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技術 ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体

出願人 東亞合成株式会社
発明者 加藤久豊吉田祇生
出願日 1993年6月4日 (27年2ヶ月経過) 出願番号 1993-160235
公開日 1994年12月20日 (25年7ヶ月経過) 公開番号 1994-345794
状態 未査定
技術分野 生物学的材料の調査,分析 酵素、微生物を含む測定、試験 糖類化合物
主要キーワード チエンケ 可視吸光スペクトル チャートスピード IRチャート アンモニウム硫酸水素塩 NMRシグナル ジブロモペンタン チオールリンカー
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1994年12月20日)のものです。
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図面 (11)

目的

本発明は修飾DNAの合成に際して重要となるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体を提供するものである。

構成

非放射性標識がリンカーを介して2'-又は3'-水酸基に導入されたヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。

効果

本発明の誘導体を用いれば、非放射性標識をオリゴマー中の任意の位置に任意の数だけ導入することができるうえ、核酸本来の機能を損なう可能性も低く、誘導体自身も安価に製造出来る。

概要

背景

近年、分子生物学発展にともなって、いわゆるDNAプローブ法を用いた診断薬などの研究が活発に行われている。これらの分野では、有機化学的合成、生化学的合成を問わず、天然型DNAだけでなく特定の修飾を施した、すなわち、チオール又はアミノリンカー、あるいは非同位体標識を導入したDNAが研究材料として盛んに用いられており、その需要は急速に高まっている。これに対応して、有機合成化学の分野では、修飾DNAの合成原料として用いることができる各種のヌクレオシド誘導体の合成研究が行われてきた。すなわち、核酸塩基部にリンカーあるいは非同位体標識を導入したヌクレオシドの合成研究であり、下記の文献等にその代表的成果を見ることができる。
J-P. Roduit, et al. Nucleosides, Nucleotides, 6, 349(1987)
J. Haralambidis, et al. Nucleic AcidsRes., 15, 4857(1987)
Institut Pasteur, WO-88/00593
A. F. Cook, et al. Nucleic Acids Res., 16, 4077(1988)
A. Roget, et al. Nucleic Acids Res., 17, 7643(1989)
コハ゜ニーオリインタストリー・ソシエテ・アノニム,公表特許公報 平3−505209
これらの業績は、分子生物学の分野に対して新規な修飾DNAを提供することで、多大な貢献をしてきたものである。しかしながら、上記の文献等に記載されたヌクレオシド誘導体は、その合成経路において、高価なハロゲン化あるいはチオ化されたヌクレオシド又は核酸塩基を必要としているため、それらを用いて合成された修飾DNAも高価なものとなり、また、核酸塩基部にリンカーあるいは非放射性標識を導入した場合、核酸塩基が持つ水素結合性等の機能に変化を生じさせる恐れも否定できない。

他の研究者らは、核酸塩基部ではなく、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分に非放射性標識等を導入する方法を開発しており、次の公報にその内容が開示されている。
カルホルニアインステイテュート・オフ゛・テクノロシ゛ー,公開特許公報 平4−60600
ヘキストアクチエンケ゛セ゛ルシヤフト, 公開特許公報 平4−290896
しかしこれらの誘導体は、フラノース環の水酸基アミノ基またはチオール基に変換したことにその構造的特徴があり、リンカー(スペーサー)部分が含まれていない。したがって、これらの誘導体は、J Haralambidisらが主張する(Nucleic AcidsRes.,15,4857(1987))、長鎖のリンカーを有している修飾DNAほど二本鎖形成能が高いという問題に満足解答を与えるものではない。

本発明者らは、分子生物学の分野で需要が急速に高まっている修飾DNAを提供するに際して必要となるヌクレオシド誘導体において、入手容易な天然型ヌクレオシドを出発物質として、核酸塩基部ではなく、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分にチオールリンカーまたはアミノリンカー、あるいは、いずれかのリンカーを介して非放射性標識が結合した誘導体の合成方法及びその合成中間体を開発することに成功し、先にその発明に関し二つの出願を行った(平成5年3月9日出願)。

