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技術 3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラーゲン断片を測定する方法

出願人 コニカミノルタ株式会社
発明者 東郷宏樹高橋壮模日高誠司
出願日 1992年11月12日 (27年3ヶ月経過) 出願番号 1992-328846
公開日 1994年5月27日 (25年8ヶ月経過) 公開番号 1994-148183
状態 未査定
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 特殊設備 一般検査 不溶性抗原 検査所 架橋物質 紫外吸収スペクトル 被測定物質 コラーゲン断片
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この項目の情報は公開日時点(1994年5月27日)のものです。
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目的

DP若しくはその置換体又はその残基を含むコラーゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供することである。

構成

抗3−デオキシピリジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれる3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供した。

概要

背景

骨粗鬆症とは骨密度が低下し、骨内部がスカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランスが保たれている間は強い骨が維持されているが老化などにより、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現象女性ホルモン欠乏、その他ホルモンの変化、ビタミンDカルシウム蛋白質の摂取不足運動不足などの多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という生理現象を背景発症するケ−スが主であり生化学的及び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会高齢化、食生活の変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加しており日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われており、今後、増加するのは確実である。

骨粗鬆症の診断は生化学.内分泌検査骨萎縮測定法、骨密度定量法組織学的検査などがあるが確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この骨密度測定法とは、光子吸収法(DEXA:2種の異なるエネルギ−のX 線を用いる方法)であり、正確な診断が可能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため普及には限界がある。

そこで最近、骨粗鬆症のマ−カ−として尿中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。この物質を同定、定量するには尿中からまず大きなタンパク質を除きその後、高速液体クロマトグラフィ−で分離、同定するなどの非常に煩雑な分析方法があるが、これは一般検査では非常に測定時間の無駄であり、同じ装置で同時に何十検体も測定が不可能であり、精度にも問題がある。

ピリジノリンと総称されるものにはリジルピリジノリン(LP)、2 ’-ヒドロキシリジルピリジノリン(HP)、3-デオキシピリジノリン(3DP)の3種類、これらの置換体及びこれらの残基を含むコラーゲン断片が尿中には存在する。前記2種類は自然蛍光を持っているが3-デオキシピリジノリンは蛍光特性を持っていない。そこでこの物質を紫外線吸収スペクトルで測定しなければならないが蛍光感度に比べ、紫外吸収スペクトルは一般的に感度が低いこと、そして微量なことから高速液体クロマトグラフィ−では測定にかなり技術を要する。

従って、本発明の目的は、3DP若しくはその置換体又はその残基を含むコラーゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、これらの物質を免疫学的に測定することに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、抗3−デオキシピリジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれる3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供する。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の方法により測定されるものは、3DP、グリコシル化誘導体のようなその置換体、及び3DP残基を含むコラーゲン断片である。尿中に含まれる、3DP残基含有コラーゲン断片は、下記式[I]又は[II]に示されるものに代表される、3DPがアミノ酸鎖の一部で置換されたものである。

概要

3DP若しくはその置換体又はその残基を含むコラーゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供することである。

抗3−デオキシピリジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれる3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供した。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

抗3−デオキシピリジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれる3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法。

請求項2

生体試料が尿である請求項1記載の方法。

請求項3

被測定物質標識物質を結合させたコンジュゲ−トを用いる請求項1又は2記載の方法。

請求項4

請求項3記載のコンジュゲ−トと生体試料中の被測定物質との両者に結合しうる特異的な抗体とを用いる請求項1又は2記載の方法。

請求項5

被測定物質に特異的に結合する抗体と標識物質が結合したコンジュゲ−トを用いる請求項1又は2記載の方法。

請求項6

上記請求項5記載のコンジュゲ−トと生体試料中の被測定物質とを特異的に結合させ過剰のコンジュゲ−トを分離するために固定化してある被測定物質に特異的に結合させる工程を含む請求項1又は2記載の方法。

請求項7

標識物質が酵素である請求項3ないし6のいずれか1項に記載の試験方法

請求項8

請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット

技術分野

0001

本発明は、生体試料中の3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラゲン断片を測定する方法に関する。本発明の方法は、骨粗鬆症診断に有用である。

背景技術

0002

骨粗鬆症とは骨密度が低下し、骨内部がスカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランスが保たれている間は強い骨が維持されているが老化などにより、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現象女性ホルモン欠乏、その他ホルモンの変化、ビタミンDカルシウム蛋白質の摂取不足運動不足などの多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という生理現象を背景発症するケ−スが主であり生化学的及び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会高齢化、食生活の変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加しており日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われており、今後、増加するのは確実である。

