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図面 (7)

構成

〔式中、Xはヒドロキシル基メトキシ基または水素原子を表し、XはデラミマイシンAではヒドロキシル基であり、デラミノマイシン Bではメトキシ基であり、デラミノマイシン Cでは水素原子である〕のデラミノマイシン A、BおよびCがストレプトミセス属に属する上記物質生産菌の培養により製造された。

デラミノマイシンA、BおよびCを脱水閉環してデラミノマイシンA2、B2およびC2を製造する。

効果

免疫抑制活性を有する。グラム陽性菌抗菌活性とある種の癌細胞抗癌活性も有する。

概要

背景

従来、微生物生産する免疫抑制物質としてサイクロスポリンA、FK506およびスパガリン等が知られているが、これらは免疫抑制剤として完全に満足できるものではない。

概要

〔式中、Xはヒドロキシル基メトキシ基または水素原子を表し、XはデラミマイシンAではヒドロキシル基であり、デラミノマイシン Bではメトキシ基であり、デラミノマイシン Cでは水素原子である〕のデラミノマイシン A、BおよびCがストレプトミセス属に属する上記物質の生産菌の培養により製造された。

デラミノマイシンA、BおよびCを脱水閉環してデラミノマイシンA2、B2およびC2を製造する。

免疫抑制活性を有する。グラム陽性菌抗菌活性とある種の癌細胞抗癌活性も有する。

目的

効果

実績

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請求項1

次の一般式〔I〕ID=000003HE=055 WI=096 LX=0570 LY=0350または次の一般式〔I′〕ID=000004 HE=050 WI=098 LX=0560 LY=0950〔式中、Xはヒドロキシル基メトキシ基または水素原子を表し、XはデラミマイシンAではヒドロキシル基であり、デラミノマイシン Bではメトキシ基であり、デラミノマイシン Cでは水素原子である〕で表される免疫抑制活性を有する抗生物質、デラミノマイシン A、デラミノマイシン Bおよびデラミノマイシン C、およびそれらの塩。

請求項2

次の一般式〔II〕ID=000005HE=050 WI=094 LX=0580 LY=1650〔式中、Yはヒドロキシル基、メトキシ基または水素原子を表し、YはデラミノマイシンA2ではヒドロキシル基であり、デラミノマイシン B2ではメトキシ基であり、デラミノマイシン C2では水素原子である〕で表される免疫抑制活性を有する抗生物質、デラミノマイシン A2、デラミノマイシン B2およびデラミノマイシン C2。

請求項3

一般式〔I〕または〔I′〕において、Xがヒドロキシル基を表す化合物である請求項1に記載のデラミノマイシンA。

請求項4

一般式〔I〕または〔I′〕において、Xがメトキシ基を表す化合物である請求項1に記載のデラミノマイシンB。

請求項5

一般式〔I〕または〔I′〕において、Xが水素原子を表す化合物である請求項1に記載のデラミノマイシンC。

請求項6

一般式〔II〕において、Yがヒドロキシル基を表す化合物である請求項2に記載のデラミノマイシンA2。

請求項7

一般式〔II〕において、Yがメトキシ基を表す化合物である請求項2に記載のデラミノマイシンB2。

請求項8

一般式〔II〕において、Yが水素原子を表す化合物である請求項2に記載のデラミノマイシンC2。

請求項9

ストレプトミセス属に属するデラミノマイシンA、デラミノマイシン Bおよびデラミノマイシン Cの生産菌を培養し、その培養物からデラミノマイシン Aおよび/またはデラミノマイシン Bおよび/またはデラミノマイシン Cを採取することを特徴とする免疫抑制活性を有する新規な抗生物質、デラミノマイシン Aおよび/またはデラミノマイシン Bおよび/またはデラミノマイシン Cの製造法

請求項10

デラミノマイシンA、デラミノマイシン Bおよびデラミノマイシン Cの生産菌がストレプトミセスアルブルス(Streptomycesalublus )MJ202−72F3株である請求項9記載の製造法。

請求項11

請求項1に記載の一般式〔I〕または〔I′〕のデラミノマイシンA、デラミノマイシン Bまたはデラミノマイシン Cを脱水を伴う閉環反応にかけることを特徴とする、請求項2に記載の一般式〔II〕で表される抗生物質、デラミノマイシン A2、デラミノマイシン B2またはデラミノマイシン C2の製造法。

請求項12

デラミノマイシンA、デラミノマイシン B、デラミノマイシン C、デラミノマイシン A2、デラミノマイシン B2およびデラミノマイシン C2からなる群より選ばれる少なくとも1つの抗生物質またはその製薬学的許容される塩を有効成分として含有し且つこれと混和された製薬学的に許容できる固体または液体状の担体を含有する医薬組成物

