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図面 (1)

構成

下記性状を有する蛋白質であることを特徴とする血管内皮細胞増殖抑制因子、及びその製造法

(1)ヒト線維芽細胞培養上清に含有される。

(3)in vitroにおけるヒト血管内皮細胞増殖抑制作用を有する。

(4)分子量が100〜150kd(分子篩クロマトグラフィーにより測定)。

効果

腫瘍網膜症慢性関節リウマチといった種々の血管新生を伴う疾病の予防、治療薬として有用である。

概要

背景

血管内皮細胞は、血管の内腔を覆う単層を形成する細胞であり、創傷治癒腫瘍増生の際の血管新生と密接に関係しており、その存在が重要視されている。また、腫瘍の増生、網膜症あるいは慢性関節リウマチといった病状の進行または乾癬の拡大といった血管新生を伴う疾病に対し、かかる血管内皮細胞の増殖抑制因子抑制的に作用することは明らかである。

既に、ヒト線維芽細胞からは、血管内皮細胞増殖因子が、既に発見されている(特開昭62−56428号公報)。また、in vitroでのヒト血管内皮細胞増殖抑制因子としては次のようなもの、例えば、ヒト血小板由来TGF−β〔A.Bairdら,B.B.R.C.,138,476(1986)〕、ヒト単球由来TNF−α〔L.Schweigererら,B.B.R.C.,143,997(1987)〕、ヒトIFN−γ〔R.Frieselら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,104,604(1987)〕、コラーゲンタイプV(K.Fukudaら,B.B.R.C.,151,1066(1988)〕、ヒト血小板第4因子〔(T.E.Maioneら、Science,247,77(1990)〕等が報告されている。また、TGF−β及びTNF−αは、動物を使ったin vivoで血管新生を促進することが報告されている〔A.Robertsら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,84,5277(1987)〕。また、IFN−γは、動物を使ったin vivoでも血管新生を抑制すると報告されている〔Y.Sidkyら、Cancer.Res.,47,5155(1987)〕。このように、従来、種々の組織あるいは培養細胞由来の物質について各種研究がなされているが、ヒト線維芽細胞上清中に上記ヒト血管内皮細胞の増殖抑制活性を有する因子が存在することは全く知られておらず、勿論かかる因子をヒト線維芽細胞より分離した例は皆無である。

概要

下記性状を有する蛋白質であることを特徴とする血管内皮細胞増殖抑制因子、及びその製造法

(1)ヒト線維芽細胞の培養上清に含有される。

(2)ヘパリンセファロースアフィニティーカラム吸着されない。

(3)in vitroにおけるヒト血管内皮細胞の増殖抑制作用を有する。

(4)分子量が100〜150kd(分子篩クロマトグラフィーにより測定)。

腫瘍、網膜症、慢性関節リウマチといった種々の血管新生を伴う疾病の予防、治療薬として有用である。

目的

本発明はこのような事情に着目してなされたものであって、今までの血管内皮細胞増殖抑制因子と由来が異なり、ヒト線維芽細胞由来の血管内皮細胞増殖抑制因子を提供することを課題とするものである。

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

下記性状を有する蛋白質であることを特徴とする血管内皮細胞増殖抑制因子ヒト線維芽細胞培養上清に含有される。ヘパリンセファロースアフィニティーカラム吸着しない。in vitroにおけるヒト血管内皮細胞増殖抑制作用を有する。分子量100〜150kd(分子篩クロマトグラフィーによって測定)。

請求項2

ヒト線維芽細胞を無血清培地で培養し、その培養上清液をヘパリンセファロースアフィニティーカラムに付して血管内皮細胞増殖因子を除いた後、高速液体クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過を行うことを特徴とする請求項1記載の血管内皮細胞増殖抑制因子の製造法

技術分野

0001

本発明は血管内皮細胞増殖抑制因子、詳しくは、in vitroでのヒト血管内皮細胞の増殖を抑制する活性を有し、医薬として有用な新しい生理活性物質及びその製造法に関する。

