有する、請求項1に記載の乾燥調製物。

請求項3

a)式(I)においてR1 及びR2 が同じであって9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シス−エイコセノイル基であり、nが1であり、そしてY+ がナトリウムイオンである(I)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、b)式(II)においてR1 がn−ドデカノイル基、n−テトラデカノイル基、n−ヘキサデカノイル基又はn−オクタデカノイル基であり、R2 は9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シスエイコセノイル基であり、そしてRa ,Rb 及びRc がメチル基である式(II)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、c)消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質、抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの医薬的に活性な物質又は物質混合物を含有する、請求項1に記載の乾燥調製物。

請求項4

a)実質的に純粋な合成ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、b)実質的に純粋な合成1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、並びにc)消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質、抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの医薬的に活性な物質又は物質混合物を含有する、請求項3に記載の乾燥調製物。

請求項5

a)実質的に純粋な合成ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、b)実質的に純粋な合成1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、c)ジクロフェナックピルプロフェンミトマイシンシタラビンダクチノマイシンダウノルビシンドキソルビシンエトポシド、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシエチルアミド、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−グルタミン酸−(Cγ)−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミドの二ナトリウム塩、N−アセチルデスメチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンナトリウム塩、N−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩、N−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−グルタミン−α−n−ブチルエステル、Nα−(N−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル)−Nε−ステアロイル−L−リシン又は6−O−ステアロイル−N−アセチルムラミル−L−アラニン−D−イソグルタミン、リンフオカイン及びそれらとの組合せを含む群からの医薬的に活性な物質又は物質混合物を含有する、請求項4に記載の乾燥調製物。

請求項6

a)実質的に純粋な合成ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、b)実質的に純粋な合成1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、c)ミトマイシン、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド、N−アセチルデスメチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩又はN−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩を含む群からの医薬的に活性な物質を含有し、これらは場合によってはヒトγ−インターフェロンもしくはインターロイキン2、又は抗原もしくはマイトジエンによる刺激の後の脾臓又は末梢血液からのヒトTリンパ球を有する培養物から得られた培養物濾液中に含まれておりそしてマクロファージ活性化因子(MAF)の高い含有率を特徴とする物質混合物と組合わせて含有する、請求項5に記載の乾燥調製物。

請求項7

a)実質的に純粋な合成ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、b)実質的に純粋な合成1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、c)N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド、N−アセチルデスメチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩又はN−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩であって場合によっては抗原又はマイトジエンによる刺激の後の脾臓又は末梢血液からのヒトTリンパ球を有する培養物から得られた培養物濾液中に含まれておりそして少なくとも70%のMAF含有率を特徴とする物質混合物の組合わされているものを含有する、請求項6に記載の乾燥調製物。

請求項8

a)次の式(I):

請求項

ID=000006HE=030 WI=112 LX=0490 LY=1550(式中R1 及びR2 はそれぞれ他方とは無関係に偶数個の炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基であり、nは1〜3の整数であり、そしてY+ は医薬として許容される塩基の陽イオンである)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、並びにb)式

請求項

ID=000007HE=030 WI=110 LX=0500 LY=2050(式中、R1 は偶数個の炭素原子をもつC10〜C20アルカノイル基であり、R2は偶数個の炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基であり、Ra ,Rb 及びRc は水素原子又はC1 〜C4アルキル基であり、そしてnは2〜4の整数である)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質を含有する乾燥調製物。

請求項9

式(I)のリン脂質対式(II)のリン脂質の混合比が10:90〜約50:50モル%で実質的に純粋な合成リン脂質を含有する、請求項8に記載の乾燥調製物。

請求項10

a)式(I)においてR1 及びR2 が同じであって9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シス−エイコセノイル基であり、nが1であり、そしてY+ がナトリウムイオンである式(I)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、並びにb)式(II)においてR1 がn−ドデカノイル基、n−テトラデカノイル基、n−ヘキサデカノイル基又はn−オクタデカノイル基であり、R2 は9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シスエイコセノイル基であり、そしてRa ,Rb 及びRc がメチル基である式(II)で表わされる実質的に純粋な合成リン脂質、を含有する、請求項8に記載の医薬組成物

請求項11

a)実質的に純粋な合成ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、並びにb)実質的に純粋な合成1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、を含有する、請求項10に記載の乾燥調製物。

技術分野

0001

本発明は合成の実質的に純粋なリン脂質及び薬学的に活性物質を含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は水性分散体中のリポソームの形態で使用される。

背景技術

0002

リポソームは多数の刊行物中の文献に記載されてきている。多くの研究はそれらの構造及び使用に関するものである。1つの脂質二重層をもつ単膜リポソームとタマネギ外皮に似た態様で配置されている幾つかの脂質二重層をもつ多重膜リポソームとの間の区別がなされている。特に、可能なかぎむらのない大きさで直径が約2.0×10-8〜5.0×10-6m、好ましくは約2.0×10-8〜3.0×10-6mである集団をもつリポソームは製薬用途に適している。

0003

その球状シエル脂質成分、例えば両親媒性脂質、例えばリン脂質、例えばレシチンセファリン又はホスファチジン酸でできた、又は、場合によってはこれらの脂質と天然脂質、例えばコレステロールとでできた1つ以上の二重層からなる。これらの二重層は封入すべき化合物を含んだ水性相を収容している内部空間を取り囲んでおり、封入すべき化合物に関してはその化合物の構造及びその他のパラメーター、例えば温度又は濃度に依存して、その水性相中及び(又は)二重層中に存在することが可能である。

0004

広範囲の種類の活性物質のための担体としてのリポソームの治療用途にはたいへんな感心がある。従ってリポソームは蛋白質(例えば抗体又は酵素)、ホルモンビタミン又は遺伝子のための担体として、又は分析の目的で標識化合物のための担体として提案されてきている。

0005

リポソームに基いた医薬投与ステムはグレゴリアイス(G.Gregoriadis )(編集者)の総観著作物、リポソームテクノロジイ、第II巻、インコーポレーションオブドラッグス、プロテインアンドジエネティックマテリアル(Liposome Technology, vol. II, Incorporation of Drugs, Proteins and Genetic Material )、シーアールプレスCRCPress )、1984年発行に記載されている。ナイト(C.G.Knight)(編集者)の総観著作物、リポソームス:フロフィズィカルトラクテアートウセラピューティックアプリケーション(Liposomes :From Physical Structure to Therapeutic Applications )、エレセビエール(Elsevier)、1981年発行の第16章166頁にはリポソームに基いた医薬投与形態の利益が次のように要約されている:

0006

1.リポソームは生物学的膜浸透し、それで普通には不浸透性であるバリヤーを通しての活性物質の移送を容易にする。特に、リポソームは包封された化合物による細胞内浸透を容易にする。
2.リポソームはあるタイプの細胞組織との特定の相互作用の観点から、増加した選択性及び低下した毒性を目的として使用することができる。

0007

3.活性物質の薬物動態はリポソームによって、例えば解放分布及び体循環からの除去をいくぶん変えることによって有益に影響され得る。
4.化学的影響及び代謝によって引起される変化に対して敏感な活性物質はリポソームにより失活に対して保護される。
5.リポソームに包封された抗原免疫反応刺激することによって免疫調節効果を得ることができる。

