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請求項1

活性化のためにATP加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質優先的に分解する概略分子量500kDaの単離された多量体チオールプロテアーゼ、または実質的に同じアミノ酸配列を持つ酵素

請求項2

エンドペプチダーゼである、請求項1の単離された多量体チオールプロテアーゼ。

請求項3

筋肉から単離された、請求項1の多量体チオールプロテアーゼ。

請求項4

概略分子量700kDaのプロテアソームとともに概略分子量1500kDaの複合体を形成する、概略分子量500kDaの単離されたATP−依存性チオールプロテアーゼ。

請求項5

本質的に純粋なマルチパイン。

請求項6

活性化のためにATP加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先的に分解する、概略分子量500kDaの遺伝子組換え的に製造された多量体チオールプロテアーゼ。

請求項7

a)ユビキチン化リゾチームのATP−刺激性分解に参与する;b)酸化剤−揖傷ヘモグロビンに対して強い蛋白質分解活性を示す;そしてc)sLLVT−MCAに対しては殆ど蛋白質分解活性を示さない、概略分子量500kDaの多量体チオールプロテアーゼ。

請求項8

活性化のためにATP加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先的に分解する、概略分子量500kDaの多量体チオールプロテアーゼをコードするDNA。

請求項9

活性化のためにATP加水分解を要求し、そしてユビキチン化蛋白質を優先的に分解する、概略分子量500kDaの精製された多量体チオールプロテアーゼを発現する宿主細胞

請求項10

a)物質、マルチパイン、ユビキチン化蛋白質、ATPおよびMg2+を混合する;b)(a)で調製した混合物をユビキチン化蛋白質のATP−刺激性分解のための適当な条件下に保つ;そしてc)ユビキチン化蛋白質のATP−刺激性分解が起きるかどうか測定する、の各段階からなる、マルチパインを阻害する該物質の性能を測定する方法。

請求項11

段階(c)でさらにユビキチン化蛋白質のATP−刺激性分解が起きる程度を測定し、そして結果を適当な対照と比較することを含む請求項10の方法。

請求項12

a)物質をマルチパイン、ATPおよびMg2+と混合する;そしてb)マルチパインとプロテアソームの間で複合体を形成するかどうかを測定する(ここでは複合体形成欠如は物質がマルチパインを阻害することの指標である)の各段階からなるマルチパインを阻害するための物質の性能を測定する方法。

請求項13

段階(a)ではユビキチン化蛋白質も存在し、段階(b)では活性マルチパイン−プロテアソーム複合体の存在をユビキチン化蛋白質のATP−刺激性分解が起きるかどうかを測定することによって評価する、請求項12の方法。

請求項14

a)ユビキチン−依存性分解を受けうる寿命の短い蛋白質を製造する培養細胞を準荒する;b)培養された細胞をATP−ユビキチン−依存性分解過程を阻害する性能を評価すべき物質とその物質が培養された細胞に入るために適当な条件下に接触させる;c)および培養された細胞のサイトゾル内に寿命の短い蛋白質が存在する程度を測定する(ここではサイトゾル内の寿命の短い蛋白質の蓄積はATP−ユビキチン−依存性分解過程の阻害の指標である)の各段階からなる細胞内のATP−ユビキチン−依存性分解過程の阻害剤のための迅速なスクリーニングの方法。

請求項15

培養された細胞が寿命の短い突然変異型の酵素を生産するCOS細胞である、請求項14の方法。

請求項16

酵素が大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼの突然変異型である、請求項15の方法。

請求項17

a)脱神経絶食発熱性感染症または代謝性アチドーシスを受けた動物から得られたヒラメ筋または長指伸筋をATP−ユビキチン−依存性過程の潜在的な阻害剤とユビキチン化蛋白質の分解に適当な条件下にインキュベーションする;b)筋肉蛋白質の分解産物の放出を潜在的阻害剤の存在下に測定する;およびc)(b)で行った測定を脱神経、絶食、発熱性感染症または代謝性アチドーシスを受けた動物から得られたヒラメ筋または長指伸筋での筋肉蛋白質の分解産物の潜在的阻害剤の不在下の放出と比較する、の各段階からなる筋肉細胞内のATP−ユビキチン−依存性過程の阻害剤を確認する方法(ここでは筋肉蛋白質の分解産物放出の減少はATP−ユビキチン−依存性過程の阻害の指標である)。

請求項18

筋肉蛋白質の分解産物が3−メチルヒスチジンである、請求項17の方法。

請求項19

a)脱神経、絶食、発熱性感染症または代謝性アチドーシスを受けた動物を準備する;b)その動物にATP−ユビキチン−依存性過程の潜在的阻害剤を投与する;c)動物による3−メチルヒスチジンの排泄を測定する;およびd)(c)で行った測定を(a)で準備した動物と同様にして脱神経、絶食、発熱性感染症または代謝性アチドーシスを受けた動物による3−メチルヒスチジンの排泄と比較する;各段階からなる動物内のATP−ユビキチン−依存性過程の阻害剤を確認する方法(ここでは3−メチルヒスチジン排泄の減少はATP−ユビキチン依存性過程の阻害の指標である)。

請求項20

マルチパインとマルチパインの活性部位と結合する物質とを、その物質とマルチパインの結合に適当な条件下に接触させてマルチパイン−物質複合体を形成させることからなるマルチパインを阻害する方法。

請求項21

1500kDaのマルチパイン−プロテアソーム複合体の機能を阻害する物質を細胞に導入することからなる細胞内マルチパインの阻害のための迅速なスクリーニング法

請求項22

マルチパイン阻害剤とマルチパインの結合のために適当な条件下に十分な量のマルチパイン阻害剤を細胞に導入することからなる細胞内ATP−ユビキチン−依存性経路の活性化を阻害する方法(ここではマルチパインとマルチパイン阻害剤の結合がその経路の機能を阻害する)。

請求項23

マルチパインおよびプロテアソームを含む概略分子量1500kDaの複合体の形成を阻害する物質を筋肉細胞に導入することからなる、筋肉細胞内のATP−ユビキチン−依存性経路を阻害する方法。

請求項24

筋肉細胞内の非リソソーム性ATP−要求性蛋白質分解過程の機能を妨害することからなる筋肉量損失を防ぐ方法。

請求項25

筋肉細胞内の非リソソーム性ATP−要求性蛋白質分解過程の活性化を、活性化にATPの加水分解を要求し、かつユビキチン化蛋白質を優先的に分解する概略分子量500kDaの多量体チオールプロテアーゼの活性化を妨害することによって、筋肉細胞内で阻害することからなる請求項24の方法。

請求項26

非リソソーム性ATP−要求性蛋白質分解過程の活性化が、筋肉細胞内でマルチパイン−プロテアソーム複合体の機能を妨害することにより阻害されることからなる、請求項24の方法。

請求項27

個体にマルチパイン阻害剤をマルチパイン阻害剤の筋肉細胞への導入および筋肉細胞内でのマルチパインとマルチパイン阻害剤との結合に適する条件下にその個体にマルチパイン阻害剤を投与することからなる、個体の筋肉量の損失を防ぐ方法(ここでは結合によりATP−ユビキチン−依存性経路の阻害が起きる)。

請求項28

哺乳類細胞をATP−ユビキチン−依存性蛋白質分解経路の活性をATP−依存性チオールプロテアーゼの活性部位と結合することによって減少させることのできる物質と接触させることからなる、概略分子量500kDaのATP−活性化チオールプロテアーゼが関与するシストゾル性ATP−ユビキチン−依存性蛋白質分解過程の哺乳類細胞内の活性化を防ぐ方法。

