技術 光学活性なノルスタチン誘導体の製造方法

0001

本発明は、医薬品の中間体として有用な光学活性ノルスタチン誘導体の立体選択的な製造方法に関する。さらに詳しく述べれば、本発明は、各種レニン阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、制癌剤の中間体である光学活性なノルスタチン誘導体を、シアノヒドリン誘導体あるいはアルデヒド誘導体から、酵素を用いて立体選択的に製造する方法に関する。

0002

ノルスタチン誘導体の製造方法としては、特開昭６２−３３１４１号公報、特開平１−１７２３６５号公報、特開平４−２０８２５７号公報などが知られている。また、酵素を用いた方法としては、特開平２−６０５９５号公報などが既に知られている。

0003

しかし、上記の方法では、中間体として生成するシアノヒドリン誘導体のジアステレオ選択性が低く、従って、目的である光学活性なノルスタチン誘導体を得るためには煩雑な精製が必要となる等の欠点があり、満足すべき製法とは言い難い。

0004

本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、シアノヒドリン誘導体あるいはアルデヒド誘導体から、酵素を用いて立体選択的にノルスタチン誘導体を製造する方法を見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、

0005

下記式（１）；

0006

で示されるシアノヒドリン誘導体に、酵素を作用させる、下記式（２）；

0007

下記式（３）；

0008

ID=000011HE=030 WI=067 LX=1165 LY=0300
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 、（Ｒ）、（Ｓ）は前述と同意味を表す。〕で示される光学活性なノルスタチン誘導体の立体選択的な製造方法を提供する。さらに

0009

下記式（５）；

0010

及び下記式（６）；

0011

本発明において、式中、Ｒ1 は水素、あるいはアミノ基の保護基を表し、Ｒ2は置換あるいは無置換のアルキル基、アリール基、アラルキル基を表す。また、（Ｓ）を記した炭素原子はＳ配置であり、（Ｒ）を記した炭素原子はＲ配置である。この場合、アミノ基の保護基としては、通常一級アミノ基に使用されるウレタン型、アミド型などの保護基、特に好ましくは、本発明の化合物を原料としての、各種プロテアーゼ阻害剤の製造において都合の良い保護基、すなわち、水素添加によって容易に脱保護できるベンジルオキシカルボニル基、あるいは酸分解によって容易に脱保護できるtert. −ブトキシカルボニル基等が望ましい。

0012

また、Ｒ2 で表されるアルキル基、アリール基、アラルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基などのような炭素数１〜５のアルキル基；また、炭素数３〜８のシクロアルカンが置換した、例えば、シクロヘキシルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルエチル基などのようなアルキル部分の炭素数１〜５のシクロアルカン置換アルキル基；フェニル基、ナフチル基、トリル基などのようなアリール基、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ｐ−メチルベンジル基などのようなものが挙げられる。

0013

この場合に、アルキル基、アリール基、アラルキル基は官能基を有してもよい。官能基としては、例えば、一置換から三置換までの、例えば、フッ素基、塩素基、臭素基などのようなハロゲン基；メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基などのような炭素数１〜５のアルコキシ基；カルボキシル基、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基などのような炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基；ニトロ基、アミノ基、アミノカルボニル基などが挙げられる。

0014

式（１）、式（３）、式（５）および式（６）で示される化合物は、対応するＤあるいはＬアミノ酸から、公知の方法により容易に製造される。本発明に用いるニトリル加水分解酵素としては、ニトリルをカルボン酸に変換する酵素、即ち、ニトリラーゼ、もしくはニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ活性を有する物を使用することができる。

0015

例えば、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、シュウドモナス属、ロドシュウドモナス属、コリネバクテリウム属、バチルス側、マイコバクテリウム属、ロドコッカスぞク、ノカルディア属、アルスロバクター属、モラキセラ属、クレブシエラ属、アクレモニウム属またはキャンディダ属に属する微生物の中から選ばれた微生物の酵素である。

