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技術 殺虫剤の製造方法及び殺虫剤

出願人 株式会社クボタ
発明者 堀秀隆浅野昌司レスリー・イントラシット橘峰生河杉忠昭
出願日 1993年4月19日 (27年7ヶ月経過) 出願番号 1993-090975
公開日 1994年10月25日 (26年1ヶ月経過) 公開番号 1994-298618
状態 未査定
技術分野 農薬・動植物の保存
主要キーワード 調査条件 添加量依存性 硫酸マンガン一水和物 硫酸鉄七水和物 増進物質 SM培地 層分配 上清成分
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(1994年10月25日)のものです。
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図面 (4)

目的

殺虫活性の高い殺虫剤を製造すること。

構成

バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記膜分離成分から陽イオン交換樹脂担体とするカラムクロマトグラフィー等電点がpH8以上の活性画分を分離し、前記カラム精製成分から分子ふるいを用いて活性画分を分離して、前記固体成分と前記精製成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造する。

概要

背景

従来、バチルス属の菌の多くが鱗翅目甲虫目双翅目鞘翅目等の昆虫殺虫する毒素タンパク生産することが知られており、この結晶毒素タンパクを含んだ生きた菌体や、死菌化した菌体、もしくは分離精製した結晶毒素タンパクを主要組成物として、前記昆虫類を殺虫するための殺虫剤を製造することが行われていた。尚、このときバチルス属の菌を培養すると、その培養物には固体成分と液体成分が含まれるが、前記毒素タンパクは、主として前記固体成分に含まれるものであったため、この培養物を固液分離して得られた液体成分である培養上清は、捨てられていた。

概要

殺虫活性の高い殺虫剤を製造すること。

バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記膜分離成分から陽イオン交換樹脂担体とするカラムクロマトグラフィー等電点がpH8以上の活性画分を分離し、前記カラム精製成分から分子ふるいを用いて活性画分を分離して、前記固体成分と前記精製成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造する。

目的

上述した従来の殺虫剤によれば、様々な昆虫に対する殺虫性を有するものの、殺虫剤中の毒素タンパク含有量を増やさなければ、殺虫活性を高めることができなかったので、殺虫活性の高い殺虫剤を提供するためには、入手困難で高価な毒素タンパクを大量に必要とするために不経済であり、高い殺虫活性を有する殺虫剤が望まれていた。

本発明の目的は、上記実情に鑑み、殺虫活性が高く経済的な殺虫剤を製造することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

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請求項1

バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記固体成分と前記培養上清とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造する殺虫剤の製造方法。

請求項2

バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記固体成分と前記膜分離成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造する殺虫剤の製造方法。

請求項3

バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記膜分離成分から陽イオン交換樹脂吸着する成分を分離し、前記固体成分と前記カラム精製成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造する殺虫剤の製造方法。

請求項4

バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記膜分離成分から陽イオン交換樹脂に吸着する成分を分離し、前記カラム精製成分から分子ふるいによる分子量が2500以下に相当する精製成分を分子ふるいを用いて分離して、前記固体成分と前記精製成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造する殺虫剤の製造方法。

請求項5

バチルス属の菌が生産する毒素タンパクと、バチルス属の菌の培養上清もしくは前記培養上清中の成分とを含む組成物が主成分である殺虫剤。

技術分野

0001

本発明は、バチルス属に属する菌を培養して、昆虫殺虫する殺虫剤の製造方法及び殺虫剤に関し、例えば、鱗翅目甲虫目双翅目鞘翅目等の昆虫を殺虫する技術に関する。

背景技術

0002

従来、バチルス属の菌の多くが鱗翅目、甲虫目、双翅目、鞘翅目等の昆虫を殺虫する毒素タンパク生産することが知られており、この結晶毒素タンパクを含んだ生きた菌体や、死菌化した菌体、もしくは分離精製した結晶毒素タンパクを主要組成物として、前記昆虫類を殺虫するための殺虫剤を製造することが行われていた。尚、このときバチルス属の菌を培養すると、その培養物には固体成分と液体成分が含まれるが、前記毒素タンパクは、主として前記固体成分に含まれるものであったため、この培養物を固液分離して得られた液体成分である培養上清は、捨てられていた。