概要

本発明は修飾DNAの合成に際して重要となるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体を提供するものである。

非放射性標識がリンカーを介して2'-又は3'-水酸基に導入されたヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。

本発明の誘導体を用いれば、非放射性標識をオリゴマー中の任意の位置に任意の数だけ導入することができるうえ、核酸本来の機能を損なう可能性も低く、誘導体自身も安価に製造出来る。

目的

本発明者らは、上記した分子生物学の分野で需要が急速に高まっている修飾DNAを提供するに際して必要となるヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体を、先に開発したものよりさらに簡便かつ安価に合成することを課題として研究を行ったのである。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

次の式[I]で示されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体

請求項

ID=000002HE=020 WI=059 LX=0305 LY=0500但し、式中のBはプリン又はピリミジン塩基、R1は水素原子水酸基保護基リン酸残基二リン酸残基又は三リン酸残基であり、R2、R3はいずれか一方が水素原子又は水酸基の保護基で、他方が(CH2)nR4であり、nは3以上の任意の整数を示し、R4は酸素原子を介して結合されたフェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する非放射性標識を示す。

技術分野

0001

本発明は、たとえばDNA診断薬の開発に利用するために必要な、オリゴマー中の任意の位置に任意の数の非放射性標識を導入した、修飾DNAの合成に際して重要となるヌクレオシド及びヌクレオチド誘導体を提供するものであり、医薬業界で広く利用されるものである。

背景技術

0002

近年、分子生物学発展にともなって、いわゆるDNAプローブ法を用いた診断薬などの研究が活発に行われている。これらの分野では、有機化学的合成、生化学的合成を問わず、天然型DNAだけでなく特定の修飾を施した、すなわち、チオール又はアミノリンカー、あるいは非同位体標識を導入したDNAが研究材料として盛んに用いられており、その需要は急速に高まっている。これに対応して、有機合成化学の分野では、修飾DNAの合成原料として用いることができる各種のヌクレオシド誘導体の合成研究が行われてきた。すなわち、核酸塩基部にリンカーあるいは非同位体標識を導入したヌクレオシドの合成研究であり、下記の文献等にその代表的成果を見ることができる。
J-P. Roduit, et al. Nucleosides, Nucleotides, 6, 349(1987)
J. Haralambidis, et al. Nucleic AcidsRes., 15, 4857(1987)
Institut Pasteur, WO-88/00593
A. F. Cook, et al. Nucleic Acids Res., 16, 4077(1988)
A. Roget, et al. Nucleic Acids Res., 17, 7643(1989)
コハ゜ニーオリインタストリー・ソシエテ・アノニム,公表特許公報 平3−505209
これらの業績は、分子生物学の分野に対して新規な修飾DNAを提供することで、多大な貢献をしてきたものである。しかしながら、上記の文献等に記載されたヌクレオシド誘導体は、その合成経路において、高価なハロゲン化あるいはチオ化されたヌクレオシド又は核酸塩基を必要としているため、それらを用いて合成された修飾DNAも高価なものとなり、また、核酸塩基部にリンカーあるいは非放射性標識を導入した場合、核酸塩基が持つ水素結合性等の機能に変化を生じさせる恐れも否定できない。

0003

他の研究者らは、核酸塩基部ではなく、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分に非放射性標識等を導入する方法を開発しており、次の公報にその内容が開示されている。
カルホルニアインステイテュート・オフ゛・テクノロシ゛ー,公開特許公報 平4−60600
ヘキストアクチエンケ゛セ゛ルシヤフト, 公開特許公報 平4−290896
しかしこれらの誘導体は、フラノース環の水酸基アミノ基またはチオール基に変換したことにその構造的特徴があり、リンカー(スペーサー)部分が含まれていない。したがって、これらの誘導体は、J Haralambidisらが主張する(Nucleic AcidsRes.,15,4857(1987))、長鎖のリンカーを有している修飾DNAほど二本鎖形成能が高いという問題に満足解答を与えるものではない。

