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この項目の情報は公開日時点(1995年3月28日)のものです。
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図面 (4)

目的

特にトリプシンに対して強い阻害活性を有する物質とその製造法に関する。

構成

牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質セリンプロテアゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質並びにこの物質を得るべく、ウシ初乳常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂吸着させることを特徴とする方法。

概要

背景

セリンプロテアゼインヒビタ−については、1930〜1940年代にKunitzがウシ膵臓塩基性トリプシンインヒビタ−(M.Kunitz,J.H.Northrop,J.Gen.Physiol,19.991(1936))及び大豆トリプシンインヒビタ−(M.Kunitz,J.Gen.Physiol,29.149(1946))を結晶化して以来、多くの研究がなされてきた。ウシ初乳中のトリプシンインヒビタ−についても、1951年にラスコフスキ−らによつて報告されている(Laskowski,M.,Jr.,and Laskowski,M.,Federation Proc.,9,194(1950))。分子量10,500の低分子量のものと高分子量のものの2種類が存在するとされているが、その後このトリプシンインヒビタ−については、ほとんど検討されていない。

概要

特にトリプシンに対して強い阻害活性を有する物質とその製造法に関する。

牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質並びにこの物質を得るべく、ウシ初乳、常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂吸着させることを特徴とする方法。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質セリンプロテアゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質

請求項2

トリプシン活性を顕著に阻害し、その他のセリンプロテア−ゼ活性も阻害することを特徴とする請求項1記載の物質。

請求項3

pH5−7の範囲で安定であり、80℃、10分間の加熱で完全に失活することを特徴とする請求項1又は2記載の物質。

請求項4

ウシ初乳常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂吸着させることを特徴とする請求項1,2,3のいずれかに記載の物質の製造法

請求項5

請求項4に記載したホエ−を分画分子量50,000のモジユ−ルを用いて限外濾過処理をしたリテンテイト又はそのリテンテイトをトリプシン又はその他のセリンプロテア−ゼを固定化した樹脂に特異的に吸着させることを特徴とした請求項1,2,3のいずれかに記載の物質の製造法。

技術分野

0001

この発明は特にトリプシンに対して強い阻害活性を有する物質とその製造法に関する。

背景技術

0002

セリンプロテアゼインヒビタ−については、1930〜1940年代にKunitzがウシ膵臓塩基性トリプシンインヒビタ−(M.Kunitz,J.H.Northrop,J.Gen.Physiol,19.991(1936))及び大豆トリプシンインヒビタ−(M.Kunitz,J.Gen.Physiol,29.149(1946))を結晶化して以来、多くの研究がなされてきた。ウシ初乳中のトリプシンインヒビタ−についても、1951年にラスコフスキ−らによつて報告されている(Laskowski,M.,Jr.,and Laskowski,M.,Federation Proc.,9,194(1950))。分子量10,500の低分子量のものと高分子量のものの2種類が存在するとされているが、その後このトリプシンインヒビタ−については、ほとんど検討されていない。

発明が解決しようとする課題

0003

発明者らは、ウシ初乳から高分子量のセリンプロテア−ゼインヒビタ−(SPI)を精製することにより、特にトリプシンに対して強い阻害物質とその製造法を得ようとするものである。

課題を解決するための手段

0004

すなわちこの発明は、牛乳及びホエ−に含有される分子量が60,000〜70,000の範囲である酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害することを特徴とする物質と、ウシ初乳、常乳及び末期乳から得たホエ−を5.5又はそれ以上のpH環境下において陰イオン交換樹脂吸着させることを特徴とする物質の製造法を提案するものである。

0005

ウシ初乳、常乳及び末期乳から得られるホエ−から5.5又はそれ以上のpH環境下で陰イオン交換樹脂に吸着させて分子量60,000〜70,000の範囲の酸性タンパク質でセリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害する物質を得る。

0006

SPIの精製に当つては、ウシ初乳から常乳によつてホエ−を得、DEAEジエチルアミノエチル基)-セルロ−スに吸着させ、1MのNaClで溶出させた画分を凍結乾燥したものをスタテイングマテリアルとして以下の精製に用いた。

0007

最初に、0.1MのTris-HClバツフア−(pH7.2)で平衡化したセフアロ−スCL-4Bカラムを用いたゲル濾過を行なつた。各フラクシヨンのSPI活性はトリプシンに基質となるカゼインを37℃で反応させ、TCA(トリクロロ酢酸)で反応を停止させたのち、遠心分離沈殿を除いた上清のO.D 275nmを測定することによつて表した。