0008

これらはその上の利益、例えば治療効果を達成するのに、遊離の活性物質を用いる時に比べて、リポソームを用いた時に必要とされる活性物質の量を減少させること、又は活性物質の投与回数を減少させることをもたらす。リポソームに基いた投与システムは物質をエンドサイテイシング細胞(endocytising cell )中に、特に細網内皮系統のエンドサイテイシング細胞中に導入する時に特別の有益をもつ。例えば、エンドサイテイシング細胞中への抗生物質の移送の促進及びこれらの細胞中に存在する原因として働く生体との改良された戦いが観察されている。エンドサイテイシング細胞は又炎症過程に伴なわれる。リポソームに包封された抗リウマチ性活性物質が周囲の組織中へよりも上記のような細胞中へ一層迅速に導入されることが観察されている。

0009

リポソームの形態で内包された細胞増殖抑制物質は細胞内皮系統の特定の器官肝臓脾臓骨髄)中に導入することができ、又は、において、肺の毛細管中での濾過及びそれに続く遊走血液単核細胞による移送の結果として、活性物質は肺胞マクロファージ中に富化することができ、それ故に肺又は肝臓の腫瘍に対する作用の改良を達成することが可能であり、一方同時に毒性を低下させる。

0010

免疫モジュレーターを包封しているリポソームは免疫系の反応(免疫刺激免疫抑制)における調節された変化を成し遂げることができる。例えば、カンサーリサーチ(Cancer Research )39、881(1979)において、ポステ(G. Poste)等はリポソームに包封されたリンフォカインによるマウスマクロファージ抗腫瘍特性の活性化を観察している。ソーン(S. Sone )及びフィドラー(I.J.Fidler)はセルイムノル(Cell. Immunol.)57、42(1981)において、リポソーム中に包封された合成ムラミルジペプチドによるラットの肺胞マクロファージの抗腫瘍特性の生体外活性化を報告している。

0011

免疫モジュレーター(例えばムラミルジペプチド及びムラミルトリペプチド)ヒトγ−インターフェロン又はマクロファージ活性化因子(MAF)をもつリポソームは、感染、特にウイルス感染に対する防衛のために、また血液中及びリンパ液中の一次腫瘍組織中の腫瘍細胞との戦いのために、そしてまた転移との戦いのために、細胞性免疫系、例えば単核細胞系の細胞、例えば血液単核細胞、肺胞マクロファージ又は腹腔マクロファージを活性化するのに適している。

0012

リポソームの製造に従来用いられている天然物質、例えば天然リン脂質(例えばホスファチジン酸、卵または大豆レシチン、又は卵または大豆セファリン)及びウシホスファチジルセリンは、たとえこの物質が精製された形態であり、そして薄層又はペーパークロマトグラフィーに従って同種のものからなると想定されても、異なった構造のアシル基をもつホスホグリセリドの混合物である。天然リン脂質をもつ乾燥製剤熱不安定性であり、それで短時間継続するのみであり、また水性相中の天然リン脂質も不安定であり、それで水性リポソーム混合物は同様に限られた時間継続するのみである。

0013

天然リン脂質のリポソーム混合物の組成が変化するために、また低い収率、種々の粒度分布及びそれらの低い安定度のために、生体外及び生体内試験結果及び臨床結果は必要な再現精度欠け、このことは、比較的長期間にわたって知られてきており且つ集中的な研究がなされてきているこの投与形態産業上の有用性に対する効果を今まで制限してきている。本発明の課題は、むらのない粒度分布及び高度の安定性をもつリポソーム分散液を水性相中で生成する医薬組成物を製造することである。

0014

本発明は、
a)式

0015

0016

(式中R1 及びR2 はそれぞれ他とは無関係に偶数炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基であり、nは1〜3の整数であり、そしてY+ は医薬として許容される塩基陽イオンである)で表わされる合成の実質的に純粋なリン脂質、
b)式

0017

0018

(式中R1 は偶数の炭素原子をもつC10〜C20アルカノイル基であり、R2 は偶数の炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基であり、Ra ,Rb 及びRc は水素原子又はC1 〜C4アルキル基であり、そしてnは2〜4の整数である)で表わされる合成の実質的に純粋なリン脂質、及び
c)生物学的活性をもつ物質又は物質混合物を含有する医薬組成物に関する。

0019

本発明の説明の範囲内において、前記及び後記の一般用語は好ましくは次の意味をもつ:有機基との関連で用いる用語“低級”、例えば低級アルキル基、低級アルキレン基、低級アルコキシ基、低級アルカノイル基等は、そのような有機基が、特に別に定義していない限りは、7個以下、好ましくは4個以下の炭素原子を含有することを意味する。

0020

式(I)及び(II)のリン脂質の命名法はIUPAC−IUBコミッションオンバイオケミカルノーメンクレイチャー(Commission on Biochemical Nomenclature)(CBN)により Eur. J. of Biochem.79、11〜21(1977)“ノーメンクレイチャーオブリピズ(Nomenclature of Lipids)”でなされた勧告に従っている(sn命名法、立体特異性番号付け)。

0021

別に指摘しない限りは、薬学的に活性な物質については世界保健機関(WHO)により提案された一般名称リコメンデッドインターナシナルノン・プロプエタリーネームズ(Recommended International Non-proprietary Names)〕を用い標準著作物“ファルマザイテシュヘミー(Pharmazeutishe Chemie)”〔シュレーダー(E.Schreeder)、ルーファー(C.Rufer )及びシュミーチェン(R.Schmiechen)、チーメベルラグスタットガード(Thieme Verlag Stuttgart )、(1982)及びメルクインデックス(Merck Index )(第10版)から選ばれている。

0022

用いた合成リン脂質純度は90重量%を越え好ましくは95重量%を越える。式(I)の合成リン脂質において、“偶数の炭素原子をもつC10〜C20アルケノイル基”の意味をもつR1 及びR2 は好ましくは9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、6−シス−オクタデセノイル基、6−トランス−オクタデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基、9−トランス−オクタデセノイル基、11−シス−オクタデセノイル基又は9−シス−エイコセノイル基である。

0023

医薬として許容される塩基の陽イオンY+ は、例えば、アルカリ金属イオン(例えばリチウムイオンナトリウムイオン又はカリウムイオン)、アンモニウムイオンモノ−、ジ−又はトリ−C1 〜C4アルキルアンモニウムイオン(例えばトリメチル−、エチル−、ジエチル−又はトリエチル−アンモニウムイオン)、2−ヒドロキシエチル−トリ−C1 〜C4 アルキルアンモニウムイオン(例えばコリン陽イオン)、又は2−ヒドロキシエチルアンモニウムイオン、及び塩基性アミノ酸例えばリシン又はアルギニンの陽イオンである。

0024

Y+ は好ましくはナトリウムイオンである。式(I)の合成リン脂質において、R1 及びR2 は好ましくは同一であり、そして9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シス−エイコセノイル基であり、nは1であり、そしてY+ はナトリウムイオンである。