請求項29

物質がパパイン様酵素の阻害剤である、請求項28の方法。

請求項30

物質がシスタチンAの類似体または誘導体である、請求項28の方法。

請求項31

請求項32

筋肉細胞から単離した40kDaのプロテアソーム阻害剤の活性を模した合成ペプチド

請求項33

700kDaのプロテアソームを阻害し分子量が40kDaまたはそれ以下のペプチド

0000

ATP依存性プロテアーゼおよびそれに対する拮抗剤悪液質および筋肉るいそ
うの処置における使用発明の背景
哺乳類細胞は少なくとも4種の蛋白質分解系を含み、それらは細胞蛋白質の代
謝回転に別個の機能を果たしていると思われる。サイドシル中には、ATPを必
要とし、そしてポリペプチドであるユビキチンが関連する溶解性蛋白質分解経路
が存在する。この多成分系は高度に異常な蛋白質および寿命の短い調節蛋白質の
選択的分解を触媒する。しかし、この過程成熟中の網状赤血球(Boches
、 F、およびA、L、Goldberg、5cience、215:978−
980 (1982) 、5penser、S、およびJ、 Et l ing
er、 J。
Biol、Chem、、257:14122〜14127 (1985))およ
び成熟中の繊維芽細胞(C4echanover、A など、Ce1l、375
7−66 (1984) 、Gronos t a j sk i、R,など、
J、Biol。
Chem 、260 : 3344〜3349 (1984))の中の大部分の
蛋白質の分解にも関与していると思われる。インシュリンまたは血清を除去した
細胞では標準的細胞蛋白質の分解は2倍まで増加する。この加速された蛋白質分
解はリゾソームを含み、これはエンドイトーンスを受けた蛋白質および膜蛋白
質の分解のための部位でもある。骨格筋全蛋白質分解を増加することのできる
他の系にはCa”−依存性プロテアーゼ(カルバインIおよびII)が関連する
ジストロフィーまたは損傷を受けた筋肉または細胞間Ca”が増加している術
後正常筋肉の中では、主にカルパイン活性化により全蛋白質分解が増加する。
さらに、ATPとは独立に機能する非すリゾーム性分解系があり;赤血球中では
この系は酸化剤−損傷蛋白質の分解を選択的に触媒する。筋肉で各種条件下にお
ける種々の細胞成分の分解におけるこれらの系の相対的な重要性は知られていな
い。
ubを要求する経路では、多くの蛋白質の分解における最初の段階はATP−依
存性過程によるこの小さいポリペプチドへの抱合を含む。ユビキチン化蛋白質は
次に1000〜1500kDa (26S)のATP−依存性蛋白質分解複合
であるUb−複合体−分解酵素(rUCDENJ)によって分解される。この経
路は網状赤血球中で最もよく特徴付けられるが、骨格筋内および他の細胞内にも
証明される。これは高度に異常な蛋白質および寿命の短い酵素または調節蛋白質
多数の迅速な分解を司ると信じられている。
真核細胞中の大きな(700kDa)多量体プロテアーゼは、プロテアソーム
呼ばれ、TJCDENの成分である。これは別個のサブユニット12〜15種お
よび特異性の異なるペプチダーゼ3種を含む。それ自身では、プロテアソームは
ユビキチン化蛋白質を分解できないが、そしてUCDENにおける蛋白質分解活
性の殆どを提供する。
発明の要約
本発明は種々の生理学的および病理学的段階を伴う、そして神経損傷絶食、発
熱、アチドーシスおよび成る種の内分泌障害で起きる筋肉量損失萎縮)の大
部分の原因となっている筋肉蛋白質の加速された分解を阻止(削減または予防)
する方法に関する。本文に述べるように、非すリゾーム性ATP−ユビキチンー
依存性蛋白質分解過程はこれらの状況下での筋肉内で増加し、萎縮筋肉内に起き
る加速された蛋白質分解の大部分の原因であることが証明されている。これも、
本文に述べるように、萎縮筋肉内には同一条件下の非筋肉組織内には見られない
ユビキチンmRNAの特異的増加、プロテアソームのためのmRNAの誘導およ
びユビキチン化蛋白質含量の増加があることの証明によって支持される。
本発明はさらにユビキチン化蛋白質の分解に関与し、プロテアソームと複合体を
形成し、ユビキチンに抱合した蛋白質を迅速に分解する1300〜1500kD
aのATP=依存性蛋白質分解複合体(UCDEN、1500kDa複合体と称
する)の一部と思われる新ATP=依存性プロテアーゼに関する。マルチパイ
(multipain)と命名されたこの新プロテアーゼはATP−ユビキチン
ー依存性経路において重要な役割を果たしていると思われる。
マルチパインは分子量約500kDaの多量体性酵素で、活性化のためにATP
加水分解を必要とし、またユビキチン化蛋白質を優先的に分解する。この新A
TP依存性酵素はチオールプロテアーゼであると思われ、Ub−抱合蛋白質を酸
溶解性産物まで分解することが示されている。マルチパインは筋肉内に確認され
、種々の型の筋肉るいそう中に活性化されているサイドシル経路で決定的な役割
を果たしていることが示されている。
本発明はさらに骨格筋細胞のようなそれが正常には存在する資源から得られる精
製マルチパイン:マルチパインをコードするDNAまたはRNA、組換えDNA
法によって製造されたマルチパイン;この酵素に特異的な抗体;マルチパインの
使用法;およびマルチパイン阻害剤および殊に各種の疾患または状況中に起きる
筋肉量減少を削減するためのその使用に関する。
新マルチパイン阻害剤は、本文に述べる、この酵素およびその構造に関する知識
および技術認識的方法を用いて設計および製造されることができる。例えば、蛋
白質分解サブユニット、ATPアーゼおよびユビキチンー結合構成要素のような
マルチパインの種々のサブユニットの知識はこの目的のために有用であろう。
本発明はさらにマルチパインまたはこの多量体酵素の構成要素の阻害剤である既
存の化合物または分子を確認する方法に関する。例えば、マルチパインはシスタ
チンAで阻害されることが示されている。故に、クローン化されたマルチパイン
発現する細胞はこの酵素を阻害する性能をめてンスタチン類似体を検定するた
め、ならびに他のマルチパイン阻害剤を確認するために用いることができる。
微生物培養液をマルチパインの抗生物質性阻害剤をめてスクリーニングすること
もできる。マルチパイン阻害剤はペプチド、ペプチド様分子であるか、ペプチド
アルデヒド、β−ラクタム誘導体、ペプチドクロロメチルケトンエポキシド
またはペプチドイソクマリンのようなペプチド誘導体であることができる。
本文に述べるように、本発明は40kDaプロテアソ一ム調節剤に関する。この
40kDaポリペプチドは精製され、ATPに結合してプロテアソームのベブラ
ーダーゼ(分解的)活性を阻害する大きい複合体の一員であることが示されてい
る。
天然に存在する40kDa阻害剤が入手できたのでプロテアソーム阻害に必要な
構造を決定し7、この調節ペプチドの活性領域またはフラグメントを確認し、そ
して新ブpテアソーム阻害剤を設計し、あるいはプロテアソームを阻害する既存
化合物を確認することが可能になった。
マルチパイン阻害剤または1500kDa複合体の他の構成要素の明害剤は筋肉
量減少(たとえば、神経損傷、絶食、感染症またはある種の内分泌障害による)
が起きている個体に投与することができる。筋肉量減少は、そのような状況下で
は、本文に述べるように、今度は主にマルチパインが関与している非すリゾーム
性ATP−ユビキチンー依存性経路の活性化による筋肉蛋白質の加速された分解
の結果であることが示されている。マルチパイン阻害剤またはATP−依存性蛋
白質分解複合体の他の構成要素の阻害剤の投与はこのような状況下には通常的に
起きる強化された蛋白質分解を妨害または削減する。その結果、蛋白質分解は減
少し、筋肉蛋白質減少の程度はその状況下に普通に起きているよりも小い程度で
起きる。マルチパインまたは1500kDa複合体の他の構成要素の阻害方法
よび、その結果、筋肉蛋白質分解の阻害方法は癌、慢性感染症病、発熱および筋
肉不使用および脱神経のような状況下に起き、し5ばしは極度消耗性である各
種の状況下に用い得ることができる。また、この方法はアチドーシスが起きてい
腎障害または肝障害の症例にも有用なのはアミノ酸の発生を削減することで、
罹轡している腎臓または肝臓窒素負荷を軽減できるからである。
図1〜3は500kDaプロテアーゼの精製段階を示す。
図1ウサギ骨格筋の画分11からの抽出物の七ノーQアニオン交換クロマト
ラフィーによる分別結果グラフ表示である。本文に述べるように、ピーク2は
ATP−刺激されたりゾチーム分解の大部分の原因であり、酸化剤で損傷したヘ
グロビンに対して強い活性を持ち、プロテアソームに特性的な基質であるSL
VT−MCAI:対しては殆ど活性を持たないことが示されたので後続する分
析はピーク2に絞った。
図2はピーク2のUb 1281−リゾチーム抱合体分解活性ゲル濾過を用い
分析のグラフ表示である。ここに、標本はATP存在下(ム)または不在下(
△)のUb−I2S■−リゾチームおよびOH/Ch−処理14cmヘモグロ
ン(・)について検定した。使用した分子量標準品ブルーデキストランチロ
グロブリンフェリチンおよびβ−アミラーゼであった。
図3は500kDaプロテアーゼの5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
]00%の結果を示し、これはスペロースカラムからのUb 1251−リゾ
チームを分解する活性のピークを濃縮し、蛋白質25μgを分析したものである

図4はりゾチーム、ユビキチン化リゾチームヘモグロビンおよび酸化剤−損傷
ヘモグロビンの5QQkDaプロテアーゼによる加水分解の相対的速度のグラフ
表示である。
図5はプロテアソームとマルチパインとをMgATPでブレインキュベーション
した後の1300kDa多量酵素複合体形成のグラフ表示である。使用レニ分子
量標準品はブルーデキストラン、ホスホリラーゼキナーゼチログロブリン、フ
ェリチンおよびβ−アミラーゼであった。
図6はマルチパイン、プロテアソームーマルチノ々イン複合体および部分的にす
精製したプロテアソームの5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示
す。
図7はマルチパイン(釦またはプロテアソームとマルチ)<インとのインキュ
ーションで形成された複合体(0) lこよって分解されたUb 12sl−リ
ゾチーム抱合体の酸溶解性125I−生成物のグラフ表示である。分子量標準品
物質P(1347Da) 、ATP (551Da) 、ADP (427D
a)およびアデノシン(267Da)であった。
図8はマルチパインまたはプロテアソームとマルチノ(インとのインキュベーシ
ョンによって形成した複合体によるUb 12fil−リゾチームの分解刺激に
対するATP−依存性のグラフ表示である。
図9は脱神経および正常ヒラメ筋の蛋白質分解に対するATP−枯渇の影響のグ
ラフ表示である。これらのデータは脱神経に続(−次的にはATP−依存性経路
の活性化による総蛋白質分解の増加を示す。値は両坐骨神経を切断したラット
たは無処置正常ラットの双方について最少5匹の平均値±SEMである。土庄類
似の体重(60〜70g)を持つラットにおける坐骨神経切断後および正常筋肉
毎日総計蛋白質分解、上台 蛋白質分解速度に対するATP−枯渇の影響。
上左 悦神経後のエネルギー非依存性蛋白質分解過程および全蛋白質分解にお
ける相対的変化(すなオ〕ち、脱神経筋肉と正常筋肉との間の蛋白質分解平均連
間の差)。下布 脱神紅後の、へTP−依存性過程における相対的変化。
図10はラットの長指伸筋における蛋白質分解に対する絶食および再給餌の影響
のグラフ表示である。左図 給餌または絶食ラットから得た筋肉内での合計蛋白
質分解およびエネルギー非依存性過程を絶食後の異なる時間および再給餌後24
時間に測定した。右図 蛋白質分解のATP−非依存性構成要素。値はラット6
匹の平均値±SEMである。
図11は絶食および絶食−給餌ラットからの筋肉内でのUb−mRNAのノーザ
ブロソト分析結果を示す、給餌ラット(a) 、24時時間量ラソ)(b)、
・18時間(C)、または48時間絶食後24時間再給餌ラッ1−(d)から得
たヒラメ筋から分離した全RNA、/レーンの10μg中のポリUb−mRNA
水準を示す。28Sおよび18SはこれらのリポソームRNAの位置を示す。
図12は実施例6記載のように絶食および絶食−再給餌ラットのヒラメ筋におけ
るドツトプロット分析により測定した全mRNA水準のグラフ表示である。給餌
動物での有!差はp<Q、005、 p<Q、05である。
発明の詳細な記載
本発明は重篤体重減少(たとえば、悪液′li)および負の窒素収支がある状
況または病状で起きている過剰な蛋白質分解の原因である経路の発見およびこの
経路を構成要素の知見に基づき、この経路および異化状況における負の窒素収支
を阻止することを可能にしたものである。
本文に述べるように、蛋白質分解系のどれが脱神経性萎縮症、絶食および他の異
化状況(たとえば、発熱)の間の骨格筋内で蛋白質分解の大きい増加の原因であ
るかを研究するための仕事は絶食または脱神経萎縮における筋肉内の加速された
蛋白質分解の大部分は非すリゾーム性(サイドシル性)ATP−ユビキチンー依
存性蛋白質分解過程の活性化が原因であることを示したが、今迄は一般に構成的
過程(しばしば「基本的蛋白質分解」と呼ばれた)であり、そして異常または寿
命の短い調節ポリペプチドの除去のために一次的な原因であると信じられてきた
。しかし、本文に述べるように、筋肉蛋白質の損失を導き、各種の生理学的およ
び病理学的刺激により引起こされる特別の細胞応答があることが示された。例え
ば、絶食時には筋肉蛋白質分解の強化はグルココルチコイドと低イン/ニリン
要し、発熱性感染症ではインターロイキン−1およびTNFを要する。また、本
文に述べるように、脱神経性萎縮、絶食およびホルモンまたはエンドトキシン
置における筋肉内での非すリゾーム性ATP−依存性過程の活性強化ではユビキ
チンは重要である。
このATP−Ub−依存性経路での多数の段階が筋肉内で絶食および脱神経に影
響されることはあり得るが、本文に述べる研究は、共因子ユビキチンとの共有
合によって分解のために標識される細胞蛋白質を加水分解する大きな(1500
kDa)酵素複合体内の新規律速的な構成要素の単離に至った。ここに述べた
研究は阻害のための鍵となる対象を確認した。記載のように、筋肉内にプロテア
ーゼを確認し、サイドシル性ATP−ユビキチンー依存性蛋白質分解経路で根本
的な役割を演じることが確認され、今では種々の型の筋肉るいそうでは活性化さ
れることが判明した。さらに本文に述べるように、プロテアソームの分解活性の
ポリペプチド性阻害剤も確認されている。
本発明は萎縮筋肉に起こり、ユビキチンが重要な役割を演じる非すリゾーム性A
TP要求性過程の活性化に起因することが知られている加速または強化された蛋
白質分解の阻止(削減または予防)方法に関する。この方法では、加速された蛋
白質分解はATP−Ub−依存性経路を−またはそれ以上の可能性がある段階(
たとえば、蛋白質のユビキチン抱合の削減により、UCDEN活性の阻害により
、またはその構成要素の一つの活性の阻害により、新規プロテアーゼであるマル
チパインや天然阻害剤のようなもの)で阻害することによって阻止される。
本発明はまた筋肉内における機能のためにATP加水分解を必要とし、種々の型
の筋肉るいそう時に活性化されるサイドシル性ATP−ユビキチンー依存性蛋白
分解性経路に根本的役割を持つプロテアーゼの発見に関する。「マルチパイン
」と呼ばれるこの蛋白質分解酵素は500kDaの多量体であり、あるいはパパ
イン族プロテアーゼに関連するチオールプロテアーゼであると思われる蛋白質複
合体である。これは6個またはそれ以上の高分子量サブユニット(大きさ50〜
130kDa)を含み、ユビキチンー抱合蛋白質を優先的にATP−依存性反応
によって分解することが示されている。本文に述べる種々の観察も、このプロテ
アーゼはユビキチンに抱合した蛋白質の認識および分解において律速成分である
ことを示す。マルチパインは多重ユビキチン鎖イソペプチダーゼ活性によっ
解重合する性能も持っている。これはスルフヒドリル基閉塞剤であるシスタチ
ンおよび関連するポリペプチドおよびペプチドクロロメチルケトンには感受性
あるが、リュウペプチン、E−64またはセリンプロテアーゼ阻害剤には感受性
がない。ATPの存在下にマルチパインはプロテアソームと11種合体を形成す
るが、複合体形成シスタチンによって阻害される。
それで、ATP−ユビキチンー依存性経路の阻害は異化段階における負の窒素収
支を処置するための新規な方法である。これは、例えば、この新たに発見された
蛋白質分解酵素の阻害剤の使用が起きている筋肉量減少の削減に至ることによっ
て達成される。このような阻害剤は筋肉細胞以外の細胞型でのサイドシル性AT
P−ユビキチンー依存性蛋白質分解系の活性を削減するときにも用いることもで
きる。過剰な蛋白質損失は敗血症火傷外傷、多(の癌、慢性または全身性
染症、筋萎縮症、アチドーンスまたはをまたは神経損傷のような神経運動変成
病を持つ人を含む多くの型の患者に共通している。それはまた、副腎皮質ステロ
イド投与を受けている人、食事摂取が減少および/または吸収が傷つけられてい
る人にも起きる。その上、蛋白質分解経路の阻害は多分、動物(たとえば、しば
しばで重篤な体重減少を起こす「輸送熱」の処置のために)で有用である