0003

骨粗鬆症の診断は生化学.内分泌検査骨萎縮測定法、骨密度定量法組織学的検査などがあるが確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この骨密度測定法とは、光子吸収法(DEXA:2種の異なるエネルギ−のX 線を用いる方法)であり、正確な診断が可能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため普及には限界がある。

0004

そこで最近、骨粗鬆症のマ−カ−として尿中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。この物質を同定、定量するには尿中からまず大きなタンパク質を除きその後、高速液体クロマトグラフィ−で分離、同定するなどの非常に煩雑な分析方法があるが、これは一般検査では非常に測定時間の無駄であり、同じ装置で同時に何十検体も測定が不可能であり、精度にも問題がある。

0005

ピリジノリンと総称されるものにはリジルピリジノリン(LP)、2 ’-ヒドロキシリジルピリジノリン(HP)、3-デオキシピリジノリン(3DP)の3種類、これらの置換体及びこれらの残基を含むコラーゲン断片が尿中には存在する。前記2種類は自然蛍光を持っているが3-デオキシピリジノリンは蛍光特性を持っていない。そこでこの物質を紫外線吸収スペクトルで測定しなければならないが蛍光感度に比べ、紫外吸収スペクトルは一般的に感度が低いこと、そして微量なことから高速液体クロマトグラフィ−では測定にかなり技術を要する。

0006

従って、本発明の目的は、3DP若しくはその置換体又はその残基を含むコラーゲン断片を簡便な操作で、かつ、感度良く測定する方法を提供することである。

0007

本願発明者らは、鋭意研究の結果、これらの物質を免疫学的に測定することに成功し、本発明を完成した。

0008

すなわち、本発明は、抗3−デオキシピリジノリン抗体又はその抗原結合性断片と、3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片との特異的結合を利用した免疫測定により、生体試料中に含まれる3−デオキシピリジノリン若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を測定する方法を提供する。

0009

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

0010

本発明の方法により測定されるものは、3DP、グリコシル化誘導体のようなその置換体、及び3DP残基を含むコラーゲン断片である。尿中に含まれる、3DP残基含有コラーゲン断片は、下記式[I]又は[II]に示されるものに代表される、3DPがアミノ酸鎖の一部で置換されたものである。

0011

0012

ID=000002HE=070 WI=104 LX=0530 LY=0600
ただし、式[I]及び[II]において、PYN は3DP残基を示し、Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリドンカルボン酸を示す。

0013

また、尿中に含まれる3DPのグリコシル化置換体は、下記式[III]又は[IV]で示されるものに代表される、リジル基のOH部分がグリコシル化されたものを包含する。

0014

0015

0016

以下、本発明の方法を実施するための手順を順を追って説明するが、下記に示すものは好ましい態様であり、本発明は下記に示す態様に限定されるものではない。

0017

尿中3DPの単離方法
高濃度のピリジノリン架橋物質を含む尿試料をペ−ジェト病患者、副線機亢進症患者の尿より採取する。早朝尿1000ml程度を元の量の1/10程度に濃縮し、0.2M酢酸溶離液としてセファデックスG25(3 x100 cm)(ファルマシア社製)を用いて蛍光、紫外線の両方のスペクトルを測定し、ピリジノリン架橋断片(蛍光部分)の前後の紫外吸収部分を画分し、凍結乾燥する。上記画分をDEAE−5DWカラム(7.5 mm x 7.5 cm)(東ソー社製)を用いて陰イオン交換クロマトグラフィ−で10%(v/v)アセトニトリルを含む0.02Mトリス−HCl(pH7.5)中NaCl(0→0.2M)の勾配溶離し、精製する。さらにそれをセファデックスG10(ファルマシア社製)のカラムで脱塩し、凍結乾燥し、最終精製はTSKODS-120T(4.6 x25cm)(東ソー社製)による逆相HPLCで行い0.1 %ヘプタフルオロ酪酸および15〜30%の直線勾配濃度のアセトニトリルで30分間溶出させる。下記実施例では、このピリジノリン架橋断片(蛍光部分)前後の3つの紫外吸収ピ−クを分離し、1H-NMR,13C-NMRで構造を同定し、3-デオキシピリジノリンを単離した。架橋断片を有しない遊離型の3DHPを単離するためには6M HCl と混合し105 〜110 ℃で24時間加水分解した後エバポレ−タで脱塩、濃縮した後、遠心分離し、上清を上記同様の操作(セファデックスG−25の代わりにセファデックスG−10、陰イオン交換カラムの代わりに陽イオン交換カラムを使用)により得られる。

