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技術 抗チロシナーゼ活性組成物

出願人 株式会社資生堂
発明者 横山峰幸田中直美
出願日 1994年1月27日 (25年10ヶ月経過) 出願番号 1994-023621
公開日 1995年8月15日 (24年3ヶ月経過) 公開番号 1995-215888
状態 未査定
技術分野 化粧料 植物物質含有医薬 非環式または炭素環式化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 澄明液 往復式 植物成長調整物質 芽生え エアーリフト 振とう培養機 特定条件下 抗チロシナーゼ活性
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1995年8月15日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (1)

構成

ニチニチソウ(Catharanthus roseus L.)の培養細胞ハイドロキノン含有栄養培地で培養して得られた培養物ホモジエネート由来組成物

効果

培養物中に含まれるハイドロキノン配糖体のみに起因する抗チロシナーゼ活性より、遥かに高い抗チロシナーゼ活性を有する組成物が提供される。

概要

背景

エノール(またはハイドロキノン配糖体類が抗チロシナーゼ(またはチロシナーゼ阻害活性を有し、美白剤として顕著な効果を奏することは知られている。また、このようなフエノール(またはハイドロキノン)配糖体類が、ニチニチソウ(Catharanthus roseus L.)の培養細胞組織培養に際して、各種ハイドロキノン類培地へ添加することにより効率よく生産できることも知られている(例えば、特開昭61−124391号、同62−44174号、同62−181795号、同63−251092号、特開平1−269498号、および同3−259091号公報参照)。これらの従来技術は、いずれも各種フエノール(またはハイドロキノン)配糖体類を効率よく生産する方法を公表する。

さらに、これらの配糖体類が、それら自体の抗チロシナーゼ活性に基づき、殊にメラニン色素の形成に伴う皮膚のしみやあざ等の予防および処置に有効であることも知られている(例えば、特開昭60−56912号公報参照)。

しかし、ヒトに対して安全に適用できるさらなる抗チロシナーゼ活性組成物入手することの要望は依然として存在する。

概要

ニチニチソウ(Catharanthus roseus L.)の培養細胞をハイドロキノン含有栄養培地で培養して得られた培養物ホモジエネート由来の組成物。

培養物中に含まれるハイドロキノン配糖体のみに起因する抗チロシナーゼ活性より、遥かに高い抗チロシナーゼ活性を有する組成物が提供される。

目的

したがつて、本発明の目的は、従来のフエノール配糖体類より効率よく得ることができ、しかも強い抗チロシナーゼ活性を示す組成物を提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
3件

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請求項1

ニチニチソウ(Catharanthus roseus L.)の培養細胞ハイドロキノン含有栄養培地で培養して得られた培養物ホモジエネートに由来する澄明液またはその乾燥物を含んでなる抗チロシナーゼ活性組成物

請求項2

美白剤として使用するための請求項1記載の抗チロシナーゼ活性組成物。

技術分野

0001

本発明は、医薬農薬化粧品および食品の技術分野で使用できる抗チロシナーゼ活性組成物に関する。

背景技術

0002

エノール(またはハイドロキノン配糖体類が抗チロシナーゼ(またはチロシナーゼ阻害活性を有し、美白剤として顕著な効果を奏することは知られている。また、このようなフエノール(またはハイドロキノン)配糖体類が、ニチニチソウ(Catharanthus roseus L.)の培養細胞組織培養に際して、各種ハイドロキノン類培地へ添加することにより効率よく生産できることも知られている(例えば、特開昭61−124391号、同62−44174号、同62−181795号、同63−251092号、特開平1−269498号、および同3−259091号公報参照)。これらの従来技術は、いずれも各種フエノール(またはハイドロキノン)配糖体類を効率よく生産する方法を公表する。

0003

さらに、これらの配糖体類が、それら自体の抗チロシナーゼ活性に基づき、殊にメラニン色素の形成に伴う皮膚のしみやあざ等の予防および処置に有効であることも知られている(例えば、特開昭60−56912号公報参照)。