以下はこの状況下にある筋肉内での加速された蛋白質分解は主に非すリゾーム性
ATP−要求性過程の活性化が原因であることの知見に至る研究;プロテアーゼ
であるマルチパインの単離と特性解析;蛋白質分解におけるその機能;プロテア
ソームに対する250kDaの天然に存在する阻害剤の単離と特性解析;マルチ
パイン阻害剤の確認方法およびこの方法で確認された阻害剤およびマルチパイン
の阻害方法およびその筋肉分解への効果の記載である。
特に実施例3〜5など、本文に述べるように、脱神経や絶食に伴う骨格筋の萎縮
により明白に加速された蛋白質分解が非すリゾーム性ATP依存性またはエネル
ギー非依存性分解系によって触媒されるかどうかの評価を行った。この研究は非
すリゾーム性ATP=依存性経路と筋肉るいそうの間の関連を明確に証明した。
本文に述べるように、各種異化状況(たとえば、脱神経、絶食、発熱、成る種の
内分泌障害または代謝性アチドーシス)下では筋肉るいそうは一次的に蛋白質分
解の加速および、加えるに、蛋白質分解の増加は以前は異常蛋白質および寿命の
短い成る種の酵素の迅速な除去においてのみ役立つと信じられていた、サイド
ル牲ATP−ユビキチンー依存性蛋白質分解系の活性化に起因することが示され
た。異化段階での加速された蛋白質分解の原因がこの経路であることの発見はイ
ンキュベートした筋肉で種々の蛋白質分解経路を阻止するかまたは選択的に測定
した研究、およびこの経路の構成要素(たとえば、ユビキチンおよびプロテアソ
ムサブユニット)のためのmRNA増加および萎縮筋肉でのユビキチンー蛋白
質抱合体の濃度増加の知見に基づいている。本文に述べるように、これらの異化
状況(たとえば、不使用、萎縮、敗血症、発熱と筋肉萎縮模倣であるエンドト
シン処理)をよく模倣する単純な動物モデルが開発され、また試験管内インキ
ュベーションの間に筋肉での蛋白質分解速度を精密に測定する方法ができた。
正常な骨格細胞中のATPを殆ど完全に除いて試験管内でインキュベートした時
、蛋白質分解は約40〜70%減少した結果が示された。ATP−依存性(非す
リゾーム性)蛋白質分解過程は対照である対側性筋肉に見られる全蛋白質分解か
残余のATP依存性過程を減じれば特定的かつ再現的に測定されることが発見
された。ヒラメ筋の脱神経後1および3日以内に、このATP−依存性過程は5
0〜250%増加したが、残余の(エネルギー非依存性)過程は変化しなかった
。このATP−依存性、非すリゾーム性過程は、アクチンの迅速な分解(3−メ
チルヒスチジン生産の増加で示されるように)を含む脱神経萎縮の間の蛋白質分
解の増加のすべての原因である。この反応は絶食時に強化された蛋白質分解の大
部分の原因である。
食餌を止めた後、筋肉内のATP−依存性蛋白質分解は選択的に150〜350
%増加した。再給餌後に、この過程は1日以内に対照値に戻った。加えるに、絶
食ウサギからの筋肉抽出物中では、内因性蛋白質および14C−カゼインのAT
P−依存性分解は給餌動物からの抽出物におけるよりも約2倍速かった。同様に
、エノドキンン(LPS)の注射をモデルとする敗血症でも筋肉内のATP−
依存性蛋白質分解の選択的増加が起きた。
本文に示すように、筋肉でのATP−依存性過程の増加は細胞の特異的な応答
あり、種々の異化状況で活性化され、萎縮筋肉での加速された蛋白質分解の大部
分の原因であると思われる。ATP−要求性分解系に影響する状況は脱神経萎縮
、絶食、発熱、成る種の内分泌障害およびアチドーシスを含む。
絶食時および脱神経萎縮筋肉内のATP−ユビキチンー依存性の系の活性化前
のように1.A T P−依存性蛋白質分解過程の活性化は絶食および脱神経萎
縮の間の骨格筋内で増加した蛋白質分解の大部分の原因であると思われる。この
過程はATP−ユビキチンー依存性経路の活性化を含むであろうから、萎縮筋肉
内のユビキチン(Ub)のためのmRNA濃度およびUb−蛋白質含量を測定し
た(実施例6参照)。ラットの食事を1日除いた後、2種のポリュビキチン転写
物(2,4および1.3kDa)の水準における2〜4倍の増加はヒラメ筋およ
び長指伸筋に見られたが、全RNAおよび全mRNA含量は50%減少した。ヒ
ラメ筋を脱神経後、1日以内にポリUb−mRNAの2〜3倍の増加も起きたが
RNA含量は減少した。絶食または脱神経によるUb−mRNAの増加にはこ
れらの筋肉内でユビキチン全含量の60〜90%上昇を伴った。絶食動物を再給
すると、Ub−mRNA水準は1日以内に対照の水準に戻った。
プロテアーゼ・マルチパインの単離と特性解析前記のように、真核細胞では多く
の蛋白質の分解はそれらのATP−要求性過程による小さいポリペプチドである
ユビキチンへの抱合を含む。UCDEN (Ub−抱合体分解酵素またはメガ
イン)はユビキチン化蛋白質を分解する。UCDENの正確な性質は不明確であ
るが、エネルギー枯渇網状赤血球の抽出物の中ではCF−1、CF−2およびC
F−3と呼ばれる構成要素3種のATP−依存性の会合によって1000〜15
00kDa (26S)複合体が形成されていることが示されている。(Gan
oth、D、など、J、Biol、Chem、。
263 :12412〜12419 (1988))。前に討議したプロテアソ
ームはUCDENの構成要素の一つ(CF−3)であることが示されている。(
Eytan、E、など、Proc、Natl、Acad、Sci、USA、86
:775107755 (1989);Driscoll、J、およびA、 L
、 Goldberg、J、Biol、Chem、 、265+4789〜47
92 (1990))。しかし、他の二つの構成要素は性質も機能も未だに不明
である。
マルチパインの性質の要約
下記のように、骨格筋内に新型のプロテアーゼが確認され、UCDEN複合体の
一部であることが判明した。この新プロテアーゼ、マルチパインは、プロテアソ
ームと約1500kDaの複合体を形成し、UCDENのCF−1構成要素の活
性型の一つに対応すると思われる。プロテアソームとは異なり、マルチパインは
a)それ自体がATP−依存性過程においてユビキチン化蛋白質を分解し、また
、N−サクニルーLeu−Leu−Va ]−]Tyr−7−アミノー4−メ
チルクマリンLLVT−MCA)およびカゼインのような典型的なプロテアソ
ームの基質に対しては殆どまたは全く活性を持たない;b)シスタチンA(パパ
イン様酵素の阻害剤)および成る種の低分子量阻害剤(たとえば、ヘミンまたは
成る種のペプチドクロロメチルケトン)には感受性であるが、セリンプロテアー
ゼ阻害剤(たとえば、ジイソプロピルフルオロホスフェート)には非感受性であ
るので、チオールプロテアーゼであると思われる;C)抗プロテアソーム抗体と
は反応しない;およびd)主なサブユニット(50〜150kDa)少なくとも
6個の組を含むが、プロテアソームにある特徴的な20〜30kDaのサブユニ
ットは含まない。
この新プロテアーゼはユビキチン化蛋白質(ユビキチン化リゾチーム)を分解す
るよりは低速であるが、ATP−依存性過程によって非ユビキチン化蛋白質(た
とえば、リゾチーム)も分解し、また酸化剤−損傷ヘモグロビンもATP−依存
性機構によって分解することが示されている。この新プロテアーゼは鍵となるサ
イドシル性(非リソシーム性)蛋白質分解経路で重要な役割を果たし、ユビキチ
ン化蛋白質のATP−依存性分解においてプロテアソーム(UCDENと同様な
大きさの複合体の構成要素として)と相乗的に機能することが示されている。大
きい複合体の中で、マルチパインはユビキチンー抱合蛋白質の最初の分解を触媒
すると思われる。総括すると、ここに示した知見はマルチパインはユビキチン抱
合蛋白質の認識と分解における律速構成要素であることを示す。
マルチパインの精製
実施例1に詳記するように、新プロテアーゼは哺乳類の骨格筋から得られている
。要約すれば、筋肉を入手し、実施例1に記載のように処理し、tub−蛋白質
抱合体分解活性を含む両分を単離した。活性を含む画分をクロマトグラフィー
よりさらにUb−蛋白@ (Ub−”I−リゾチーム)−分解活性を持つピーク
2個に分離した。ピーク2はユビキチン化リゾチームのATP−に刺激される分
解の大部分の原因であり、酸化剤−損傷ヘモグロビンに対して強い活性を持つが
、プロテアソームの特徴的な基質であるN−サクシニル−Leu−Leu−Va
 1−Try−7−アミノ−4−メチルクマリン(sLLVT−MCA)に対し
て活性を持たないことが示された(図1)。活性はさらに精製して分子量約44
0000の活性な単一ピークを得た。これは見かけの分子量540kDaを持つ