0016

具体的な微生物としては、アシネトバクターエスピーＡＫ２２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−２４５１）、アルカリゲネスフェカリスＡＴＣＣ８７５０、シュウドモナスフルオレッセンスＩＦＯ ３９２５、ロドシュウドモナススフェロイデス ＡＴＣＣ １１１６７、コリネバクテリウムエスピー ＫＯ−２−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３５３）、バチルスサブチリスＣＮ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３５４）、マイコバクテリウムエスピー ＡＣ ７７７（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３５２）、ロドコッカスエスピー ＡＫ ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６）、ノカルディアグロベルラ ＡＴＣＣ ２１５０５、アルスロバクターエスピー Ａ７（微工研菌寄託第８９２７号）、モラキセラエスピーＤ１２（微工研菌寄託 第８９３３号）、クレブシェラ エスピー Ｄ５Ｂ（微工研菌寄託 第８９３２号）、アクレモニウムエスピー Ｄ９Ｋ（微工研菌寄託 第８９３０号）、キャンディダトロピカリスＡＴＣＣ ２０３１１等が挙げられる。これらの菌株は何れも特開平２−８４１９８号公報、特開昭６３−２０９５９２号公報に記載されている。

0017

本発明における反応方法は、ニトリル加水分解酵素、即ち微生物またはその調製物と、前記式（１）あるいは、前記式（３）で示されるシアノヒドリン誘導体、もしくはシアン化合物の存在下、前記式（５）あるいは、前記式（６）で示されるアルデヒド誘導体を接触させることにより行われる。微生物またはその調製物とは、具体的には、前記微生物を培養した培養物、そこから集めた菌体または菌体処理物（例えば、菌体の破砕物または菌体より分離抽出した酵素）、さらには、菌体または菌体処理物を適当な方法により担体に固定化したものを示す。

0018

本発明で使用される微生物の培養は、公知の方法に準じて行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄養源として公知のものが利用でき、グルコース、グリセリン、エタノール、シュークロース、グルタミン酸、酢酸、クエン酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア、尿素等の窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等の有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、コバルト、マンガン、ランタン等の無機栄養源を適宜組み合わせて使用できる。

0019

また、微生物の本発明における反応活性を上昇させる物質として、イソブチロニトリル等のシアノ化合物、カプロラクタム等のアミド化合物を添加しても良い。培地のｐＨは５〜１０の範囲で選べば良く、培養温度は１８〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養時間は１〜１０日の範囲で活性が最大になるまで培養すれば良い。

0020

本発明における反応条件を次に説明する。反応媒体は、水、緩衝液または培養液等の水性媒体、水性媒体とジメチルスルホキシド、メタノール等の水溶性有機溶媒との混合媒体、さらには、水性媒体と水不溶性有機溶媒とからなる２相系媒体が使用できる。また、反応媒体中に適当な界面活性剤を０．０１〜１０重量％程度添加しても良い。反応媒体中への基質の添加は前記式（１），（３），（５）あるいは式（６）で示される化合物を粉末または液状のままで、あるいは適当な溶媒に溶かして添加する。

0021

添加濃度は０．０１〜７０重量％程度、好ましくは、０．１〜４０重量％であり、反応媒体中に完全に溶解しなくても良い。原料としてアルデヒド誘導体を用いる場合はシアン化ナトリウム、シアン化カリウム等のシアン化合物をアルデヒド誘導体に対して０．５〜３０倍モル、望ましくは、１〜１０倍モル添加する。

0022

反応に菌体を使用する場合の菌体濃度は通常、０．０１〜４０重量％であり、好ましくは０．０５〜２０重量％の範囲でよい。反応温度は５〜８０℃、好ましくは１５〜６０℃、反応ｐＨは４〜１２、好ましくは６〜１０である。反応は、通常１〜１００時間で目的生成物である前記式（２）、あるいは前記式（４）の光学活性ノルスタチン誘導体の光学純度が低下しない範囲で終了すれば良く、通常、反応率は１０〜１００％、望ましくは、４０〜１００％である。このときの生成物の光学純度は８０％e.e.以上が望ましい。消費される基質は上記の範囲内に維持されるように添加しても良い。

0023

本発明における反応機構は、ニトリルをカルボン酸に変換する酵素であるニトリラーゼもしくはニトリルヒドラターゼ、アミダーゼがシアノヒドリンの２位にＲ配置を有するニトリルに選択的に作用すること、即ち、該酵素による反応速度が不斉中心によって非常に大きく異なることに基づくと考えられる。さらに、作用されずに残るもう一方のシアノヒドリン異性体は、シアン化合物の存在下、アルデヒド誘導体との平衡反応により、自然にラセミ化されたシアノヒドリン誘導体となり、反応は進む。この結果、ラセミ体の原料に対する反応率は５０％を越えることもできる。従って、原料として前記式（５）あるいは、前記式(6) で示すアルデヒド誘導体とシアン化合物も用いることができる。