0004

しかし、ヒトに対して安全に適用できるさらなる抗チロシナーゼ活性組成物を入手することの要望は依然として存在する。

発明が解決しようとする課題

0005

したがつて、本発明の目的は、従来のフエノール配糖体類より効率よく得ることができ、しかも強い抗チロシナーゼ活性を示す組成物を提供することにある。

課題を解決するための手段

0006

本発明者は、ニチニチソウの培養細胞を用いる培養物の有効利用を目的に研究してきたところ、特定条件下で培養した培養物のホモジエネート中には、上記ハイドロキノン配糖体類自体の抗チロシナーゼ活性以外に、さらにその活性を高める物質が存在することを見い出した。

0007

したがつて、本発明によれば、ニチニチソウの培養細胞をハイドロキノン含有栄養培地で培養して得られた培養物のホモジエネートに由来する澄明液またはその乾燥物を含んでなる抗チロシナーゼ活性組成物が提供される。

0008

本発明者らは、現時点でハイドロキノン配糖体以外に抗チロシナーゼ活性を増強する上記ホモジエネート中のフアクターが何んであるかを確認していないが、そのフアクターは、それ自体抗チロシナーゼ活性を示すものであるか、あるいはフエノール配糖体類と協同して抗チロシナーゼ活性を増強する作用のあるもののいずれかであると信じている。すなわち、本発明の組成物は、結果として培養物中に含まれるハイドロキノン配糖体類自体の抗チロシナーゼ活性より、その活性が増強された培養物のホモジエネート由来の澄明液またはその乾燥物を含む組成物であればすべてを包含する。

0009

かかる組成物は、栄養培地中に添加されるハイドロキノンが一定の培養条件下で培養物中に遊離の状態では存在しなくなるので、ヒトを始めとする哺乳類に対して殆ど毒性を示さない。そのため、医薬、農薬、化粧品および食品の技術分野で広範囲に用いることができる。

0010

本発明にいうニチニチソウの培養細胞とは、それ自体既知組織培養法によりカルスまたは腫瘍組織を形成するものであればいずれも使用でき、具体的にはニチニチソウの芽生え幼植物)の根、胚軸子葉、ならびに成熟体の根、、葉葉柄、花、花粉などの細胞群または組織片をいう。かかる細胞の具体的なものとしては、本出願人により、平成6年1月11日付で工業技術院生命工業技術研究所に、それぞれ受託番号FERM P−14051およびFERM P−14052で寄託された細胞CrAおよびCrBを挙げることができる。これらの細胞の培養は、まずこれらの培養細胞のいずれかを用い、常法で、例えばオーキシンサイトカイニンなどの植物ホルモンを含む植物生長調整物質を添加した培地でカルスを誘導するが、またはアグロバクテリウムトウメフアシエンス(Agrobacterium tomefaciens)やアグロバクテリウムリゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)などを用いる常法により腫瘍組織を作出する。こうして得られたカルスまたは腫瘍組織を、ムラシゲ−スクーグ(Murashige-Skoog)培地(以下、「MS」培地という)、リンスマイヤー−スクーグ(Linsmaier-Skoog)培地(以下、「LS培地」という)、ホワイト(White)、ガンボルグ(Ganborg)、ニツチ(Nitsch)、ヘラー(Heller)、シエンク−ヒルブラント(Schenk-Hildebrant)、ニツチ−ニツチ(Nitsch-Nitsch)、コーレンバツハ−シユミツト(Kohlenbach Schmidt)等の任意の栄養培地で培養する。これらのうち、本発明ではLS培地やMS培地都合よく使用できる。

0011

培養槽形式通気撹拌型エアーリフト型、回転式円筒型等いずれの形式であつてもよいが、その中でも通気撹拌型が好ましい。

0012

一般にカルスの誘導に際してはオーキシンが必要とされるが、2,4−ジクロロエノキ酢酸(2,4−D)、α−ナフタリン酢酸(NAA)、2,4,5−トリフロロフエノキシ酢酸(2,4,5−T)、インドール酢酸(IAA)などを用いることも可能である。