マルチパインの特性解析
この精製プロテアーゼの特性解析は、これが主サブユニットバンド(Mr値40
000−150000)少なくとも6個の組合せであり、プロテアソームの特徴
的な20〜30kDaのバンドはどれも含まないことを示した。
このプロテアーゼの触媒的性質を評価した(実施例1)。Ub−リゾチームの加
水分解はATPの添加で5倍に刺激され、リゾチームの分解は3倍に刺激された
。対照的に、このプロテアーゼによる天然および酸化剤−損傷ヘモグロビンのこ
のプロテアーゼによる分解はATPには非依存性であった。酸化剤−損傷ヘモグ
ビンは天然ヘモグロビンよりも15倍速く分解された。
このプロテアーゼはまたユビキチン化基質(非ユビキチン化基質と対比して)に
明瞭な優先性を持つことが示された。反対に、プロテアソームはUb−抱合体に
対してはあるとしても極(僅かな活性を示した。このプロテアーゼがUb抱合体
を分解する蛋白質分解反応の性質はUbj2fii−リゾチームから発生した酸
可溶性生成物の大きさを測定することで評価した。この評価はこのプロテアーゼ
エンドペプチダーゼであり、エキソペプチダーゼ活性を欠(と思われることを
示した。
この新プロテアーゼがプロテアソームと共通の構成要素を共有するとの可能性は
ヒト肝粒子に対するモノクロナール抗体(表11 ;Mat thews、W、
など、Proc、Nat 1.Acad、Sc i、USA、86 : 259
7〜2601 (1989)’)およびラット肝プロテアソームに対するポリク
ナール抗体を用いて研究した(実施例1)。これらの処理は新プロテアーゼと
プロテアソームの間には交差活性がないことを証明した。交差活性の欠如ウェ
スターンプロット分析により確認した:2種の抗体は新プロテアーゼとは反応し
なかった。
酵素阻害剤のマルチパインへの影響
この新プロテアーゼに対する種々の型の酵素阻害剤の効果も実施例1に記載する
ように検討した。結果を表Iに示す。不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤である
ジイソプロピルフルオロホスフェート(D F P)は抱合体分解には影響しな
かった。重金属キレートするO−フェナントロリンは幾分かの阻害を示した。
対照的に、チオール閉塞剤であるN−エチルマレイミド(NEM)および多数の
パパイン様チオールプロテアーゼの強力な阻害剤である卵白シスタチン(シスタ
チンA)はこの活性を強く阻害した。同様な濃度で、シスタチンB(ステフィン
B)は55%阻害を示し、シスタチンCでは有意な効果を示さなかった。それで
この新活性はチオールプロテアーゼであると思われるが、共に多数のチオールプ
ロテアーゼ(たとえば、リソソームの酵素またはカルパイン類)の阻害剤である
リューベプチンの存在下では30%のみが阻害され、E64では全(阻害されな
かった。しかし、リューベブチンおよびE64に対する感受性は定着結合に先行
する配列に強く影響され、感受性であるのはチオールプロテアーゼ全てではない
。ATP−Ub−依存性蛋白質分解系およびプロテアソームを完全に阻害できる
ヘミンはこの新プロテアーゼによる抱合体分解活性も阻害した。
これらの結果は、この新酵素がその活性部位チオール基を持つことを示唆する
。有効な阻害剤のパターンは活性化されたときセリンプロテアーゼとして働く多
重の触媒部位があるプロテアソームからこの新酵素の活性を明瞭に区別する。
+25I−リゾチーム(非−Ub)および酸化剤−損傷ヘモグロビンの新プロテ
アーゼによる分解への異なる阻害剤の効果はL7b−リゾチームと同様な結果を
示した。
これは単一な型の活性部位がこの異なる型の蛋白質の加水分解に包含されている
ことを示唆する。
ユビキチン化および非ユビキチン化蛋白質がこの新プロテアーゼの同じ部位に結
合するかどうかの評価を行った(実施例1)。結果はりゾチーム、ヘモグロビン
および酸化剤−処理ヘモグロビンの間に競合を示さなかった(すなわち、これら
の基質はどれも[Jb 1251−リゾチームの分解を削減しなかった)。これ
はこの新プロテアーゼがユビキチン化および非ユビキチン化蛋白質基質双方を認
識する特異的結合領域を持つことを示唆する。
マルチパイン−プロテアソーム複合体
この新プロテアーゼと十分に精製したプロテアソームは両者をATPとMg2+
の存在下にインキュベートした時に1500kDaの複合体を形成することが示
された。得られた複合体はユビキチン化リゾチームを分解し、そのUb−抱合体
−分解活性は抗プロテアソーム抗体との免疫沈降によって阻害されることが示さ
れた。
マルチパインとプロテアソームの間で試験管内で形成された複合体は1500k
DaのUb−抱合体分解酵素または以前に網状赤血球および筋肉から単離した2
6S蛋白質分解複合体UCDENに極めて類似もしくは同一であると思われる。
これらの構造は似た大きさであり、不安定であり、そして同じヌクレオチドで活
性化される。これらは同じ基質(Ub−リゾチーム抱合体、カゼインおよびフル
オロメトリックペプチド)を分解し、同じ群の阻害剤に感受性である。ここに記
載した複合体は、以前に単離したものと同様に、特徴的な20〜30kDaプロ
テアソームサブユニツトおよびマルチパインに見出される大きいポリペプチド6
個を含む多数のより大きいサブユニットを含む。ここに形成した複合体は40〜
150kDaのポリペプチドを少なくとも10〜12個を含む(図2)。
各種の観察(実施例2)はプロテアソームとマルチパインはこの複合体中に等量
存在することを示唆する。本文に述べる事実はまたプロテアソームとマルチパイ
ンはユビキチン化蛋白質のATP−依存性分解においては相乗的に機能すること
を示す。例えば実施例2に記載するように、マルチパイン単独でUb I!8i
−リゾチームを分解する時に、約11残基のペプチド1種だけが126■−生成
物である。しかし、プロテアソーム−マルチパイン抱合体はこの基質をより迅速
に分解しく実施例2)、約3および5残基のさらに小さい+u■−ペプチドのみ
を発生した。
実施例7に記載するように、プロテアソームの蛋白質分解活性を阻害する40k
Daのプロテアソーム調節ポリペプチドが網状赤血球から精製され、その放出が
蛋白質分解を活性化すると思われるATP−結合蛋白質であることが示された。
単離された阻害剤は250kDaの多重体として存在し非常に不安定(42℃で
)ある。それはATPまたは非加水分解性ATP類似体の添加で安定化されるが
、精製された阻害剤はプロテアソーム機能の阻害にはATPを必要とせず、AT
P−アーゼ活性も持たない。この阻害剤は1500kDaの蛋白質分解複合体の
必須の構成要素に対応することが示されている。網状赤血球からATPを除くと
、1500kDaのUCDENは見出されない。代わりにGanothなどはC
F=1、CF−2およびCF−3と名付けた構成要素3個を確認した。本文に記
載する単離した阻害剤は多くの点からCF−2と同一と思われる。これらの知見
はこの阻害剤がUCDEN複合体のATP−依存性機構において一つの役割を演
じているとの考え方を示す。例えば、蛋白質分解の間に1500kDa複合体の
ATP加水分解中に40kDa阻害剤を機能的に放出して一時的にプロテアソー
ムの活性を表すことおよびユビキチン化蛋白質がこの機構を開始する可能性があ
る。
精製された因子は実施例7に記載するようにフルオロゲンテトラペプチドおよ
び蛋白質基質の双方のプロテアソームによる加水分解を阻止することが示されて
いる。この阻害剤、プロテアソームおよび部分的に精製したCF−1をATPと
M g2−の存在下に混合した時に、1500kDaの複合体は再構築されてU
b125■−リゾチームの分解が起きた。
プロテアソームの多重ペプチダーゼ活性へのこの阻害剤の単離は薬理学介入
魅力ある部位を与えた。続いて記載するように、これはその構造的および機能的
特徴を評価すればプロテアソーム阻害剤を開発するのに有用な情報を得ることの
できる天然阻害剤を提供する。
本発明の使用
この発見は構成的過程(しばしば「基礎的蛋白質分解」とよばれる)として主に
異常または寿命の短い調節ポリペプチドの除去の役目をすると信じられている溶
解性ATP−Ub−依存性経路の生理学的役割に関する現在法がっている見解
変更するものである。ここに初めて示すように多くの病状や状況に特徴的に見ら
れる体重の減少および負の窒素収支はこの経路を経る加速されたまたは過剰な蛋
白質分解の結果である。脱神経、絶食、発熱または代謝性アチドーシスの際に起
きる筋肉るいそうは主にこの加速された蛋白質分解による。原因となる経路と鍵
となる構成要素(たとえば、マルチパインおよび天然プロテアソーム調節剤)が
確認されたので、今では加速された蛋白質分解、従って、体重減少と負の窒素収
支を減少または除くことが可能である。ATP−Ub−依存性経路における多重
の段階は筋肉内では絶食および脱神経により影響されるかも知れないが、調節の
一つの明瞭な点は実施例6に示すようにUb−mRNAの製造速度である。加え
るに、筋肉蛋白質とユビキチンとの抱合の増加はこれらの状況下に認められてい
る。
この知見はこの蛋白質分解過程を削減し、それで各種の型の癌およびエイズ、発
熱性感染症、脱神経萎縮(不活用化および不使用)、ステロイド療法および外科
手術を含む疾病に伴う悪液質のような状況における負の窒素収支および筋肉るい
そうを処置するための効果的な方法の基礎とすることができる。これは激しく
耗性で個人治癒能力を激しく損ない得るそのような病気または状況の特徴を逆
転するか回避するために有用であることができる。殊に、ATP−Ub−依存性
経路の部分的な阻止は処置への一方法である。これで多数の生理学的および病理
学的状況に起きる加速された蛋白質分解の削減(全部または一部)に至るが、こ
の過程を経て行われる正常な分解過程には影響しない。
本文に述べる研究の結果、マルチパインは入手でき、種々の型の筋肉るいそうで
は活性化されることが明らかなサイドシールの蛋白質分解経路において決定的な
役割を演じることが示された。本発明の精製マルチパインを入手できたので、既
知方法を用いてこの酵素の活性部位または蛋白質分解サブユニットの決定を可能
にした。例えば、蛋白質分解はシスタチンにより阻止されるので(K i < 
1 uM)ので、活性サブユニットアフィニティークロマトグラフィーには、
パパインで行われたように、ニワトリシスタチンをリガンドとして用いることが
できる。
他に +257−標識シスタチンとマルチパインとのジエチルスペルイミデート
のような二官能性試薬を用いる交差結合はシスタチン−結合の構成要素の標識を
可能にするであろう。さらに、放射性ペプチドクロロメチルケトン(CK類)は
活性部位を共有結合で標識するのに用いることができる。加えるに、これらの阻
害剤を12s1で化学的目印をつけるための方法も発展させた。閉鎖CBZ基
をCBZ−A ] a−A r g−A r g−MNAから除去し、125J
ポルトンハンター試薬と反応させてこの阻害剤を高比活性に標識できること
を見出した。マルチパインの活性部位は標識できる。一度、活性サブユニットが
確認されると、以下に述べるように決定的なポリペプチドをクローンできる。
他のマルチパインサブユニットの機能も決定できる。例えば、ATP結合サブユ
ニット(多分、ATP−アーゼであろう)の機能を決定するのは興味深く、また
ポリュヒキチン鎖を解重合して遊離のユビキチンを再生するイソペプチダーゼ
性を司るサブユニットの確認は興味深い。一度活性部位またはサブユニットが確
認されると、これを結晶化し、結晶構造特性値(coordinates)を
用いて合理的なドラッグデザインの基礎とすることができる。例えば、活性サブ
ユニットをシスタチンAのような既知の阻害剤との複合体として結晶化させ、相
互作用に関する情報を得、これを「シスタチン様」物質シスタチン類似体であ
る物質)またはマルチパイン活性部位に結合してマルチパインが個々にまたは形
成複合体の一員として作用を予防する他のマルチパイン阻害剤の設計に用いるこ
とができる。阻害剤は、例えば、ペプチドまたはペプチド様の分子(たとえば、
ペプチドアルデヒド、ペプチドクロロメチルケトンまたはペプチドイソクマリン
)であり得る。マルチパイン活性部位構造の知識はマルチパインが重要な一員で
あり、その活性化が、ここで最初に示したように、絶食、脱神経および感染症の
間に骨格筋に起きる蛋白質分解増加の大部分を占めるATP−依存性蛋白質分解
過程を妨害するために用いることのできる薬品を設計できるようにするであろう

