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技術 グリセンチンの生産法

出願人 株式会社日清製粉グループ本社
発明者 佐藤岳哉名取與平
出願日 1993年12月28日 (27年2ヶ月経過) 出願番号 1993-334126
公開日 1995年5月30日 (25年8ヶ月経過) 公開番号 1995-135993
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 有機低分子化合物及びその製造 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 奇数個目 気相式 微量金属イオン 操作説明書 蛋白加水分解酵素 動物臓器 トリスー塩酸 DNAリンカー
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1995年5月30日)のものです。
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図面 (5)

目的

成熟グリセンチンを生産する方法の提供。

構成

T7φ10プロモーターの下流にT7 s10ペプチドアミノ末端ペプチド断片ヒト型グリセンチンの融合遺伝子をコードしているDNAを含み大腸菌で該DNAの発現指令できる組換えベクター形質転換された該融合グリセンチン遺伝子を発現できる大腸菌株を培養して融合グリセンチンを生産し、得られた融合グリセンチンをカテプシンCで処理して成熟型グリセンチンを生産する。

概要

背景

概要

成熟グリセンチンを生産する方法の提供。

T7φ10プロモーターの下流にT7 s10ペプチドアミノ末端ペプチド断片ヒト型グリセンチンの融合遺伝子をコードしているDNAを含み大腸菌で該DNAの発現指令できる組換えベクター形質転換された該融合グリセンチン遺伝子を発現できる大腸菌株を培養して融合グリセンチンを生産し、得られた融合グリセンチンをカテプシンCで処理して成熟型グリセンチンを生産する。

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請求項1

ヒトグリセンチンにそのアミノ末端側へペプチドを連結した融合蛋白質として組換え遺伝子技術により生産し、後に不用のペプチド部分を切断して成熟型ヒトグリセンチンを製造するに際して、ヒトグリセンチンのアミノ末端側に連結したペプチド部分のアミノ酸数偶数であり、不用のペプチド部分の切断方法カテプシンCを用いた加水分解であるヒトグリセンチンの生産方法

請求項2

ヒトグリセンチンのアミノ末端に偶数個アミノ酸よりなるペプチドが付加した融合ペプチドを生産するに際し、Met−A−グリセンチン〔式中Metは翻訳開始コドンATGによりコードされるメチオニンであり、Aはアミノ末端のアミノ酸がアラニングリシンセリンバリンスレオニンより選ばれた1つのアミノ酸であり、偶数個のアミノ酸よりなるペプチドを示す〕の配列をコードする遺伝子を含み、微生物で該遺伝子の発現指令できる組換えベクター形質転換された該融合ペプチドを発現できる株を培養して融合ペプチドを生産する請求項1記載のヒトグリセンチンの生産方法。

請求項3

微生物が大腸菌である請求項2記載のヒトグリセンチンの生産方法。

請求項4

偶数個のアミノ酸よりなるペプチドが、T7 s10ペプチドのアミノ末端領域であり、アミノ末端のアラニンを含むペプチドよりなる配列である請求項3記載のヒトグリセンチンの生産方法。

請求項5

ヒトグリセンチンのアミノ末端に偶数個のアミノ酸よりなるペプチドが付加した融合ペプチドを生産するに際し、Met−B−グリセンチン〔式中Metは翻訳開始コドンATGによりコードされるメチオニンであり、Bはアルギニンアスパラギンアスパラギン酸グルタミングルタミン酸イソロイシンロイシンリジントリプトファンチロシンフェニルアラニンヒスチジンより選ばれた1つのアミノ酸またはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジンより選ばれた1つのアミノ酸をアミノ末端とし奇数個のアミノ酸よりなるペプチドを示す〕の配列をコードする遺伝子を含ンま微生物で該遺伝子の発現を指令できる組換えベクターで形質転換された該融合ペプチドを発現できる株を培養して融合ペプチドを生産する請求項1記載のヒトグリセンチンの生産方法。