0025

式(I)の合成リン脂質は特に1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリンナトリウムである。式(II)の合成リン脂質において、“偶数の炭素原子をもつC10〜C20アルカノイル基”の意味をもつR1 は好ましくはn−ドデカノイル基、n−テトラデカノイル基、n−ヘキサデカノイル基、n−オクタデカノイル基又はn−エイコサノイル基である。

0026

式(II)の合成リン脂質において、R2 は式(I)で記載した意味をもつ。式(II)の合成リン脂質において、式−(Cn H2n)−の基は枝分れのない又は枝分れしたアルキレン基、例えば1,1−エチレン基、1,1−、1,2−又は1,3−プロピレン基又は1,2−、1,3−又は1,4−ブチレン基、又は好ましくは1,2−エチレン基(n:2)である。

0027

式(II)の合成リン脂質において、好ましくはR1 はn−ドデカノイル基、n−テトラデカノイル基、n−ヘキサデカノイル基又はn−オクタデカノイル基であり、R2 は9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シス−エイコセノイル基であり、Ra ,Rb 及びRc はメチルであり、そしてnは2である。式(II)の合成リン脂質は特に1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリンである。下記の括弧内に与えられている名称は式(I)及び(II)のリン脂質中のアシル基R1 及びR2 に対して普通に使用されている:

0028

9−シス−ドデセノイル基(ラウロレオイル基)、9−シス−テトラデセノイル基(ミリストレオイル基)、9−シス−ヘキサデセノイル基(パルミトレオイル基)、6−シス−オクタデセノイル基(ペトロセロイル基)、6−トランス−オクタデセノイル基(ペトロセライドイル基)、9−シス−オクタデセノイル基(オレオイル基)、9−トランス−オクタデセノイル基(エライドイル基)、11−シス−オクタデセノイル基(バクセノイル基)、9−シス−エイコセノイル基(ガドレオイル基)、n−ドデカノイル基(ラウロイル基)、n−テトラデカノイル基(ミリストイル基)、n−ヘキサデカノイル基(パルミトイル基)、n−オクタデカノイル基(ステアロイル基)、n−エイコサノイル基(アラキドイル基)。

0029

生物学的活性をもつ物質又は物質混合物は特に、消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの薬学的に活性な物質である。

0031

置換されたフェニル酢酸塩又は2−フェニルプロピオン酸塩を含む群からの非ステロイド炎症抑制剤、例えばアルクロフェナックイブフェナックイブプロフェン、MK−830、BL−2365、クリンダナックフェンクロラック、ケトプロフェンフェノプロフェンインドプロフェン、フェンクロフェナック、ジクロフエナック、フルルビプロフェンピルプロフェンナプロキセン、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、又はシクロプロフェン;アントラニル酸誘導体、例えば式

0032

0033

(式中、R1 ,R2 及びR3 はそれぞれ他とは無関係に水素原子、メチル基塩素原子又はトリフルオロメチル基である)で表わされるアントラニル酸誘導体、例えばメフェナム酸フルフェナム酸トルフェナム酸又はメクロフェナム酸アニリノ置換ニコチン酸誘導体、例えばミフラム酸、クロニキシン又はフルニキシン;2−インドール−3−イル基又はピロール−2−イル基をもつヘテロアリール酢酸又は2−ヘテロアリール酢酸、例えばインドメタシンオキシメタシンイントラゾール、アセメタジン、シンメタシン、ゾメピラック、トルメチンコールピラック又はチアプロフエン酸;スリンダックタイプのインデニル酢酸及び鎮痛活性ヘテロアリールオキシ酢酸、例えばベンザダックである。抗生物質を含む群からの薬学的に活性な物質は、例えば、式

0034

0035

(式中、R1 は水素原子又はピロリジン−1−イル−メチル基であり、R2 は水素原子又はヒドロキシル基であり、R3 は水素原子、ヒドロキシル基又はメチル基であり、R4 は水素原子又はメチル基であり、そしてR5 は水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基である)で表わされるテトラサイクリン抗生物質、例えばクロルテトラサイクリンオキシテトラサイクリンテトラサイクリンデメチルクロルテトラサイクリンメタサイクリンドキシサイクリンミノサイクリン又はロリテトラサイクリンアミノグリコシド、例えばカナマイシン

0036

アミカシンゲンタマイシンC1a、C2 、C2b又はC1 、シソマイシンネチルマイシンスペクチノマイシンストレプトマイシントブラマイシンネオマイシンB、ジベカシン又はカネンドマイシン;マクロライド、例えばマリドマイリン又はエリスロマイシンリンコマイシン、例えばクリンダマイシン又はリンコマイシン;それぞれ6β−又は7β−アシルアミノ基をもつペニシラン酸(6−APA)−及びセファロスラン酸(7−ACA)−誘導体(これらは発酵的に、半合成的に又は完全に合成的に得られる6β−アシルアミノペニシラン酸又は7β−アシルアミノセファロスポラン酸の誘導体又は3位で変性されている7β−アシルアミノセファロスポラン酸誘導体中に存在する)、

0039

抗リーシュマニア物質を含む群からの薬学的に活性な物質は、例えば、アンチモン化合物、例えば酒石酸アンチモニルカリウムスチボフェン、ナトリウムスチボカプテート及びナトリウムスチボグルコネートである。抗真菌物質を含む群からの薬学的に活性な物質は、例えば、チオ炭酸誘導体、例えばジベンズチオントルナフテート又はトルクレートイミダゾール誘導体、例えばクロトリマゾールミコナゾールエコナゾールイソコナゾール又はケトコナゾール;又はポリエン抗生物質、例えばニスタチンナタマイシン又はアムフオテリシンBである。

0040

抗腫瘍物質を含む群からの薬学的に活性な物質は、例えば、ビス−(2−クロロエチルアミン基をもつアルキル化剤、例えばクロルメチンクロラムブシルメルファラムウラムスチン、マノムスチン、リン酸エストラムスチン、メクロルエタミンオキシドシクロホスファミドイフォスファミド又はトリフォスファミド;アジリジン構造をもつアルキル化剤、例えばトレタミンチオテパトリアジクオン又はミトマイシン;アルキル化メタンスルホン酸エステル、例えばブスルファン

0042

癌化学療法に用いられている抗生物質、例えばダクチノマイシンダウノルビシンドキソルビシンミスラマイシン、ブレオマイシンA2 又はB2 又はエトポシド、及びビニカアルカロイド、例えばビンクリスチン、場合によってはクロルメタミン、プレドニソロン又はプレドニソン組合わされたもの、及びプロカルバジンである。免疫モジュレーターは、例えば、ムラミルペプチド、例えばムラミルジペプチド又はムラミルトリペプチド、特に式

0043

0044

(式中、Xは基−C(=O)−又は−C(=O)−O−であり、R1 はL−Ala−D−isoGln−L−Ala−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミド基、L−Ala−D−Glu(Cγ−L−Ala)−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミド基、L−Ala−D−isoGlnOH基、L−Ala−D−GlnNH2 −α−n−ブチルエステル基、L−Ala−D−isoGln−L−(ステアロイル)−Lys基、L−Val−D−Gln−NH2 −α−n−メチルエステル基