マルチパインの構成要素である特定のサブユニットまたはポリペプチドと特異的
相互作用する阻害剤も造ることができる。
精製されたマルチパインはまたペプチド配列の情報を得てオリゴヌクレオチド
ローブの製造に用い、次にこれをヒトおよび他の哺乳類のcDNAライブラリー
からマルチパインをクローンするために用いることができる。精製マルチパイン
の一部のアミノ酸配列は既知の方法(たとえば、Sambrook、J、など、
Mo1ecular−Cloning;a−LabortoryjManual
、第2刊、ColdSpring−Harbor−Laboratory4’r
ess、1989)および推論されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを
用いて得ることができる。推論された配列を持つオリゴヌクレオチドは公知方法
(たとえば、Sambrook、J、など、Molecular−Clonin
g;a争Labortor)zManual、第2刊、Co1d争Spring
・Harbor−Laboratory−Presss 1989)を用いて製
造され、プローブハイブリダイズする配列をヒトまたは他の哺乳類のcDNA
ライブラリーに探索するために用いることができる。ライブラリーから得たcD
NA配列は次に適当なベクター(たとえば、pBR322、pUc)に挿入し、
適当な宿主(たとえば、大腸菌に12)で発現して組換え一製造したマルチパイ
ンまたはマルチパイン構成要素に至る。この方法で製造したマルチパン同一性
は公知技術(たとえば、物理的性質、精製マルチパインと反応することが公知の
抗体との反応、プロテアソームとの複合体形成能)で証明できる。
大腸菌でのクローン化遺伝子の発現はマルチパインの蛋白質分解サブユニットの
利用価値を増すために有用である。蛋白質分解サブユニットを活性型で得るのは
望ましいが、マルチパインの他のサブユニットはその正しい折りたたみと安定性
のために必要でありうる。このサブユニットを多量に入手できれば、これをそれ
自身としてまたはシスタチンとの複合体として結晶化できるであろう。得られる
結晶はX線回折分析を行い、結晶構造の情報を新薬またはマルチパインを阻害で
きる既存薬品を選ぶために用いることができる。
マルチパイン遺伝子の配列を決定し、そのヌクレオチド配列に基づ(オリゴヌク
レオチドプローブ(マルチパイン遺伝子を確認しまたはハイブリダイズする遺伝
子)を他の哺乳類並びに他の型の細胞中の同様な遺伝子の確認に用いることがで
きる。本文中で用いる用語マルチパイン遺伝子とは前記のように製造した精製マ
ルチパインをコードするDNA、マルチパインサブユニットをコードするDNA
、上記のようにして得られた精製マルチパインと実質的に同一の活性と機能的性
質を持つ蛋白質またはポリペプチドをコードするDNAおよびマルチパイン遺伝
子に基づくオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするDNAを含むこと
が意図されている。
マルチパインと反応するか認識する抗体は公知方法を用いて製造でき、本発明の
対象でもある。ポリクロナール血清は適当な動物宿主(たとえば、ウサギ、マウ
ス、サル)に精製または組換え一製造マルチパインを1回またはそれ以上注射し
、抗体生産が起きるために適当な時間後にその動物から血液を得る。モノクロ
ール抗体はKoh I e rとMilsteinの技術のような公知技術を用
いて製造できる。どちらの方法で製造した抗体も他の組織および他の動物におけ
るマルチパインまたはサブユニットを確認するために用いることができる。
本文に述べるように、ATP−依存性蛋白質分解(たとえば、萎縮筋肉、絶食)
が強化されている状況下にはUb−mRNA水準(すなわち、ポリUb遺伝子が
特異的に誘導される)が増加する。この濃度は強化された分解が逆転した時(た
とえば、再給餌)には正常に戻る。適当なオリゴヌクレオチドプローブを構築
てUb−mRNAを検出し、また正常量より多く存在するかどうか決定すること
もできる。これを加速された蛋白質分解の指標として用いることができる。
マルチパイン遺伝子が発現している細胞(たとえば、それが発現している細胞系
)を阻害剤の検定に用いることができる。また、精製マルチパインまたは組換え
一製造マルチパインは阻害剤の検定に用いることができる。潜在的マルチパイン
阻害剤のスクリーニングには潜在的阻害剤がプロテアーゼの活性を妨害する性能
を測定して実施する二とができる。例えば、潜在的阻害剤をこのプロテアーゼが
ユビキチンー蛋白質抱合体を分解するのに適当な条件下にマルチパイン、ユビキ
チン化蛋白質基質(たとえばユビキチン化リゾチーム)、ATPおよびMg!+
と混合する。潜在的阻害剤を除いて同じ成分を含む対照を比較の目的で用いる。
阻害剤は抱合体の分解を減らす性能によって特性解析する。微生物培養液も同
様にマルチパインの抗生物質阻害剤の検定に用いることもできる。
マルチパイン阻害剤ならびにプロテアソーム阻害剤とUCDEN阻害剤は絶食、
脱神経または不使用(不活動)、ステロイド療法、発熱性感染症および他の状況
下に起きる蛋白質分解の増加原因の大部分であることが示されている非すリゾー
ム性ATP−依存性蛋白質分解を(完全にまたは部分的に)削減するために用い
ることができる。本文に述べるように、シスタチンは多重性阻害剤であって個別
的にまたは700kDaのプロテアソームと共に1500kDaの複合体の一部
としてマルチパインの機能を妨げるために用いることができる。シスタチン類似
体またはマルチパインおよび/または複合体の形成を妨げる分子も使うことがで
きる。
低分子量プロテアーゼ阻害剤をそれらのマルチパインを阻害する性能またはそれ
がマルチパインを阻害するように修飾するための評価をすることができる。例え
ば、E−64とその誘導体は大部分のチオールプロテアーゼの強力な阻害剤であ
る。しかし、それらはマルチパインを阻害できない。E−64の多数の新類似体
と誘導体を合成しこれら、ならびに本研究に基いて設計した別の誘導体も、マル
チパインを阻害する性能について検定することもできる。各種ペプチドクロロメ
ルケトン類(CK類)は不可逆的にセリンおよびチオールプロテアーゼ双方に
おける活性部位のヒスチジンと反応する。成る種のトリペプチドCK類(たとえ
ばCBZ−a I a−a r g−a r g−CK)はマルチパインおよび
1500kDaの複合体を比較的低濃度(50uM)で不活化することが示され
た。このような試薬はペプチド配列を検討して非常に特異化することができるの
で、マルチパイン阻害能を評価した。評価できる他の化合物はチオールプロテア
ーゼの選択的阻害剤であるペプチドジアゾメタン複素環阻害剤であるイソクマ
リンおよび種々の合成β−ラクタムを含む。予備的データはこれらの化合物のあ
るものは1500kDaのATP−依存性複合体を阻害できることを示唆してい
る。
潜在的なマルチパイン阻害剤として特に興味があるものはシスタチンおよびシス
タチンスーパーファミリー構成員(ステフィンAおよびB1シスタチンc1キ
ニノーゲン)である。そのパパインとの複合体中での三次元構造およびクローン
化ヒトシスタチンAの部位指向突然変異誘発に関する情報はマルチパインの蛋白
質分解サブユニットの性質、機構および構造さえも決定する価値ある根拠であろ
う。
1500kDaの蛋白質分解複合体に対して効果的なことが判明した阻害剤のあ
るものが無処置細胞で蛋白質分解を選択的に阻害することができるかどうかを決
定する必要があろう。これは以下のようにして行う:第一に、筋肉の粗製抽出物
を用いて阻害剤がATP−ユビキチンー依存性経路全体遮断する性能をテスト
する。この研究にはモデル放射性基質と出現した遊離チロシンを測定することで
分解を容易に追跡できる内因性細胞蛋白質を用いることができる。1. C,K
ettelhutなど、Diabetes/Metab、、Rev、、4.75
1〜772 (1988)、M、Ti5chlerなど、J、B i o 1.
Ch em、 、257.1613〜1621 (1982)。有望な試薬は次
に無処置ラット筋肉と培養細胞についてテストして細胞間蛋白質分解に対する効
果、哺乳類細胞への浸透能、および細胞のパイアビリティ−に対する効果を評価
する。
医薬の候補をATP−ユビキチンー依存性分解過程を阻害する性能についてテス
トすることは殊に有用な方法はユビキチン依存性で分解する寿命の短い蛋白質が
生産される培養細胞中で行うものである。この過程の阻害はサイドシルに蛋白質
蓄積をもたらす。サイドシルに蛋白質が蓄積する程度は公知方法を用いて測定
できる。例えば、この過程の潜在的な阻害剤を寿命の短い蛋白質を生産する培養
細胞に導入し、潜在的阻害剤の存在下にサイドシルに存在する酵素量の範囲を不
在下での範囲と比較する。潜在的な阻害剤存在下の酵素蓄積は被検潜在的阻害剤
によるATP−ユビキチンー依存性過程の阻害の指標である。分解がユビキチン
ー依存性である寿命の短い蛋白質(たとえば、異常なアミノ端を持ちこれが迅速
エビキチン−依存性分解を示す突然変異β−ガラクトシダーゼのような寿命の
短い酵素)をコードする遺伝子を安定的にトランスフオームしたCO8細胞のよ
うな培養細胞はこの目的に利用できる。例えば、半減期が約15分で、エビキチ
ン−依存性分解を示す大腸菌から得た突然変異または組換え型β−ガラクトンダ
ーゼをコードする遺伝子で安定的にトランスフオームしたCO8細胞を用いるこ
とができる(Bachma i r、A、など、Sc 1ence、234.1
79〜186 (1986);Gonda、D、に、など、J、Biol、Ch
em、 、264 +16700〜16712 (1989)’)。迅速に分解
される他の突然変異型酵素も使うことができる。この過程を阻害する性能を評価
すべき物質(潜在的阻害剤)の存在下の突然変異β−ガラクトシダーゼのCOS
サイドシルへの蓄積はこの過程の阻害の指標である。適切な対照は潜在的阻害剤
不在下同一条件下のCO8細胞である。この方法は微生物培養物または化学標本
から効果的阻害剤をめるスクリーニングに用いることができる。
蛋白質合成を遮断する物質を細胞に加えると酵素活性抗原(蛋白質)が同様な
迅速さで消滅し、蛋白質分解への潜在的阻害剤の作用を確かめることを可能にす
る。細胞成育、ATP含量および蛋白質合成の測定は高閲に有毒な物質を確認(
または排除)するが、これは細胞からATPを除(試薬は蛋白質分解の潜在的阻
害剤であると思われるので有用である。
阻害剤処置細胞ではパルスチェイス同位元素法を用いるのが内因性の寿命の短い
蛋白質および寿命の長い蛋白質、特に寿命の長いもの、特にユビキチン依存性経
路によって分解されると知られているもの(たとえば、オンコゲン生成物myC
またはfos)の分解速度を追跡するのに有益であろう。
効果のあった阻害剤は次に試験管内でインキュベートしたラットでテストする。
この実験では、一方の脚のヒラメ筋または長指伸筋を阻害剤とインキュベートし
、一方、反対側の同じ筋肉を対照に用いる。この方式の大きな利点は感度が高く
、安価で、動物の同位元素標識が不要な点にある。1.C,Kettelbut
など、Diabetes/Metab、、Rev、 、4: 751〜772 
(1988) 、K、Furunoなど、J、Biol、Chem、 、265
:8550〜8557 (1990)。経験では動物6匹で総蛋白質分解または
合成における10〜15%位の統計的に有意な変化を証明することは容易である
。これは筋肉蛋白質の平均代謝回転時間から計算でき、この大きさの蛋白質分解
の大きさの変化でも治療的利益があろう;もし2週間維持すれば、蛋白質分解の
削減15%はそれ自体で脱神経筋肉の重量を少な(とも倍加するに至る。また、
筋肉重量の60%を占め、主な生物内置白質貯蔵を代表する筋原繊維蛋白質分解
への阻害剤の効果を追跡するのも興味がある。これらの蛋白質は脱神経または絶
食で差別的に喪失する。K、Furunoなど、J、Biol、Chem、 、
265:8550〜8557 (1990)。筋原繊維の構成要素の分解は筋肉
蛋白質からの3−メチルヒスチジンの放出を測定して特異的に追跡でき、これは
アクチン分解のための特異的な検定法である。K、Furunoなど、J、Bi
ol、Chem、、265 :8550〜8557 (1990): B、B、
Lowe ] ]など、Bi。
chem、J、234 (1986)。脱神経(不使用)で萎縮進行中または絶
食またはエンドトキシン処置(発熱)動物からの筋肉をこのように研究すること
は特に重要である。このような組織では総蛋白質分解は強化され、人の病気によ
く似ているがよく制御された試験管内条件下で研究できる。このような標本での
効果の証明は医薬の開発過程を大いに加速するであろう。
蛋白質分解過程の阻害は筋肉るいそうが起き、背景状況を悪化させ、患者をさら
衰弱させている広範な状況に有用であろう。この状況は癌、エイズ、外科手術
または外傷後の筋肉るいそう(個体または骨格の運動不足)、感染症、あらゆる
原因による悪液質、副腎ステロイド処置および窒素収支を活性化するかまたは負
に至らせる状況を含む。
マルチパイン阻害剤は動物に起きる重量損失対処するためにまたは成長促進剤
として作用させるために投与できる。蛋白質分解を阻害するように働くので、全
蛋白質蓄積を促進し、成長促進における蛋白質合成をより効率的にする。例えば
、それらを動物に投与してや牛を輸送する時のように固定するか監禁する時に
起きる輸送熱と呼ばれる筋肉量の流行病的な損失(全蛋白質分解)を防ぐ。
本発明のマルチパイン阻害剤は種々の経路(たとえば、静脈内、皮下、筋肉内)
で投与でき、一般に生理学的に許容し得る担体(たとえば、生理食塩水)と組合
わせて投与されよう。投与すべきマルチパイン阻害剤の量は実験的に決め、また
、用いる特定の阻害剤、個体の状況および個体の大きさおよび重量のようなもの
への考慮に基づくであろう。それらは単独にまたは他のマルチパイン阻害剤また
は筋肉量の損失の原因である他の経路(たとえば、リゾソーム性またはCa”+
依存性経路)の阻害剤と組合わせて投与することもできる。
本発明を以下の実施例により説明するが、これにはいかなる意味でも限定的な意
図はない。
DEAE−セルロース(DE52)はWhatman−Biosystems社
(Maidstone、Kent、英国)から購入した。Ub、カゼイン・アン
モニウム・サルフェート(1級)、ヌクレオチドおよびN−サクシニル−Leu
−Leu−Va I−Tyr−7−アミド−4−メチルクマリン(sLLVT−
MCA)はBoehringer (Mannheim、ドイツ)からである。
記載された他のペプチドはBachem−Bioscience (Phil’
adeIphia、PA)からまたはEnzyme−8yste’m5−Pro
ducts (Livermore、CA)からである。新たに精製したヒトヘ
モグロビン(1mM)を製造し、Fagan、J、M、など、J、Biol、C
hem、、261 :5705〜5713 (1986) 、RiceおよびM
eansが記載したようにして+40−ホルムアルデヒドで標識した。Rice
、R,H,およびMeans、G、E SJ、Biol、Chem、246+8
31〜832 (1972)。酸化剤−損傷ヘモグロビンを造るためにはI40
−メチルヘモグロビンを蛋白質nmo I当り50nmolの酸素ラジカル濃度
で6oCO照射によって発生させたOHおよびO,ラジカルに曝した。Davi
s、に、J、A、 、J、Bio 1.Chem、 、262 : 9895〜
9901 (1987) 。カゼインおよびリゾチームは以前に記載されたよう
に各々14C−ホルムアルデヒドおよび+4111で放射標識した。Waxma
nなど、J、Biol、Chem、 、262:2451〜2457 (198
7)。
抽出物および新酵素の製造
ニューシーラント白ウサギ(4〜5kg)をCO2で窒息させて屠殺、直ちに
筋を取出した。筋肉から脂肪結合組織を除き、冷やしておいた肉グラインダー
で潰した。筋肉量250g (湿重量)を20mM−トリス−HCl (pH8
゜0) 、]、mM−MgC+2.0.1mM−EDTAおよび1mM−DTT
を含む水冷緩衝液(3mL/g組織)に懸濁し、ILワーリングブレンダー
最高速度で1分間ホモゲナイズした。以下の処理は全て4℃で行った。NaOH
でpH7,0に調整後、110000Xで30分間遠心分離後上澄液を100
000×gで60分間超遠心分離して粗製抽出物を調製した。
超遠心分離後、抽出物を20mM−トリス−HCl (pH7,0)および1m
M−DDT (緩衝液A)の中で平衡化したDE−52の100mLカラムにか
けた。カラムを溶出液に蛋白質が検出されなくなるまで洗い、ATP依存性蛋白
質分解活性の大部分を含む結合した蛋白質(画分II)を0.5M−NaC1を
含む緩衝液Aで展開した。溶出した蛋白質(画分II)を硫酸アンモニウム分別
に付した。
遊離のプロテアソームを他の活性から分けるために、筋肉画分IIを38%飽和
とし、45分間撹拌した。不溶性蛋白質を110000xで20分間遠心分離に
よって単離し、次に0〜38%ペレットを20mM−トリス−HCl (pH7
゜0) 、1mM−DDTに懸濁した。同一緩衝液で完全に透析後、この両分を
濃縮し、20mM−トリス−HCl (pH7,8)で平衡化したPharma
ciaモノQカラム(FPLC)にかけた。Ub 1251−リゾチームを分解
した画分(図IA、ピーク1および2参照)を集め、濃縮し、モノ0分別に用い
たのと同じ緩衝液に150mM−NaC1を含むもので平衡化したPharma
ciaスペロース6ゲル濾過カラムにかけた。新酵素の一回の製造にはモノQカ
ラム処理3回分を含み、これらからの活性画分をゲル濾過まで集めておいた。ス
ペロース6カラムからの活性画分を集め、濃縮し、以下に記載するように次の実
験に使用した。
塊!
指摘した所(下記参照)を除き、全ての酵素的検定には直線性があった。検定に
ATPが存在する時は2mMであった。特段の記載がない限り、全検定でカラム
からの両分50μLまたは精製プロテアーゼ(10μg)を50mM−トリス−
HCl (pH7,8) 、10mM−MgC12,1mM−DTTおよび放射
性蛋白質5μg、Ub−抱合体0.5μg、またはフルオロゲン性ペプチド0.
 5mMを含む200μL中でインキュベートした。蛋白質分解の検定では、反
応混合物はUb−リゾチームまたは標識蛋白質的15000cpmを含んでいた
。+251−リゾチーム、Ub 125I−リゾチーム、14C−カゼイン、1
4C−ヘモグロビンおよびOH/ 02−処理14C−ヘモグロビンの分解は3
7℃で60分間インキュベーション後、酸溶解性放射能の生成を測定して検定し
た。Ub−+251−リゾチームは肝画分IIを用い、HoughとRechs
teinerの方法に従って製造した。Houghなど、J、Biol、Che
m、、261+2400〜2408 (1986) 。Hough、R,および
Rechsteiner、M、、J、B i o 1. Chem、、 261
 : 2391〜2399 (1986) 、”’1リゾチームとUbは以前に
記載されている方法に従って製造した。Waxmanなど、J、Biol、Ch
em、 、262 +2451〜2457 (1987)、Faganなど、旧
ochem、J、、243:335〜343 (1987)。
抱合体の濃度は抱合体合成に用いた1261−リスキソチームの特性放射能に基
づL\て算出した。1単位のsLLVT−MCAは30分間に生成する10nm
olのMCAを表す。
蛋白質はLaemmliが記載したように5DS−PAGE (10%ポリアク
リルアミドゲル)によって分析した。Laemml t、U、に、Nature
 (London)、227:680−685 (1970)、ゲルはクーマシ
ブリリアントブルーR−250で着色した。非変性ゲルを以前に記載されてい
るように処理した。Driscoll、J とGoldberg、A、L、 、
J、Bi。
]、Chem、 、265 : 4789〜4792 (1990)。
免疫学的方法
免疫沈殿は抗プロテアソームIgG(100μg)と蛋白質A−セファロース
以前の記載のようにインキュベートして行った。Ma t thewsなど、P
roc、Nat 1.Acad、Sci i、USA、86:2597〜260
1 (1989)。対照免疫沈殿はHycloneおよび抗ゴルジーモノクロナ
ル53FC3を用いて行った。精製ヒト肝プロテアソームに対するモノクロナル
抗体2−24 (Laemml i、U、に、Na ture (London
)227 :680〜685 (1970)’)はに、TanakaとA、Ic
hihara (徳島大学、日本)の厚意により提供された。精製ヒト肝プロテ
アソームに対するポリクロナル抗体はT、EdmundsとA、L、Goldb
ergによってウサギ中に生成した。Matthewsなど、Proc、Nat
l、Acad、Sci、USA、86:2597〜2601 (1989)。免
プロッティング用には蛋白質を10%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動させた。蛋白質をニトロセルロース紙(Hershkoなど、Proc、N
atl、Acad、Sci、USA、77 :1783〜1786 (1980
)。に写した後、以前の記載のように免疫プロッティングを行った。Hough
など、J、Biol、Chem、、262 : 8303〜8313 (198
7) 、Houghなど、ユビキチン(Rechsteiner、M 編)中、
101〜134頁、Plenum−Press、New−York (1988
)。
本実験では、使用した基質はUbに抱合したIH■−リゾチームであり、肝臓抽
出物を用いてHoughとReChSteinerによって記載されたように(
Houghなど、J、B io 1.Chem、 、261 : 2400〜2
408 (1986) 、Hough、R,およびRechsteiner、M
、 、J、Bi。
1、Chem、 、261 + 2391〜2399 (1986)) して製
造した。このユビキチン化蛋白質は粗製抽出物中では低速で分解されたが、画分
II(DEAE−セルロースに結合し、ATP依存性分解系を含む両分)はこの
基質を迅速に加水分解して酸−溶解性生成物とした(表I)。この過程は2時間
直線的であり3mM−ATPの添加により2〜3倍に加速された。対照的に、非
加水分解性ATP類似体であるAMPCPPまたはAMP−PNP、またはM
g!7在時のATP (および1mM−EDTA存在下)はUb−抱合蛋白質の
分解を刺激しウサギ骨格筋から得たユビキチン化リゾチームを分解する500k
Daのプロテアーゼの精製方式
%式%
モノQカラムの容量が小さいので、DE52から得た物質の独立な製造が3回必
要であった。実施例1記載の通り、各製造からの活性成分をゲル濾過前に集めた