発明が解決しようとする課題

0003

上述した従来の殺虫剤によれば、様々な昆虫に対する殺虫性を有するものの、殺虫剤中の毒素タンパク含有量を増やさなければ、殺虫活性を高めることができなかったので、殺虫活性の高い殺虫剤を提供するためには、入手困難で高価な毒素タンパクを大量に必要とするために不経済であり、高い殺虫活性を有する殺虫剤が望まれていた。

0004

本発明の目的は、上記実情に鑑み、殺虫活性が高く経済的な殺虫剤を製造することにある。

課題を解決するための手段

0005

この目的を達成するための第1発明の殺虫剤の製法の特徴手段は、バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記固体成分と前記培養上清とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造することにあり、また、第2発明の殺虫剤の製法の特徴手段は、バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記固体成分と前記膜分離成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造することにあり、また、第3発明の殺虫剤の製法の特徴手段は、バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記膜分離成分から陽イオン交換樹脂吸着する成分を分離し、前記固体成分と前記カラム精製成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造することにあり、また、第4発明の殺虫剤の製法の特徴手段は、バチルス属の菌を培養した培養物から昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記培養上清から膜分離による分子量が1000〜3000に相当する膜分離成分を限外ろ過膜を用いて分離した後、前記膜分離成分から陽イオン交換樹脂に吸着する成分を分離し、前記カラム精製成分から分子ふるいによる分子量が2500以下に相当する精製成分を分子ふるいを用いて分離して、前記固体成分と前記精製成分とを混合させ、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造することにあり、また、第5発明による殺虫剤の特徴構成は、バチルス属の菌が生産する毒素タンパクと、バチルス属の菌の培養上清もしくは前記培養上清中の成分とを含む組成物を主成分とすることにあり、それらの作用効果は以下の通りである。

0006

本発明者らは、バチルス属の菌を培養した培養物から、昆虫に対する殺虫性を有する結晶毒素タンパクを含む固体成分を分離し、他方、バチルス属の菌を培養した培養物から培養上清を分離し、前記固体成分と前記培養上清とを混合して、その混合物を主要組成物として殺虫剤を製造することにより、前記固体成分の殺虫活性を大きく増大することが出来るということを実験的に証明した。また、前記培養上清のみでは殺虫活性がきわめて低いものであることも明らかにした。これらの結果から、前記培養上清には何等かの物質が含まれており、この物質は、種々の昆虫に対しては殺虫活性を示さないものの、結晶毒素タンパクが前記昆虫を殺虫する作用を増進させる効果を有するという性質を持つものであると考えられる。以下この何等かの物質を仮に殺虫活性増進物質と呼ぶものとする。

0007

本発明の第1、第2、第3、第4発明の特徴手段によれば、バチルス属の菌を培養して得た培養上清、あるいは、その培養上清の様々な分離精製成分には、前記殺虫活性増進物質が含まれているから、昆虫に対する殺虫性を有する毒素タンパクの殺虫活性の高い殺虫剤を製造することが出来る。また、第5発明による殺虫剤は高い殺虫活性を有することから従来の殺虫剤よりも少量で、あるいは短期間で昆虫を殺虫することが出来るようになった。

0008

尚、分離精製とは、複数種の成分の混合組成物を、それら成分の性質の違いによって、複数の部分に分割して、それら分割した部分の成分組成を、より一種のの割合が高くなるようにすることを指し、この分割された部分を部分精製成分と呼び、この分割する操作を分画と呼ぶものとする。

発明の効果

0009

従って、従来の殺虫剤よりも有効に様々な害となる昆虫(以下害虫と称する)を殺虫することが出来る殺虫剤の製法及び殺虫剤を提供することができたので、これら害虫を殺虫する事により、例えばさつまいも、キャベツ等の農作物を、害虫に喰われたりする被害を受けなくし、より確実に収穫することができるようになった。

0010

以下に本発明の実施例を図面に基づいて説明する。バチルスチューリンゲンシスクルスタキー・HD−1(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 )(菌寄託番号ATCC33679)(以下HD−1と称する)をソイフラワー培地を用いて培養し、その培養物を遠心分離により固液分離して、その分離した固体成分(培養ペレット)を洗浄し、元の培地の10分の1量(体積)の蒸留水くわえて懸濁液を調整した。また、固液分離した液体成分を培養上清とした。