技術分野

0001

本発明は免疫抑制活性を有し且つ抗菌活性および抗腫瘍活性も有する新規抗生物質デラミマイシン類(Delaminomycins)に関し、またそれらの製造法に関する。

0002

詳しくは、本発明は免疫抑制活性、グラム陽性細菌に対する抗菌活性および抗腫瘍活性を有する新規抗生物質としてデラミノマイシンA、デラミノマイシン B、デラミノマイシン C、デラミノマイシン A2、デラミノマイシンB2およびデラミノマイシン C2、ならびにこれらの製薬学的許容できる塩に関し、またこれらの新規な抗生物質の製造法にも関する。また、本発明はこれらの新規な抗生物質を有効成分として含む医薬組成物、特に免疫抑制剤組成物に関する。

0003

上記のデラミノマイシンA、デラミノマイシン B、デラミノマイシン C、デラミノマイシン A2、デラミノマイシン B2およびデラミノマイシンC2はこれら新規な抗生物質を本発明者が収得するのに成功した当初では、それぞれに抗生物質MJ202−72F3−A、MJ202−72F3−B、MJ202−72F3−C、MJ202−72F3−A′、MJ202−72F3−B′およびMJ202−72F3−C′と命名された抗生物質であり、それらの研究所名称で日本特許出願平4−187403号明細書(1992年6月23日出願)に記載されてあるけれども、最近はMJ202−72F3の名称の代りにデラミノマイシン(Delaminomycin) の新名称を用いることにした。

背景技術

0004

従来、微生物生産する免疫抑制物質としてサイクロスポリンA、FK506およびスパガリン等が知られているが、これらは免疫抑制剤として完全に満足できるものではない。

発明が解決しようとする課題

0005

臓器移植免疫不全疾患および局所の炎症の医療に有用であるより優れている新規な免疫抑制物質を得ること、また優れた抗腫瘍活性物質を得ることは長年、要望されている。

課題を解決するための手段

0006

本発明者らは微生物生産物中に有用な免疫抑制活性物質見出す目的で、天然土壌より数多くの微生物を単離し、それら微生物の生産物について種々の研究を行なった。その結果、本発明者らが新たに土壌から分離したストレプトミセス属に属する微生物の培養液中に優れた免疫抑制活性を有してMJ202−72F3−A、BおよびC物質と当初に命名された3種の抗生物質が生産され蓄積されることを認めた。それらの物質を単離し、生物学的および物理化学的性状を調べ、これらの物質が免疫抑制活性とグラム陽性細菌に対する抗菌活性および抗腫瘍活性を有すること、および化学構造式の決定により新規化合物であること、また互変異性体があることを見出した。

0007

なお、MJ202−72F3−A、−Bおよび−C物質が夫々にデラミノマイシンA、デラミノマイシン Bおよびデラミノマイシン Cと最近に改名したのは、前述のとおりである。

0008

さらに、本発明者らは上記のデラミノマイシンA、BおよびCをそれぞれに原料として用い、それらを、脱水を伴う閉環反応からなる化学的方法により、デラミノマイシン Aからデラミノマイシン A2を、デラミノマイシン Bからデラミノマイシン B2を、またデラミノマイシン CからデラミノマイシンC2を製造することに成功した。これらデラミノマイシン A2、B2およびC2についても生物学的および物理化学的性状を調べ、これらの物質が免疫抑制活性とグラム陽性細菌に対する抗菌活性および抗腫瘍活性を有すること、および化学構造式の決定により新規化合物であることを見出した。

0009

すなわち、本発明は免疫抑制活性、抗菌活性および抗腫瘍活性を有する新規抗生物質デラミノマイシンA、BおよびCならびにA2、B2およびC2の各物質を提供し、またそれらの製造法を提供するものである。

0010

詳しく言えば、第1の本発明によると、次の一般式〔I〕
ID=000006HE=055 WI=102 LX=0540 LY=0300

0011

または次の一般式〔I′〕
ID=000007HE=055 WI=100 LX=0550 LY=0900

0012

〔式中、Xはヒドロキシル基メトキシ基または水素原子を表し、XはデラミノマイシンAではヒドロキシル基であり、デラミノマイシンBではメトキシ基であり、デラミノマイシン Cでは水素原子である〕で表される免疫抑制活性を有する新規な抗生物質、デラミノマイシン A、デラミノマイシン Bおよびデラミノマイシン C、およびそれらの塩が提供される。

0013

一般式〔I〕で表される化合物と一般式〔I′〕で表される化合物は互変異性の関係にある。また、一般式〔I〕または一般式〔I′〕のデラミノマイシンA、BまたはCの塩には、製薬学的に許容できる金属、例えばナトリウムカリウムの如きアルカリ金属との塩、カルシウムの如きアルカリ土類金属との塩、あるいはアンモニウム塩がある。