Ub−抱合体を分解する活性を単離するために、画分IIを硫酸アンモニウム沈
殿に付した。38%(NH4)2SO4飽和ではプロテアソーム複合体は大部分
可溶のままであった。Waxmanなど、J、Biol、Chem、 、262
+2451〜2457 (1987) 、Dr i s co I ]、J、と
Goldberg。
、A、L、、J、B io ]、Chem、 、265 : 4789〜479
2(1990)。
蛋白質ベレットは再呼濁し、透析し、モノQ−F PLC(Ph a rma 
c i a)を用いたカラム上クロマトグラフした。Ub 125I−リゾチー
ム分解活性のピーク2個を見出した。小さいピークが約100mM−NaCI
、また、活性がより大きい第2のピークは240mMで溶出した。ピーク1はリ
ゾチームとカゼインに対するかなりの分解活性も示し、この過程もATPによっ
て5倍近くも加速された(図1)。スベロース6 (FPLC)上のゲル濾過で
見掛けの分子量1000と1500kDaの分子量を示した。それで、これは
解離していないUCDENかメガパイン複合体に対応するであろう。しかし、こ
の構造は非ユビキチン化すクソチームを多分Ub−抱合体蛋白質を分解するのと
同様な容易さで分解することは注目に値する。
Ub−リゾチームの加水分解に加えて、ピーク2はATP−刺激性のりゾチーム
分解を示したが、後者の活性はピーク1のそれよりも小さかった。ピーク2は6
0Cou射により発生する0T−1および02ラジカルとの接触により損傷され
たヘモグロビン(Hb)に対して強い蛋白質分解活性も示した。この酸化剤−損
傷へモグロビンは天iHbのそれよりもずっと速かった。さらに、酸化剤−損傷
Hbの分解はATPには非依存性であった。以前に、赤血球では、酸化剤−損傷
へモグロビンもA T Pまたはプロテアソームも必要ない過程で迅速に分解さ
れることが見つかっていた。しかし、ピーク2はいずれもプロテアソームの基質
であるIC−カゼインまたはサクンニルーLeu−Leu−Va I−Tyr−
MNA。
ザク/ニル−Phe−Leu−Phe−MNA (MNAはメチルナフチルアミ
ンの略号である) 、Z−Gay−Pro−MCA、Z−Aha−Arg−Ar
g−MNA、Z−Leu−Leu−Glu−βNA、グルタリルーAha−Al
a −P h e −MNA、 A r g−A r g−MNAおよびZ−G
 I y−G ] y−A r g −MNAを含む幾つかのオリゴペプチド
対して殆どまたは全(活性を示さなかった。
sLLVT−MCAに対してATP=刺激性活性を持つピーク二個が見出された
。ピーク3は320mM−で溶出され、sLLVT−MCA、リゾチームおよび
カゼインに対してATP−刺激性活性を、また天然または0H10”処理ヘモグ
ロビンのATP非依存性分解を示した。スペロース6 (FPLC)上のゲル濾
過で、このピークは見掛けの分子量約3QQkDaで溶出された。この活性は新
プロテアーゼまたはより確からしくはプロテアソームのフラグメントを示すであ
ろう。ピーク4は普通は38〜80に硫酸アンモニウムで沈殿する画分を同じモ
ノQカラムで展開するとプロテアソームが溶出される所である430mMに見出
された。それて、そのMr (600kDa)およびsLLVT−MCA分解能
の点でピーク4はプロテアソームに類似しているが、理由は不明であるが蛋白質
(リゾチーム、カゼインまたはヘモグロビン)を分解しない。
後続する研究をピーク2に集中したのは、ATP−刺激性ユビキチン化リゾチー
ム分解の殆どを占め、酸化剤−損傷ヘモグロビンに対して強い活性を持つが、プ
ロテアソームに対する特徴的な基質であるsLLVT−MCAには殆ど活性を示
さなかったからである。この活性をさらにスペロース6ゲル濾過カラムを用いる
ゲル濾過で精製して、分子量約440000の単一の活性ピーク(図2)が得ら
れた。セファロース300上の分析用ゲル濾過では、見掛けの分子量540kD
aを示した。
Ub−抱合体分解活性を持つ主プロテアーゼの迅速な単離のために用いる段階を
表1にまとめた。純度を評価するために、ATP−刺激性ピークを非変性条件下
のPAGEに付した。非変性ゲル上で単一バンドとして精製プロテアソームより
も有意に遠くまで(10〜15mm)移動した(実施例2参照)。5DS−PA
GE分析では、精製プロテアーゼはMr値が50000と150000の間の主
すブユニットバンド少なくとも5個の組合せを示しく図3)、プロテアソームに
特徴的な20〜30kDaバンドをどれも含まなかった。以前に、Ha u g
hなどは網状赤血球からの巨大な抱合体−分解性複合体の5DS−PAGE分析
が高分子量サブユニット少なくとも6から10個(45と115kDaとの間)
を示したと報告し、Waxmanなども部分的に精製した標品では43と110
kDaの間の領域にある王ポリペプチド10がら12個を観察した。そこで、こ
の新プロテアーゼは非常に大きなcomplesの中に含まれるサブユニットを
持つと思われる(実施例2参照)。
500kDaの酵素の触媒的性質
ゲル濾過後(図2) 、500kDaのピークはモノQクロマトグラフィー後と
同じ活性を示した。Ub−リゾチームの加水分解は2mM−ATPの添加で5倍
に、リゾチームの分解は3倍に刺激された。一方、天然および酸化剤−損傷ヘモ
グロビンは共にATPには非依存性(粗製抽出物中と同様)であり、酸化剤−処
置基質は天然ヘモグロビンよりも15倍速く分解された。これらの基質では、U
b12fil−リゾチームと125I−リゾチームでと同様に、この酵素は鋭い
至適pH78を示した。この活性はpH7,0または10.0では約50%に減
少し、pH5,0以下または120以上では明確な活性はなかった。
ub−抱合蛋白質の多量調製が困難なため、標準検定で用いたユビキチン化リゾ
チームの濃度はin離リゾチームのそれよりも約10倍(+2J−リゾチームと
モル量を比較しこ時)低かった。けれども、この新プロテアーゼはユビキチン化
したりゾチームをユビキチン化しないものと殆ど同じ位速く分解した(表II)