0011

結晶毒素タンパクを含むこの懸濁液は、約130kDaの結晶毒素タンパクを400μg/mlの割合で含む。その懸濁液と培養上清とを1:9の割合で混合したもののハスモンヨトウの一令幼虫に対する殺虫活性を常法に従って調べ、LC50を比較したところ、上清を混合した場合には培養ペレットのみの場合の5倍以上の殺虫活性を示すことがわかった。

0012

尚、殺虫活性の比較は以下のようにして行う。各検体を水で種々の濃度に希釈して、別に用意した昆虫飼料重量比1:9(10%)の割合で混合した後、容量約30mlのプラスチックカップに配分する。昆虫飼料は、ロールストンリングレン飼料組成〔(Raulston, J.R. and Lingren, P.D., U.S. Dept. Agr. Res. Serv. 145 1-10 1972)参照〕を改良して制作した。昆虫の幼虫は、50頭飼育して25℃、60%RHで7日後の死亡率調査し、濃度一致致死率プロビット)の関係から各検体のLC50値を算定して殺虫活性とする。LC50値とは、前記害虫の半数を殺虫する為に必要な殺虫剤量であるから、この値が小さいほど少ないほど、少ない殺虫剤の投与量で昆虫を殺虫できることを意味し、殺虫性が高いといえる。

0013

尚ソイフラワー培地とは以下のような成分であり、1リットル当りの重量(グラム)で表した。また、前記ソイフラワー培地は、水酸化カリウムでpH7.5に調整してある。

0014

大豆粉末……………………50g
マルトデキストリン……………………50g
ペプトン……………………10g
炭酸カルシウム(CaCO3 ) ……………………0.5g
塩化鉄(FeCl2 ) ……………………30mg
硫酸亜鉛(ZnSO4 ) ……………………10mg
硫酸銅(CuSO4 ) ……………………1mg
塩化マンガン(MnCl2 ) ……………………5mg
塩化マグネシウム(MgCl2 ) ……………………300mg
塩化カルシウム(CaCl2 ) ……………………300mg
消泡剤少量、

0015

また、殺虫活性の比較に用いた飼料組成は以下のとおりであり、水溶液トル当りの重量(グラム)もしくは容量(ml)で表した。
寒天……………………15.5g
小麦胚芽……………………36.0g
大豆粉末……………………80.7g
庶糖 ……………………14.6g
ソルビン酸……………………1.1 g
L−アスコルビン酸……………………4.8 g
無機塩類ウェソン塩液(Wesson salt mix )(シグマ社)〕
……………………12 g
ビタミン混液(以下組成物) ……………………4 ml
水溶液100mlあたり
パントテン酸……1.2g
ナイアシンアミド……0.6g
リボフラビン……0.3g
葉酸……0.3g
チアミン……0.15g
ピリドキシン……0.15g
ビオチン……0.012g
ビタミンB12 ……0.025g
塩化コリン(15%水溶液) ……………………13.3ml
ホルマリン(37%水溶液) ……………………1.3ml

0016

次に、殺虫剤に関する本発明の試験例を以下に示す。

0017

〔試験例1〕:培養上清が毒素タンパクの殺虫活性に及ぼす影響
HD−1をソイフラワー培地で培養した培養物を得た。この培養物(培養上清と菌体の細胞と毒素タンパクを含む組成物)、前記培養物を遠心分離によって固液分離した固体成分である培養ペレット(菌体の細胞と結晶毒素タンパクとを含み、培養上清を含まない組成物)を培養上清の10分の1量の蒸留水で懸濁したものと、前記培養物を固液分離した液体成分である培養上清とをそれぞれ調整し、これら組成物及び培養ペレットに培養上清を加えた組成物を、夫々ハスモンヨトウの幼虫に与え、個々の殺虫活性を調べた。

0018

0019

表1に示したように、ハスモンヨトウの幼虫に対する培養物本来の殺虫活性はLC50の値として860であるが、培養ペレットのみでは培養物の10倍濃度の殺虫活性として570(培養物と同濃度に換算して5,700)、培養上清のみでは16,000と培養物の殺虫活性より低くなっている事が解る。ところが培養ペレットの懸濁液1に対して体積比9の培養上清を加えるとLC50は、1100になり、培養物の殺虫活性と同等のLC50値を示し、培養物本来の殺虫活性を回復することが解る。また、この効果は比較的良く再現する。