背景技術

0002

血管内皮細胞は、血管の内腔を覆う単層を形成する細胞であり、創傷治癒腫瘍増生の際の血管新生と密接に関係しており、その存在が重要視されている。また、腫瘍の増生、網膜症あるいは慢性関節リウマチといった病状の進行または乾癬の拡大といった血管新生を伴う疾病に対し、かかる血管内皮細胞の増殖抑制因子抑制的に作用することは明らかである。

0003

既に、ヒト線維芽細胞からは、血管内皮細胞増殖因子が、既に発見されている(特開昭62−56428号公報)。また、in vitroでのヒト血管内皮細胞増殖抑制因子としては次のようなもの、例えば、ヒト血小板由来TGF−β〔A.Bairdら,B.B.R.C.,138,476(1986)〕、ヒト単球由来TNF−α〔L.Schweigererら,B.B.R.C.,143,997(1987)〕、ヒトIFN−γ〔R.Frieselら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,104,604(1987)〕、コラーゲンタイプV(K.Fukudaら,B.B.R.C.,151,1066(1988)〕、ヒト血小板第4因子〔(T.E.Maioneら、Science,247,77(1990)〕等が報告されている。また、TGF−β及びTNF−αは、動物を使ったin vivoで血管新生を促進することが報告されている〔A.Robertsら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,84,5277(1987)〕。また、IFN−γは、動物を使ったin vivoでも血管新生を抑制すると報告されている〔Y.Sidkyら、Cancer.Res.,47,5155(1987)〕。このように、従来、種々の組織あるいは培養細胞由来の物質について各種研究がなされているが、ヒト線維芽細胞上清中に上記ヒト血管内皮細胞の増殖抑制活性を有する因子が存在することは全く知られておらず、勿論かかる因子をヒト線維芽細胞より分離した例は皆無である。

発明が解決しようとする課題

0004

本発明はこのような事情に着目してなされたものであって、今までの血管内皮細胞増殖抑制因子と由来が異なり、ヒト線維芽細胞由来の血管内皮細胞増殖抑制因子を提供することを課題とするものである。

課題を解決するための手段

0005

本発明者らは、上記課題を解決するため、ヒト線維芽細胞上清中に血管内皮細胞の増殖抑制活性を有する因子を見出し、本発明を完成するに至った。

0006

即ち、本発明は、下記性状を有する蛋白質であることを特徴とする血管内皮細胞増殖抑制因子に関する。
ヒト線維芽細胞の培養上清に含有される。
ヘパリンセファロースアフィニティーカラム吸着しない。
in vitroにおけるヒト血管内皮細胞の増殖抑制作用を持つ。
分子量100〜150kd(分子篩クロマトグラフィーにより測定)。

0007

本発明はまた、ヒト線維芽細胞を無血清培地で培養し、その培養上清液をヘパリンセファロースアフィニティーに付して、血管内皮細胞増殖因子除いた後、高速液体クロマトグラフィーにかけ、ゲル濾過を行うことを特徴とする血管内皮細胞増殖抑制因子の製造法に関する。

0008

本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子は、例えば以下のようにして調製することができる。

0009

本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子の由来とするヒト線維芽細胞としては、血管内皮細胞増殖抑制因子産生能を有するものであれば特に限定はされないが、好ましくは、ヒト胎児由来の線維芽細胞が挙げられる。

0010

当該ヒト線維芽細胞の培養に用いられる培地としては、MEM培地及びRITC−807培地に5〜10%の哺乳動物血清(例、胎仔血清、仔牛血清ヒト血清馬血清)を含む培地が好ましい。また本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子を採取する際には、RITC−807培地に、マウス上皮性細胞増殖因子(EGF)5〜20ng/ml,インシュリン1〜5μg/ml,トランスフェリン5〜15μg/ml,アプロチニン0.5〜1.5μg/ml,及び牛血清アルブミンBSA)を添加した無血清培地が好ましい。