0024

本発明における目的生成物の分離は、次のようにして行われる。反応終了液より菌体等の不溶物を除去したのち、ｐＨをアルカリ性、好ましくは８．５〜１２とし、水と混和しない不活性な溶媒、例えば、ベンゼン、ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル等の溶媒により未反応物を抽出除去し、次に、ｐＨを酸性、好ましくは２．０〜３．０とし、上記溶媒で抽出することによって目的物を分離する。更に、目的物の精製は、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーや活性炭処理等により行われる。

0025

反応生成物、及び、原料の光学純度は例えば、キラルセルＯＤ−Ｒ、キラルセルＯＪ、キラルＡＧＰ（ダイセル化学工業株式会社）、Ceramospher Chiral RU −１（資生堂）、SUMICHIRALOA（住友化学分析センター）等の光学分割カラム、あるいは、ノバパック−Rhenyl（ウォーターズ）等を用いたＨＰＬＣ分析によって測定することができる。

0026

（参考例１）
Ｎ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｌ−シクロヘキシルアラニナール（下記式(7) の合成：

0027

Ｎ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｌ−シクロヘキシルアラニノール２５．７３ｇ（９９．９８mmol）をＤＭＳＯ１２０ ml 及びトルエン５８ ml に加え、０℃に冷却した。これにトリエチルアミン７５．７ ml （５４１．８９mmol) を加えた後に、三酸化硫黄−ピリジン錯体８６．２４ｇ（５４１．８９mmol）を徐々に加え、０℃で１時間攪拌した。反応終了後、反応液に、酢酸エチル３００ ml及び氷水３００ ml を加え、有機層を分液した後、飽和食塩水３００ ml で有機層を３回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１〜３：１）で生成し、Ｎ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｌ−シクロヘキシルアラニナール２５．０３ｇ（９８．０２mmol）を収率９８．０４％で得た。

0028

ＩＲ（ＫＢｒ）：３３００，２９２０，１７３０，１６７０，１５２０，１３７０，１２９０，１１７５cm-1
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：０．８−２．０（ｍ，１３Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），４．２９（ｂ，１Ｈ），４．９０（ｂ，１Ｈ），９．５９（ｓ，１Ｈ）。
ＭＳ m／e ：２５６（Ｍ＋１）+

0029

（参考例２）
Ｎ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシルアラニナール（下記式(8) の合成：

0030

ＩＲ（ＫＢｒ）：３３００，２９２０，１７３０，１６７０，１５２０，１３７０，１２９０，１１７５cm-1
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：０．８−２．０（ｍ，１３Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），４．２９（ｂ，１Ｈ），４．９０（ｂ，１Ｈ），９．５９（ｓ，１Ｈ）。
ＭＳ m／e ：２５６（Ｍ＋１）+

0031

（参考例３）
３−（Ｓ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシブチロニトリル（下記式（9)の合成：

0032

Ｎ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｌ−シクロヘキシルアラニナール１３．０１ｇ（５０．９４mmol）を水１３２ ml 及びクロロホルム５３５ ml に加え、０℃に冷却した。これにシアン化ナトリウム７．４９ｇ（１５２．８２mmol）を加えた後に、１Ｎ−ＨＣｌ １５３ ml を滴下し、０℃で１２時間攪拌した。反応終了後、反応液の有機層を分液した後、水層からクロロホルム３００ ml で有機層を抽出した。合わせた有機層を水３００ ml で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮し無色透明油状物、３−（Ｓ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシブチロニトリル１４．３８ｇ（５０．９４mmol）を収率１００％で得た。

0033

高速液体クロマトグラフィーの分析により、シン体（２Ｒ，３Ｓ）が６４％、アンチ体（２Ｓ，３Ｓ）が３６％であった。以下、その分析条件を示した。（カラム：ウォーターズNova-PaK Pheny １３，９×４７mm溶離液： pH ＝３．５
０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｈ3 ＰＯ4 ／ＣＨ3 ＣＮ＝７０／３０流速：１ml／min 検出：ＲＩ検出器保持時間：２６，１min （シン），２４．５min（アンチ））

0034

ＩＲ（ＮａＣｌ）：３３３０，２８５０，２２５０，１６９５，１５１０，１４５５，１３７０，１２５０，１１７０cm-1
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：０．８：１．８（ｍ，１３Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），３．６−４．１（ｍ，１Ｈ），４．３−４．７（ｍ，１Ｈ），４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．３５（ｂｒ，１Ｈ）
ＭＳ m／e ：２８３（Ｍ＋１）+

0035

（参考例４）
３−（Ｒ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシブチロニトリル（下記式(10)の合成：

