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技術 新規バチルス・チューリンゲンシス菌

出願人 東亞合成株式会社
発明者 飯塚敏彦森博徳大森巌
出願日 1993年3月3日 (27年7ヶ月経過) 出願番号 1993-067560
公開日 1995年1月6日 (25年9ヶ月経過) 公開番号 1995-000180
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 農薬・動植物の保存
主要キーワード 走査電子顕微鏡用 ガラス円盤 うつし 加熱液 通液体 昆虫学 選択分離 各検査項目
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1995年1月6日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (4)

目的

ハマ虫類に対してきわめて高い殺虫効果を示す新規バチルスチュリンゲンシスを提供することを目的とするものである。

構成

本発明の新規バチルス・チュ−リンゲンシス菌(Fu2−7株及びMe8−18株)は自然界から採取した土壌中に存在し、ハマキ虫類に対する殺虫活性指標選択分離された、現行鱗翅目生物農薬生産株の2倍前後の殺虫活性を示す結晶毒素蛋白を産生するものである。

効果

ハマキ虫類に卓効を示すBT農薬を製造できる。

概要

背景

Bt菌の生活環中、胞子形成期にこれと同調して形成される細胞内封入体は、結晶毒素蛋白と称され、多くの鱗翅目昆虫幼虫に対して毒性を示すことから農薬として広く用いられている。

現在、諸外国において登録されている鱗翅目昆虫用殺虫剤の製造に使用されているBt菌株としては、クルスタキHD−1株(var. kurstaki HD-1)、アイザワイ株(var. aizawai)を挙げることが出来る(植物防疫、45巻、12号、498〜499(1992)) 。これらの菌株のうち、実用として広く用いられているのはクルスタキHD−1株であり、それを用いて作られた生物農薬は、国内で、化学農薬抵抗性を獲得したコナガ(アブラナ科野菜重要害虫のひとつ)の防除薬剤として重要な位置を占めている。

近年、安全な農薬に対するニーズが高まりつつあり、それに応じて生物農薬の開発も盛んになりつつあるが、実用面からみた場合に、クルスタキHD−1株を用いて作られた生物農薬(以下BT剤という)によるコナガ防除以外での生物農薬の使用機会はきわめて少ない状況にある。また、広く使用されているBT剤も、国内において鱗翅目害虫として無視し得ないハマ虫類に対しては効力が未だ不十分である。すなわち、BT剤はコナガ防除に対しては1000〜2000倍の希釈溶液散布すれば充分な防除効果が得られるが、ハマキ虫類に対しては500倍もしくは250倍の希釈溶液の散布が必要となり、作物生産コストに占める割合が大きくなるという問題点を有している。

したがって、ハマキ虫類に対してコナガに対すると同等程度に効くBT剤が強く求められているが、現行のBT剤製造菌株であるクルスタキHD−1株ではハマキ虫類に対して充分な殺虫効力を有する結晶毒素蛋白を産生させることができないのが現状である。

概要

ハマキ虫類に対してきわめて高い殺虫効果を示す新規バチルスチュリンゲンシスを提供することを目的とするものである。

本発明の新規バチルス・チュ−リンゲンシス菌(Fu2−7株及びMe8−18株)は自然界から採取した土壌中に存在し、ハマキ虫類に対する殺虫活性指標選択分離された、現行の鱗翅目用生物農薬生産株の2倍前後の殺虫活性を示す結晶毒素蛋白を産生するものである。

ハマキ虫類に卓効を示すBT農薬を製造できる。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

従来のバチルスチューリンゲンシス菌に比較してハマ虫類に対する殺虫効力を2倍前後示す結晶毒素蛋白を産生する新規バチルス・チューリンゲンシス菌

技術分野

0001

本発明は、鱗翅目昆虫(ガやチョウの類)、なかでもバチルスチューリンゲンシス(以下Btという)菌の産生する結晶毒素蛋白を有効成分とする既存の生物農薬が効きにくいハマ虫類幼虫に対して、きわめて高い殺虫効果を示す結晶毒素蛋白を産生する新規Bt菌を提供するものであり、農業農薬業界で有効に利用されるものである。

背景技術

0002

Bt菌の生活環中、胞子形成期にこれと同調して形成される細胞内封入体は、結晶毒素蛋白と称され、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示すことから農薬として広く用いられている。