0013

また、サイトカイニン、ゼアチン、6−ベンジルアデニンカイネチンリボシルゼアチン、イソペンテニルアデニンなどのいずれを添加することも可能である。

0014

オーキシンを添加する場合の濃度は10-7Mから10-5Mの範囲であり、サイトカイニンを用いる場合の濃度は10-8Mから10-4Mの範囲である。

0015

この様にして誘導したカルスは上記培地に寒天を加えない液体培地植え継ぎ振とう培養を行う。腫瘍組織も同様に振とう培養ができるが、その場合、一般に植物ホルモンを含む植物成長調整物質は必要ない。もちろん寒天を含む培地でもカルスまたは腫瘍組織は分裂成長する。

0016

液体振とう培養では通気のために回転式振とう培養機往復式振とう培養機で常時振とうを継続する。回転数は50rpmから150rpmの範囲が好ましく、特に110rpm程度が好ましい。

0017

培養中、光は照射してもしなくてもよい。光を照射する場合、光の照射条件は通常1000ルクスから10000ルクスである。また、培養温度は20℃から30℃が好適であるが、そのうちでも特に20〜26℃が望ましい。

0018

カルスまたは腫瘍組織(以下、まとめて培養細胞という)は週一回新鮮な培地に植え継ぎ継代培養する。

0019

本発明では、培養中にハイドロキノンを適宜添加することが必要である。添加方法無菌的に調製したハイドロキノン水溶液ポンプで連続的に培養液滴下する方法で行う。

0020

このときの添加条件は連続的に添加する添加速度コントロールして培地中のハイドロキノン濃度が4mM以下、好ましくは2mM以下となるように、さらに好ましくはハイドロキノンが培地中に蓄積しない(検出されない)ように行う。ハイドロキノンは連続的でない方法、すなわち間欠的に添加することもできる。ハイドロキノンの添加は、継代培養により細胞濃度が一定以上、例えば50g/l以上、好ましくは250g/l以上の高濃度に達した後に行う。こうすることにより、所望の抗チロシナーゼ活性を有する培養物が得られる。

0021

培養物のホモジエネートに由来する澄明液は、当該技術分野で既知方法で培養物をホモジナイズし、次いで遠心分離または濾過により細胞破砕物等の固形分を除去して得ることができる。ホモジナイズは、例えばポリトロン(Polytron)(商標、Kinematica 社製、スイス)を用いて行う。また、遠心分離は、通常2,500〜25,000rpm、好ましくは8,000〜12,000rpmで行う。こうして得られる澄明液は、その中に含まれる産生されたハイドロキノン配糖体、殊にアルブチン(ハイドロキノンβ−D−グルコース)そのものに由来する抗チロシナーゼ活性より遥かに高い総抗チロシナーゼ活性を有する。さらに、使用目的に応じて、上記澄明液を適当な分離工程にかけて、より活性の高まつた組成物を得ることもできる。

0022

抗チロシナーゼ(またはチロシナーゼ阻害)活性は、下記のように測定できる。

0023

マツシユルームチロシナーゼを用いた抗チロシナーゼ活性試験
試薬の調製
チロシナーゼ溶液(500Unit/ml)
マツシユルームチロシナーゼ(2000Unit/mg:SIGMA社製)10mgを精し、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)40mlに溶解する。

0024

L−チロシン溶液
L−チロシン(和光純薬社製)0.0453gを精秤し、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)100mlに溶解する。

0025

0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)
0.1M NaH2PO450.9mlと0.1M Na2HPO449.1mlを混合し100mlとする。

0026

使用機器
タイターテツクツインリーダーラス(Type 381:Flow Labolatories 社製)
試験方法
96穴ブレートの各穴に0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)を100μlずつ分注し、サンプル溶液を20μl添加する。次にチロシナーゼ溶液を30μlずつ添加し、ツインリーダーで492nmの吸光度を測定し、反応0時間における吸光度の値をT0とする。その後、各穴にL−チロシン溶液50μlを添加し37℃で60分間反応させる。60分後、492nmにおける吸光度を測定し、その値をTとする。コントロールとして、サンプル溶液の代わりに0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)20μlを用い、反応0時間における吸光度をC0とする。同様に、37℃で60分間反応させ、60分後に492nmにおける吸光度を測定し、その値をCとする。チロシナーゼ阻害活性は、以下に示す等式で計算した。なお、阻害活性70%以上のサンプルを陽性と判定した。