0045

L−Ala−D−isoGln−L−Ala−1,2−ジパルミトイル−sn−グリセリンエステル基又はL−Ala−D−isoGln−L−Ala−コレステロールエステル基であり、R2 は水素原子、メチル基又はn−プロピル基であり、R3 は水素原子、n−ステアロイル基、10−(2,3−ジメトキシ−1,4−ジオキソ−5−メチル)−2,5−シクロヘキサエノイル基、2−ベヘノイルオキシ−2−メチルプロパノイル基又はn−オクタノイル基であり、

0046

R4 は水素原子又はn−オクタノイル基であり、R5 はC1 〜C4アルキル基であり、そしてR6 は水素原子又はC1 〜C4 アルキル基である)で表わされるもの及びそれの相当する2−パルミトイルチオ誘導体;n−ラウロイル−L−Ala−D−isoGln−(m−DAP−Gly)−NH2 、n−ラウロイル−L−Ala−D−isoGln−(L−DAP−Gly)−NH2 、n−ラウロイル−L−Ala−D−isoGln−(L−Lys−D−Ala)−NH2 、

0047

n−オクタノイル−L−Ala−D−isoGln−(L−Lys−D−Ala)−NH2 又はパルミトイル−Cys−((2R)−2,3−ジラウロイルオキシプロピル)−Ala−D−Glu−(Gly−タウリン−Na)−NH2 タイプの免疫調節特性をもつリポペプチドであり、又はそれらは抗原又はマイトジエン等によって刺激された時にリンパ球、単核細胞又はマクロファージによって分泌されるリンフォカインである。

0048

リンフォカインを含む群としては、例えば、公知のタイプのインターフェロン、特に天然又は組換え体のヒト−γインターフェロン、例えば、ヨーロッパ特許出願第63,482号、第77,670号、第83,777号、第88,540号、第89,676号、第95,350号、第99,084号、第110,044号及び第112,967号及び国際出願(PCT)WO83/04,053及びWO84/02,129に従って得ることのできるヒトγインターフェロンがある。

0049

ヨーロッパ特許出願第121,157号に従った、次のアミノ酸配列をもつ組換え体ヒトγインターフェロン:
H2 N−Cys−Tyr−Cys−Gln−Asp−Pro−Tyr−Val−Gln−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−Gly−His−Ser−Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr−Leu−Phe−Leu−Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys−Glu−Glu−Ser−Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser−Gln−Ile−Val−Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−Lys−Asn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln−Lys−Ser−Val−Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met−Asn−Val−Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys−Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr−Ser−Val−Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−Arg−Lys−Ala−Ile−His−Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met−Ala−Glu−Les−Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Glu−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Gln−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−OH、

0050

及び英国特許出願第2,107,718号に従った、次のアミノ酸配列をもつ組換え体ヒトγインターフェロン:
H2 N−Cys−Tyr−Cys−Gln−Asp−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−Gly−His−Ser−Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr−Leu−Phe−Leu−Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys−Glu−Glu−Ser−Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser−Gln−Ile−Val−Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−Lys−Asn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln−Lys−Ser−Val−Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met−Asn−Val−Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys−Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr−Ser−Val−Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−Arg−Lys−Ala−Ile−His−Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met−Ala−Glu−Leu−Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Gly−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−OH、
が好ましい。

0051

リンフオカインを含む群としてはまた精製された形態のヒトインターロイキン2、例えば、T細胞マイトジエンによるヒト腫瘍白血病細胞又はリンパ腫細胞の活性化の後に培養物濾液中で得ることができまた逆相HPLCによって精製されているインターロイキン2;抗原又はマイトジエンによる刺激の後に脾臓又は末梢血液からのヒトTリンパ球をもつ培養物から得ることができる培養物濾液、例えばヒトT細胞−白血病リンパ腫ウイルスHTLV−I)、植物凝集素又はコンカナバリンA;及びマクロファージ遊走阻止因子MIF)、白血球遊走阻止因子白血球遊走拡大因子、マクロファージ活性化因子(MAF)、コロニー刺激因子、インターロイキン1及び2及びγインターフェロンの用語で知られてきている成分をもつ混合物を含有する培養物濾液、特にマクロファージ活性化因子(MAF)を高い含有率でもつ培養物濾液又は単離物がある。

0052

本発明の医薬組成物は比較的むらのない大きさ(約2.0〜3.0×10-9m)及び良好な貯蔵安定性を特徴とする。例えば、上記の合成リン脂質及びムラニルペプチドからなる乾燥製剤(凍結乾燥物)は数ケ月から数年までの期間継続する。乾燥製剤は使用の直前振盪ボルテックス)又は振動によって水性緩衝液中に非常に簡単に分散させることができ、それで現場で使用することができ、ほとんどの場合に濾過、中和透析等の如き追加の処置を避けることができる。合成のリン脂質及び包装化合物としてのムラミルペプチドをもつ水性リポソーム分散体は10℃以下の温度で数週間から数カ月の期間継続し、また凍結乾燥体の形態で貯蔵安定性にすることさえできる。

0053

本発明の医薬組成物は特に良好な生理学安全度、例えば低い毒性及びそれらがリポソームの水性分散体の形態で投与される時に好ましい薬物動態プロフィルを特徴とする。従って、特に単核細胞系の細胞を通して非常に迅速なエンドサイト−シスが起る。前記の合成リン脂質及び包装化合物としてのムラミルジ−又はトリ−ペプチドからなるリポソームは肺及び肝臓中に特に十分に富化することができそしてマクロファージによって迅速に取込まれる。特に、肺胞マクロファージは刺激され、そして生理学的に異常な物質、例えばウイルス又は転移腫瘍細胞を排除する。リポソームの形態の本発明の医薬組成物はそれ故に転移腫瘍と戦うための癌の化学療法に極めて適している。

0054

本発明の医薬組成物の製造に用いることのできるリン脂質(I)及び(II)の混合物は、水性相中での分散の後に約37℃よりも低い相転移温度液体ゲル形態)をもつ。リポソーム分散体は加熱することなしで作ることができる。水性分散体中の式(I)及び(II)のリン脂質がリポソームの形態となっており、その内部に生物学的活性をもつ前記の化合物又は物質混合物が封入されているその水性分散体は医薬投与システムであり、これは、場合によっては例えば超遠心分離によって濃縮するか又は単離した後に経口(p.o.)又は非経口(i.v.、i.m.、i.p.又は局所)投与のための治療目的に適している。

0055

経口投与の場合には、リポソームに基いた投与システムは活性成分の吸収を改善することができる。経口投与については、pH7.0〜7.8、好ましくは7.2〜7.4に緩衝化されたリポソームを含有する水性分散体は製薬的に許容される稀釈剤又は担体と、又は通例の添加物、例えば着色剤又は香料と混合することができ、又シロップの形態で又はカプセルの形態で用いることができる。

0056

非経口投与については、リポソームは、pH7.0〜7.8、好ましくは7.2〜7.4に緩衝化された担体液体として役立つ無菌水溶液、例えば無菌の、カルシウムを含まない、等張塩水又はグルコース溶液中に分散させる。局所投与については、pH7.0〜7.8、好ましくは7.2〜7.4に緩衝化されたリポソーム含有水性分散液を通例の固体担体、例えば増粘剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース、及び適した防腐剤酸化防止剤又は香料と混合され、それで皮膚又は粘膜に塗布するためにローション又はゲルの形態で用いられる。