請求項6

微生物が大腸菌である請求項5記載のヒトグリセンチンの生産方法。

技術分野

Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys

0001

本発明は糖尿病治療薬などの医薬用途に有用なヒト型グリセンチンの製法に関する。

0002

グリセンチンは69アミノ酸よりなる消化管ペプチドホルモンであり消化管生理作用に重要な役割を演じており、例えば特願平4−185066号に示されている様に糖尿病治療薬等の医薬品として期待される。グリセンチンは1976年にF. Sandbyらによってブタ小腸より初めて単離精製され〔F. Sandby, et.al., Horm. Metab. Res. vol 18, 366〜371(1976)〕、ついでA.J. Moodyにより構造決定がなされた〔A. Thim and A.J. Moody Regul. Pept. vol 2, 139-150(1981)〕。その後数種の動物のグリセンチン遺伝子の構造が解明され、遺伝子の構造から各々のアミノ酸配列が明らかにされた。そのアミノ酸配列には動物種特異性がある。しかしヒト型グリセンチンはヒト臓器入手が困難であることから単離精製されたことはない。

0003

グリセンチンの生産法としては動物臓器からの抽出、化学合成などが考えられる。しかし動物臓器からの抽出法は臓器中のグリセンチンの含有量が微量であるため多量の臓器を必要とし、しかも上述のように動物種によりアミノ酸配列に差異があるためブタなど多量に入手できる動物臓器からのものは単離、精製が可能であるものの、このように精製して得られるグリセンチンは動物種に固有のものでヒト型と異なる。そしてヒト臓器からの抽出精製は臓器入手が不可能に近いのでこれを抽出源とすることはできない。化学合成法はアミノ酸配列が長いため反応収率が低くしかも試薬が高価であるため安価に多量のグリセンチンを供給することはできない。

0004

これに対し本発明者等は既にヒト型グリセンチンのアミノ酸配列をコードするDNAを合成しこれをベクターつなぎこれにより形質転換された微生物を培養することによってヒト型グリセンチンを製造する技術を開発した(消化管ホルモン(XI)、394〜401、(1992);消化管ホルモン研究会編三好等編、医学図書出版参照)。そしてこの遺伝子発現のためにlac. trc, trp, λPL等一般に使用されるプロモーターを用い種々の大腸菌宿主でのヒト型グリセンチンの生産を検討したが得られたグリセンチンはアミノ末端メチオニンが付加しており天然型とは異なっていた。

課題を解決するための手段

0005

遺伝子産物ペプチドより天然型ペプチドを得る方法として目的とするペプチドのアミノ末端側にメチオニンを介してペプチドを付加した融合ペプチドを作りブロムシアンを用いてメチオニンの部位で部位特異的に分解する化学的方法や、適当なペプチドと目的ペプチドの間に特定の部位特異的蛋白質分解酵素認識配列を挿入した融合ペプチドを作りその酵素で部位特異的に加水分解する酵素的方法などがあるが、グリセンチンにこれらの方法を適用する場合は前者の方法ではグリセンチン配列内にもメチオニンが存在するためこのメチオニン部位でグリセンチンが加水分解されてしまうことになる。又後者の方法ではグリセンチン配列内の蛋白加水分解酵素により分解され易い部位が存在するため副生成物が多く、目的とするグリセンチンの収率が悪い。更に目的ペプチドと他のペプチドとの融合ペプチドをアミノ末端から1アミノ酸ずつ加水分解するアミノペプチダーゼや、カルボキシ末端から加水分解するカルボキシペプチダーゼで処理して付加したペプチドを除き目的ペプチドを生産する方法も考えられる。しかしこれらの酵素は基質特異性が低いので必要とする部位で反応を停止するためには微妙な反応条件の調節を行わねばならずしかも条件の調節が非常に困難であるためおよそ工業的な製法とはなり得ない。この様に従来知られた方法では成熟型(天然型)グリセンチンを十分生産することが出来なかった。

0006

これらの背景の基に本発明者らはグリセンチンの生産方法につき研究を続けグリセンチンのアミノ末端がアルギニンであることに着目し、カテプシンCタンパク質のアミノ末端から2アミノ酸ずつ加水分解するがアミノ末端に塩基性アミノ酸が現れるとそこで反応が停止しそれ以上の加水分解が起こらないことを利用して遺伝子組換え法により偶数個のペプチドをグリセンチンのアミノ末端側に付加した融合ペプチドを生産し、かくして得られた融合グリセンチンをカテプシンCで加水分解して除去することにより特異的に成熟型グリセンチンを生産する方法を開発した。