0027

チロシナーゼ阻害(抗チロシナーゼ)活性(%)
=[1−(T−T0)/(C−C0)]×100
抗チロシナーゼ活性組成物
本発明の抗チロシナーゼ活性組成物は、総組成物当りの上記活性が70%を超えるように、上述のホモジエネートに由来する澄明液またはその乾燥物を含む。なお、上記乾燥物は、澄明液をエバポレート凍結乾燥またはスプレードライすることにより得ることができる。

0028

以下、本発明の組成物を美白剤、殊に美白化粧料を例に更に説明するが、本発明の用途は美白剤に限定されるものでない。

0029

本発明の美白化粧料は、その剤型により上記澄明液またはその乾燥物を所定量含める他に、化粧品、医薬品等通常用いられる各種成分を適宜含めることができる。これらの成分としては、例えば、油分、紫外線吸収剤酸化防止剤界面活性剤保湿剤香料、水、アルコール増粘剤色材皮膚栄養剤(酢酸トコエロール、パントテニールエチルエーテルグリチルリチン酸塩)等が挙げられる。

0030

本発明の剤型は任意であり、例えば化粧水等の可溶化系乳液またはクリーム等の乳化系、あるいは軟膏または分散液などの剤型をとることができる。

0031

美白の目的で本発明の組成物を使用する場合には、例えば、総組成物の上記チロシナーゼ阻害活性が40%以上、好ましくは70%以上を示すものを、1/50〜1/1000の量で処置を必要とする皮膚へ塗布すればよい。こうして、所望の美白効果、例えば顔などにできるしみの脱色が期待できる。

0032

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

0033

例1
1lフラスコに360mlリンスマイヤーとスクーグ培地(LS培地)を入れてオートクレーブした。40mlのニチニチソウ培養細胞CrA株含有液を加えて26℃、120回転で培養した。5日目に200mg/1ハイドロキノン(以下HQと略記する)(和光純薬社製)水溶液を(コントロールは蒸留水を)4mlを添加した。翌日サンプリングして、以下の細胞量に1,3−ブチレングリコール(以下、1,3−B.G.と略記する)と水を加えた。このものをホモジエナイズ後、遠心(19500rpm、20分)した。

0034

得られた上澄を、HPLCで測定したところ、HQは検出されず、アルブチン濃度が85mg/lであつた。

0035

この上澄液を上述の方法で測定したところ、チロシナーゼ阻害活性は、図1の白ぬき丸(○)で示す値であつた。上澄液は現実のアルブチン濃度が85mg/lであるのにもかかわらず、標品アルブチン5000mg/lに相当するチロシナーゼ阻害(抗チロシナーゼ)活性を示した。すなわち、上澄液は、それに含まれるアルブチンから予期されるチロシナーゼ阻害活性の約59倍強い活性を示すことがわかる。

0036

例2
培地量を180mlとし、培養細胞を下記のようにCrA株およびCrB株を用い、そしてHQの添加を培養7日目に行い、そしてサンプリングを下記のように行つたこと以外、例1の方法を繰り返した。なお、上澄の調製は、各細胞重量に対して半分量のエタノールクエン酸・リン酸緩衝液(pH5.08)を加えて、ホモジナイズした後、遠心した。下記に結果を示すが、活性はその上澄のチロシナーゼ阻害活性を意味する。

0037

結果
活 性
−HQ(CrB株) 1%
+HQ(CrB株),HQ添加後3時間目13%
+HQ(CrB株),HQ添加後6時間目 39%
+HQ(CrB株),HQ添加後24時間目 49%
+HQ(CrA株),HQ添加後24時間目 87%
例3
CrA株を用い、6日目にHQ添加し、翌日サンプリングしたこと以外、例2の方法を繰り返した。なお、上澄の調製は、細胞重量に対して0.7倍量のエタノールを加えてホモジエナイズし、次いで遠心した。上澄を塩酸でそれぞれpH2.99、pH3.93、pH5.02に調整した。チロシナーゼ阻害活性を測定した結果を以下に示す。