0004

本発明者らは、分子生物学の分野で需要が急速に高まっている修飾DNAを提供するに際して必要となるヌクレオシド誘導体において、入手容易な天然型ヌクレオシドを出発物質として、核酸塩基部ではなく、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分にチオールリンカーまたはアミノリンカー、あるいは、いずれかのリンカーを介して非放射性標識が結合した誘導体の合成方法及びその合成中間体を開発することに成功し、先にその発明に関し二つの出願を行った(平成5年3月9日出願)。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明者らは、上記した分子生物学の分野で需要が急速に高まっている修飾DNAを提供するに際して必要となるヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体を、先に開発したものよりさらに簡便かつ安価に合成することを課題として研究を行ったのである。

課題を解決するための手段

0006

本発明者らは、核酸塩基部ではなく、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分に非放射性標識が結合したヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体をさらに簡便かつ安価に合成することに成功し、本発明を完成したのである。すなわち、本発明は次の式[I]で示されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体に関するものである。

0007

0008

但し、式中のBはプリン又はピリミジン塩基、R1は水素原子、水酸基の保護基リン酸残基二リン酸残基又は三リン酸残基であり、R2、R3はいずれか一方が水素原子又は水酸基の保護基で、他方が(CH2)nR4であり、nは3以上の任意の整数を示し、R4は酸素原子を介して結合されたフェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する非放射性標識を示す。

0009

○式[I]で示される誘導体の合成方法
式[I]で示されるヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体は、たとえば、次の式[II]で示されるヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体を経由して、フェノール性水酸基またはカルボキシル基を有する非放射性標識との間でハロゲン化水素の脱離による求核置換反応により合成することができる。

0010

0011

但し、式中のB、R1は式[I]と同じであり、R5、R6はいずれか一方が水素原子又は水酸基の保護基で、他方が(CH2)nXであり、Xはハロゲン原子を示す。

0012

すなわち、3'-及び5'-水酸基を保護したヌクレオシド誘導体(式[II]においてR1及びR5が、水酸基の保護基であり、Bのプリンまたはピリミジン残基が好ましくはアデニン残基グアニン残基シトシン残基及びウラシル残基であり、Xのハロゲン原子が好ましくは臭素原子である)とフェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する非放射性標識とを、適当な溶媒中で、塩基を作用させて(但し、フェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する非放射性標識が予め塩基との塩を形成している場合は、さらに塩基を加えなくてもよい)、数時間から数日間反応させると、式[I]で示されるヌクレオシドが合成される。酸素原子を介して結合されるフェノール性水酸基又はカルボキシル基を有する非放射性標識としては、DNAプローブの検出などに用いることができるものであればその使用に格別の限定は無いが、本発明にとり好ましいものは、フルオレセイン、フルオレセインメチルエステル又はエチルエステルである。この反応で用いる溶媒としては、本反応の進行を妨害しないものの中から選択すれば良いが、なかでも、テトラヒドロフラン、1,5-ジオキサン、テトラヒドロフラン/水、1,4-ジオキサン/水、ジメトキシエタンアセトン、N,N-ジメチルホルムアミドジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド/水混合物などが好ましい。塩基としては、アルカリ金属炭酸塩又は重炭酸塩金属水酸化物水素化金属アルキル金属グリニャール試薬などを用いることができ、好ましくは、炭酸ナトリウム炭酸カリウム水酸化ナトリウム水酸化カリウム又は水酸化テトラ-n-ブチルアンモニウムである。又、触媒として、臭化テトラ-n-ブチルアンモニウムあるいはテトラ-n-ブチルアンモニウム硫酸水素塩トリス[2-(2-メトキシエトキシ)エチル]アミンヨウ化カリウムトリフェニルホスフィンあるいはトリブチルホスフィンなどを加えると効果的であり、これらの触媒は、単独または併用して用いることができ、用いる量としては、それぞれ0.05当量から2当量が好ましい。反応温度は、室温から還流温度までを用いることができる。水酸基の保護基としては、トリチル型保護基、ベンジル及びアリル型保護基、アシル型保護基、シリル型保護基などが例示され、本発明にとり好ましいものは、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、および、tert-ブチルジメチルシリル基である。水酸基の保護基の除去は、常法により行えば良く、リン酸化反応あるいは三リン酸化反応などを行うと、式[I]で示される各種のヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体が得られる。なお、これらの反応においては、必要に応じてプリンまたはピリミジン残基に公知の方法により保護基を導入することができる。R2、R3におけるアルキレン基鎖長を示すnは3以上の任意の整数を示すものであり、nが3未満のものは合成が殆ど不可能であり、原料入手の困難性を考慮すると本発明にとりnが20以下の整数が好ましい。