0003

現在、諸外国において登録されている鱗翅目昆虫用殺虫剤の製造に使用されているBt菌株としては、クルスタキHD−1株(var. kurstaki HD-1)、アイザワイ株(var. aizawai)を挙げることが出来る(植物防疫、45巻、12号、498〜499(1992)) 。これらの菌株のうち、実用として広く用いられているのはクルスタキHD−1株であり、それを用いて作られた生物農薬は、国内で、化学農薬抵抗性を獲得したコナガ(アブラナ科野菜重要害虫のひとつ)の防除薬剤として重要な位置を占めている。

0004

近年、安全な農薬に対するニーズが高まりつつあり、それに応じて生物農薬の開発も盛んになりつつあるが、実用面からみた場合に、クルスタキHD−1株を用いて作られた生物農薬(以下BT剤という)によるコナガ防除以外での生物農薬の使用機会はきわめて少ない状況にある。また、広く使用されているBT剤も、国内において鱗翅目害虫として無視し得ないハマキ虫類に対しては効力が未だ不十分である。すなわち、BT剤はコナガ防除に対しては1000〜2000倍の希釈溶液散布すれば充分な防除効果が得られるが、ハマキ虫類に対しては500倍もしくは250倍の希釈溶液の散布が必要となり、作物生産コストに占める割合が大きくなるという問題点を有している。

0005

したがって、ハマキ虫類に対してコナガに対すると同等程度に効くBT剤が強く求められているが、現行のBT剤製造菌株であるクルスタキHD−1株ではハマキ虫類に対して充分な殺虫効力を有する結晶毒素蛋白を産生させることができないのが現状である。

発明が解決しようとする課題

0006

本発明者等は、クルスタキHD−1株の産生する結晶毒素蛋白と比較して、ハマキ虫類に対して高い殺虫活性を有する結晶毒素蛋白を産生させる菌株を見出すべく鋭意研究を行ったのである。

課題を解決するための手段

0007

本発明者等は、自然界から広くBt菌を採取し、ハマキ虫類に対する殺虫活性を指標として、クルスタキHD−1株より高い殺虫活性を示す菌株を選別した結果、ハマキ虫類に対してクルスタキHD−1株の2倍の殺虫活性を示す結晶毒素蛋白を産生する新規Bt菌を見いだし、本発明を完成したのである。

0008

すなわち、本発明は、従来のバチルス・チューリンゲンシス菌に比較してハマキ虫類に対する殺虫効力を2倍前後示す結晶毒素蛋白を産生する新規バチルス・チューリンゲンシス菌に関するものである。

0009

本発明者等が採用したBt菌の分離方法およびBt菌の同定方法は以下のとおりである。
○Bt菌の分離方法
自然界から採取した土壌を10mgずつ量し、滅菌三角フラスコに入れ10mlの滅菌蒸留水注入し30分間振盪後、暫時静置する。その上澄液2mlをサンプリングし、直ちに98℃で10分間加熱する。この加熱液を10倍、100倍の2段階に希釈し、各々1mlを普通培地肉エキス0.3%、ペプトン0.3%、寒天1.5%、 pH=7.0)と共に9cmのペトリ皿で30℃で24〜48時間静置培養する。得られたコロニーをすべて普通斜面培地に植え30℃で4日〜6日培養し、結晶毒素蛋白の形成を待ち位相差顕微鏡により結晶毒素蛋白産生の有無を観察する。結晶毒素蛋白が認められた菌株については、さらに走査電子顕微鏡を用い結晶形態を観察する。