0057

本発明は狭い意味では式(I)のリン脂質対式(II)のリン脂質の混合比約10:90〜約50:50モル%で合成の実質的に純粋なリン脂質を含有し、また消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質、抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの製薬的に活性な物質又は物質混合物を含有し、そして場合によっては存在してもよい、pH7.0〜7.8に緩衝された担体液及び(又は)追加の固体担体を含有してもよい医薬組成物に関する。

0058

本発明は好ましくは、
a)式(I)においてR1 及びR2 は同じであって9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シス−エイコセノイル基であり、nは1であり、そしてY+ はナトリウムイオンである式(I)で表わされる合成の実質的に純粋なリン脂質、

0059

b)式(II)においてR1 はn−ドデカノイル基、n−テトラデカノイル基、n−ヘキサデカノイル基又はn−オクタデカノイル基であり、R2 は9−シス−ドデセノイル基、9−シス−テトラデセノイル基、9−シス−ヘキサデセノイル基、9−シス−オクタデセノイル基又は9−シスエイコセノイル基であり、そしてRa ,Rb 及びRc はメチル基である式(II)で表わされる合成の実質的に純粋なリン脂質、

0060

c)消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質、抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの製薬的に活性な物質又は物質混合物、及び場合によっては存在してもよい、pH7.2〜7.4に緩衝された担体液体、を含有する医薬組成物に関する。

0061

本発明は特に、
a)合成の、実質的に純粋なナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、
b)合成の、実質的に純粋な1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、
c)消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質、抗真菌物質、抗腫瘍物質及び免疫モジュレーターを含む群からの製薬的に活性な物質又は物質混合物、及び場合によっては存在してもよい、pH7.2〜7.4に緩衝された担体液体、を含有する医薬組成物に関する。

0062

本発明は一層特に、
a)合成の、実質的に純粋なナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、
b)合成の、実質的に純粋な1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、

0063

c)消炎薬、例えばジクロフナック又はピルプロフェン;抗腫瘍物質、例えばミトマイシン、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はエトポシド;免疫モジュレーター、例えばN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−グルタミン酸−(Cγ)−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミドの二ナトリウム塩

0064

N−アセチルデスメチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンナトリウム塩、N−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩、N−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−グルタミン−α−n−ブチルエステル、Nα−(N−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル)−Nε−ステアロイル−L−リシン又は6−o−ステアロイル−N−アセチルムラミル−L−アラニン−D−イソグルタミン;リンフオカイン又はそれらとの組合せ、を含む群からの製薬的に活性な物質又は物質混合物、及び場合によっては存在していてもよい、pH7.2〜7.4に緩衝された担体液体、を含有する医薬組成物に関する。

0065

本発明は一層特に、
a)合成の、実質的に純粋なナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、
b)合成の、実質的に純粋な1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、

0066

c)抗腫瘍物質、例えばミトマイシン、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はエトポシド、及び免疫モジュレーター、例えばN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド、N−アセチルデスメチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩又はN−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩であって、

0067

場合によってはヒトγインターフェロン又はインターロイキン2、あるいは抗原又はマイトジエンによる刺激の後に脾臓又は末梢血液からのヒトTリンパ球をもつ培養物から得られた培養物濾液中に含まれておりそしてマクロファージ活性化因子(MAF)の高い含有率を特徴とする物質混合物と組合わされているもの、を含む群からの製薬的に活性な物質及び場合によっては存在していてもよい、pH7.2〜7.4に緩衝された担体液体、を含有する医薬組成物に関する。

0068

本発明は何よりもまず、
a)合成の、実質的に純粋なナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン、
b)合成の、実質的に純粋な1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン、

0069

c)免疫調節作用をもつ化合物、例えばN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド、N−アセチルデスメチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩又はN−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミンのナトリウム塩であって、

0070

場合によっては抗原又はマイトジエンによる刺激の後に脾臓又は末梢血液からのヒトTリンパ球をもつ培養物から得られた培養物濾液中に含まれておりそして少なくとも70%のMAF含有率を特徴とする物質混合物と組合わされているもの、及び場合によっては存在していてもよい、pH7.2〜7.4に緩衝された担体液体、を含有する医薬組成物に関する。

0071

上記の医薬組成物は乾燥製剤の形態で市販することができ、そしてpH7.0〜7.8に緩衝化された担体液体中の水性リポソーム分散液の形態で用いることができる。投与すべき活性物質の投与量は一般的には、例えばドイツ薬局方に規定されている、及び特定の投与形態、患者年令及び患者の健康に対して問題の活性物質について知られている最高量及び最低量である。

0072

本発明に従って作ることのできるリポソームをもった水性分散液は又、しかしながら、より少ない投与量で投与された活性物質は受容器官に受け取らせることができそれで治療効果をもたらすことができ、又は一層高い投与量での投与では望ましくない副作用を避けることができる。リポソームの形態で包封されているムラミルペプチド又はリポペプチドタイプの前記の免疫モジュレーターの好ましい投与量は1回の投与当り体重1Kg当り0.01〜約10mgである。リポソーム形態のリンフオカイン、例えばヒトγ−インターフェロン又はMAFを含有する混合物の場合には、好ましい投与量はγインターフェロン又はMAF1ml当り約100〜100,000単位である。

0073

本発明は又式(I)及び(II)で表わされる合成の実質的に純粋なリン脂質の混合物、特に均質混合物、特に式(I)のリン脂質対式(II)のリン脂質の混合比が約10:90〜約50:50モル%である混合物に関する。30:70モル%の混合比が好ましい。これらの混合物は水溶性活性物質を含有する水性相中でリポソームを作るのに用いることができる。

0074

本発明の医薬組成物又は前記した混合物は、例えば、次のようにして作られる:
a)式(I)及び(II)で表わされる合成の、実質的に純粋なリン脂質及び生物学的活性をもつ親油性の物質又は物質混合物を含む均質混合物を作り、そしてリポソームの製造のためにその生成均質混合物を水性相中に分散させ、又は
b)式(I)及び(II)で表わされる合成の、実質的に純粋なリン脂質を含む均質混合物を作り、そしてリポソームの製造のために、その生成均質混合物を生物学的活性をもつ水溶性物質又は物質混合物を含有する水性相中に分散させ、そして必要ならばその生成した水性分散液をpH7.0〜7.8に緩衝し、そして所望によりその生成リポソームを濃縮し且つ(又は)分離する。

0075

均質混合物は例えばフイルム形成によって又は好ましくは凍結乾燥体の生成によって作られる。フイルムの形成は、変法a)に従って式(I)及び(II)の合成リン脂質及び包封されるべき親油性物質又は物質混合物を溶解させることによって、又は変法b)に従って式(I)及び(II)の合成リン脂質を、融点の低い有機溶媒中に溶解させ、そして溶媒を除去することによって実施される。