0007

更に詳細にその方法を説明するとグリセンチンのアミノ末端側にペプチドを付加した融合グリセンチンの遺伝子を宿主細胞発現可能なプロモーターの下流につないで作成したベクターで、この遺伝子を発現出来る細胞を形質転換し、かくして得られた細胞を培養し、必要に応じて遺伝子の誘導発現を行い、グリセンチンを生産せしめ更にグリセンチンのアミノ末端がアルギニンであることに着目し、カテプシンCがペプチドをアミノ末端から2アミノ酸ずつ加水分解するがアミノ末端に塩基性アミノ酸が現れるとそこで反応が停止しそれ以上の加水分解が起こらないことを利用して偶数個のペプチドをグリセンチンのアミノ末端側に付加した融合ペプチドをカテプシンCで加水分解して除去することにより特異的に成熟型グリセンチンを生産するものである。

0008

遺伝子発現の為のプロモーターとしては、宿主細胞で発現可能なものならばどの様なものでも良いが、その中でもバクテリオファージT7のφ10プロモーターが好ましく、又、宿主細胞としてはプロモーターが発現するものであればどの様な細胞でも使用できるが大腸菌が望ましい。

0009

グリセンチンと融合するペプチドはグリセンチン生産を増すものならどのようなものでも良いがT7s10ペプチドなどが好ましい。融合するペプチドとグリセンチンの配列の間に更に別のアミノ酸配列が挿入されても良い。融合する偶数個のペプチドのアミノ酸数はカテプシンCの加水分解の効率から大きすぎない事が望ましく、20アミノ酸以下が好ましい。宿主としてはどの様な大腸菌でも良いがφ10プロモーターからグリセンチン遺伝子を発現するためにはその大腸菌でT7RNAポリメラーゼが生産されなければならない。T7RNAポリメラーゼを大腸菌で生産させるためには大腸菌にT7バクテリオファージを感染させる、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を有するプラスミドを保有する大腸菌を用いる、または染色体にT7RNAポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌を用いるなどによりこの要件を満たすことが出来る。T7RNAポリメラーゼ発現の制御のためには大腸菌で発現制御できるよう構築したT7RNAポリメラーゼ遺伝子を染色体に組み込んだ大腸菌を用いるのが好ましい。この様な菌株としてEscherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS, Escherichia coli HMS174(DE3)pLysE, Escherichia coliBL21(DE3), Escherichia coli BL21(DE3)pLysS, Escherichia coli BL21(DE3)pLysE等が好ましく使用されるがこれらの菌株は市販されており当業者は自由に入手することが出来る。

0010

グリセンチンの生産に用いる菌株を炭素源窒素源微量栄養素微量金属イオンなどを含む培地好気的に培養し、必要に応じてT7RNAポリメラーゼの誘導発現を行って融合グリセンチンの生産を行う。培養培地は大腸菌がグリセンチンを生産するものならどのような培地でも良いがM9ZB培地などが好ましく、必要に応じ添加物などを加えても良い。

0011

菌体蓄積した融合グリセンチンは通常用いられるペプチドの精製法を組み合わせて精製すれば良いがその1方法として消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、394〜401ページ(1992)に示される方法が好ましい。

0012

グリセンチンのアミノ末端側に付加するペプチドはグリセンチンとの融合ペプチドとして生産されるものであればどのようなものでも良いがT7ファージs10ペプチドなどが生産量を高めるのに望ましい。更に、カテプシンCで加水分解して成熟型グリセンチンを生産する場合には生産された融合ペプチドの部分のアミノ酸数は偶数であり、しかも配列内に塩基性アミノ酸が存在しないか存在しても偶数番目に存在することおよび奇数個目のアミノ酸にプロリンを含まないことが必要である。生産された融合グリセンチンの融合ペプチド部分のアミノ酸数を偶数にするための一方法としては、この遺伝子の翻訳開始信号ATGによりコードされるメチニオンを含んで奇数個のアミノ酸をコードするよう遺伝子を構築し、生成する融合ペプチドのアミノ末端メチニオンが生産菌によりプロセッシングされて除かれ生成した融合グリセンチンの融合ペプチド部分のアミノ酸数が偶数個となるよう翻訳開始信号ATGによりコードされるメチオニンの次のアミノ酸を選択しなければならない。この様なアミノ酸としてアラニングリシンセリンバリンスレオニンがあげられる。

