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技術 無血清培養可能な細胞とワクチンウイルスの製造法

出願人 科学技術振興事業団新技術事業団
発明者 小林行治
出願日 1993年6月3日 (27年6ヶ月経過) 出願番号 1993-133705
公開日 1995年4月4日 (25年8ヶ月経過) 公開番号 1995-087964
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤
主要キーワード 製造時期 マイコプラズマ症 湿潤条件下 飼育管理 ウイルス生産性 ERDF培地 BGM 生産用
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この項目の情報は公開日時点(1995年4月4日)のものです。
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構成

無血清培養可能な、アフリカミドリ腎細胞由来BGM細胞誘導株BGM−BB5株である細胞と、これを用いた無血清培養によるワクチンウイルスの製造。

効果

安価な培地で、安定的にワクチン等の有用物質の製造が可能となる。また、牛胎児血清に起因するマイコプラズマ混入マイコプラズマ症診断の際に発生する非特異反応を防止することができる。

概要

背景

概要

無血清培養可能な、アフリカミドリ腎細胞由来BGM細胞誘導株BGM−BB5株である細胞と、これを用いた無血清培養によるワクチンウイルスの製造。

安価な培地で、安定的にワクチン等の有用物質の製造が可能となる。また、牛胎児血清に起因するマイコプラズマ混入マイコプラズマ症診断の際に発生する非特異反応を防止することができる。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

フリカミドリ腎細胞由来BGM細胞誘導株BGM−BB5株(FERM P−13626)であることを特徴とする無血清培養可能な細胞。

請求項2

請求項1のBGM−BB5株細胞を無血清培養するワクチンウイルス製造法

技術分野

0001

この発明は、無血清培養可能な細胞ワクチン製造法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、血清を使用しないで培養可能な細胞株樹立と無血清培養したこの細胞株によるワクチンの製造方法に関するものである。

0002

一般に、ワクチン製造には、発育鶏卵や鶏をはじめとする種々の動物由来初代細胞株化細胞が使用されているが、発育鶏卵や初代細胞を使用する場合、鶏の飼育管理やワクチンの製造時期に合わせた受精卵の管理等の煩雑な作業が必要とされている。また、株化細胞を培養するためには、通常、それらの細胞の増殖因子として牛胎児血清を使用しなければならないが、牛胎児血清が極めて高価であること、また、品質間のばらつきやマイコプラズマウイルスなどの混入の危険性が伴い、厳重な品質管理が要求されるなどの問題がある。さらに、鶏のガンボロ病ウイルスワクチンでは、その不活化ワクチンを鶏に接種したとき、ワクチンに使用した牛血清由来の成分により鶏の体内に抗体が産生され、マイコプラズマ症診断の際に非特異的に陽性反応が現れる事が知られている。(山田進二著鶏のワクチン 205頁 1992年)。マイコプラズマ症に感染した親鶏は一般的に殺処分されるために、診断の際に発生する非特異的な反応は重大な問題となっている。

0003

この発明は、以上の通りの従来技術の欠点を解決するためになされたものであり、牛胎児血清を使用しないで培養できる細胞株を樹立するとともに、牛胎児血清を使用しない新しいワクチンウイルスの製造法を確立し、マイコプラズマ症の診断やワクチンの被接種者に悪影響を与えず、安価で安全性の高いワクチンを提供することを目的としている。

課題を解決するための手段

0004

この発明は、上記の課題を解決するものとして、牛胎児血清を使用しないで培養できるアフリカミドリ株化細胞由来のBGM細胞誘導株BGM−BB5株工業技術院生命工学工業技術研究所受託:FERM P−13626)を提供するとともに、牛胎児血清を使用しないで、この細胞株によるワクチンウイルスの製造法をも提供する。