0076

フイルムの製造に適した溶媒の選択は脂質成分及び包接化合物の溶解度に依存する。フイルム形成による均質混合物の製造に適した溶媒は、例えば、低沸点且つ低融点(0℃未満)で、置換されていない又は置換されている、例えばハロゲン化されている脂肪族又は脂環式炭化水素、例えばn−ヘキサンシクロヘキサン塩化メチレン又はクロロホルムアルコール、例えばメタノール;低級アルカンカルボン酸エステル、例えば酢酸エチル;又はエーテル、例えばジエチルエーテル、又はこれらの溶媒の混合物である。溶媒は真空中で、好ましくは高真空下で、又は不活性ガス、例えば窒素での吹き出しによって除去される。

0077

凍結乾燥体の生成は変法a)に従って式(I)及び(II)の合成リン脂質及び包封されるべき親油性物質又は物質混合物の溶液を凍結乾燥することによって、又は変法b)に従ってドイツ特許出願第2,818,655号に記載の方法で式(I)及び(II)の合成リン脂質の、融点の高い有機溶媒中の溶液を凍結乾燥することによって実施される。適した溶媒は脂質成分及び包接化合物と共に凍結乾燥の間、例えばメタノール−、エタノール−又はアセトンドライアイス混合物の温度で固体であるものであり、それで、例えば0℃よりも高い融点をもつ有機溶媒、例えば氷酢酸ベンゼン又はジオキサン、特に第三ブタノールである。

0078

均一混合物は又、有機溶媒、例えばクロロホルム中のリン脂質及び親油性包接化合物の溶液を噴霧乾燥することによって作ることができる。均質混合物は粉末の形態で得られる。式(I)のリン脂質対式(II)のリン脂質のおおよその混合比約10:90〜約50:50モル%、特に30:70モル%は均質混合物の製造に適している。包接化合物対脂質の合計量のおおよその混合比は約0.001〜1.0:1.0、好ましくは0.005〜0.1:1.0モルである。

0079

分散は、例えば、変法a)に従って、前もって作られたリン脂質(I)及び(II)及び親油性包接化合物の均質混合物が加えられている水性相、又は変法b)に従って、水溶性包接化合物を含有しており且つ前もって作られたリン脂質(I)及び(II)の均質混合物が加えられている水性相を振盪する(例えばボルテックスミキサー)かまたは攪拌することによってもたらされる。大きいか、小さいか、単膜か又は多重膜かであり得るリポソームの生成は自生的に(自生小胞化)、即ち外部エネルギーの追加の供給なしで、高速で起る。(水性分散液の全重量との相関で)約0.1〜50重量%、好ましくは2〜20重量%の均質混合物を水性相中に分散させることができる。

0080

酸性的に又は塩基性的に反応する水性分散液はpH7.0〜7.8、好ましくは7.2〜7.4に緩衝化される。分散は好ましくはすでにそのpH値に緩衝化されている水性相中で実施される。変法a)は親油性でわずかに水溶性の活性物質、例えばムラミルジ−又はトリペプチドをリポソームの形態で封入すべきである時に特に適している。変法b)は水溶性活性物質、例えばトリフォスファミドタイプのシタラビン又はシトスタチックスのリポソーム混合物を作る時にさし示される。

0081

水性リポソーム混合物の形態の本発明の医薬組成物の製造はリポソームの製造について今まで知られてきている他の任意の方法に従って、例えばリン脂質(I)及び(II)及び包接化合物を含有する水性分散液を超音波で、又は注入法又は逆相蒸発によって処理することによって通例の方法で実施できる。分散は約36℃未満の温度で、好ましくは室温で実施される。包封すべき化合物の敏感さが必要とするならば、そのプロセスを、冷却しながらそして場合によっては不活性ガス雰囲気、例えば窒素又はアルゴン雰囲気下で実施する。生成リポソームは水性相中で非常に長期間(数週間又は数カ月まで)安定である。水性リポソーム分散液の形態の医薬組成物は、場合によっては安定剤、例えばマンニトール又はラクトースの添加後において、凍結乾燥によって貯蔵安定性になる。

0082

生成される単膜リポソームの大きさは、とりわけ、活性物質の構造及び脂質成分、これらの成分の混合比及び水性分散液中のこれらの成分の濃度に依存する。例えば、脂質成分の濃度を増加又は減少させることによって小さい又は大きいリポソームの含有率の高い水性相を作ることができる。リポソーム分散液の後処理によって、例えば超音波での処理によって又はストレート穴フィルター〔例えばヌクレオポール(Nucleopore) 〕を通しての押出しによって、リポソームの特にむらのない大きさ分布を達成することが可能である。

0083

小さなリポソームからの大きなリポソームの分離は、実際に必要であるならば、通例の分離方法によって、例えばゲル濾過によって、例えば担体としてセファロス(Sepharose)4B又はセファクリル(Sephacryl)を用いて、又は超遠心分離、例えば160,000gでの超遠心分離でのリポソームの沈降によって実施される。例えば、数時間、例えば約3時間のそのような重力場での遠心分離の後に、大きなリポソームは沈積し、一方小さなリポソームは分散したままであり、それでデカント分離できる。数時間の遠心分離の後、小さなリポソームからの大きなリポソームの完全な分離が達成される。

0084

もし変法b)に従って、水性相が包封されていない水溶性化合物を含有しているならば、リポソームは好ましくは分別される。特に、水溶性抗腫瘍物質、例えばアルキル化剤は、例えば濾過、限外濾過、透析又は遠心分離によって分別されるべきである。なぜなら、これらの活性物質は溶解した形態では特に十分には許容されないからである。富化したリポソームは担体液体、例えば等張の無菌塩水と混合することができる。比較的むらのない大きさの小さなリポソームをもつ水性分散液は超音波処理によっても得られる。

0085

6.0×10-8mよりも大きな直径をもつ水性相中の全てのリポソーム及び高分子量凝集物中に存在する包封されていない親油性活性物質及び余分の分散した脂質も、ゲル濾過によって分別することも可能であり、それで比較的むらのない大きさのリポソーム部分をもつ水性分散液を得ることが可能である。リポソームの完了した生成及び水性相中のそれらの含有率は種々の物理的測定法を用いてそれ自体公知の方法で検知できる。例えば電子顕微鏡での凍結破壊試料及び薄片の使用、X線回析ダイナミックライトスカタリング、分析超遠心分離での濾液の質量測定及び特に分光分析法例えば核共鳴スペクトル( 1H、13C及び31P)での分光分析法で検知できる。

0086

式(I)及び(II)の合成の実質的に純粋なリン脂質は公知である。例えばブラウニング(J.Browning)及びシーリング(J.Seelig)はケム・アンドフィズックスオブリピズ(Chem. and Physics of Lipids)24(1979),103〜118頁に記載の総観的報文“シンセシス オブスペシフィカリデュテレートッド サチュレーテッドアンドアンサチュレーテッドフォスファチジルセリンズ(Synthesis of Specifically Denterated Saturated and Unsaturated Phosphatidylserins )”において、1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリンの製造を記載している。