表11
プロテアソームおよび新プロテアーゼによる異なる基質の分解に関する抗プロテ
アソームモノクロナール抗体との免疫沈殿の効果ユビキチン化
リゾチーム リゾチーム カゼイン
−ATP +ATP −ATP +ATP −ATP +^TP対照抗体 61
2 1872 7 8 217 856抗プロテアソ一ム抗体 41 105 
0 Q 32 74新プロテアーゼ
対照抗体 79292 41190 0 0抗プロテアソ一ム抗体 70281
 36179 0 00H102処理
ヘモグロビン ヘモグロビン SLLVT−MCA−ATP +^TP −AT
P +^TP −ATP +^TP対照抗体 45 51 927 8g6 0
.8 3.7抗プロテアソ一ム抗体 0 0 31 36 0.1 0.1新プ
ロテアーゼ
対照抗体 19 17 263 270 0.1 0.2抗プロテアソ一ム抗体
 15 22 267 256 0.1 0.1リゾチームの二つの型が同じ濃
度で存在する時、125I−リゾチームよりUb−12J−リゾチームは約3倍
速(分解される(図5)。これらの知見はユビキチン化基質に対する新プロテア
ーゼの明瞭な優先性を示すが、プロテアソームとは対照的に、tJb−抱合体に
対しては、あるとしても掻く僅かの活性しか示さなかった。この蛋白質分解反応
の性質を解明するために、このプロテアーゼによってUb 051−リゾチーム
から発生する酸溶解性生成物の大きさを測定した。G25ゲル濾過カラム(0,
2M−酢酸Naと0.1M−NaC1で平衡化)上のクロマトグラフィーIこよ
り、酸溶解性断片は標準ペプチドである物質Pにより決めると概略分子量130
0Dになる単一の鋭いピークとして溶出した。それで、この酵素はエンドペプチ
ダーゼであり、エキソペプチダーゼ活性を欠くと思われる。
この新プロテアーゼがプロテアソームと共通の構成要素を持つがどうかをテスト
するために、ヒト肝粒子に対するモノクロナール抗体(Matthewsなど、
Proc、Nat 1.Acad、Sci、USA、86:2597〜2601
 (1989)表II)またはラット肝プロテアソームに対するポリクロナール
抗体を用いた。両抗体との免疫沈殿はリゾチーム、Ub−リゾチームまたは酸化
剤−処置ヘモグロビンに対して検定した場合は新酵素の活性に影響しながったが
、これらの処理は精製したウサギ筋肉プロテアソームを14c−カゼインまたは
sLLVT−MCA (表II)で検定した場合は定量的に沈殿した。(これら
の種々のプロテアソーム活性は抗体によって直接阻害されないが、こレラの実験
では、これらの活性は共に蛋白1ftA−セファロースとの沈殿によって除去し
た)。交差活性がこれらの多重体プロテアーゼの間にないことはウェスターン
ロットにより確認したが、モノクロナールまたはポリクロナール抗体はこの新プ
ロテアーゼとは反応しなかった。
ヌクレオチド効果
表IIIはlJb 12J−リゾチームの骨格筋から得たこの新活性による分解
に対するヌクレオチドの効果を示す。この検定では、セファロース6クロマトグ
ラフイーから得た活性ピークをUb 12J−リゾチームと37℃で1時間イン
キュベートした。反応混合物はヌクレオチド2mMまたはPP11mMを含有し
ていた。表IIIに示すように、Ub+254−リゾチームの精製酵素による加
水分解はATPにより7倍まで加速された。対照的に、ADPまたはAMPまた
無機燐酸塩はこの過程に有意な効果を持たなかった。非加水分解性ATP類似
体であるアデニル−5°−オイルイミドジホスフェート(AMP−PNP)お
よびアデノノン5゛−〇−チオトリホスフエート(ATP−γ−8)では刺激性
は見られなかった。故に、この反応はATPの加水分解を要求し、ATP開裂
ロテアーゼである大腸菌からのLa (]on)およびTi(clp)およびミ
トコンドリアならびにプロテアソームの迅速単離型について知られているのと同
様である。
表III
骨格筋からの新活性によるUb−′251−リゾチームの分解に関するナン 1
00 ATP−γ−8103
ATP 743 CTP 373
ADP 113 GTP 435
AMP 130 UTP 108
AMP108A 90 PPi 118反応反応物はヌクレオチド2mMまたは
PP110mMを含んでいた。
ATP不在時には、精製酵素によるUb−抱合体の加水分解は少なくとも2時間
直線的てあり、ATPを加えると何倍も促進された(図5)。故に、この効果は
ATP加水分解を経る真の活性化を含み、単なる酵素の安定化ではない。また、
ATPによるユビキチン化および非ユビキチン化リゾチーム分解の活性化には約
20分の誘導期が先行するのは注目に値する(図5)。この面白い誘導期は明ら
かにATPの刺激性効果に関する、何故なら直線的過程であるこれらの基質また
は酸化剤−損傷ヘモグロビンのATP−非依存性分解にはラグタイムは見られな
い。この興味をそそる時間依存性の根拠は不明であるが、ある別の構成要素の
失によると思われる。同様な効果は真核細胞または原核細胞にある他のATP−
依存性蛋白質分解酵素では観察されていない。
ATP要求性はCTPまたはGTPでも部分的に満たすことができ、蛋白質分解
には大体4倍の刺激が起きる(表111)。それで、このヌクレオチド要求性は
1500kDaの複合体によるUb−抱合体分解のヌクレオチド特異性に関する
前記知見に似ている。このヌクレオチド効果もプロテアソームのATP依存型に
より必要とする効果とは異なり、そこでは非加水分解性類似体を含むヌクレオ
トリホスフェートはどれもペプチド基質の加水分解を活性化できたが、この蛋
白質分解の刺激性はATPのみで見られた。
異なるATP濃度を研究した時、抱合体分解の最高の刺激性は1mMで観察され
た。このデータはATPのに、は0.5mMまたはそれ以下であり、これは細胞
間のATP濃度より十分に低い。それで、この活性化は生理学的であり、このに
、は培養細胞での以前の観察に符合して、細胞ATPの枯渇は蛋白質分解を阻害
するが、これはATP濃度が極端に低下(〉75%)した時にのみ見られる。
この酵素自身は全く不安定である。ATP不在下に40℃で貯蔵する時、Ub−
抱合体に対する蛋白質分解活性が進行的に喪失する。−70℃でも、Ub抱合体
リゾチーム、非ユビキチン化リゾチームまたは酸化剤−損傷ヘモグロビンを分解
する性能は全て3〜4日に50%まで減少した。この迅速な不活性化はATPま
たは非加水分解性類似体AMP−PNPの存在により予防できた。グリセロール
の添加は粗製抽出物とプロテアソームのATP−依存性分解系を安定化するが、
この活性の進行性損失も予防して6日後にも酵素の完全な機能を残した。ヌクレ
オチドとグリセロールがこの酵素を安定化させる性能は40℃でも観察されたが
、不活性化はもっと速かった。プロテアソームのATP−依存型も不安定でヌク
レオチドで安定化される;しかし、これらのプロテアーゼ複合体2個の不安定性
は全(異なる。プロテアソームは時間とともにATP依存性を失い、すぐに活性
になるが、この新酵素はATP不在下には活性を失うだけである。加えるに、S
DSや脂肪酸のような洗剤は、プロテアソームを刺激するが、この新酵素は不活
性化(表IV)L、これはずっと不安定な構造であると思われる。
表IV
新プロテアーゼの種々の活性および骨格筋からのプロテアソームに対する添加U
 b −1,1リゾチ01110!−処理 5LLVTゾチーム −ム へモグ
ロビン −MCA相対活性(%)
なし 100 100 100 100100DFP(196929118
ンスタチンA(4ujl) 30 24 27 93ヘミン(0,1mM) O
ロ 7O
N E M(1mM) 29 27 30 370イペブチン(01園M) 6
9 72 73 83E 64 (0,1mM) 100 100 100 1
00オレイン酸Na(0,125m1l) 29 34 40 179S D 
S (0,01i+ll) 44 46 42 1250−フェナントロリン(
0,1mM) 48 55 54 60新プロテアーゼは37℃で1時間蛋白質
基質および2mM−ATPとインキュベートした。スベロース6クロマトグラフ
イーにより得たプロテアソームはsLLVT−MCAとインキュベートした。基
質を加える前に混合物を10分間20℃でブレインキュベートした。DFPはD
MSOに溶かし、その最終濃度(1%)は酵素活性には影響がなかった。
新ATP−依存性プロチアーゼをさらに特徴付けるために、種々の型の酵素阻害
剤をテストした(表IV)。セリンプロテアーゼの不可逆的阻害剤であるジイソ
プロピルフルオロホスフェート(DFP)は抱合体分解に影響しなかった。
重金属をキレートする0−フェナントロリンはい(らかの阻害を示した。対照的
に、チオール閉鎖剤であるN−エチルマレイミド(NEM)および多数のパパイ
ン様チオールプロテイナーゼの強力な阻害剤である卵白シスタチン(シスタチン
A)はこの活性を強く阻害した。同様な阻害は関連するヒトのポリペプチドであ
るステフィンAでも観察された。シスタチンの同様な効果は以前にウサギ筋肉か
らの巨大なUCDEN複合体に対するATP+Ub−依存性蛋白質分解について
報告された。ステフィンAによる阻害に生理学的な興味があるというのは、多数
哺乳類組織には同族的蛋白質阻害剤が存在するからである。同様な濃度で、シ
スタチンBは55%阻害を示し、シスタチンCでは有意な効果は検出されなかっ
た。この新活性はチオールプロテアーゼであると思われるが、共に多数のチオー
ル型プロテイナーゼ(たとえばリソソームの酵素またはカルパイン類)の阻害剤
であるリューペブチンの存在で30%程が阻害され、E64では全くなかった。
しかし、リューペブチンとE64の感受性は定着結合に先行する配列に強く影響
され、それらが感受性であるのはチオールプロテアーゼの全てではない。ATP
−Ub−依存性蛋白質分解系を完全に阻害できるヘミンおよびプロテアソームも
この新プロテアーゼによる抱合体−分解活性を阻害する(表IV)。
これらの知見はこの新酵素はその活性部位にチオール残基を持つことを示唆する
。従って、ノチオスレイトールはその活性を促進し、酵素機能の維持に必要であ
る。効果的阻害剤のパターンは明らかにこの活性をプロテアソームのものと区別
し、後者では活性化された時多重の触媒部位(必須のスルフヒドリル基も持つが
)を持つセリンプロテアーゼとして働((表IV)。表IVに示すように、12
5I−リゾチームおよび0H10Y2−一処理+4(−ヘモグロビンの分解につ
いて異なる阻害剤の効果も比較した。これらの物質についてはよく似た阻害プロ
ファイルが得られたのは、Ub−リゾチームと同様であった。それで、これら異
なる型の蛋白質の加水分解には単一な型の活性部位が含まれていると思われる。
酸化剤−損傷ヘモグロビンの分解はATPに非依存的であり、一方ユビキチン化
および非ユビキチン化リゾチームはヌクレオチド加水分解を要求するが、単一の
酵素複合体がこれら三基質の分解を司っていると見えるのにはい(つかの理由が
ある:a)三活性は同時に精製された(図1および2)、b)ATPおよびグリ
セロールが3つの全てを同様な仕方で安定化した。C)これらの異なる活性が同
様な至適pHを持っていた。d)シスタチンおよび他の阻害剤がUb−抱合体の
分解を削減する性能が他の蛋白質の分解を阻害する性能に関連付けられた。これ
らのデータの最も簡単な解釈はこれらの3基質は単一の活性部位または単一な型
の部位によって分解されることであろうと思われるが、ATPがあるものの分解
を促進するのになぜ全部の基質はしないのかが理解し難い。
ユビキチン化および非ユビキチン化蛋白質が同一の部位に結合されるかどうかテ
ストするため、リゾチーム、ヘモグロビンまたは酸化剤−処理ヘモグロビンの飽
和濃度(5から25μg)の存在下に精製酵素を37℃で1時間インキュベート
した。これらの基質はどれもUb−I2SI−リゾチーム(リゾチーム領 5μ
gを含有)の分解を削減しなかったが、非標識リゾチームおよび酸化したヘモグ
ロビンは類似体の放射性蛋白質の分解を直線的に減らした。加えるに、この濃度
ではりゾチームと酸化剤処理ヘモグロビンとの間には競合は検出されなかった。
これら三基質の間に競合を証明できなかったことはこのプロテアーゼが特有の結
合領域を持ち、これらの異なる蛋白質基質を認識し、さらにUb−リゾチームの
分解には遊離のりゾチームの発生を含まないことを示唆する。
プロテアソームとの会合
Ub−抱合リゾチームを分解する性能があるので、この酵素は1500kDaの
UCDEN複合体の構成要素であろう。事実、この新酵素はその大きさとクロマ
トグラフィー的挙動が網状赤血球からの成分子CF−IJと似ている。もしそう
なら、ATPの存在下にプロテアソームと複合体を形成する筈である。この仮説
試すために、マルチパインと十分に精製した筋肉からのプロテアソーム略等量
をMg2’″−ATPの存在または不在下に37℃でインキュベートした。スベ
ロース6ゲル濾過後に得た活性ピーク(各1mg蛋白質)を1mM−Mg−AT
P存在下に30分間インキュベートした後、同じスペロース6カラムにかけた。
流速領 1mL/分で1.QmL画分を集めた。標品をUb−I2s■−リゾチ
ームについて測定した。
図5に示すように、Mg”−ATp存在下のプレインキュベーションは130Q
kDaの複合体を形成させ、これもユビキチン化リゾチームを分解した。ATP
またはM g 2’を除くか(図5) 、ATPを類似体AMP−PNPで置き
換えると複合体は形成せず、500および700kDaの酵素の分解が起きた。
もしプロテアソームが含まれないとMg”−ATPとインキュベーションしても
マルチパイン活性の大きさは変化しなかった(データは示してない)。この観察
は5DS−PAGEおよびウェスターンプロット分析で示唆されたようにマルチ
パイン標品がプロテアソームを含まない筈であることを確認し、ATPによる活
性化の誘導期(図4)は分子間会合ではないことを示す)。最後に、試験管内で
形成したtJb−抱合体−分解活性は抗プロテアソーム抗体との免疫沈殿によっ
て阻止できたのは天然複合体についての前記研究と同様である。
基質(+2J−リゾチーム、ユビキチン化+251−リゾチーム、+4(−メチ
ルヘモグロビンおよびOHおよび0□ラジカルで損傷した+40−メチルヘモグ
ロビン)は実施例1に記載のように製造した。
筋肉抽出物の分別−ニュージ−ランドホワイト(4〜5kg)雄ウサギ(Mil
 1brook−Farms、MA)からの大腰筋を処理し、ボスト−ミトコン
ドリア抽出物を作製、実施例1のようにDEAE−セルロースで分別した。DE
AEセルロース吸着し、0.5M−NaC1(画分II)で溶出した蛋白質を
(NH4)2SO,で分別して遊離のプロテアソーム(38〜80%)を他の活
性(0〜38%)から分離した。両面性を濃縮し、別々にファルマシアのモノQ
カラム(FPLC)にかけた。プロテアソームとマルチパイン画分をさらにPh
arma c i aのスペロース6ゲル濾過カラムにかけ、活性画分を集めて
以下の実験に用いた。