0010

○形態および生化学的性状によるBt菌の同定方法
バージェイズマニュアルオブシステマティックバクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology volume 2, Wiliams & Wilkins, Baltimore, 1984) に準じ、各検査項目とその方法を記載した参考文献を以下に記載する。
(1)形態
寒天培地および液体培地に生育した細胞について、次の点を検査する。培地組成肉汁および肉汁寒天を基準とする。
1.細胞の形および大きさ1、6)
2.運動性の有無、運動性がある場合は鞭毛着生状態1、2、6)
3.胞子の有無、胞子がある際の胞子、胞子嚢の形、大きさ及び胞子の部位1、2)
4.グラム染色性1、2)
5.抗酸性1、2)
(2)培養所見
1.肉汁寒天平板培養1、6)
2.肉汁寒天斜面培養1、6)
3.肉汁液体培養1、6)
4.肉汁ゼラチン培養1、4、6)
5.リトマスミルク1、4、6)
寒天培地では生育の様相、色、光沢、拡散性色素などを、液体培地では表面発育の有無、濁度などを、ゼラチン穿刺培養では生育の状態、ゼラチン液化等を、リトマス・ミルクではその反応(アルカリ性酸性か)、凝固液化等について検査する。
(3)生化学的性状
次の生理学的性質に関し、検査する。
1.硝酸塩還元6)
2.VPテスト1、3、4、6)
3.インドールの生成3、4、6)
4.デンプン加水分解4、6)
5.クエン酸の利用(Koserの培地)3)
6.色素の生成1、4、6)
7.ウレアーゼ1、3)
8.カタラーゼ1、6)
9.レシチナーゼ5)
10.生育の範囲(pH、温度など)3、6)
11.酸素に対する態度好気性嫌気性の区別など)3)
12.下記の糖類からの酸およびガスの生成有無3、6)
・L-アラビノースD-キシロース・D-グルコース
・D-マンノースショ糖乳糖
・D-マンニットグリセリンサリシン7)
13.耐熱性溶性外毒素3)
14.病原性3)

0011

参考文献
1)地憲二:応用菌学(下巻)、p.30〜51、 p.68〜86、 p.90〜91、 p.107、 p.122〜123、 p.127〜128 (岩波)(1958)
2)微生物研究法懇談会編:微生物学実験法、p.134〜138 (講談社)(1982)
3)伝染病研究所学友会編:細菌学実習提要、p.64〜65、 p.136 〜151 (丸善)(1958)
4)Society of American Bacteriologists : Manual of MicrobiologicalMethods,p.154 〜168(McGRAW-Hill Book Co.,)(1957)
5)赤堀四郎 監修:酵素ハンドブック、p.444(1966)
6)東京大農芸化学教室改訂新版実験農芸化学上巻p.232〜243(1960)
7)Norris, J.R. : J. Appl. Bact., 27(3), p.439(1964)

0012

血清型によるBtの分類方法
大庭らの方法(J. Invertebr. Pathol., 32, 303-309 (1978)、 J. Invertebr.Pathol., 33, 387-388 (1979))、Bonnefoi and de Barjacの方法(Entomophaga,8, 223-229 (1963))、 de Barjac and Lemille の方法(J. Invertebr. Pathol.,15, 139-140 (1970))、de Barjac and Bonnefoiの方法(I. Invertebr. Pathol.,20, 212-213 (1972)) に準じた。

0013

DNAプローブによる結晶毒素型の分類方法
浅野らの方法(平成4年度日本応用動物昆虫学年次大会講演要旨集 p.211)に準じた。

0014

走査電子顕微鏡用試料作成方法
飯塚らの方法(飯塚敏彦ら、北大農邦紀要13(3)、 423 〜431、 1982)を改変した。即ち、普通斜面培地に移植後30℃で4日〜6日間培養した菌株を1白金耳とり、滅菌蒸留水に浮遊懸濁させ、結晶毒素蛋白と胞子の浮遊液を作成する。この浮遊液を1cmのガラス円盤試料台にのせ自然乾燥させ、カーボンおよび金蒸着の後、走査電子顕微鏡(日本電子SM−SI)で観察した。

0015

○ハマキ虫類に対する殺虫活性試験方法
普通斜面培地から菌株を1白金耳かきとり、普通液体培地5mlを含むL字管接種し、30℃で16時間振盪培養する。この培養液1mlを普通液体培地50mlを含む坂口フラスコに接種し、30℃で3日間培養し、バイオアッセイに供する。バイオアッセイは人工飼料インセクタLF協同飼料(株)、横)で室内飼育したチャノコカクモンハマキ10日齢の幼虫を使用する。上記培養液を7割6段階に希釈し、この希釈液0.25mlを5gの人工飼料(インセクタLF)に均一に混合する。同混合物内容積65mlのアイスクリームカップの側面に固定し、10日齢の幼虫を10頭供試し、25℃で飼育し、7日後に死虫数を測定した。この死亡率から、プロビット法(Finney, D.J., Probit Analysis (3rd ed.),Cambridge Univ. Press, 318pp, 1974) によってLC50(ppm) を算出する。なお、殺虫試験は1希釈液あたりカップを3連用意し、30頭あたりの死亡率で計算し、ブランクとしては普通液体培地を用いた。