0087

消炎薬、抗生物質、抗リーシュマニア物質及び癌化学療法剤を含む群からの製薬的に活性な物質は公知である。メルクインデックス(Merck Index )、第10版、又は前記したシュレーダー(Schroeder )等の総観著作物“ファーマゼウティシュヘミヘ(Pharmazeutische Chemie)”を参照のこと。式(VI)のムラミルペプチドタイプの前記した免疫モジュレーターも公知である。例えばヨーロッパ特許明細書第25495号及び第21367号及びフランス特許明細書第7,637,091号を参照のこと。

0088

リポペプチドタイプの前記の免疫モジュレーターも公知である。例えばEP−A−114,787又はヨーロッパ特許明細書第330号を参照のこと。精製インターロイキン2の製造もEP−A−0106179及び米国特許明細書第4,448,879号に記載されている。マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、白血球遊走阻止因子、白血球遊走拡大因子、マクロファージ活性化因子(MAF)、コロニー刺激因子等を含有する物質混合物は多数の刊行物、例えば、サラヒュディ(Salahuddi S.Z.)等、サイエンス(Science)223(4637)703−707(1984)に記載されている。

0089

ヒトMAFの特に高い含有率をもつ培養物濾液の製造も多数の刊行物、例えばレ(Le J. )等、J.イムノロジィー(J.Immunology)vol.131、2821〜2826(1983)、クレイネルマン(Kleinermann )等、J.クリニカルインベスティゲーション(J.Clinical Investigation)、72、304−315(1983)、カメロン(Cameron D.J.)、J. Clin. Lab. Immunol.(1984)、13、47−50、及びクライネルマン(Kleinermann E.S.)及びフィドラー(Fidler I.J. )リンフォキンリサーチ(Lymphokine Research )、vol.2、 No.1、7−12(1983)に記載されている。

0090

7.0〜7.8のpHをもつ、使用する緩衝液は好ましくは、例えば HagersHandbuch der Pharmazeutischem Praxis. Springer Verlag, Vol 1,pp 357−359に示された指示に従って製造できる二水素/水素ホスフェートに基いた無菌ホスフェート緩衝液である。特にpH7.2をもつ無菌の等張のカルシウムを含まない緩衝液(デュルベコ)が使用される。以下の実施例は本発明を限定することなしで本発明を例示する。

0091

実施例1
無菌の第三ブタノール586mg、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド(ヨーロッパ特許明細書第25,495号に従って製造したもの)0.1mg、ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン(純度95%)〔ブラウニング(J.Brawning)及びシーリグ(J.Seelig)の報文、ケム・アンドフィズックスオブリピズ(Chem.and Physics of Lipid )24(1979)103〜118頁に従って製造したもの)75mg、

0092

及び1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン(アバンティ、極性脂質)(純度95%)175mgを丸底フラスコ中で溶解させる。その溶液をアクディスク(2.0×10-7m)で無菌濾過し、無菌バイアル中に入れ、そして−45℃で凍結させる。そのバイアル25℃の温度に達するまで真空中で乾燥し、そしてアルゴン雰囲気下で密封する。

0093

使用の前に、無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝化された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5mlを無菌のシリンジを用いて室温でこの乾燥製剤(凍結乾燥物)に加え、そしてそのバイアルを標準化された実験室用振盪機(ボルテックス、段階6)で10分間振盪する。その生成するリポソーム分散液は4℃で貯蔵可能であり、そして非経口(i.v.)投与に適している。

0094

実施例2
無菌の第三ブタノール586mg、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド(ヨーロッパ特許明細書第25,495号に従って製造したもの)0.1mg、ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン(純度95%)(ブラウニング及びシーリグの報文、ケム・アンドフィズックスオブリピズ25(1979)103−118頁に従って製造したもの75mg及び1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン(アバンティ、極性脂質)(純度95%)175mgを丸底フラスコ中で溶解させる。

0095

その溶液をアクロディスク(2.0×10-7m)で無菌濾過し、そして無菌バイアル中に入れる。そのバイアルを150rpm で回転させそしてその溶媒を、1バールの圧力下で、濾過されている精製窒素流中で吹き出しによって除去する。次いでそのバイアルに6.0×10-2ミリバールの高真空下で真空を生じさせる。そのバイアルをアルゴン保護ガス雰囲気下で密封する。

0096

使用の前に、無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝化された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5mlを室温で無菌のシリンジを用いて、すでに製造されているフイルムに加え、そしてそのバイアルを標準化された実験室用振盪機(ボルテックス、段階6)で10分間振盪させる。その生成リポソーム分散液は4℃で貯蔵可能であり、また非経口(i.v.)投与に適している。

0097

実施例3
ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルセリン75mg(0.091ミリモル)、1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン175mg(0.231ミリモル)及びN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミド0.1〜10mgからなるリポソームを含有する水性分散液を実施例2で記載した方法と類似の方法で製造することができる。

0098

実施例4
無菌の第三ブタノール586mg、ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン(純度95%)75mg及び1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン(純度95%)175mgを丸底フラスコ中で溶解させ、アクロディスク(2.0×10-7m)で無菌濾過し、そして無菌のバイアル中に入れる。そのバイアルを1750rpm で回転させ、そして濾過されている精製窒素流中で1バールの圧力下で吹き出しによって溶媒を除去する。次いでそのバイアルに6.0×10-2ミリバールの高真空下で真空を生じさせる。そのバイアルをアルゴン保護ガス雰囲気下で密封する。

0099

使用の前に、4g/lの濃度でドキソルビシンを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5mlを室温で、無菌のシリンジを用いて、すでに製造されているフィルムに加え、そしてそのバイアルを標準化された実験室用振盪機(ボルテックス、段階6)で10分間振盪させる。次いでその分散液を40000gで60分間遠心分離する。濾液を取り出し、そしてそのリポソームを0.85%無菌塩水2.5ml中に懸濁させる。

0100

実施例5
無菌の第三ブタノール506mg、ナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン(純度98%)(ブラウニング及びシーリングの報文、ケム・アンドフィズックスオブリピズ24(1979)103頁に従って製造したもの)75mg及び1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン(純度99.5%)〔エイブル(H.Eibl)の報文、ケム・アンド フィジックスオブ リピズ 26(1980)239頁及びエイブルの報文アンゲワンテヘミエ(Angewandte Chemie )96(1984)247頁に従って製造したもの)175mgをバイアル(15ml)中で溶解させる。

0101

その溶液をアクロデスク(2.0×10-7m)で無菌濾過し、無菌バイアル中に入れ、そして−45℃で凍結させる。そのバイアルを25℃の温度に達するまで真空中で乾燥し、そしてアルゴン雰囲気下で密封する。使用の前に、4g/lの濃度でドキソルビシンを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝された塩水(デュルベコ)2.5mlを無菌シリンジを用いてこの乾燥製剤に加え、そしてそのバイアルを標準化された実験室用振盪機(ボルテックス、段階6)で1分間振盪する。

0102

無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝された塩水22.5mlの添加(このことは10℃で平衡にならせている)の後、その懸濁液を2分間振盪させ、次いで10000g及び10℃で30分間遠心分離する。残留物を取り出しそしてリポソームを無菌塩水25ml中に10℃で再懸濁させる。リポソームを0.85%無菌塩水2.5ml中再懸濁させるとすぐに遠心分離プロセスをくり返す。リポソーム懸濁液は液体250mg当り9mgのドキソルビシンを含有しており、i.v.投与に適している。