1251−リゾチーム、ub 1251−リゾチーム、14C−カゼイン、+4
0−へモグロピンおよび0H102−処理14C−ヘモグロビンの分解は実施例
1およびTanakaと協力者の記載のように検定した。Tanaka、に、な
ど、J、Bi。
1、Chem、、261 : 15197〜15203 (1986) 。検定
は全て2時間の間直線的であった。特段の記載がない限り、検定には50μLづ
つのカラム画分または精製プロテアーゼ(5μg)を5QmM−トリスHCI 
(pH7゜8) 、10mM−MgCl2.1mM−DTTおよび放射性蛋白質
5μg、125I−リゾチーム抱合体0.5μgまたはQ、5mM−フルオロゲ
ンペプチドであるサクシニル−Leu−Leu−Va 1−Try−7−アミド
−4−メチルクマリン(sLLVT−MCA)200μL中でインキュベートし
た。Ub−抱合体の量はUbに結合した125I−リゾチームの放射能に基づい
て算出した。sLLVT−MCA1単位は30分間に生成するMCAlonmo
 lを示す。
電気泳動
蛋白質はBradfordの方法で検定した。(Bradford、M、M、。
Anal、Biochem、 、72:248〜254 (1976))、蛋白
質は5DS−PAGE (10%ポリアクリルアミド)によりLaemmliの
方法(Pickart、C,M、など、Arch、Biochem、Bioph
ys、、272:114〜121 (1989) )を用いて分析し、クーマジ
ーブリリアントブルーR−250で染色した。4%ポリアクリルアミドゲル非変
性電気泳動を前記実施例1とDriscollとGolbergに記載のように
行った。Driscoll、J、とA、L、Golberg、J、Bio、Ch
em、、265:4789〜4792 (1990)。

プロテアソームとマルチパインとの間の複合体形成これら二つのATP−活性化
プロテアーゼがub−抱合体を分解する大きし1複合体を形成する性能を以下の
ように検討した。マルチノくインをスペロース6ゲル濾過で得、これをプロテア
ソーム画分と共にATPとMg24の存在または不在下に30分間37℃でイン
キュベート後、同じゲル濾過カラムにかけた。この条件ではプロテアソーム(7
00kDa)およびマルチパイン(500kDa)活性の大部分を1500kD
aで溶出す...

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