0020

培養上清を毒素タンパクとともに与えるとハスモンヨトウに対して、培養ペレット単独の時に比較し5倍以上殺虫活性が増進し、上清のみでは、ハスモンヨトウに対する有効な殺虫性をもたないことがわかる。

0021

〔試験例2〕:殺虫活性の増進と培養上清の量との関係
つぎに培養上清の量に対して活性促進効果が、どの様に変化するのかを調べてみた。尚、この試験においても、試験例1において用いた培養ペレットの懸濁液及び培養上清を用いた。その結果を表2に示す。

0022

0023

表2から、ハスモンヨトウに対する殺虫活性は、上清濃度の増加と共に増大していることがわかる。このことは、上清のみを加えたときの致死率が殆どないこともあわせて、上清中に結晶毒素タンパクが溶解して殺虫活性を増進したものではないことを裏付けた上で、培養上清の濃度が高いほど殺虫活性の増進効果が高くなることを示すものである。

0024

従って上記試験に用いた培養上清を混入してなる組成物は、高い殺虫活性を持つ殺虫剤として用いられることがわかる。

0025

〔試験例3〕:他の昆虫に対する活性増進効果
これら殺虫活性の増進効果は、ハスモンヨトウのみに特異的なものであるのかどうかを調査するために、シロチモジヨトウヨトウガの幼虫に対する殺虫活性の増進効果を調査した。この試験においても、HD−1をソイフラワー培地で培養した培養物を用いた。尚、殺虫活性の増進効果の比較をするに当たっては、前記培養物より得た培養ペレットを乾燥粉末に加工した粉末製剤の1%懸濁液と、前記培養物より得た培養上清を用い、所定濃度の毒素タンパクを飼料に混入して、トキシン含有飼料を調整する。一方そのトキシン含有飼料に、培養上清をトキシン含有飼料に対して5000ppmとなるように加えた組成物を調整する。そしてトキシン含有飼料と前記組成物との上述の昆虫類に対する殺虫活性を調べた。

0026

尚、粉末製剤は、以下のようにして調整した。まず、培養物を遠心分離して培養ペレットを得た。この培養ペレットを蒸留水により3〜4回洗浄、遠心分離を繰り返し、クリ−ム状の沈殿物を得た。この沈殿物にソルビン酸(防腐剤)、EDTAリグニン硫酸系の界面活性剤を加え、噴霧乾燥を行った。

0027

その結果を表3に示す。

0028

0029

表3に示した様にシロイチモジヨトウ、ヨトウガの幼虫に対しても著しい殺虫活性の増進効果を示した。この場合、殺虫活性はハスモンヨトウに対して20倍以上、シロイチモジヨトウに対しては10培以上、ヨトウガについては4培程度増進されていることがわかり、殺虫活性の増進効果はハスモンヨトウに限られるものではないといえる。従って、本発明の殺虫剤及び殺虫剤の製造方法はハスモンヨトウに対するものに限られる訳ではないことがわかる。

0030

尚、担体として、ケイソウ土タルククレ−、ベントナイト等を加えて製剤化することもできる。また、防腐剤としては、ソルビン酸の他に、チアゾ−ル系の化合物クエン酸アスコルビン酸等の酸、ホルマリン等のアルデヒド類、その他メチルパラベン等の有機化合物等、界面活性剤としては、陽イオン陰イオン非イオン系の界面活性剤を用いることが出来、これらは、単用してもよいし、複数を組み合わせて用いることも可能であることはいうまでもない。

0031

〔試験例4〕:他のバチルス属の菌の培養上清の殺虫活性増進効果
これらの殺虫活性の増進効果が、HD−1株を培養した培養上清に特異的に見られるものであるのかどうかを調べるために、下記に示す4種の菌をソイフラワー培地で培養した培養上清を用い、ハスモンヨトウの幼虫に対する殺虫活性の増進効果を調べた。

0032

すなわち、殺虫活性の増進効果を調べた3種のバチルス属の菌(すべてタイプストレイン)は
●バチルス・チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイ(Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain Buibui)(菌寄託番号 FERM BP−3465)(以下ブイブイと称する)
●バチルス・チューリンゲンシス・テニブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis)
●バチルス・チューリンゲンシス・クルスタキー・ストレイン・81GG(Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki strain 81GG)(菌寄託番号 NRRLB−18425)(以下81GGと称する)
である。