0013

生産された融合グリセンチンの融合ペプチドのアミノ酸数を偶数個とする別の方法として遺伝子の翻訳開始信号ATGによりコードされるメチオニンを含んで偶数個のアミノ酸をコードする様遺伝子を構築し、生成する融合ペプチドのアミノ末端メチオニンが生産菌により除去されず、生成した融合グリセンチンの融合ペプチド部分のアミノ酸数が偶数個となるよう翻訳開始信号ATGによりコードされるメチオニンの次のアミノ酸を選択しなければならないが、この様なアミノ酸としてアルギニン、アスパラギンアスパラギン酸グルタミングルタミン酸イソロイシンロイシンリジントリプトファンチロシンフェニルアラニンヒスチジンがあげられる。

0014

カテプシンCを用いた融合型グリセンチンの加水分解反応はこの酵素の反応に用いられる一般的な反応条件で行えば良い。反応液には必要に応じ混入している蛋白加水分解酵素活性阻害するためにロイペプチンアンチパインキモスタチン、E−64などのプロテアーゼインヒビターを加えても良い。

0015

実施例1
発現ベクターの構築
T7φ10プロモーターの下流に融合グリセンチン遺伝子を結合した発現ベクターの構築を行った。一連実験操作は一般的な遺伝子組換えの実験法(T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook編Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press社(1989)等参照)により行った。

0016

グリセンチン遺伝子DNAを連結するためNovagen社より入手したベクタープラスミドpET-3aのBam HI認識配列の下流にStuI認識配列を挿入した。
5′−GATCCTTAGCGTAGGCCTT−3′(配列表・配列番号1)
および
5′−GATCAAGGCCTACGCTAAG−3′(配列表・配列番号2)
の配列の2種のオリゴヌクレオチドをMilliGen/Biosearch社製Cyclone PlusDNA合成機で及び同社から供給される合成試薬を用いて、付属操作説明書により合成した。オリゴヌクレオチドの精製はMilligen/Biosearch社製のOligo-PaKTMと付属のオリゴヌクレオチド精製マニュアルに従い精製した。これ以下の実験に用いるオリゴヌクレオチドの合成及び精製も全てのこの方法によって行った。各々のオリゴヌクレオチド5μgを宝酒造製T4ポリヌクレオチドキナーゼで同社の反応条件によりリン酸化した。次いで両反応液を合わせて90℃で5分保温した後3時間かけて30℃まで温度を下げてオリゴヌクレオチドのアニーリングを行った。プラスミドpET-3a(F. W. Studier et. al., Methodsin Enzymology 185巻60ページ〜89ページ(1990)参照)をBam HIで加水分解し、次いで宝酒造製E. coliアルカリフォスターゼで同社の示す反応条件で脱リン酸化した。得られた線状プラスミドとアニーリングしたオリゴヌクレオチドを宝酒造製DNAライゲーションキットを用いて同社のプロトコールに従ってライゲーションした。このライゲーションしたDNAを用いて塩化カルシウム法によりE.coli JM109の形質転換を行い、アンピシリンを50μg/mlの濃度で含むLB寒天培地で生育する形質転換株を選択した。得られた形質転換株を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地終夜培養を行い培養菌体よりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミドをStuIで加水分解してアガロースゲル電気泳動を行うことにより本酵素による切断部位が存在するプラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列をUnited States Biochemical Corporation社製Sequenase version 2.0キットを用いて同社のプロトコールに従ってダイデオキシ法によって決定した。新たに得られたプラスミドをpET110と命名した。pET110はBamHI認識配列の下流に新たにStuI認識配列が存在することを確認した。pET110のBam HI及びStuI認識配列間の塩基配列は配列表・配列番号3に示す通りである。