0011

ヒト線維芽細胞の培養に際しては、最初から該細胞を無血清培地で培養してもよいが、哺乳動物血清を含む培地で、サブコンフルエントまで培養し、その後、培地を除き、リン酸緩衝塩類溶液細胞層洗浄して無血清培地に交換して培養することが好ましい。また、当該ヒト維芽細胞の培養は、通常常圧で37±0.5℃で行われ、培養に使用される気相は、二酸化炭素5%、酸素10〜20%、窒素85〜75%が好ましい。

0012

次に、上記ヒト線維芽細胞を培養して得た培養上清を原材料とし、酸性側pH条件下で、望ましくはpH5.0以下の緩衝液透析後、酢酸緩衝液平衡化されたヘパリンセファロースカラムに付し、血管内皮細胞増殖因子を吸着させて除き、カラム素通り画分に本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子を得、該素通り画分を濃縮する。このことから明らかなように、本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子は、上記の如き酸性条件下においてヘパリンセファロースカラムに吸着されず、血管内皮細胞増殖因子と分離され得るものである。

0013

かくして得られた抽出画分を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にかけ、ゲル濾過を行い、精製し、本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子を得ることができる。

0014

本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子の分子量は、100〜150kd(分子篩クロマトグラフィーにより測定)であり、それはTSKG−2000SWまたはTSKG−3000SWカラムクロマトグラフィーを用い測定したものである。

0015

本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子はin vitroにおけるヒト血管内皮細胞の増殖抑制作用を持つものであるが、その活性測定は、通常以下のようにして行われる。すなわち、ヒト臍帯大動脈壁等由来のヒト血管内皮細胞をプロテアーゼ処理トリプシン又はコラゲナーゼ)して分離し〔(E.A.Jaffeら,J.Clin.Invest.,52,2745(1973)〕、この血管内皮細胞を10%牛胎仔血清を添加したRITC−807培地に懸濁させ、コラーゲンコートした12ウェルマルチプレートコースター社製)に3.4×104 cells/穴の濃度でまき込み、5%炭酸ガス,10〜20%酸素及び75〜85%窒素の存在下で培養する。血管内皮細胞をまき込んで約6時間後に、ヒト血管内皮細胞増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子(b−FGF)2〜5ng/mlを添加し、同時に所定量の被検試料(本発明のECGI又は他の各種因子)を添加し、培養開始後、3〜4日間細胞数をカウントして追跡する。b−FGF無添加群及びb−FGFだけを添加した群をコントロールとし、b−FGFの内皮細胞増殖促進作用を抑制する活性を測定する。ヒト血管内皮細胞増殖因子としては、b−FGFだけでなく、酸性線維芽細胞増殖因子(a−FGF)などの他の血管内皮細胞増殖因子を使用してもよい。

0016

以下に実施例及び実験例を示し、本発明をより具体的に述べるが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。

0017

実施例1
(1)(ヒト2倍体線維芽細胞の培養上清液の調製)
ヒト胎児肺由来の2倍体線維芽細胞(HEL)を10%牛胎仔血清を含むRITC−807培地で、小容量の培養容器、T−75フラスコ(コースター社製)で培養してコンフルエントになった細胞を、約3倍の培養面積をもった培養容器、T−225フラスコ(コースター社製)に植え込んだ。約3日後に培地を除去し、Ca2+イオン及びMg2+イオン無添加のリン酸緩衝塩類溶液〔PBS(−)と略す〕で細胞層を2回洗浄した。その後、マウス上皮細胞増殖因子(EGF)5〜20ng/ml、インシュリン1〜5μg/ml、トランスフェリン5〜15μg/ml、アプロチニン0.5〜1μg/ml及び0.1%牛血清アルブミン(BSA)を含むRITC培地に交換し、2〜4日毎に新鮮培地と培地交換しながら培養上清を採取した。その培養上清にフェニルメタンスルフォニルフルオリドPMSF)70〜150μM、エチレンジアミン酢酸ナトリウム3〜7mMを添加し、限外濾過膜YM−10(アミコン社製)で1/50〜1/100に濃縮した。その後、pH4.5の酢酸緩衝液50mM及び塩化ナトリウム100mMを含む透析外液により4℃で透析を行った。透析終了後遠心分離(10000rpm,4℃,15分間)して上清を得た。