0033

その結果、いずれの菌体の培養上清についても、HD−1の生産する毒素タンパクがハスモンヨトウの幼虫を殺虫する殺虫活性を増進する効果が認められた。

0034

さらに、81GGは、HD−1と同様に、ハスモンヨトウに対する殺虫性を有する毒素タンパクを生産するが、この毒素タンパクについても上記菌体の培養上清によって、殺虫活性が増進されるかどうかを調べたところ同様の結果が得られた。また、81GGの生産する毒素タンパクは、他のヨトウ類昆虫の幼虫に対しても殺虫活性を有し、上記3種の菌体の培養上清を添加して用いた場合にも同様の増進効果が得られた。

0035

従って、上記菌体は殺虫活性増進物質を生産することがわかり、本発明の殺虫剤及びその製造方法は、HD−1の培養上清を用いるものに限られるものではなく、他の菌体を培養した培養上清を用いても良いことがわかり、また、HD−1の生産する毒素タンパクを用いるものに限るものではなく、他の菌体の生産する毒素タンパクであってもよいことがわかり、さらに、培養上清と毒素タンパクは同じ菌体由来のものに限らず、それぞれ異なる菌体から得た培養上清及び毒素タンパクを用いて殺虫剤を製造することができるものであることがわかる。

0036

〔試験例5〕:殺虫活性増進物質生産に及ぼす培地成分の影響
上記殺虫活性増進物質は、ソイフラワー培地を用いてバチルス属の菌を培養した場合にのみ特異的に生産されるものであるのかどうかを調べるために、様々な培地で81GG及びHD−1を培養した培養上清が、81GGの生産する毒素タンパクのハスモンヨトウの幼虫に対する殺虫活性を増進する効果があるかどうかを試験した。

0037

即ち、バチルス属の菌の培養に用いた培地は、PGSM培地、3倍高濃度PGSM培地、NYS 培地、LB培地であり、これらの培地の成分を1リットルあたりの組成は以下に示す通りである。また、下記に示すpHに調整してある。

0038

PGSM培地:
ペプトン………………………… 7.5 g
グルコース………………………… 1 g
リン酸二水素カリウム(KH2PO4) …………………… 4 g
リン酸水素二カリウム(K2HPO4) …………………… 5 g
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4・7H2O) …… 0.0123g
硫酸マンガン一水和物(MnSO4・H2O) …………… 0.002 g
硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4・7H2O) ……………… 0.0014g
硫酸鉄七水和物(FeSO4・7H2O) ……………… 0.02 g
塩化カルシウム2水和物(CaCl2・2H2O) ……… 0.184 g
pH=7.2

0039

3倍高濃度PGSM培地:
ペプトン………………………… 22.5 g
グルコース………………………… 3 g
リン酸二水素カリウム(KH2PO4) …………………… 12 g
リン酸水素二カリウム(K2HPO4) …………………… 15 g
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4・7H2O) …… 0.0123g
硫酸マンガン一水和物(MnSO4・H2O) …………… 0.002 g
硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4・7H2O) ……………… 0.0014g
硫酸鉄七水和物(FeSO4・7H2O) ……………… 0.02 g
塩化カルシウム二水和物(CaCl2・2H2O) ……… 0.184 g
pH=7.2

0040

NYS培地:
ヌートリエンブロス………………………… 1.25 g
トリプトン………………………… 1.25 g
酵母抽出物………………………… 0.5 g
塩化カルシウム二水和物(CaCl2・2H2O) ……… 0.206 g
塩化マグネシウム六水和物(MgCl2・6H2O) …… 0.407 g
塩化マンガン四水和物(MnCl2・4H2O) ………… 0.02 g
硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4・7H2O) ……………… 0.0004g
硫酸鉄七水和物(FeSO4・7H2O) ………………… 0.0004g
硫酸アンモニウム((NH4)2SO4) ……………… 0.0004g
pH=7.2

0041

LB培地:
トリプトース ………………………… 10 g
酵母抽出物………………………… 5 g
食塩(NaCl) ………………………… 5 g
pH=7.2

0042

その結果を表4に示す。尚、(+)は殺虫活性増進効果がみられたもの、(−)は殺虫活性増進効果が見られなかったものを表す。

0043

0044

この結果、PGSM培地を用いた場合には3倍高濃度でなければ殺虫活性増進物質を生産せず、毒素タンパクの殺虫活性を増進させることができないものの、ソイフラワー培地以外の他の培地を用いてもソイフラワー培地を用いた場合と同様の殺虫活性増進物質を生産することがわかる。従って、本発明の殺虫剤の製造方法及び殺虫剤は、ソイフラワー培地を用いて生産した培養上清を用いたものに限るものではなく、他の培地を用いて得た培養上清を用いたものでも良いことがわかる。