0008

0009

その結果、SPI活性はフラクシヨンNo.122〜126に強く認められたので、この部分を集め、トヨパ−ルHW-55によりリクロマトを行なつた。前記の方法でSPI活性を測定したところ、メインピ−クの前半にかかつたシヨルダ−部分に活性が認められた。さらに、この画分をHPLC分析し、図1に示した結果を得た。この2つのピ−クのうち前の1のピ−クのみ強いSPI活性を有しており、2のピ−クに活性は認められなかつた。したがつて、1のピ−クのみを分取し、ウシ初乳SPIとして、種々の実験に用いた。

0010

また前述のスタ−テイングマテリアルからトリプシン−セフアロ−スカラムを用いたアフイテイクロマトグラフイ−によつて同様なSPIが得られた。CNBr-activated Sepharose4Bにトリプシンをカツプリングさせ、初乳SPIを吸着させる。2MのNaClを含むTris-HClバツフア−(pH7.2)でゲルを洗い、pH12のバツフア−により溶出してくる画分にSPI活性が確認された。

0011

SPIの性状に関しては、精製したSPIは、Native PAGEとSDS-PAGEで共にシングルバンドとなり、SDS-PAGEの結果から、分子量は60,000〜70,000の範囲であつた。また2次元電気泳動の結果、等電点酸性側となつた。

0012

次に、SPIのpH安定性熱安定性について検討した。活性測定には、メチルクマリルアミドペプタイドを基質として用い、遊離してくるアミノメチルクマリンを、蛍光光度計で測定し、コントロ−ルに対する阻害率(%)で示した。

0013

0014

SPIはそれぞれのpHのバツフア−に溶かし、37℃で1時間、各pH状態に保つたのち測定した。その結果、SPIはpH5の弱酸性から中性域で安定であつた(図2)。熱安定性は65℃と80℃で0〜60分間の加熱を行ない、5分ごとにサンプリングして、阻害活性を測定した。80℃では、5分間の加熱でほぼ100%失活したのに対し、65℃の加熱では、活性はゆるやかに失なわれたが、60分間加熱後も7割程度は残していた(図3)。

0015

次にトリプシン以外のセリンプロテア−ゼとして、エラスタ−ゼ、プラスミンMIP(戻り誘導酵素)について検討した。ここで、MIPとは、木下らによつて報告されているように、魚体筋肉中に存在するセリンプロテア−ゼである。このプロテア−ゼは、加熱により活性化してミオシンを分解するため、カマボコ等の魚肉練り製品の「戻り」の原因とされている。今回用いたMIPはメルル−サ科パシフイツクヘイクのすり身より木下らの方法に準じて調製した。

0016

活性測定は前記のように各プロテア−ゼに対し特異性の高いメチルクマリルアミドペプタイドを基質に用い、トリプシン、エラスタ−ゼ、プラスミンは37℃で、MIPについては、至適温度である60℃で反応させ、SPI活性を測定した。

0017

*使用した合成基質ペプチド研)
トリプシン:Boc-Phe-Ser-Arg-MCA
MIP :Boc-Phe-Ser-Arg-MCA
エラスタ−ゼ:Suc-Ala-Ala-Ala-MCA
プラスミン:Boc-Val-Leu-Lys-MCA
0.1Mリン酸バツフア−pH7.5(MIPのみpH7.0)に溶解して用いた。

0018

その結果、トリプシンに対し最も強い阻害活性を有し、次いでMIP、エラスタ−ゼ、プラスミンの順に活性は低下した(図4)。トリプシン活性は0.175μMのSPIで、MIP活性は1.4μMのSPIで完全に阻害された。また1.4μMのSPIでエラスタ−ゼは約40%、プラスミンは約20%阻害された(プラスミンにはほとんど作用しないと考えられた)。

発明の効果

0019

上述のようにしてこの発明によれば、セリンプロテア−ゼ活性を特異的に阻害する物質が得られた。

図面の簡単な説明

0020

図1SPI活性のHPLCパタ−ンを示すグラフである。
図2SPIのpH安定性を示すグラフである。
図3SPIの温度安定性を示すグラフである。
図4各セリンプロテア−ゼに対するSPIの阻害効果を示すグラフである。

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