0014

また、第2の本発明によると、次の一般式〔II〕
ID=000008HE=045 WI=096 LX=0570 LY=1850

0015

〔式中、Yはヒドロキシル基、メトキシ基または水素原子を表し、YはデラミノマイシンA2ではヒドロキシル基であり、デラミノマイシン B2ではメトキシ基であり、デラミノマイシン C2では水素原子である〕で表される免疫抑制活性を有する新規な抗生物質、デラミノマイシン A2、デラミノマイシン B2およびデラミノマイシン C2が提供される。

0016

〔1〕デラミノマイシンA、BおよびCの物理化学的性質
(a)第1の本発明によるデラミノマイシン A(一般式〔I〕または〔I′〕でXがヒドロキシル基である化合物)の物理化学的性状は下記のとおりである。

0017

(1)物質の色および性状:無色〜白色、固体
(2)分子式:C29H43O6 N
(3)元素分析:C29H43O6 N・H2 Oとして
C H O N
実測値67.37% 8.79% 21.22% 2.61%
計算値67.03% 8.73% 21.55% 2.70%
(4)分子量:501
(5)FAB(Fast Atom Bombardment)マススペクトル:m/z 500〔M−H〕- が観測された。

0018

(6)紫外線吸収スペクトルメタノール溶液中で測定した吸収ピークを次に示す。
ID=000009HE=010 WI=082 LX=0640 LY=0550

0019

(7)赤外線吸収スペクトルKBr法):添付図面の図1に示す。
ID=000010HE=010 WI=126 LX=0420 LY=0700

0020

(8) 1H−NMRスペクトル(400MHz):
ID=000011HE=040 WI=139 LX=0355 LY=0850

0021

メタノール中メタノール(3.30ppm)を基準物質として測定した。

0022

(9)13C−NMRスペクトル(100MHz):
ID=000012HE=025 WI=139 LX=0355 LY=1350

0023

重メタノール中メタノール(49.00ppm)を基準物質として測定した。

0024

(10)溶解性:メタノールに可溶、水、アセトンエーテルn−ヘキサンに難溶または不溶である。
(11)薄層クロマトグラフィーメルク社製シリカゲル60F254 Art.5554使用):Rf値次表に示す。

0025

0026

(12)呈色反応バニリン硫酸およびアニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

0027

(b)第1の本発明によるデラミノマイシンB(一般式〔I〕または〔I′〕でXがメトキシ基である化合物)の物理化学的性状は下記のとおりである。

0028

(1)物質の色および性状:無色〜白色、固体
(2)分子式:C30H45O6 N
(3)分子量:515
(4)FAB(Fast Atom Bombardment)マススペクトル:m/z 514〔M−H〕- が観測された。

0029

(5)紫外線吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した吸収ピークを次に示す。
ID=000014HE=010 WI=082 LX=0640 LY=2450

0030

(6)赤外線吸収スペクトル(KBr法):添付図面の図2に示す。
ID=000015HE=010 WI=128 LX=0410 LY=2600

0031

(7) 1H−NMRスペクトル(400MHz):
ID=000016HE=040 WI=135 LX=0375 LY=0300

0032

重メタノール中メタノール(3.30ppm)を基準物質として測定した。

0033

(8)13C−NMRスペクトル(100MHz):
ID=000017HE=025 WI=130 LX=0400 LY=0800

0034

重メタノール中メタノール(49.00ppm)を基準物質として測定した。

0035

(9)溶解性:メタノールに可溶、水、アセトン、エーテル、n−ヘキサンに難溶または不溶である。
(10)薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲル60F254 Art.5554使用):Rf値を次表に示す。

0036

0037

(11)呈色反応:バニリン硫酸およびアニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

0038

(c)第1の本発明によるデラミノマイシンC(一般式〔I〕または〔I′〕でXが水素である化合物)のとおりである。

0039

(1)物質の色および性状:無色〜白色、固体
(2)分子式:C29H43O5 N
(3)分子量:485
(4)FAB(Fast Atom Bombardment)マススペクトル:m/z 484〔M−H〕- が観測された。

0040

(5)紫外線吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した吸収ピークを次に示す。
ID=000019HE=010 WI=082 LX=0640 LY=1900