0045

また、試験例1〜5において用いた昆虫、菌体、培地は、種々ある昆虫、菌体、培地の代表例であり、本発明の構成はこれらに限られるものではない。さらに、培養上清と毒素タンパクとが混在する組成物を調整するに、培養上清と、毒素タンパクとを個別に分離して得た後に混合する方法に限らず、菌体を培養した培養物から培養上清と毒素タンパクとを分離せずにそのまま用いることもできる。また、前記培養物の上清成分濃縮して殺虫活性増進物質の濃度を高めて用いることも可能である。

0046

〔試験例6〕:培養上清の分離精製
培養上清のみの殺虫剤の殺虫効果を調べた場合、わずかな殺虫活性を示すことがある。このことからバチルス・チューリンゲンシスを培養した培養上清には、細菌細胞から遊離した毒素タンパクもしくは毒素タンパクの溶解成分(以下可溶性トキシン成分と称する)が溶解している可能性があると考えられる。約130kDaのプロトキシンである毒素タンパクの場合、タンパク分解酵素の働きで約60kDaの断片に切断された後は、タンパク分解酵素抵抗性を示してそれ以上分解されないことが知られている。〔(Appl. Ent. Zool. 26 (4) 485-492) 参照〕。しかし、例えば毒素タンパクの一つであるCryIA(a)タンパクはN−末端から603番目までのアミノ酸を切断すると活性を失う事が知られており〔(J. Biol. Chem. 260 6273-6280, 1985)参照〕、約60kDaより小さなペプチドは殺虫活性を持たないと考えられる。

0047

(1)分画分子量サイズ10kDaの限外ろ過膜による膜分離
そこで上清に存在すると考えられる分子量の大きな可溶性トキシン成分を取り除くために分画分子量サイズ10kDaのアミコン社製の限外ろ過膜を用いて培地を分離精製し、それぞれの膜分離成分について、HD−1が生産する毒素タンパクのハスモンヨトウに対する殺虫活性を増進する効果を調べた。

0048

0049

その結果、表5に示したように可溶性トキシン成分を含まないと考えられる10kDaの膜を透過した(つまり10kDa以下の)膜分離成分に、殺虫活性の増進効果があることがわかり、殺虫活性増進物質は分子量10kDa以下であると考えられる。つまり、10kDa以下の分子量の膜分離成分を毒素タンパクと混合して殺虫活性を増進させた殺虫剤を製造することができることがわかる。

0050

(2)分画分子量サイズ1kDa、3kDaの限外ろ過膜による膜分離
前記膜分離成分のうち10kDa以下の成分を、更に分画サイズ3kDa、1kDaのアミコン社製限外ろ過膜を用いて分画し、それぞれの分画精製成分についてHD−1が生産する毒素タンパクのハスモンヨトウに対する殺虫活性を増進する効果を調べた。ちなみに分画前のペレットのみでのLC50値は、800であった。

0051

その結果、表6に示したように殺虫活性増進効果は、培養上清のうち1kDa〜3kDaの膜分離成分を含むものにみられ、1kDa以下、3kDa以上の膜分離成分の殺虫活性増進効果はほとんど見られなかった。

0052

0053

従って、殺虫活性増進物質は分画分子量サイズ1kDaの膜を多少透過するが、そのほとんどが分画分子量サイズ1kDaの膜分離成分の内の不透過物、3kDaの膜分離成分のうちのろ過液中に存在するものであるとわかり、分子量1kDa〜3kDaの範囲の物質であると考えられる。

0054

つまり、1kDa〜3kDaの分子量の膜分離成分を毒素タンパクと混合することによって殺虫活性を増進させた殺虫剤を製造することができることがわかる。

0055

尚、試験例6において分子量と表記するものは、限外ろ過膜の透過により測定される見かけの分子量であって、実際の殺虫活性増進物質の分子量とは、必ずしも一致しないことは周知の事実である。また、分画分子量サイズの表記においてkDaとは、分子量1000を意味する。