0016

○結晶毒素蛋白の定量方法
培養液を4℃の蒸留水で3回水洗し、2倍に濃縮したものを調製する。この液にSDS−PAGE用サンプルバッファー(62 mMトリス(pH=8.0)、2%SDS、5%2-メルカプトエタノール、10%グリセロール、0.1%ブロモフェノールブルー)を等量混合し、100℃で5分間加熱する。室温冷却後、同液10μlをSDSーポリアクリルアミドゲル(10%ゲル)にアプライし、30 mA/ゲルの電流下、電気泳動を行う。なお、同一ゲルの別レーン事前に調製した卵白アルブミン溶液(400〜2000μg/ml)を10μlアプライしておく。電気泳動終了後、常法にしたがってcoomassie blue R-250染色/脱色操作を行う。結晶毒素蛋白の分子量に相当する130〜135kD、60〜65kDのバンドの濃さをデンシトメーター(Digital DensitorolDMU-33C、東洋科学産業(株))で測定し、同一ゲル内にアプライしたアルブミンの結果から、アルブミンに換算した結晶毒素蛋白濃度を算出した。

0017

本発明者等は、ハマキ虫類の実用防除を可能とするBT剤を開発すべく、現行のBT剤生産株であるクルスタキHD−1株よりもハマキ虫類に対して高い殺虫活性を有するBt菌を自然界から広く検索した。その結果、クルスタキHD−1株が産生する結晶毒素蛋白に比較して2倍前後の殺虫活性を示す結晶毒素蛋白を産生する新規Bt菌を得たのである。なお、本実施例では、ハマキ虫類の代表としてチャノコカクモンハマキを用いて殺虫試験を行ったが、本昆虫種と同種にあたるリンゴコカクモンハマキ、リンゴモンハマキをはじめ、ミダレカクモンハマキチャハマキなどのハマキ虫に対しても同等の殺虫効果が期待でき、本発明の新規Bt菌により産生される結晶毒素蛋白の殺虫剤としての適用対象は、チャノコカクモンハマキのみに限定されるものではない。

0018

以下に新規Bt菌の由来ならびに特徴について詳細に記す。1986年5月15日、北海道十勝圃場から、また1986年7月15日、北海道富良野市山部東大演習林からそれぞれ土壌を採取した。前述の分離法に準じて菌株を分離し、位相差顕微鏡・走査電子顕微鏡による結晶毒素蛋白産生の有無を確認し、結晶毒素蛋白産生株のみを選別した。

0019

つぎに、チャノコカクモンハマキに対する高い殺虫活性を与える菌株をスクリーニングした。そのなかで、北海道十勝芽室町圃場の土壌からのMe 8−18株(受託番号第P−13460号)および北海道富良野市山部東大演習林の土壌からのFu 2ー7株(受託番号第P−13459号)がクルスタキHD−1株の2倍に相当する殺虫活性を示した。以上の菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所寄託されている。両菌株の検査結果に基づく特徴を以下に示す。表1は形態に関する検査結果を示す。

0020

0021

表1に示された結果は、両菌株の特徴がバチルス・チューリンゲンシスの分類学的特徴とよく一致していることを示している。参考までに、図1〜2に両菌株の位相差顕微鏡を、図3〜4に走査電子顕微鏡結果を示す。この結果より、結晶毒素蛋白の形状は主として両菱形錐状(bi-pyramidal)であるが、一部正方状(cuboidal)のものが混入していることがわかる。