0041

(6)赤外線吸収スペクトル(KBr法):添付図面の図3に示す。
ID=000020HE=010 WI=126 LX=0420 LY=2050

0042

(7) 1H−NMRスペクトル(400MHz):
ID=000021HE=040 WI=137 LX=0365 LY=2200

0043

重メタノール中メタノール(3.30ppm)を基準物質として測定した。

0044

(8)13C−NMRスペクトル(100MHz):
ID=000022HE=025 WI=130 LX=0400 LY=0300

0045

重メタノール中メタノール(49.00ppm)を基準物質として測定した。

0046

(9)溶解性:メタノールに可溶、水、アセトン、エーテル、n−ヘキサンに難溶または不溶である。
(10)薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲル60F254 Art.5554使用):Rf値を次表に示す。

0047

0048

(11)呈色反応:バニリン硫酸およびアニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

0049

(d)第2の本発明によるデラミノマイシンA2(一般式〔II〕でYがヒドロキシル基である化合物)の物理化学的性状は下記の通りである。

0050

(1)物質の色および性状:無色〜白色、固体
(2)分子式:C29H41O5 N
(3)元素分析:C29H41O5 N として
C H O N
実測値71.22% 8.46% 16.91% 3.28%
計算値72.02% 8.54% 16.54% 2.90%
(4)分子量:483
(5)FAB(Fast Atom Bombardment)マススペクトル:m/z 482〔M−H〕- 、636〔M+NBA〕+ が観測された。

0051

(6)紫外線吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した吸収ピークを次に示す。
ID=000024HE=010 WI=072 LX=1140 LY=1550

0052

(7)赤外線吸収スペクトル(KBr法):添付図面の図4に示す。
ID=000025HE=015 WI=132 LX=0390 LY=1750

0053

(8) 1H−NMRスペクトル(400MHz):
ID=000026HE=040 WI=135 LX=0375 LY=1950

0054

クロロホルムテトラメチルシランTMS)(0ppm)を基準物質として測定した。

0055

(9)13C−NMRスペクトル(100MHz):
ID=000027HE=025 WI=139 LX=0355 LY=2450

0056

重クロロホルム中重クロロホルム(77.00ppm)を基準物質として測定した。

0057

(10)溶解性:メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、エーテルに可溶、n−ヘキサン、水に難溶または不溶である。
(11)薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲル60F254 Art.5554使用):Rf値を次表に示す。

0058

0059

(12)呈色反応:バニリン硫酸およびアニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

0060

(e)第2の本発明によるデラミノマイシンB2(一般式〔II〕でYがメトキシ基である化合物)の物理化学的性状は下記の通りである。

0061

(1)物質の色および性状:無色〜白色、固体
(2)分子式:C30H43O5 N
(3)分子量:497
(4)FAB(Fast Atom Bombardment)マススペクトル:m/z 498〔M+H〕+ 、496〔M−H〕- が観測された。

0062

(5)紫外線吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した吸収ピークを次に示す。
ID=000029HE=010 WI=061 LX=1195 LY=1150

0063

(6)赤外線吸収スペクトル(Kbr法):添付図面の図5に示す。
ID=000030HE=015 WI=120 LX=0450 LY=1350

0064

(7) 1H−NMRスペクトル(400MHz):
ID=000031HE=040 WI=135 LX=0375 LY=1550

0065

重クロロホルム中TMS(0ppm)を基準物質として測定した。

0066

(8)13C−NMRスペクトル(100MHz):
ID=000032HE=025 WI=139 LX=0355 LY=2050

0067

重クロロホルム中重クロロホルム(77.00ppm)を基準物質として測定した。

0068

(9)溶解性:メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、エーテルに可溶、n−ヘキサン、水に難溶または不溶である。
(10)薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲル60F254 Art.5554使用):Rf値を次表に示す。

0069

0070

(11)呈色反応:バニリン硫酸およびアニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

0071

(f)第2の本発明によるデラミノマイシンC2(一般式〔II〕でYが水素である化合物)の物理化学的性状は下記のとおりである。

0072

(1)物質の色および性状:無色〜白色、固体
(2)分子式:C29H41O4 N
(3)分子量:467
(4)FAB(Fast Atom Bombardment)マススペクトル:m/z 468〔M+H〕+ 、466〔M−H〕- が観測された。

0073

(5)紫外線吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した吸収ピークを次に示す。
ID=000034HE=010 WI=061 LX=1195 LY=0550

0074

(6)赤外線吸収スペクトル(KBr法) :添付図面の図6に示す。
ID=000035HE=010 WI=139 LX=0355 LY=0750

0075

(7) 1H−NMRスペクトル(400MHz):
ID=000036HE=040 WI=139 LX=0355 LY=0900

0076

重クロロホルム中TMS(0ppm)を基準物質として測定した。

0077

(8)13C−NMRスペクトル(100MHz):
ID=000037HE=025 WI=139 LX=0355 LY=1400

0078

重クロロホルム中重クロロホルム(77.00ppm)を基準物質として測定した。

0079

(9)溶解性:メタノール、酢酸エチル、クロロホルムに可溶、水、n−ヘキサンに難溶または不溶である。
(10)薄層クロマトグラフィー(メルク社製シリカゲル60F254 Art.5554使用):Rf値を次表に示す。