0018

免疫学的測定法
3DPに対して特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は公知の方法によって作られる。例えばキャンベル(Campbell,A,M)著、(1986)”生物学および分子生物学における実験技術(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology )”13巻、を参照。上記架橋断片に対する抗体をつくることは可能であるがこれらの架橋断片の分子量はせいぜい5000以下であるから、3DP、その置換体またはその残基を含むコラーゲン断片を担体分子に結合させることが好ましい。適した担体分子としてはウシ血清アルブミン卵アルブミンなどがあげられるがこれに限られるわけではない。また、これらの抗体の抗原結合性断片(Fab断片及びF(ab’)2 断片)も用いることができる。なお、上記架橋コラーゲン断片を担体に結合したものを免疫原として抗血清を調製した場合、3DPに特異的に結合する抗体を選択することは、これらを固定したカラムに抗血清を通過させ、吸着したものを採取することにより行うことができる。この操作の詳細は下記実施例に記載されている。

0019

標識は放射性ラベル例えば125Iまたは蛍光ラベル例えばフルオレセインイソチオシアネ−トもしくはロ−ダミンでもよい。磁性物質、または、常磁性元素Fe,Cu,Mn,Gd または造形物質例えば、131In のごとき放射性核種を標識として使用してもよい。また、西ワサビペルオキシダ−ゼのような酵素でもよいがこれに限られるわけではない。コンジュゲ−トとは標識物質と抗体又は、標識物質と抗原および抗原類似物質結合物質ことであり、アビジン-ビオチン等を介して標識化することも可能である。またこれらの物質の結合にはグルタルアルデヒド法、過ヨ−ソ酸法マレイミド法、ピリジルジスルフィド法(酵素免疫測定法:石川栄治ら、医学書院)などが挙げられる。測定法としては抗原様物質固定化して標識抗体を用いたインヒビションアッセイ、抗体を固定化して標識抗原試料競合させる競合法、2抗体法などいずれの公知の方法でもよい。

0020

実施例1
抗血清(ウサギ)の作成、精製法
上記尿中3DP架橋断片の単離法で単離した後、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドハイドロクロライドを用いて卵白アルブミンに結合させフロイント完全アジュバントによりエマルジョン化した。上記免疫原(3DP)を四肢指の皮内16ケ所および背部皮内数ケ所に注射した。3 週後に補助注射として上記免疫原を1/5 〜1/10程度に希釈したものを2ml静脈に注射、10日後に試験採取して、免疫電気泳動法で検討した。IgG,IgM,IgAおよび補体β1CAの沈降線が明瞭に認められた。つぎにIgG の精製として硫酸ソ−ダによる塩析でIgG 画分を沈殿させ混在する他のタンパクを除くためにDEAEセルロ−スカラムに通すことによって素通り画分高純度なIgG が得られた。さらに抗体の精製をおこなうためにアフィテイクロマトグラフィ−をおこなった。それぞれ精製した抗原30mgを2ml のcoupling buffer(NaHCO3 4.2g, NaCl 29g を水で1000mlにする。PH=8.3) に溶解して洗浄したCNBr−セファロース(ファルマシア社製) 2g を18mlのcoupling buffer に加え室温で2 時間振とうした。これを遠心管に移し2000rpm で遠心し、上清を捨て、グリシン-HCl緩衝液で2 回洗い、最後にグリシン-HCl緩衝液に懸濁して、一晩氷室におき、残存する活性基をブッロックした。次にcoupling buffer で洗い、0.1M酢酸緩衝液(PH=4.0)で洗った。この操作を2回繰り返した。こうして作成した不溶性抗原をカラムにつめcoupling buffer 約30mlを流し洗浄したあと、IgG 画分をカラムに吸着させた。coupling buffer 約70mlを流してカラムを洗浄した。グリシン-HCl 緩衝液を流し溶出させすべて試験管にとった(2 〜3ml ずつ)。各試験管ごとに0.1 N NaOH を注意深く加えて、PHを中性にし吸光度(280nm )を測定し、タンパク質陽性の画分をすべてプ−ルして濃縮した。PBS透析後、遠心して、不溶性のものを除き、所定の濃度にした。こうして3DPの抗体を作成した。