0017

pGL5(消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI394ページ〜401ページ(1992)参照)のグリセンチン遺伝子下流のPstI認識配列をSmaI認識配列に変換した。
5′−CATGGCCCGGGACAGCACA−3′(配列表・配列番号4)
及び
5′−AGCTTGTGCTGTCCCGGGC−3′(配列表・配列番号5)
の配列の2種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記と同様の方法で精製、リン酸化、及びアニーリングを行った。pGL5をNcoI及びHind IIIで加水分解し、反応物をアガロースゲル電気泳動で展開し、約4kbバンドゲルより抽出することにより目的断片を精製した。次いでアニーリングしたオリゴヌクレオチドと精製した直鎖状プラスミドをライゲーションした。ライゲーションしたDNAを用いてpET110作製の際と同様にE. coli JM109を形質転換した。pET110の際と同様に形質転換株よりプラスミドを抽出し精製した。得られたプラスミドをSmaIで加水分解し、本酵素による切断部位が存在するプラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の配列の存在するプラスミドを選択しpGL44と命名した。新たに得られたプラスミドpGL44はグリセンチン遺伝子下流のPstIの認識配列が失われ新たにSmaI認識配列サイトが付加されていた。pGL44のグリセンチン遺伝子下流の新たなSmaIサイトを含むNcoI−Hind III 間の塩基配列は配列表・配列番号6に示す通りである。

0018

pGL44のグリセンチン遺伝子5′末端領域の改変を行った。
5′-AATTCAGATCTATCGAAGGTCGACGTTCTCTGCA-3′(配列表・配列番号7)
及び
5′-GAGAACGTCGACCTTCGATAGACTG-3′(配列表・配列番号8)
の2種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記と同様な方法で精製、リン酸化、及びアニーリングした。pGL44をEcoRI及びPstIで加水分解した後上記と同様に脱リン酸化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドとライゲーションした。アニーリングしたDNAを用いてE. coli JM109を形質転換した。形質転換株よりプラスミドを抽出しBgl IIで処理し新たに本酵素により切断されるプラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の塩基配列を持つプラスミドをpGL122と命名した。pGL122はpGL44のEco RI〜PstIサイトに合成オリゴヌクレオチドが挿入されたものであることを確認した。pGL122の改変された部位の塩基配列を配列表・配列番号9に示す。

0019

pGL122をBgl II及びSmaIで加水分解し、グリセンチン遺伝子を含むDNA断片の精製を行った。pET110をBam HI及びStuIで加水分解した後脱リン酸化した。これをグリセンチン遺伝子を含むDNA断片と混合しT4DNAリガーゼでライゲーションした。反応物をE. coli JM109と混合し形質転換を行い新たにプラスミドpGL125を得た。pGL125はT7φ10プロモーターの下流にT7 s10ペプチド、挿入アミノ酸配列及びグリセンチンの融合ペプチド遺伝子が連結した発現ベクターである。pGL125構築の過程を簡単に図1に示した。

0020

Met-Arg付加グリセンチン遺伝子の構築
A) pGL144の構築
pUC18を制限酵素DraIで切断しアガロース電気泳動を行って、アンピシリン耐性遺伝子を含む断片を精製した。pGL125を制限酵素DraIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行ってアンピシリン耐性遺伝子を含まない断片を精製した。それぞれの断片を、T4DNAリガーゼを用いてライゲーション反応を行った。反応産物を大腸菌JM109株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で形質転換体を選択した。

0021

得られた形質転換体より定法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素切断地図を作成し目的のプラスミドが構築されていることを確認し、このプラスミドをpGL144とした。pGL144構築過程を簡単に図2に示した。

0022

B) pGL146の構築
A)で構築したpGL144を制限酵素NdeIとPstIで切断し、ここに合成DNAリンカーを挿入した。合成DNAリンカーの配列を以下に示す。
5′−TATGCGTCGTTCCCTGCA−3′(配列表・配列番号10)
および
5′−GGGAACGACGCA−3′(配列表・配列番号11)