0080

0081

(11)呈色反応:バニリン硫酸およびアニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

0082

〔2〕デラミノマイシンA、B、C、A2、B2およびC2の生物学的活性
本発明によるデラミノマイシン A、BおよびCならびにデラミノマイシンA2、B2およびC2の各々は、グラム陽性細菌に対して強い抗菌作用を有することが認められた。

0083

脾細胞には、細胞性免疫関与するT細胞Tリンパ球とも言う)と抗体産生に基づく免疫に関するB細胞Bリンパ球とも言う)とが含有される。脾細胞に含有されているT細胞は、T細胞に選択的に作用するマイトジェンであるコンカナバリンAで処理されると、活性化され芽球化即ち幼若化して増殖する反応を起すことが知られる。しかし、B細胞はコンカナバリンA処理を受けても活性化されず増殖しないことが知られる。コンカナバリンA処理により活性化されたT細胞を含有する脾細胞が増殖する反応の程度は、T細胞による 3H−チミジンの取り込み(incorporation) の量を測定することにより評価できる。

0084

或る化合物がT細胞による細胞性免疫を抑制する活性を有するか否かは、コンカナバリンA処理された脾細胞をその化合物の存在下で培養し、その際の脾細胞の増殖反応がその化合物により阻害される程度を測定することで判定できる〔参考文献1; Larson,E.L.ら:Mechanism of T cell activation. I.A screeningof“step one”ligands.「Eur. J. Immunol.」10巻,93〜99(1980)、および参考文献2: Ueno,M.ら:Dethymicin, a novel immunosuppressant isolated froman Amycolatopsis. Fermentation, isolation, physico-chemical propertiesand biological activities.「J. Antibiot.」45巻,1819〜1826(1992)参照〕。

0085

本発明によるデラミノマイシンA、B、C、A2、B2またはC2はコンカナバリンA処理で活性されたマウス脾細胞が増殖する反応を阻害する活性を有することがin vitro の試験により認められた。

0086

更に、或るマウス個体から取った脾細胞(リンパ球)を、別のマウス個体から取られて予じめマイトマイシンC処理を受けて刺激細胞(stimulator)として作用する脾細胞(リンパ球)と混合し、このように混合された細胞を培養すると、前者の脾細胞 (反応細胞、responder)に含有されるT細胞が刺激されて芽球化即ち幼若化して増殖する反応を起すことが知られる。

0087

この反応は混合リンパ球培養反応 (Mixed LymphocyteCulture Reaction) と言われるが、混合リンパ球培養反応において、混合されたリンパ球を培養する培地中に、T細胞に選択的に阻害活性を示す化合物を添加して置くと、混合リンパ球培養反応での組織適合抗原依存性のT細胞の増殖反応に対し阻害することが知られる〔参考文献1; Ishizuka,M.ら:Induction of antitumor resistance tomouse leukemia L1210 by spergualins.「J. Antibiot.」39巻,1736〜1743(1986)および参考文献2;Ueno,M. ら:Dethymicin, a novel immunosuppressantisolated from an Amycolatopsis. Fermentation, isolation,physico-chemicalpropertiesand biological activities.「J. Antibiot.」45巻,1819〜1826(1992)参照〕。

0088

本発明によるデラミノマイシンA、B、C、A2、B2およびC2は混合リンパ球培養反応のin vitro試験で反応細胞として働くT細胞の増殖反応を阻害する活性を有することが認められた。

0089

更にまた、羊赤血球抗原として注射されて免疫を受けたマウスに、羊赤血球を再度注射することにより遅延型過敏症(DTH)が起る現象を利用することにより、或る化合物が細胞性免疫を抑制する活性を有するか否かを評価する試験が知られている〔参考文献1;「J. Antibiot.」33巻, 642〜652(1990) および参考文献2;「J. Antibiot.」45巻,1819〜1826(1992)参照〕。

0090

羊赤血球を抗原として注射されたマウスの遅延型過敏症のin vivo試験において、本発明のデラミノマイシン類(delaminomycins)は抑制活性を示した。一方、B細胞が関与する抗体産生試験においてはまったく阻害活性を示さなかった。従って、本発明による一般式〔I〕または〔I′〕および一般式〔II〕のデラミノマイシン類は免疫抑制活性をもち、また抗菌活性も有する。