0013

利用方法
本発明の2'-又は3'-水酸基に非放射性標識を有するヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体は、DNA、RNAなどのオリゴマー中の任意の位置に任意の数の非放射性標識を導入し、プローブの検出などに利用されるものであるが、DNA、RNAなどのオリゴマーに導入するには公知の方法を用いることができ、リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、H−ホスホネート法あるいはチオホスファイト法などの有機化学的手法および酵素の作用を利用する生化学的手法を例示することができる。

0014

本発明の2'-又は3'-水酸基に非放射性標識を有するヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体においては、非放射性標識をオリゴマー中の任意の位置に任意の数だけ導入することができること、及び、従来の核酸塩基部に導入する方法あるいは、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分に非放射性標識を直接導入する方法に比較して、核酸本来の機能を損なう可能性が低いという作用を示す。また、本発明の誘導体は、フルオレセインイソチオシアネートなどの高価な原料を用いることなく、安価なフルオレセイン又はそのエステルを用いて製造することができる。

0015

以下、実施例により本発明で提供される2'-又は3'-水酸基に非放射性標識を有するヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体の合成例について説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の構造式においては、次の略号を使用する。すなわち、Ad=アデニン残基、Ur=ウラシル残基、MMTr=4-メトキシトリチル基、TBDMS=t-ブチルジメチルシリル基である。

0016

実施例1
下記式で示される化合物1及び化合物2を以下の様にして合成した。

0017

0018

0019

5'-O-4-メトキシトリチル-2'-O-(5-ブロモペンチル)ウリジン4.07g(6.11mmol)の1,4-ジオキサン70ml溶液に、フルオレセイン2ナトリウム4.59g(12.2mmol)、水酸化ナトリウム0.25g(6.25mmol)及びヨウ化カリウム1.02g(6.14mmol)の水25ml溶液を滴下し、48時間加熱還流した。放冷後、5%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムルで抽出し、飽和食塩水洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、それぞれ褐色粉末状の化合物2種を得た。NMRおよびIR分析によりそれぞれ上記化合物1及び2であることを確認した。化合物1の収量は1.20g(21%)。化合物2の収量は0.49g(9%)であった。1H−NMRのケミカルシフト、IRシグナル波数及びシリカゲル薄層クロマトグラフィー移動度を以下に示し、IRチャート図1及び図2に示す。
化合物1
1H−NMR(CDCl3)δ:0.97−2.03 (6H,m)
3.23−4.55 (13H,m)
5.25−5.53 (1H,m)
5.73−6.00 (1H,m)
6.42−8.08 (25H,m)
IR(KBr)cm-1:3410,2940,1770,1710,1660,1610,1460,1250,1180.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.47 (クロロホルム:メタノール=10:1)
化合物2
1H−NMR(CDCl3)δ:0.67−2.00 (6H,m)
3.22−4.57 (13H,m)
5.20−5.53 (1H,m)
5.77−6.03 (1H,m)
6.50−8.40 (25H,m)
IR(KBr)cm-1:3410,2930,1710,1660,1590,1460,1250,1100.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.39 (クロロホルム:メタノール=10:1)