0022

表2には培養所見に関する検査結果を示す。

0023

0024

表2に示された結果は、両菌株の特徴がバチルス・チューリンゲンシスの分類学的特徴とよく一致していることを示している。

0025

表3および表4には生化学的性状に関する検査結果を示す。

0026

0027

0028

表3および表4に示された結果は、両菌株の特徴がバチルス・チューリンゲンシスの分類学的特徴とよく一致していることを示している。鞭毛抗原による血清型の分類結果では、両菌株はクルスタキ亜種分類され、結晶毒素遺伝子の分類結果では、Me 8−18株は、CryIA(a) 、CryIA(b) 、CryA(c) 、CryIIA、CryIIBを保有しており、Fu 2−7株は、CryIA(a) 、CryIA(b) 、CryIA(c) 、CryIIA、CryIIB、CryIII を保有していた。

0029

以下に本菌株の産生する結晶毒素蛋白のハマキ虫類に対する殺虫効果を具体的な測定例をもって示す。

0030

殺虫試験I
Me 8−18株およびFu 2−7株の普通液体培養液(坂口フラスコ培養/30℃・3日間振盪培養)を用いたチャノコカクモンハマキに対する室内殺虫試験結果を表5に示す。殺虫試験は日をかえて2回実施し、対照としてクルスタキHD−1株培養液を用いた。

0031

0032

表中の上段数字はLC50(ppm)を与える結晶毒素蛋白濃度(アルブミン換算値)を意味し、下段の数字はクルスタキHD−1株に対する相対殺虫活性の比率を意味する。本結果から、Me 8−18株およびFu 2−7株の結晶毒素蛋白はクルスタキHD−1株の結晶毒素蛋白に比して2倍前後、すなわち1.5倍から3.5倍程度の殺虫活性を有することが明らかである。

0033

殺虫試験II
Me8−18株およびFu2−7株の普通液体培養液を無菌的に採取し、滅菌蒸留水で2回水洗し、凍結真空乾燥した。この凍結真空乾燥粉末乳鉢粉砕し、粉末中の結晶毒素蛋白を定量した。つぎに、結晶毒素蛋白を5%含有する粉末を作成すべく、助剤としてぼう硝:乳糖:カオリン(20部:20部:60部)混合物を添加し、微粉砕した(ハード粉砕器:HM−70型、柴田化学(株)、東京;10秒間処理)。本粉末を展着剤クエース2000倍加用の分散媒に溶解(5分間撹拌)させたのち、その200mlを小型噴霧器(Ball Sprayer C、旭理化(株))に投入し、20枚程度の葉がついた(ヤブキタ)の枝3本に均一に散布した。なお、希釈倍数は500倍と1000倍とした。室温風乾後、任意に葉を20枚程度採取し、1枚ずつ内容積100mlのアイスクリームカップにうつし、これに10日齢のチャノコカクモンハマキ10頭を供試し、25℃で7日間飼育し、死亡率を測定した。対照としてはクルスタキHD−1株を用いて同様の結晶毒素蛋白を5%含む粉末試料を作成し、同様の殺虫試験を行った。結果を表6に示す。

0034

0035

表中の数字は7日後の死亡率(%;200頭あたり)を示している。本結果からも明かなように、Me8−18株およびFu2−7株を用いたBT剤はハマキ虫類の防除に対してきわめて有効であることがわかる。

発明の効果

0036

本発明によれば、ハマキ虫類に対して実用的なBT殺虫剤を製造することができ、農薬業界に与える効果は大なるものである。

図面の簡単な説明

0037

図1Me 8−18株の普通液体坂口フラスコ培養液の位相差顕微鏡写真である。楕円状に見え粒子が胞子で、両錐状ならびに小サイコロ状に見える粒子が結晶毒素蛋白である。油浸、X1500の条件で撮影した。
図2Fu 2−7株の普通液体坂口フラスコ培養液の位相差顕微鏡写真である。楕円状に見える粒子が胞子で、両錐状ならびに小サイコロ状に見える粒子が結晶毒素蛋白である。油浸、X1500の条件で撮影した。
図3Me 8−18株の普通液体坂口フラスコ培養液菌体から調製した走査電子顕微鏡写真である。X10000の条件で撮影した。カプセル状に見える粒子が胞子で、両菱錐状ならびにサイコロ状に見える粒子が結晶毒素蛋白である。
図4Fu 2−7株の普通液体坂口フラスコ培養液菌体から調製した走査電子顕微鏡写真である。X10000の条件で撮影した。カプセル状に見える粒子が胞子で、両菱錐状ならびにサイコロ状に見える粒子が結晶毒素蛋白である。

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