0023

それぞれの合成DNA2μgをT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液を合わせて94℃で5分加熱した後1時間で室温まで温度を下げてアニーリングを行った。このようにして作成した合成DNAリンカーと、制限酵素NdeIとPstIで切断しアガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状のpGL144を宝酒造のDNAライゲーションキットを用いて、結合した。この結合したDNAを大腸菌JM109株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で形質転換体を選択した。得られた形質転換体より定法に従ってプラスミドを抽出し、サンガーらのダイデオキシ法により目的の塩基配列を有していることを確認し、このプラスミドをpGL146とした。pGL146構築過程を簡単に図3に示した。

0024

実施例2 s10−ペプチド付加グリセンチン遺伝子の構築
F. W. Studier, et.al., Methodsin Enzymology, 185, 74頁(1990)に示されたs10ペプチドのN末端側の翻訳開始コドンATGに対応するメチオニンを含み11アミノ酸よりなるペプチドとグリセンチンとの融合ペプチドの遺伝子の構築を行った。実施例1−A)で構築したpGL144を制限酵素NdeIとPstIで切断し、ここに合成DNAリンカーを挿入した。合成DNAリンカーの配列を以下に示す。
5′-TATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGTTCCCTGCA-3′(配列表・配列番号12)
および
5′-GGGAACGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCA-3′(配列表・配列番号13)

0025

それぞれの合成DNA2μgをT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液を合わせて95℃で5分加熱した後、1時間で室温まで温度を下げてアニーリングを行った。このようにして作成した合成DNAリンカーと、制限酵素NdeIとPstIで切断し、アガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状のpGL144を宝酒造のDNAライゲーションキットを用いて、結合した。この結合したDNAを大腸菌JM109株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で形質転換体を選択した。得られた形質転換体より定法に従ってプラスミドを抽出し、サンガーらのダイデオキシ法により目的の塩基配列を有していることを確認し、このプラスミドをpGL145とした。pGL145構築過程を図4に示す。

0026

実施例3 融合グリセンチンの生産
pGL146で大腸菌HMS174(DE3)pLysSを形質転換し融合グリセンチン生産能を有する形質転換体を得た。この形質転換体を培地1リットル当たりNZ−アミン10g、NaCl 5g、NH4Cl 1g、KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、グルコース4g、MgSO4 7H2O 264mgを含む培地に接種し37℃で振盪培養した。菌体濃度がA550=0.6の時点でイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド終濃度0.5mMとなるよう加えてさらに2.5時間培養した。菌体に蓄積した融合グリセンチンの量をグリセンチンのアミノ末端に対する抗体とカルボキシ末端に対する抗体を用いた酵素免疫測定法(消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、358〜363ページ参照)により測定したところ培養液1リットル当たりグリセンチン換算で30mgだった。培養液1リットルの菌体より消化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、394〜401ページ(1992)に記載した方法で融合グリセンチンを精製し精製標品7.3mgを得た。

0027

精製標品をペプチドシークエンサーにかけてアミノ末端側5個のアミノ酸の配列を調べたところMet−Arg−Arg−Ser−Leu−の配列が得られ、天然型グリセンチンのアミノ末端側に設計した通り2個のアミノ酸が付加した融合型グリセンチンであった。

0028

実施例4
pGL145で大腸菌HMS174(DE3)pLysSを形質転換し、融合型グリセンチン生産能を有する形質転換体を得た。この形質転換体を実施例3と同様の条件下で培養および融合型グリセンチンの精製を行い、実施例3に記載されている方法に従って、菌体内に蓄積した融合型グリセンチンの量と精製した融合型グリセンチンの量を測定した。菌体内に蓄積した融合型グリセンチンは、培養液1リットル当たり90mgであった。精製した融合型グリセンチンは、22mgであった。

0029

精製標品をペプチドシークエンサーにかけてアミノ末端側の13アミノ酸の配列を調べたところ配列はAla−Ser−Met−Thr−Gly−Gly−Gln−Gln−Met−Gly−Arg−Ser−Leu−であり、天然型グリセンチンのアミノ末端側にs10ペプチドのN末端側の10個のアミノ酸が付加した融合型グリセンチンであった。