0020

実施例2
下記式で示される化合物3を以下の様にして合成した。

0021

0022

実施例1で合成した化合物1の2.80g(3.05mmol)をクロロホルム20mlに溶解し、ギ酸2.00ml(53.0mmol)を加え、室温下で2.5時間攪拌した後、水及び飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、燈褐色粉末状の化合物0.71gを得た(収率36%)。1H−NMRおよびIR分析により上記化合物3であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示し、1H−NMRチャート図3に示す。
1H−NMR(CDCl3-CD3OD)δ:1.23−2.13(6H,m)
3.50−4.33(9H,m)
5.68(1H,d)
5.83(1H,d)
6.33−6.80(6H,m)
7.07−7.33(1H,m)
7.43−8.07(4H,m)
IR(KBr)cm-1:3410,2940,1740,1710,1660,1470,1250,1190,1100.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.51 (クロロホルム:メタノール=5:1)

0023

実施例3
下記式で示される化合物4を以下の様にして合成した。

0024

0025

実施例1で合成した化合物2の1.25g(1.36mmol)をクロロホルム10mlに溶解し、ギ酸1.00ml(26.5mmol)を加え、室温下で2.5時間攪拌した後、水および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、燈褐色粉末状の化合物0.33gを得た(収率37%)。1H−NMRおよびIR分析により上記化合物4であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示し、1H−NMRチャートを図4に示す。
1H−NMR(CDCl3-CD3OD)δ:0.87−1.83 (6H,m)
3.37−4.33 (9H,m)
5.70 (1H,d)
5.87 (1H,d)
6.37−8.37 (11H,m)
IR(KBr)cm-1:3390,1710,1660,1590,1460,1260,1210,1100.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.19 (クロロホルム:メタノール=5:1)

0026

実施例4
下記式で示される化合物5を以下の様にして合成した。

0027

0028

まず、下記式で示される化合物6及び化合物7を以下の様にして調製した。

0029

0030

0031

アデノシン6.36g(23.8mmol)、1,10-ジブロモデカン35.7g(119mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド100ml懸濁液に0℃で60%油性水素化ナトリウム1.00g(25.0mmol)を加え、室温下で3.5時間攪拌した後、クロロホルムルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、無色結晶性の化合物二種を得た。1H−NMR及びIR分析によりそれぞれ化合物6(収率31%)及び化合物7(収率3%)であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示した。
化合物6
1H−NMR(CDCl3−DMSO−d6)δ:0.90−2.10(16H,m)
3.17−3.90(7H,m)
4.07−4.27(1H,m)
4.33−4.77(3H,m)
5.98(1H,d)
6.83−7.20(2H,br)
8.10(1H,s)
8.15(1H,s)
IR(KBr)cm-1:3330,3160,2930,2850,1670,1600,1330,1300,1090.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.33(クロロホルム:メタノール=10:1)
化合物7
1H−NMR(CDCl3−DMSO−d6)δ:1.00−2.10(16H,m)
3.17−4.33(9H,m)
4.67−5.03(2H,m)
5.88(1H,d)
6.73−7.17(2H,br)
8.06(1H,s)
8.13(1H,s)
IR(KBr)cm-1:3320,3170,2930,2850,1690,1610,1340,1300,1100.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.25(クロロホルム:メタノール=10:1)