0005

すなわち、この発明は、無血清培養可能な細胞株の樹立についての検討から発明されたものであって、より具体的には、以下の通りの経緯に基づいてなされたものである。すなわち、発明者らは、まず10%の牛胎児血清(以下、FCSと略す)を含有するイーグル培地(日水製薬製)で生育可能なアフリカミドリ猿腎株化細胞由来のBGM細胞(以下、BGM細胞と略す)(Health American Sciences Vol.11 No.4 275−282(1974)) を一週間毎に継代し、4%FCSまで2%刻みで低減させて順化した。さらに、4%FCS以降は1%刻みで1%FCSまで一週間毎に継代した。しかしながら1%FCSでは継代途中に死細胞が急激に増え、生育が遅くなったので、基礎培地ERDF培地(極東製薬工業製)に変更し、かつインシュリントランスフェリンエタノールアミンおよび亜セレン酸ナトリウムを増殖因子として添加した(以下、ITE因子と略す)。それらの濃度はそれぞれ、インシュリン 0.02−2IU/ml、トランスフェリン 2−200μg/ml、エタノールアミン 2−200μM、亜セレン酸ナトリウム 2.5−250nMが好適であった。その結果、生育状態および生育速度は10%FCSの場合と同等にまで回復した。以後の継代は0.3%刻みで一週間に1回、しかも同一FCS濃度で2回連続して行った。最終のFCS無添加では一週間に一回の継代を3回繰り返した。3回目の増殖過程で細胞の成育にばらつきが見られたので、クローニングを行い、増殖が良い細胞3株を選抜した。選抜した細胞株のうち、最も生育が良好な細胞B株を再度クローニングし、10株を選抜した。そのうち血清を含有しなくても増殖が良く、保存安定性の良い株BB5株を得た。このBB5株は、基礎培地をERDF培地からイーグル培地に戻してもERDF培地と同等の増殖を示したことから、基礎培地は特に限定されない。

0006

次に、無血清培地で生育可能なBGM−BB5株のウイルス生産能について調べた。BGM−BB5株をITES因子を含むERDF培地で24時間培養後、ガンボロ病ウイルスワクチンK株(化血研製)を102 TCID50接種し、37℃で一週間培養した結果、培養上清には106.5 TCID50のウイルスが増殖し、BGM−BB5株は鶏胎児初代細胞(CEF)やBGM細胞の10%牛胎児血清含有培地の場合と同等のウイルス生産能を示した。このように、BGM−BB5株は、牛胎児血清を使用しなくてもウイルス生産が可能なことを見いだした。

0007

さらに、このBGM−BB5株は、他のウイルス株、たとえばニューカッスルウイルスや鶏伝染性気管支炎ウイルスワクチン株についてもCEF細胞と同等のウイルス生産性を有しており、BGM−BB5株に順化するウイルスであれば種類は特に限定されないことを確認した。このようにBGM−BB5株はウイルスの生産用の細胞として広い有用性を見出した。

0008

この発明のBGM−BB5株は、その増殖に牛胎児血清を必要としないので、安価な培地で、安定的にワクチンをはじめ有用物質の製造を可能とする。さらに、牛胎児血清を使用しないことから、牛胎児血清に起因するマイコプラズマの混入や、マイコプラズマ症診断の際に発生する非特異反応を防止することができる。

0009

以下実施例を示し、さらに詳しくこの発明について説明する。
実施例1
BGM細胞を牛胎児血清を使用しないで培養した場合は、表1に示したように細胞数が増加しないか、もしくは増殖が極めて遅い。一方、無血清培地に誘導したBGM−BB5株では、順調な細胞の増加が認められた。

0010

なお、培地組成および培養温度等の条件は以下の通りとした。
培地組成:(1)10%FCS含有ERDF培地
(2)ERDF培地(極東製薬製)
(3)ITES因子含有ERDF培地(極東製薬製)
インシュリン0.2IU/ml、トランスフェリン20μg/ml、エタノールアミン20μM、亜セレン酸ナトリウム25nM
培養温度:37℃、5%二酸化炭素、湿潤下、培養日数:6日間

0011

0012

実施例2
実施例1の無血清条件下で培養したBGM−BB5株を用いて、ウイルスの増殖を試みた。使用ウイルスは、鶏ガンボロ病ウイルスワクチンK株(化血研)であり、接種ウイルス量は102.0 TCID50とした。また、培地組成は、次の表2の通りとした。

0013

また、培養温度は37℃、5%炭酸ガス湿潤条件下とし、培養時間は6日とした。

0014

0015

その結果、表3に示した通り、牛胎児血清を使用しないで培養したBGM−BB5株では、血清を用いたBGM細胞や鶏胎児繊維芽細胞(CEF)と同等のウイルス増殖能を示した。

0016

0017

実施例3
実施例1と同一条件で培養した、ニューカッスルウイルスワクチンB1株(化血研)を実施例2と同一条件で接種し培養した。使用ウイルスは、ニューカッスルウイルスワクチン B1株(化血研)であり、接種ウイルス量は102.0EID50とした。また、培地組成は次の表4の通りとした。

0018

また、培養温度は37℃、5%炭酸ガス湿潤条件下とし、培養時間は6日とした。

0019

0020

その結果、表5に示した通り、BGM−BB5株でもウイルスは生産された。

0021

発明の効果

0022

この発明により、以上詳しく説明した通り、安価な培地で、安定的にワクチンをはじめ有用物質の製造を可能とする。そして、牛胎児血清に起因するマイコプラズマの混入やマイコプラズマ症診断の際に発生する非特異反応を防止することができる。

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