0091

これらの結果から、本発明のデラミノマイシン類はT細胞を選択的に阻害する活性を有すると認められ、臓器移植で必要とされる免疫抑制剤(immunosuppressant) として、また細胞性免疫反応を原因とする過敏免疫状態である自己免疫疾患治療に有用な薬剤としての用途がある。また、ある種の癌細胞に対し癌細胞の増殖阻害活性を示す事も認められることより本発明のデラミノマイシン類は抗癌剤としての用途がある。要約すると、本発明によるデラミノマイシン A、B、C、A2、B2およびC2の各々はグラム陽性菌感染症の治療に有用であるとともに臓器移植や自己免疫疾患に有用な免疫抑制剤または免疫調節剤としての用途がある。さらに、ある種の癌に対して有用な抗癌剤としての用途がある。

0092

第1および第2の本発明によるデラミノマイシンA、B、C、A2、B2およびC2の生理活性を後記の試験例で評価した。

0093

試験例1
マイトジェンにより起された脾細胞の増殖反応に対すデラミノマイシンの阻害活性
PMI1640培地(10%、牛胎児血清を含む)中に懸濁されたCDFマウス脾細胞に供試化合物(デラミノマイシン)を種々の濃度で添加し、更にマイトジェンとしてコンカナバリンAを0.5μg/mlとなるように添加した後に37℃、5%炭酸ガス濃度の条件下にて、72時間脾細胞を培養した。培養終了時の16〜18時間前に 3H−チミジンを添加し、その後、細胞増殖を 3H−チミジンの細胞内取り込みを基準として判定した。また、細胞増殖を50%阻害する供試化合物濃度、すなわちIC50値も測定した。その脾細胞増殖に対する供試化合物の阻害活性を次式阻害率で評価した。

0094

阻害率(%)=100−(T/C×100)
但し、Tは供試化合物で処理した時の 3H−チミジンの取り込み量を表わし、Cは処理しない時の取り込み量を表わす。得られた試験結果を表1に示す。

0095

0096

試験例2
混合リンパ球培養反応(Mixed Lymphocyte Culture Reaction) に対するデラミノマイシンの阻害活性
混合リンパ球培養反応を行うため、刺激細胞として、WKYラットから採取した脾細胞をマイトマイシンC50μg/mlで37℃、20分間処理したものを用い、反応細胞として、フィッシャーF344ラットから採取した脾細胞のナイロンウール付着細胞を用いた。これら細胞を混合し、混合された細胞をRPMI1640培地(5%、牛胎児血清を含む)中にて、種々の濃度で添加される供試化合物(デラミノマイシン)の存在下又は非存在下で培養することにより37℃、5%炭酸ガス濃度の条件下で120時間反応させた。

0097

反応終了の16〜18時間前に 3H−チミジンを添加し、反応細胞への 3H−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターにて測定した。混合リンパ球培養反応に対する供試化合物の阻害活性は、阻害率〔100−(T/C×100),%〕で評価した。また、この反応を50%阻害する供試化合物濃度、すなわちIC50値も測定した。その試験結果を表2に示す。

0098

0099

試験例3
マウス遅延型過敏症(DTH)に対するデラミノマイシンの抑制効果
CDF1 マウスに羊赤血球(105 個/マウス)を静注して免疫後、4日目に羊赤血球(108 個/マウス)を足蹠皮下注射して感作させ、遅延型過敏症(DTH)を惹起した。供試化合物は免疫後0〜4日目まで毎日1回、腹腔内投与した。感作5日目に、マウス足蹠の厚さを測定する事によりDTHに対する抑制効果を判定した。この抑制効果は次式で算出される阻害率(%)で評価した。

0100

阻害率(%)=100−(T/C×100)
但し、Tは供試化合物を投与した時の足蹠の厚さを表し、Cは供試化合物無投与の時の足蹠の厚さを表す。得られた試験結果を表3に示す。

0101

0102

試験例4
癌細胞に対するデラミノマイシンの増殖阻害活性
各種動物癌細胞および人癌細胞を培養し、これらの培養癌細胞の増殖を50%阻害する本発明のデラミノマイシン A、B、C、A2、B2およびC2の濃度、すなわちIC50値を測定して癌細胞に対する増殖阻害活性を評価した。得られた結果を表4に示す。

0103

0104

試験例5
抗菌活性
さらに本発明によるデラミノマイシンA、B、C、A2、B2およびC2は各種の細菌に対して抗菌活性を有する。寒天平板希釈法によって測定した各種細菌および糸状菌に対する本発明の新規抗生物質の最小生育阻止濃度MIC.)(μg/ml)の測定結果をそれぞれ表5a、表5b、表5cおよび表5dに示す。