0032

つぎに、下記式で示される化合物8を以下の様にして調製した。

0033

0034

フルオレセイン2ナトリウム5.10g(13.6mmol)及びテトラ-n-ブチル硫酸水素塩4.60g(13.5mmol)のイソプロピルアルコール−水(1:1)60ml溶液に硫酸ジエチル3.60ml(27.5mmol)を加え、室温下で2時間攪拌した後、炭酸カリウム3.80g(27.5mmol)及び硫酸ジエチル2.70ml(27.5mmol)を加えた。45分間攪拌後、クロロホルムルで抽出し、10%クエン酸水溶液および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製およびアセトンからの再結晶を行い、赤褐色結晶性の化合物1.30gを得た(収率27%)。1H−NMR、紫外可視吸光スペクトルおよびIR分析により化合物8であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数、紫外−可視吸光スペクトルの吸収波長およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示し、1H−NMR、紫外−可視吸光スペクトルのチャート図5および図6に示した。
1H−NMR(CDCl3−DMSO−d6)δ:0.93(3H,t)
3.97(2H,q)
6.50−7.87(9H,m)
8.07−8.27(1H,m)
IR(KBr)cm-1:1720,1640,1590,1460,1270,1210,1110.
紫外−可視吸光スペクトル(メタノール)λmax:229,498.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.37(クロロホルム:メタノール=10:1)

0035

上記の様にして調製した化合物6の1.56g(3.21mmol)、化合物8の1.74g(4.83mmol)、トリフェニルホスフィン0.84g(3.21mmol)及び臭化テトラ-n-ブチルアンモニウム0.10g(0.32mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド15ml懸濁液に炭酸カリウム2.22g(16.1mmol)を加え、90℃で24時間攪拌後、放冷した。10%炭酸ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、残さをジクロロメタン20mlに溶解し、イミダゾール0.70g(10.3mmol)及び塩化t-ブチルジメチルシリル1.50gg(9.96mmol)を加え、室温で24時間攪拌した。次に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、燈褐色粉末状の化合物1.11gを得た(収率35%)。1H−NMRおよびIR分析により上記化合物5であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示し、1H−NMRチャートを図7に示す。
1H−NMR(CDCl3)δ:0.12(12H,s)
0.83−2.15(37H,m)
3.37−4.68(11H,m)
5.77−6.18(3H,m)
6.38−7.00(6H,m)
7.22−7.78(3H,m)
8.00−8.37(3H,m)
IR(KBr)cm-1:3330,2930,2860,1720,1640,1600,1520,1470,1250.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.51(クロロホルム:メタノール=5:1)

0036

実施例5
下記式で示される化合物9を以下の様にして合成した。

0037

0038

まず、下記式で示される化合物10を以下の様にして調製した。

0039

0040

5'-O-t-ブチルジメチルシリルウリジン25.5g(71.1mmol)のテトラヒドロフラン100ml溶液に0℃で2.0M塩化-t-ブチルマグネシウム/テトラヒドロフラン溶液75.0ml(150mmol)を滴下し、30分間攪拌後、同温で1,5-ジブロモペンタン82.0g(357mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド100ml溶液加え、21時間加熱還流した。放冷後、メタノール20mlを加えて不溶物を溶解した後、酢酸エチルで抽出し、10%クエン酸水溶液および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、無色液状の化合物を得た(収率50%)。1H−NMRおよびIR分析により化合物10であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示した。
1H−NMR(CDCl3)δ:0.08(6H,s)
0.89(9H,s)
1.33−2.17(6H,m)
3.20−4.45(10H,m)
5.60−5.90(2H,m)
7.82(1H,d)
IR(KBr)cm-1:3430,2930,1710,1660,1460,1100.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.53(クロロホルム:メタノール=10:1)

0041

上記の様にして得られた化合物10の1.80g(3.55mmol)、前記化合物8の1.35g(3.75mmol)、トリフェニルホスフィン0.93g(3.55mmol)及び臭化テトラ-n-ブチルアンモニウム0.12g(0.36mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド15ml懸濁液に炭酸カリウム2.45g(17.7mmol)を加え、90℃で10時間攪拌後、放冷した。次に、1.0Mフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム/テトラヒドロフラン溶液5.0ml(5.0mmol)を加え、室温で3.5時間攪拌後、クロロホルムで抽出し、水および飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、燈褐色粉末状の化合物1.15gを得た(収率48%)。1H−NMRおよびIR分析により上記化合物9であることを確認した。1H−NMRシグナルのケミカルシフト、IRシグナルの波数およびシリカゲル薄層クロマトグラフィーの移動度を以下に示し、IRチャートを図8に示す。
1H−NMR(CDCl3−DMSO−d6)δ:0.82−2.05(9H,m)
5.63(1H,d)
5.88(1H,d)
6.20−8.33(11H,m)
IR(KBr)cm-1:3390,2940,1710,1660,1600,1500,1460,1250,1210,1110.
シリカゲル薄層クロマトグラフィー
Rf:0.59(クロロホルム:メタノール=5:1)