0038

結果
活性
78.5%
90.5%
93.0%
例4
500mlのコルベン3本に、180mlずつLS倍地を入れた。これらのコルベンに、それぞれCrA株の細胞懸濁液20mlずつを加えて培養を開始した。培養6日目に200mM HQを1mlずつ添加して培養を続けた。翌日、細胞を集め(137g、湿重量)て、メタノール270mlを加えてホモジエナイズした。処理物を9000rpmで10分間遠心した。

0039

上澄を分け取り、ロータリーエバポレーターによりメタノールを留去した。残存する水溶液を画分1として以下のように処理した。

0040

まず、同量酢酸エチルを水溶液に加え分配抽出を行つた。酢酸エチル相から溶媒を留去し、残渣をヘキサン/メタノールで分配抽出して得られたメタノール相を画分2と称する。一方、酢酸エチル抽出の水相n−ブタノールで抽出した。n−ブタノール相を画分3と称し、水相を画分4と称する。

0041

これらの画分、およびそれらの希釈物の抗チロシナーゼ活性を下記に示す。

0042

抗チロシナーゼ活性
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
画分 1 2 3 4 2+3 2+4 3+4 2+3+4
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
希釈(倍)
1 68 60 99 100 78 52 96 82
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
10 33 90 80 46 93 92 79 94
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
50 19 96 19 22 64 71 24 63
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
(なお、対照にはジメチルスルホキシドを用いた)
以上の結果から活性は画分2に集中していることが推測されるので、画分2をさらに希釈して、相対的な抗チロシナーゼ活性を測定した。

0043

希釈倍率1のときの抗チロシナーゼ活性を100としたときの、各希釈倍率における相対的な活性は、それぞれ、10倍で93、50倍で100、100倍で100、500倍で78、1000倍で39、10000倍で15を示し、本発明の組成物の抗チロシナーゼ活性を、必要により、高めた組成物を提供できることがわかつた。

0044

製剤例クリーム状美白化粧料
重量%
(1)ステアリルアルコール4.0
(2)ステアリン酸5.0
(3)イソプロピルミルステート18.0
(4)グリセリンモノステアリン酸エステル3.0
(5)プロピレングリコール10.0
(6) 実施例1で得られた上澄液(チロシナーゼ阻害活性65%) 0.01
(7)水酸化ナトリウム0.2
(8)亜硫酸水素ナトリウム0.01
(9) 2,4−ジヒドロキシベンゾエノン0.1
(10)香料適量
(11)精製水残部
製法
精製水にプロピレングリコールと水酸化ナトリウムと例1で得られた上澄液を加え、撹拌後加熱して70℃に保つ(水相)。他の成分を撹拌混合加熱溶解して70℃に保つ(油相)。水相に油相を徐々に加え、全部加え終わつてからしばらくその温度に保ち、反応を起こさせる。その後ホモジナイザーで均一に乳化し、よくかき混ぜながら30℃まで冷却しクリーム状美白化粧料を得た。

0045

このクリーム状美白化粧料は美白効果に優れていた。

発明の効果

0046

組織培養物に含まれるフエノール(またはハイドロキノン)配糖体類、単独よりも、遥かに抗チロシナーゼ活性の高い組織培養澄明液およびその乾燥物が提供される。これらの澄明液および乾燥物は、美白剤へ有利に使用することができる。

図面の簡単な説明

0047

図1実施例1で得られる澄明液のチロシナーゼ阻害活性を表すグラフである。グラフ中、○印は、上記澄明液の活性を示し、−・−印は標品アルブチンを用いたときの活性に対する検量線を示し、そして←印は、アルブチン産生前のニチニチソウ細胞の活性を示し、←--印は澄明液中の実際のアルブチン濃度を示す。

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