0056

〔試験例7〕:殺虫活性と毒素タンパクの添加量依存性
一般に毒素タンパクが高濃度に含まれている殺虫剤ほど殺虫性が高いとされているが、本発明の殺虫剤の製造方法においても同様の効果があるのか、また、同様の効果があるとすれば、毒素タンパクをどの程度混ぜれば良いかを調べるために、殺虫活性が毒素タンパク濃度によってどのように変化するかを調べた。まず、培養物から2層分配法〔(Goodman,N.S., Gotfried,R.J., and M.H.Rogoff, 1967, J. Bacteriol., 94 485)参照〕に依ってHD−1の生産する毒素タンパクの結晶を精製した。また、様々な濃度の毒素タンパクと、その毒素タンパクに1kDa〜3kDaの膜分離成分を5000ppm加えた組成物の、ハスモンヨトウの幼虫に対する殺虫活性を調べた。

0057

その結果、表7に示したように毒素タンパクのみの殺虫性と毒素タンパクに上清の膜分離成分を加えた場合の殺虫活性を比較した場合に、前記膜分離成分は、本質的に精製していない培養物に加えた場合と同様に殺虫活性を増進する効果を示すことがわかった。また、上清を用いた場合においても殺虫活性の増進効果は毒素タンパクの含有量に依存し、前記殺虫活性の調査条件でのLC50は0.66μgであることがわかった。これは毒素タンパクのみでのLC50値が18μgであることから、27倍の殺虫活性増進効果が見られたことを示す。従って、培養上清の殺虫活性増進効果は、培養上清が毒素タンパクに作用するものであり、培養ペレット中に含まれる胞子等は、直接殺虫活性を増進するために必要ない事を示している。しかし精製した毒素タンパクの結晶にも、活性に影響を与えない程度の胞子等が、不可避不純物として含まれている可能性があり、この不可避不純物が殺虫活性増進物質と相互作用している可能性を完全に否定することは出来ない。

0058

0059

〔試験例8〕:イオン交換カラムクロマトグラフィーによる精製
試験例6に示したように、殺虫活性増進物質は、分画分子量サイズ1kDaと3kDaの間に回収される膜分離成分に含まれていると考えられる。そこで殺虫活性増進物質を、より有効に利用するため、前記膜分離成分を、さらにイオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製する事を試みた。

0060

(1)陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製
まず、HD−1を培養した20リットルの培養培地を、ミリポア社の限外ろ過膜を用いて膜分離して、1kDa〜3kDaに相当する分子量の膜分離成分を得た。つぎに、50mMトリス塩酸緩衝液pH8.0で平衡化した陰イオン交換樹脂(Pharmacia社のDEAEセファロース)を、担体としてカラム充填した後、前記膜分離成分をチャージして、50mMトリス塩酸pH8.0の緩衝液で十分洗浄した後、前記緩衝液にNaClを溶解し、0〜0.4MのNaCl濃度勾配で担体に吸着した膜分離成分を溶出させた。尚、この分画操作は、カラムとして直径2.5cm、長さ25cmのガラス管を用い、一フラクション2.5mlづつ分画して行った。

0061

このときの典型的な溶出パターン図1に示す。全フラクションを1本おきに検定して、夫々のHD−1由来の毒素タンパクに対するの殺虫活性増進効果を調べたところ、殺虫活性増進物質は、イオン交換体に吸着せず、前記緩衝液の洗浄のみで溶出したことがわかった。(図1斜線部分)従って殺虫活性増進物質は、等電点中性か、中性より高い物質であると考えられる。

0062

(2)陽イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製
上に示したように殺虫活性増進物質は、約pH8.0以上にその等電点を持つ可能性が考えられるので、上記殺虫活性増進物質を含むカラム精製成分のうち殺虫活性増進効果を示すフラクションを、pH8.0のトリス塩酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換樹脂(Parmacia社のCMセファロース)を担体として用いたカラムクロマトグラフィーによりさらに分離精製した。

0063

分離精製は前述の精製と同様に、まず、前記カラム精製成分を、前記担体を充填したカラムに、チャージし、つぎに前記緩衝液で充分洗浄した後、前記溶出液で溶出させて行った。