0021

実施例2
抗体の標識化
ヨウ素酸法によるIgGのペルオキシダ−ゼ標識
”酵素免疫測定法”作製法に準じて標識抗体を作成した。

0022

実施例3
抗原の標識化
過ヨウ素酸酸化法によるペルオキシダ−ゼのペプチド分子への標識法
”酵素免疫測定法”の作製法に準じて標識抗原を作成した。

0023

実施例4
インヒビションアッセイを行うためにマイクロタイタプレ−ト(96穴)のウエルに免疫原として使用した3DHP-アルブミン被覆させた(4 ℃、一晩)。次にこの液をウエルから除き、洗浄液(0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)+0.1%Tween20 )で1 回洗浄した。3%BSA (ウシ血清アルブミン)を含むPBS溶液でウエルを満たし37℃1時間放置した。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめHPLCで濃度を測定してあるサンプルと3DHPに対するペルオキシダ−ゼ標識抗体を含む液(50μl 、BSA を1%含む液で希釈)は別の試験管で37℃1時間反応させてある。この混合溶液をウエルに加えてさらに37℃1時間反応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗体を含む液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液(ウエル1個当たり100 μl ;0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01%過酸化水素水)を加え、発色させた。410nm での光学密度を、MR580マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−(ダイナテック製)を用いて測定した。結果を下記表1に示す。

0024

実施例5
競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト(96穴)のウエルに3DHPに対する抗体を被覆させた(4 ℃、一晩)。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液(0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)+0.1%Tween20 )で1 回洗浄した。3%BSA (ウシ血清アルブミン)を含むPBS溶液でウエルを満たし37℃1時間放置した。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるサンプルとペルオキシダ−ゼ標識抗原(3DHP)+0.14M NaCl/10mM−リン酸バッファ−(PH=7.5)をウエルに添加し37℃1時間反応させた。標識抗原溶液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液(ウエル1個当たり100 μl ;0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01%過酸化水素水)を加え、発色させた。410nm での光学密度を、MR580マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−(ダイナテック製)を用いて測定した。結果を下記表2に示す。

0025

実施例6
2抗体法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト(96穴)のウエルに免疫原として使用した3DHP-アルブミンを被覆させた(4 ℃、一晩)。次にこの液をウエルから除き、洗浄液(0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)+0.1%Tween20 )で1 回洗浄した。3%BSA (ウシ血清アルブミン)を含むPBS溶液でウエルを満たし37℃1時間放置する。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめHPLCで濃度を測定してあるサンプルと3DHPに対する抗体を含む液(50μl 、BSA を1%含む液で希釈)は別の試験管で37℃1時間反応させてある。この混合溶液をウエルに加えてさらに37℃1時間反応させた。抗体を含む液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、カッペル社の抗ウサギIgG(H+L)に実施例2と同様の操作によりペルオキシダ−ゼを標識したものをバッファ−で希釈して各ウエルに加え37℃1 時間反応させた。ペルオキシダ−ゼ標識抗ウサギIgG を含む液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液(ウエル1個当たり100 μl ;0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01%過酸化水素水)を加え、発色させる。410nm での光学密度を、MR580マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−(ダイナテック製)を用いて測定した。結果を下記表3に示す。

0026

実施例7
競合法を行うためにマイクロタイタ−プレ−ト(96穴)のウエルに3DHP-pep(上記式[I]で示されるもの、以下同じ)に対する抗体を被覆させた(4 ℃、一晩)。次にこの液を ウエルから除き、洗浄液(0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)+0.1%Tween20 )で1 回洗浄した。3%BSA (ウシ血清アルブミン)を含むPBS溶液でウエルを満たし37℃1時間放置した。BSA 溶液を除去したあと上記洗浄液でウエルを洗浄した。あらかじめ混合してプレインキュベ−トしてあるサンプルとペルオキシダ−ゼ標識抗原(3DHP-pep)+0.14M NaCl/10mM- リン酸バッファ−(PH=7.5)をウエルに添加し37℃1時間反応させた。標識抗原溶液を除去し上記洗浄液で十分にウエルを洗浄し、ペルオキシダ−ゼ基質溶液(ウエル1個当たり100 μl ;0.14M NaCl/10mM-リン酸バッファ−(PH=7.5)中0.25mMのオルトフェニレンジアミンと0.01%過酸化水素水)を加え、発色させた。410nm での光学密度を、MR580マイクロエリザ、オ−ト、リ−ダ−(ダイナテック製)を用いて測定した。結果を下記表4に示す。

0027

0028

ID=000007HE=020 WI=086 LX=0620 LY=2350
ID=000008 HE=040 WI=086 LX=0620 LY=0300

0029

0030

0031

これらの結果から競合法、インヒビションアッセイともに3DHP,3DHP-pep の値が測定可能であることが示された。

発明の効果

0032

本発明により、生体試料中の3DP若しくはその置換体又はその残基を有するコラ−ゲン断片を簡便な操作で感度良く測定する方法が提供された。本発明により、骨粗鬆症を簡便、正確、迅速に行うことが可能になる。

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