0036

Ｎ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシルアラニナールから、参考例３と同様な方法を用いて、３−（Ｒ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシブチロニトリルを得た。高速液体クロマトグラフィーの分析により、シン体（２Ｓ，３Ｒ）が６４％、アンチ体（２Ｒ，３Ｒ）が３６％であった。

0037

ＩＲ（ＮａＣｌ）：３３３０，２８５０，２２５０，１６９５，１５１０，１４５５，１３７０，１２５０，１１７０cm-1
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：０．８：１．８（ｍ，１３Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），３．６−４．１（ｍ，１Ｈ），４．３−４．７（ｍ，１Ｈ），４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．３５（ｂｒ，１Ｈ）
ＭＳ m／e ：２８３（Ｍ＋１）+

0038

以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
（実施例１）
３−（Ｓ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸（下記式(11)の合成：

0039

グルコース１．０％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．５％、リン酸１カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０２％、塩化ナトリウム０．１％、イソブチロニトリル０．１％を含み、 pH を７．５とした殺菌培地１００ ml に、予め同培地で培養したニトリラーゼ活性を持つロドコッカス属細菌を１％植菌し、３２℃で４８時間培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、これを水道水１０ ml の入った三角フラスコ中に懸濁させた後、１０ ml のエタノールに溶解させた５０ mg の３−（Ｓ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシブチロニトリルを添加し、３０℃で４８時間反応を行った。

0040

反応終了後、遠心分離により菌体を除去した後、その上清液から抽出・クロマト操作にて、１６ mg の３−（Ｓ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸を収率３０％で得た。参考例３のＨＰＬＣ分析（保持時間：５．９min ）から光学純度は９０％e.e.であった。

0041

ＩＲ（ＫＢｒ）：３３５０，２９２０，２８５０，１７２０，１６９０，１５１０，１３７０，１２５５，１１７０cm-1
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：０．８：２．１（ｍ，１３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），４．１−４．５（ｍ，２Ｈ），５．１−５．６（ｂｒ，１Ｈ），５．７−６．１（ｂｒ，１Ｈ）
ＭＳ m／e ：３０２（Ｍ＋１）+

0042

（実施例２）
３−（Ｒ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸（下記式(12)の合成：

0043

グルコースの代わりに酢酸アンモニウムを用いる以外は実施例１と同じ組成の培地で培養したニトリル加水分解活性を有するアシネトバクター属細菌を培養した後集菌した。これを４０ ml の水が入った三角フラスコに懸濁した後、１０ ml のメタノールに溶解した３−（Ｒ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシブチロニトリル８０ mg を添加し、３０℃で４８時間反応を行った。

0044

反応終了後、遠心分離によって菌体を除去し、上清をpH１０にしたのち４０ ml のクロロホルムを加え、未反応体を除去した。ついで、水層の pH を１．５にし５０ ml のクロロホルムで抽出した。有機層を濃縮して５２ mg の３−（Ｒ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸を収率６０％で得た。ＨＰＬＣ分析（保持時間：７．０min ）における光学純度は９１％e.e.であった。

0045

ＩＲ（ＫＢｒ）：３３５０，２９２０，２８５０，１７２０，１６９０，１５１０，１３７０，１２５５，１１７０cm-1
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：０．８：２．１（ｍ，１３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），４．０−４．３（ｍ，２Ｈ），４．８−５．１（ｂｒ，１Ｈ），６．０−６．３（ｂｒ，１Ｈ）
ＭＳ m／e ：３０２（Ｍ＋１）+

0046

（実施例３）実施例１と同じ組成の培地で培養したマイコバクテリウム属細菌を培養した後、集菌した。これを４０ ml の０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ pH ７．２）が入った三角フラスコに懸濁した後、１０ ml のメタノールに溶解したＮ−tert．−ブトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシルアラニナール５００ mg とシアン化ナトリウム９６ mg を添加し、３０℃で４０時間反応を行った。

0047

反応終了後、遠心分離によって菌体を除去し、上清を抽出・クロマト操作を行うことにより５００ mg の３−（Ｒ）−tert．−ブトキシカルボニルアミノ−４−シクロヘキシル−２−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸を収率８５％で得た。ＨＰＬＣ分析における光学純度は９３％e.e.であった。

0048

本発明により、各種レニン阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、制癌剤の中間体であるノルスタチン誘導体をニトリル加水分解酵素を用いて、常温常圧の反応条件で製造できる。さらに、本発明によれば光学純度の極めて高いノルスタチン誘導体を高選択的、かつ、高収率で得ることが可能となった。