0030

実施例5天然型グリセンチンの調製
カテプシンCの基質としては、Met−Arg付加グリセンチンを用いた。基質である融合型グリセンチン15mgを終濃度1mg/mlとなるように50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)5mM NaCl 5mM DTTを含む溶液の中に溶かした。この溶液にベーリンガーマンハイム・山之内社のカテプシンC(20units/ml)を3unit加えた。さらに夾雑プロテアーゼによる非特異的切断を押さえるためにロイペプチンを終濃度25μMとなるように添加した。22℃で1時間反応した後、ODSカラムを用いる逆相HPLCにより保持時間11.27分の主ピーク分離回収した。分離条件は、流速1.0ml/分、モニター220nm、GLサイエンス社製InertsilODS−2カラム(4.6×250mm)、A液;20%アセトニトリル+0.002M HCl、B液;40%アセトニトリル+0.002M HClで20分間の直線グラジエントである。

0031

主ピークのペプチドを回収し、アミノ末端の配列をペプチドシークエンサーで解析した結果、天然型グリセンチンの配列であるArg−Ser−Leu−Gln−Asp−Thr−が得られた。また回収した主ピークを定法に従いベーリンガー・マンハイム・山之内社製のリシルエンドペプチダーゼで切断し、HPLCにより分離してペプチドマッピングを行った。分離条件は下記の通りである。流速1.0ml/分、モニター220nm、GLサイエンス社製InertsilODS−2カラム(4.6×250nm)、A液;0.05%トリフルオロ酢酸水溶液、B液;80%アセトニトリル+0.05%トリフルオロ酢酸水溶液で、A液とB液の割合を60分間でA液100%、B液0%からA液20%、B液80%に直線的に変えてHPLCを行った。HPLCのクロマトグラム図5に示した。

0032

それぞれのピーク分取し、気相式自動ペプチドシークエンサー(PSQ−1、島津製作所)により解析したところピークa,b,c,d,eの画分はアミノ酸配列が配列表・配列番号14、15、16、17、18に示したものであり、それぞれがグリセンチンの63−69、1−9、32−44、10−31、45−62の部分に相当した。これにより得られたペプチドは天然型グリセンチンの全構造を保持していることが確認された。

0033

実施例6天然型グリセンチンの調製
カテプシンCの基質としてはs10−ペプチド付加グリセンチンを用いた。基質である融合型グリセンチン15mgを終濃度1mg/mlとなるように50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)5mM NaCl 5mM DTTを含む溶液の中に溶かした。この溶液にベーリンガー・マンハイム・山之内社のカテプシンC(20units/ml)を3unit加えた。さらに夾雑プロテアーゼによる非特異的切断を押さえるためにロイペプチンを終濃度25μMとなるように添加した。22℃で1時間反応した後、ODSカラムを用いる逆相HPLCにより主ピークを分離回収した。分離条件は、実施例5と同一である。

0034

保持時間11.44分の主ピークを採集しアミノ末端の配列をペプチドシークエンサーで解析した結果、天然型グリセンチンの配列であるArg−Ser−Leu−Gln−Asp−Thr−が得られた。また回収した主ピークを定法に従いリシルエンドペプチダーゼで切断し、ペプチドマッピングを行った。HPLCのクロマトグラムは図5と同様であった。各断片のアミノ酸配列をペプチドシークエンサーを用いて解析したところ、天然型グリセンチンの全構造を保持していることが確認された。

0035

つぎに、比較のために同様のヒト型グリセンチンのアミノ末端側にペプチドが付加した融合グリセンチンについて、ファクターXaまたはエンテロキナーゼを用いて加水分解する方法を参考例として示す。