0103

実施例6
実施例5で記載した方法と類似の方法で、1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン(純度99.5%)225mg(0.297ミリモル)及びナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−S−セリン(純度98%)25mg(0.030ミリモル)を含有する乾燥製剤からドキソルビシン含有リポソームを作ることができる。そのリポソーム懸濁液は液体250mg当り7mgのドキソルビシンを含有し、そしてi.v.投与に適している。

0104

実施例7
1g/lの濃度でミトマイシンCを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5ml中にリン脂質の乾燥製剤を分散させ、その分散液を遠心分離し、そしてその生成物を塩水中に懸濁させることによって、実施例4及び5に記載の方法と類似の方法でリポソーム分散液を作ることができる。

0105

実施例8
50〜200μgのナトリウムN−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(英国特許明細書第1,570,625号)及びヨーロッパ特許出願第121,157号(協和発酵工業株式会社)に従って単離した1,000〜10,000単位の組換え体ヒトγ−インターフェロンを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5ml中にリン脂質の乾燥製剤を分散させることによって、実施例5で記載した方法と類似の方法で、しかし遠心分離は用いないでリポソーム分散液を作ることができる。

0106

実施例9
50〜200μgのナトリウムN−アセチルデスメチル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン及び1,000〜100,000単位の組換え体ヒトγ−インターフェロンを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝化された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)中にリン脂質の乾燥製剤を分散させることによって、実施例5に記載の方法と類似の方法で、しかし遠心分離は用いないでリポソームの懸濁液を作ることができる。

0107

実施例10
50〜200μgのナトリウムN−アセチル−D−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン及び1,000〜100,000単位の組換え体ヒトγ−インターフェロンを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝化された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5ml中リン脂質の乾燥製剤を分散させることによって、実施例4に記載の方法と類似の方法で、しかし遠心分離プロセスは用いないでリポソームの懸濁液を作ることができる。

0108

実施例11
約50〜200μgのナトリウムN−アセチルデスメチル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン及び1,000〜100,000単位の組換えたヒトγ−インターフェロンを含有する無菌の、カルシウムを含まない、ホスフェートで緩衝化された(pH7.2〜7.4)塩水(デュルベコ)2.5ml中にリン脂質の乾燥製剤を分散させることによって、実施例4に記載の方法と類似の方法で、しかし遠心分離は用いないでリポソーム懸濁液を作ることができる。

0109

実施例12
1gのソルビトール結晶の大きさ125〜500μm)を含有する丸底フラスコに、1〜10mgのN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニル−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミド(ヨーロッパ特許明細書第25,495号に従って製造したもの)、75mgのナトリウム1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−(S)−セリン及び175mgの1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリンを含有する無菌の第三ブタノール14.2mlを真空中で滴下する。

0110

次いで溶媒を調節された温度条件下で真空中で除去する。その生成乾燥粉末製剤をアルゴン雰囲気下で密封する。使用の前に、この乾燥製剤に無菌蒸留水20mlを室温で無菌シリンジを用いて添加し、そしてフラスコを10分間振盪させる。

0111

実施例13
実施例12で記載した方法と類似の方法において、担体としてソルビトールの代りグルコースサッカロース、ラクトース又は塩化ナトリウムを用いてもよい。

0112

実験例1
I.被験リポソーム組成物
次の脂質組成のリポソームを調製した。
(1)1,2−ジ−n−ヘキサデカノイル−3−sn−ホスファチジル−S−セリン(Avanti Polar LipidsInc. Birmingham Ala.)及び1,2−ジ−n−オクタデカノイル−3−sn−ホスファチジルコリン(Avanti)の重量比3:7組成物(両脂質が飽和脂肪酸を含む比較例)

0113

(2)1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−S−セリン(Browning J. 及び Seeling J., Chem. and Physics of Lipids24(1979)103に従って製造したもの)及び1,2−ジ−n−オクタデカノイル−3−sn−ホスファチジルコリン(Avanti)の重量比3:7の組成物(式(II)のリン脂質においてR1 のみならずR2 も飽和脂肪酸である故、比較例)

0114

(3)1,2−ジ−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジル−S−セリン(前記)及び1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−シス−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリン(Eibl H., Chem. and Physics of Lipids26(1980)239及び Eibl H., Angewandte Chemie96(1984)247に従って製造したもの)の重量比3:7の組成物(本発明)

0115

リポソーム組成物を次の様にして調製した。前記脂質のクロロホルム溶液1mlを15mlのバイアルに入れた。溶剤を除去した後、脂質が薄層となってバイアルの壁に付着した。残留する溶剤を、室温にて15時間真空にすることにより除去した。次に、バイアルを窒素雰囲気下でシールした。バイアルを−20℃にて貯蔵した。バイアルを50℃に加温し、2.5mlの無菌のカルシウム不含有リン酸緩衝液(pH7.2〜7.4)を無菌の注射器により注入し、室温にて放置することによりフィルムを10分間予備膨潤させ、そして標準化された実験室振とう装置(ボルテックス、ダイアルセット6)中で10分間振とうすることにより分散させて、試験すべきリポソーム組成物を調製した。

0116

II.マウスにおける急性毒性試験
静脈内急性毒性試験を、17〜24gのTif:MAGf(SPF)マウスを用いて行った。すべてのマウスを、温度22±2℃、相対湿度50〜70%の調節された動物室に入れた。人工光線毎日14時間与えた。動物を Macrolon (商標ケージ飼育した。

0117

リポソーム組成物(2.5ml)を、10ml/Kgの標準体積の注射が可能な濃度に希釈した。尾部静脈を通して0.1ml/10秒の速度で静内注射を行った。投与レベル当り3匹の動物から成る群を用いた。処置した後、マウスを5分間観察して死亡率を決定した。

0118

III.結果
──────────────────────────────
リポソーム脂質濃度注射量急性毒性
組成物(mg/ml) (mg/Kg) (死亡数/全数)
──────────────────────────────
1 10 100 0/3
25 250 3/3
2 25 250 0/3
50 500 3/3
3 25 250 0/3
50 500 0/3
──────────────────────────────

0119

IV.結論
これらの結果から、2種類の飽和脂質成物1,2−ジ−n−ヘキサデカノイル−3−sn−ホスファチジル−S−セリン及び1,2−ジ−n−オクタデカノイル−3−sn−ホスファチジルコリンを含むリポソーム組成物、並びに1種の飽和脂質成分1,2−ジ−n−オクタデカノイル−3−sn−ホスファチジルコリンを含有するリポソーム組成物は、250mg/Kg及び500mg/Kgのレベルにおいて毒性であり(3匹のマウスのすべてが死亡)、

0120

他方2種類の不飽和脂質成分1,2−ジ−(9−cis−オクタデセノイル−3−sn−ホスファチジル−S−セリン及び1−n−ヘキサデカノイル−2−(9−cis−オクタデセノイル)−3−sn−ホスファチジルコリンを含有するリポソーム組成物は500mg/Kgの高投与レベルにおいて非毒性であった(3匹のマウスのすべてが生き残った)。

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