0042

実施例6
下記式で示される化合物11及び化合物12を以下の様にして合成した。

0043

0044

0045

実施例5で合成した化合物9の673mg(1.00mmol)をトリメチルホスフェート5mlに溶解し、−10〜−20℃で、オキシ塩化リン0.10ml(1.07mmol)を滴下し、同温で30分間攪拌後、さらにオキシ塩化リン0.10ml(1.07mmol)を滴下した。室温下で50分間攪拌した後、反応混合物を−10〜−20℃で、1.0Mピロリン酸−トリス(トリ-n-ブチルアンモニウム)/N,N-ジメチルホルムアミド溶液9.0mlに滴下した。室温下で2時間攪拌した後、反応混合物を0℃で、トリエチルアミン1.40mlの水20ml溶液に加え、15分間攪拌した後、4℃で20時間放置した。クロロホルムで抽出した後、有機層に、水25ml、0.5M炭酸水素ナトリウム/炭酸ナトリウム水溶液(pH=9.0)10ml及びアセトン25mlを加えて攪拌した後、水層分取した。水層を高速液体クロマトグラフィーを用い、下記条件で分析したところ、図9に示すチャートが得られた。
カラム:ODS−15
溶出溶媒メタノール水溶液20−40%(20分)
検出波長: 254nm
チャートスピード: 2.5mm/min
ピークI及びピークIIをそれぞれ分取し、紫外−可視吸光スペクトル及び31P−NMR分析を行い、ピークIが化合物11、ピークIIが化合物12であることを確認した。紫外−可視吸光スペクトルの吸収波長および31P−NMRのケミカルシフトを以下に示し、紫外−可視吸光スペクトルのチャートを図10および図11に示した。
化合物11
紫外−可視吸光スペクトル(H2O)λmax:229,254,454,477.
31P−NMR(D2O)δ:−22.7, −12.2, −7.4
化合物12
紫外−可視吸光スペクトル(H2O)λmax:228,253,454,477.
31P−NMR(D2O)δ: −11.9, −7.9

発明の効果

0046

本発明で提供される2'-又は3'-水酸基に非放射性標識を有するヌクレオシド、ヌクレオチド誘導体を用いれば、非放射性標識をオリゴマー中の任意の位置に任意の数だけ導入することができること、及び、従来の核酸塩基部に導入する方法あるいは、ヌクレオシドを構成するフラノース環の特定部分に非放射性標識を直接導入する方法に比較して、核酸本来の機能を損なう可能性が低いという特長を有しているため、その利用価値は高い。又、フルオレセインイソチオシアネートなどの高価な原料を用いることなく、安価なフルオレセインまたはそのエステルを用いることができ安価に製造出来るという特長を示す。

図面の簡単な説明

0047

図1図1は実施例1で得られた化合物1のIRチャート。
図2図2は実施例1で得られた化合物2のIRチャート。
図3図3は実施例2で得られた化合物3の1H−NMRチャート。
図4図4は実施例3で得られた化合物4の1H−NMRチャート。
図5図5は実施例4で調製した化合物8の1H−NMRチャート。
図6図6は実施例4で調製した化合物8の紫外−可視吸収スペクトルチャート。
図7図7は実施例4で得られた化合物5の1H−NMRチャート。
図8図8は実施例5で得られた化合物9のIRチャート。
図9図9は実施例6で得られた反応物HPLCチャート。
図10図10は実施例6で得られた化合物11の紫外−可視吸収スペクトルチャート。
図11図10は実施例6で得られた化合物12の紫外−可視吸収スペクトルチャート。

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