0036

参考例1
ヒト型グリセンチンのアミノ末端側にAla−Ser−Met−Thr−Gly−Gly−Asn−Agn−Met−Gly−Asn−Gly−Ser−Ile−Glu−Gly−Argの配列を有するペプチドが付加した融合グリセンチンをファクターXaで加水分解した。基質の融合グリセンチン100μgを2mMCaCl2を含む20mMトリスー塩酸緩衝液(pH8.0)200μlに溶解し、ファクターXaを0.08unit加えた。28℃で2時間反応した後実施例5と同一条件下でHPLCを行い、2種の反応生成物を得た。生成物のアミノ末端側のアミノ酸配列を気相シーケンサーにより解析したところ、生成物の一方のアミノ末端側10アミノ酸の配列はArg−Ser−Leu−Gln−Asp−Thr−Glu−Glu−Lys−Serであり、グリセンチンのアミノ末端側10アミノ酸の配列と一致した。他の生成物のアミノ末端側10アミノ酸の配列はSer−Phe−Ser−Ala−Ser−Gln−Ala−Asp−Pro−Leuで、グリセンチンのアミノ末端から12番目のアミノ酸以降の10アミノ酸の配列と一致した。即ちファクターXaはグリセンチンの11番目のアミノ酸Argと12番目のアミノ酸Serの間を加水分解してアミノ末端側11アミノ酸が欠損した不完全なグリセンチンを生ずる。反応中の融合グリセンチン、グリセンチン、アミノ末端欠損グリセンチンの量の変化を経時的に調べた。結果を次の表に示した。

0037

反応時間 融合グリセンチン グリセンチンアミノ末端欠損グリセンチン
1時間 56.8% 32.1% 11.1%
2時間 36.8 34.5 28.7
4時間 2.5 33.5 64.0

0038

反応により生ずるグリセンチンは最初に添加した融合グリセンチンの35%以下で、ファクターXaによるグリセンチンの生産法はカテプシンCを用いた方法より劣る。

0039

参考例2
参考例1と同一の融合グリセンチンをエンテロキナーゼで加水分解した。基質の融合グリセンチン100μgを10mM CaCl2を含有する40mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)1mlに溶解し、エンテロキナーゼ1unitを加えた。37℃で3時間反応した後実施例5と同一条件下でHPLCを行い生成物を分析したところ、少なくとも6個の断片に切断されていた。エンテロキナーゼはグリセンチンを非特異的に加水分解するのでグリセンチンの生産には不適当である。

0040

配列番号:1
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
GATCCTTAGCGTAGGCCTT

0041

配列番号:2
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
GATCAAGGCC TACGCTAAG

0042

配列番号:3
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成 DNA
配列:
GGATCCTTAGCGTAGGCCT

0043

配列番号:4
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
CATGGCCCGG GACAGCACA

0044

配列番号:5
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
AGCTTGTGCTGTCCCGGGC

0045

配列番号:6
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成 DNA
配列:
CCATGGCCCGGGACAGCAAG CTT

0046

配列番号:7
配列の長さ:34
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
AATTCAGATCTATCGAAGGTCGACGTTCTCTGCA

0047

配列番号:8
配列の長さ:25
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
GAGAACGTCGACCTTCGATA GACTG

0048

配列番号:9
配列の長さ:36
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成 DNA
ID=000002HE=015 WI=064 LX=0280 LY=1900

0049

配列番号:10
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
TATGCGTCGT TCCCTGCA

0050

配列番号:11
配列の長さ:12
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
GGGAACGACG CA

0051

配列番号:12
配列の長さ:45
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
TATGGCTAGC ATGACTGGTG GACAGCAAAT GGGTCGTTCC CTGCA

0052

配列番号:13
配列の長さ:39
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:合成DNA
配列:
GGGAACGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCA TGCTAGCCA

0053

配列番号:14
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala

0054

配列番号:15
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Arg-Ser-Leu-Gln-Asp-Thr-Glu-Glu-Lys

0055

配列番号:16
配列の長さ:13
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Arg-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys

0056

配列番号:17
配列の長さ:22
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Ser-Arg-Ser-Phe-Ser-Ala-Ser-Gln-Ala-Asp-Pro-Leu-Ser-Asp-Pro-Asp-Gln-Met-Asn-Glu-Asp-Lys

図面の簡単な説明

0057

配列番号:18
配列の長さ:18
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド配列

0058

図1プラスミドpGL125の構築過程を示す図。
図2プラスミドpGL144の構築過程を示す図。
図3プラスミドpGL146の構築過程を示す図。
図4プラスミドpGL145の構築過程を示す図。
図5カテプシンC処理後の精製物をリシルエンドペプチダーゼで処理した加水分解物高速液体クロマトグラムを示す図。

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