0105

0106

0107

0108

0109

さらに、第3の本発明によると、ストレプトミセス属に属するデラミノマイシンA、BおよびCの生産菌を培養し、その培養物からデラミノマイシン Aおよび/またはデラミノマイシン Bおよび/またはデラミノマイシン Cを採取することを特徴とする、免疫抑制活性を有する新規な抗生物質、デラミノマイシン A、および/またはデラミノマイシン Bおよび/またはデラミノマイシンCの製造法が提供される。

0110

本発明の方法に用いるデラミノマイシンA、BおよびCの生産菌はストレプトミセス属の菌株でデラミノマイシン A、BおよびCの少なくとも1つの生産能を有するものであれば良く、特に一つの菌株に限定されない。使用できるデラミノマイシン A、BおよびCの生産菌の一例には平成2年1月、山梨県大月市の土壌より分離された放線菌でMJ202−72F3の菌株番号が付された菌株がある。

0111

以下、MJ202−72F3株の菌学的性状について述べる。

0112

1.形 態
MJ202−72F3株は、分枝した基生菌糸より比較的長い気菌糸伸長し、その先端は5〜6回転のらせんを形成する。輪生枝および胞子のうは認められない。気菌糸の先端には50個以上の胞子の連鎖を認め、胞子の大きさは約0.5〜0.7×0.8〜1.2ミクロンであった。なお、胞子の表面はとげ状あるいはいぼ状を呈する。

0113

2.各種培地における生育状態
色の記載について〔 〕内に示す標準は、コンティナー・コーポレーションオブ・アメリカカラーハーモニーマニュアル(Container Corporation ofAmerica のcolor harmony manual) を用いた。

0114

(1)シュクロース硝酸塩寒天培地(30℃培養)
無色〜うす黄の発育上に、部分的に明るい灰〔2fe, Covert Gray〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
(2)グルコースアスパラギン寒天培地(30℃培養)
発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められない。
(3)グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP−培地5、30℃培養)
うす黄〔2gc,Bamboo〕の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(4)スターチ無機塩寒天培地(ISP−培地4、30℃培養)
無色〜うす黄の発育上に、明るい灰〔3fe,Silver Gray 〕の気菌糸をわずかに着生する。溶解性色素は認められない。

0115

(5)チロシン寒天培地(ISP−培地7、30℃培養)
うす黄〔2gc,Bamboo〕の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
(6)栄養寒天培地(30℃培養)
発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。
(7)イースト麦芽寒天培地(ISP−培地2、30℃培養)
うす黄〔1 1/2ic, Lt Antique Gold〕の発育上に、部分的に明るい灰〔f,〜2fe, Covert Gray〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
(8)オートミール寒天培地(ISP−培地3、30℃培養)
うす黄の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められない。

0116

(9)グリセリン・硝酸塩寒天培地(30℃培養)
発育は無色〜うす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。
(10)スターチ寒天培地(30℃培養)
発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。
(11)リンゴ酸石灰寒天培地(30℃培養)
発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。
(12)セルロース濾紙片添加合成液、30℃培養)
40日間培養後も生育は認められない。

0117

(13)ゼラチン穿刺培養
15%単純ゼラチン培地(20℃培養)では、発育はうす黄、白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められない。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地(27℃培養)の場合、発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。

0118

(14)脱脂牛乳(30℃および37℃培養)
30℃培養で、発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められない。37℃培養の場合、発育は極めて悪く、うす黄の発育がわずかに観察されるが、気菌糸および溶解性色素は認められない。

0119

3.生理的性質
(1)生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地(グルコース1.0%、L−アスパラギン0.05%、リン酸二カリウム0.05%、寒天3.0%、pH7.0)を用い、20℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各温度で試験した結果、50℃を除き、そのいずれの温度でも発育したが、37℃の生育は極めて悪い。なお、生育至適温度は27℃〜30℃付近と思われる。

0120

(2)ゼラチンの液化(15%単純ゼラチン培地、20℃培養;グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、27℃培養)
15%単純ゼラチン培地およびグルコース・ペプトン・ゼラチン培地のいずれの場合も21日間の観察で液化性は認められない。
(3)スターチの加水分解(スターチ・無機塩寒天培地およびスターチ寒天培地、いずれも30℃培養)
いずれの培地においても水解性は認められない。

0121

(4)脱脂牛乳の凝固ペプトン化(脱脂牛乳、30℃および37℃培養)
30℃培養では、培養後21日目より凝固することなくペプトン化が始まるが、その作用は極めて弱い。37℃培養の場合、生育は極めて悪く、それらの作用は観察されない。

0122

(5)メラニン様色素の生成(トリプトン・イースト・ブロス、ISP−培地1;ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ISP−培地6;チロシン寒天培地、ISP−培地7;いずれも30℃培養)
いずれの培地でも陰性である。