0018

(2)(ヒト2倍体線維芽細胞の産生する血管内皮細胞増殖抑制因子の精製)
(1)に記載した如く、ヒト2倍体線維芽細胞(HEL)を無血清培地で培養して得た培養上清を原材料をした。約2lの培養上清より調製された原材料をpH4.5の酢酸緩衝液20mMで平衡化されたヘパリンセファロースCL−6Bカラム(1.6×15cm)(ファルマシア社製)に付し、カラム素通り画分を限外濾過膜YM−10で濃縮した。以下、これを粗抽出画分をいう。該粗抽出画分の活性を図1に示す。次に、該粗抽出画分を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にかけ、ゲル濾過を行った。その結果、分子量100〜150kd及び14〜25kdの画分に活性が認められた。低分子量の物質はTGF−βと考えられるが、高分子量の物質は新規の因子を考えられる。この様にして、本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子を得ることができた。

0019

実験例1(ヒト血管内皮細胞の増殖抑制活性測定)
ヒト臍帯由来血管内皮細胞(HuV−EC)をプロテアーゼ処理(トリプシン又はコラゲナーゼ)して分離した。この血管内皮細胞を10%牛胎仔血清を添加したRITC−807培地に懸濁させ、コラーゲンコートした12ウェルマルチプレート(コースター社製)に3.4×104 cells/穴の濃度でまき込み、5%炭酸ガス,10〜20%酸素及び75〜85%窒素の存在下で培養した。血管内皮細胞をまき込んで約6時間後に、ヒト血管内皮細胞増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子(b−FGF)5ng/mlを添加し、同時に被検試料(本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子)を添加した。培養開始後、3〜4日間細胞数をカウントして追跡した。b−FGF無添加群及びb−FGFだけを添加した群をコントロールとし、b−FGFの内皮細胞増殖促進作用を抑制する活性を測定した。その結果、被験試料は著しく血管内皮細胞の増殖を抑制し、培養3日後のその細胞数は、b−FGF無添加対照群のそれとほぼ等しかった。

0020

実験例2 (種々の血管内皮細胞の増殖に対する本発明の血管内皮細胞増殖抑制因子の抑制効果
実施例1(2)で得られた粗抽出画分について、上記記載の方法に従って種々の培養細胞に対する増殖抑制活性を調べた。ウサギ血管内皮細胞(REC)、マウス脾臓由来内皮細胞MSS−31)、ヒト胎児正常2倍体線維芽細胞(MRC−5)、マウス細胞(Balb/C3T3)、牛卵胞細胞(BFC)、ヒト甲状腺上皮細胞(THR−2)、牛血管内皮細胞(CPAE)、ヒト血管内皮細胞(HuV−EC)を各々培養し、増殖抑制活性を調べた結果、ヒト血管内皮細胞及び牛血管内皮細胞の増殖に対してだけ増殖抑制作用が認められた。

発明の効果

0021

本発明のヒト線維芽細胞由来の血管内皮増殖抑制因子は、ヒト血管内皮細胞の増殖を特異的に抑制する活性をもつので、腫瘍、網膜症、慢性関節リウマチといった種々の血管新生を伴う疾病の予防・治療薬として使用出来る可能性が非常に大である。

図面の簡単な説明

0022

図1ヒト胎児肺由来の2倍体線維芽細胞の培養上清から調製された該粗抽出画分のヒト血管内皮細胞増殖抑制活性についての濃度依存曲線を示す。

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