0064

このときの典型的な溶出パターンを図2に示す。全フラクションを1本おきに検定して、夫々のHD−1由来の毒素タンパクに対する殺虫活性増進効果を調べたところ、前記担体に吸着し、約0.18MのNaClで溶出したカラム精製成分(図2斜線部分)が、HD−1が生産する毒素タンパクの殺虫活性増進効果を、有することがわかった。従って、殺虫活性増進物質は、等電点が約pH8より高い物質であるとわかった。

0065

尚、殺虫活性増進物質の含まれる前記カラム精製成分は、毒素タンパクと混合して殺虫活性を増進させた殺虫剤を製造することに用いることができる。

0066

〔試験例9〕カラム精製成分の分子ふるいによる精製
CMセファロースカラムクロマトグラフィーで精製したカラム精製成分は、図2から、まだ充分に精製されたものではないことがわかる。従って、このカラム精製成分をさらに精製するために、ゲルろ過担体を用いた分子ふるいによって精製した。

0067

(1)デキストラン製のゲルろ過担体を用いた精製
同じ緩衝液で平衡化したゲルろ過担体(Pharmacia社製のセファデックスG−25)を、直形1.4cm、長さ90cmのカラムに充填すると共に、、CMセファロースカラムクロマトグラフィーで精製したカラム精製成分(試験例8−(2))を、透析せずに凍結乾燥して、その凍結乾燥物を極く小量の前記緩衝液に溶かした溶液造り、担体の体積の2%相当量の前記溶液を、セファデックスカラムにチャージし、さらに前記緩衝液を溶出液として溶出させ、2.5mlづつ分画した。

0068

この時の典型的な溶出パターンを図3に示す。全フラクションを1本おきに検定して、HD−1由来の毒素タンパクに対する夫々の殺虫活性増進効果を調べたところ、およそ蔗糖が溶出する付近(分子量約500〜600に相当する)の分子ふるい精製成分(図3斜線部分)が殺虫活性を増進する効果を有することがわかった。

0069

しかし、この事は殺虫活性増進物質の分子量が蔗糖に近い値である事を意味するものではなく、分子ふるいによる物質の分画を行った場合には、溶出点が分子の形状に著しく左右されるため、試験例3で、限外ろ過膜を用いたときに、殺虫活性増進物質が分画分子量サイズ1kDaと3kDaの間に回収されることを考えあわせて、殺虫活性増進物質の分子量は、ファルマシア社のセファデックスG−25を用いる限り、蔗糖の分子量に近いと言えるものである。

0070

尚、セファデックスG−25は、棒状の分子で分子量約100〜5000、球状の分子で分子量約1000〜5000の物質をふるい分けることのできる担体であるとみなされているものである。

0071

(2)デキストラン製のゲルろ過担体を用いた再精製
図3に示した様に、殺虫活性増進物質の含まれるピークの分画限界には、大きなピ−クが存在するので、後ろのピークの混入がある事は明らかである。そこで、前述の精製と同様に殺虫活性増進効果のあるフラクションを集め、凍結乾燥し、小量のトリス塩酸緩衝液に溶解し、再度クロマトグラフィーによる分離精製を行った。

0072

その結果、図4に示した様に、この再精製成分は、殺虫活性増進物質のピーク(図4斜線部分)の直後に混入物質によると思われるショルダ−が存在するので、まだ不純物を含んだ殺虫活性増進物質の部分精製物である。この殺虫活性増進物質は更に精製する事により純粋な物質として同定できる。

0073

尚、試験例9においては分子ふるいの担体としてセファデックスG−25を用いたが、これに限るものではなく、バイオゲルバイオラッド社)セルロファイン(チッソ)などから適当な分画サイズのものを選ぶことができる。また、再精製に用いる担体は始めの精製に用いた担体とは異なる性能のものを用いても良いことはいうまでもない。

0074

尚、前記分子ふるい精製成分や、分子ふるいによる再精製成分は、いずれも毒素タンパクと混合して、殺虫活性を増進させた殺虫剤を製造するために用いることができる。

図面の簡単な説明

0075

図1試験例8−(1)のカラムクロマトグラフィーを示すクロマトグラフ
図2試験例8−(2)のカラムクロマトグラフィーを示すクロマトグラフ
図3試験例9−(1)のカラムクロマトグラフィーを示すクロマトグラフ
図4試験例9−(2)のカラムクロマトグラフィーを示すクロマトグラフ

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