0123

(6)炭素源利用性プリハム・ゴドリーブ寒天培地、ISP−培地9;30℃培養)
D−グルコース、イノシトールを利用して生育し、シュクロース、D−マンニトールラクトースは利用しない。D−キシロース、D−フルクトースの利用の存否は判然とせず、L−アラビノースラムノースラフィノースは、おそらく利用しないと思われる。

0124

(7)リンゴ酸石灰の溶解(リンゴ酸石灰寒天培地、30℃培養)
培養後7日目頃より、リンゴ酸石灰の溶解が認められ、その作用は中等度である。
(8)硝酸塩の還元反応(0.1%硝酸カリウム含有ペプトン水、ISP−培地8、30℃培養)
陰性である。
(9)セルロースの分解(濾紙片添加合成液、30℃培養)
40日間培養の観察では生育せず、分解は認められない。

0125

以上の性状を要約すると、MJ202−72F3株の形態は、分枝した基生菌糸より5〜6回転のらせん形成を有する気菌糸を伸長し、輪生枝および胞子のうは認められない。気菌糸の先端には50個以上の胞子を連鎖し、胞子の表面はとげ状あるいはいぼ状である。種々の培地で、発育は無色〜うす黄、気菌糸の着生は悪いが、2〜3の培地では、明るい灰の気菌糸を部分的に着生する。溶解性色素は認められない。生育至適温度は27℃〜30℃付近である。メラニン様色素の生成は陰性、スターチの水解性は認められず、蛋白分解力は弱い。また、細胞壁に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸LL−型であった。

0126

これらの性状より、MJ202−72F3株は、ストレプトミセス(Streptomyces)属に属すると考えられる。ストレプトミセス属の既知菌種検索すると近縁の種として、ストレプトミセス・アルブルス(Streptomyces albulus ,文献,International Journal of Systematic Bacteriology,22巻, 271頁,1972年;同誌,30巻, 371頁,1980年)およびストレプトミセス・ナタレンシス(Streptomyces natalensis,文献,International Journal of Systematic Bacteriology,22巻, 323頁,1972年)があげられた。当面は、MJ202−72F3株をストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)MJ202−72F3と命名する。

0127

なお、MJ202−72F3株を工業技術院微生物工業技術研究所(日本、県つくば市にある)に寄託申請し、平成3年12月24日、微工研菌寄第12674号として受託された。

0128

更に、MJ202−72F3株と、前述の2菌株<ストレプトミセス・アルブルスIMCS−0802(ISP 5492)、ストレプトミセス・ナタレンシス IMS S−0687(ISP 5357)>とを実地に比較検討した。その結果、MJ202−72F3株と上記の両菌株は、ゼラチンの液化、ミルクの凝固、ペプトン化、及びスターチの水解性にやや相違が認められた。しかし、それらの性質は変化し易く、大きな相違とは考えられない。さらに、気菌糸の色調、炭素源の利用性等より、MJ202−72F3株はストレプトミセス・アルブルスに、より類似していた。そこで、MJ202−72F3株をストレプトミセス・アルブルス(Streptomyces albulus )MJ202−72F3株と同定した。

0129

現在、MJ202−72F3株はブタペスト条約の規約下に寄託を移行されて上記の微生物工業技術研究所(現在は生命工学工業技術研究所と改称)に寄託番号「FERM BP−4079」として寄託されてある。

0130

次に、第3の本発明の方法による抗生物質、デラミノマイシンA、BおよびCの製造について説明する。

0131

本発明による新規抗生物質デラミノマイシンA、BおよびCは、ストレプトミセス属に属するデラミノマイシンA、BおよびCの生産菌を適当な培地で培養することにより、好ましくは好気的条件下に培養することにより、培地中に目的の抗生物質を産生、蓄積させ、次いで培養物から目的の抗生物質を採取することにより製造することができる。

0132

培地はデラミノマイシンA、BおよびCの生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有するものでありうる。具体的には、例えば、炭素源としてグルコース、イノシトール、マルトースおよび油脂類などが使用でき、窒素源として大豆粉綿実粕、乾燥酵母エキスポリペプトンおよびコーンスティープリカーなどの有機物並びにアンモニウム塩または硝酸塩、例えば硫酸アンモニウム硝酸ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの無機物が利用できる。また必要に応じて食塩塩化カリウム炭酸カルシウムリン酸塩重金属塩などの無機塩類を培地に添加することができる。発酵中発泡を抑制するために常法に従って適当な消泡剤、例えばシリコーン系消泡剤を添加することもできる。

0133

培養方法としては、一般に行なわれている生理活性抗生物質等の生産のための微生物の培養方法であればよく、特に好気的液体深部培養法が適している。培養温度は20〜37℃が適当であるが、27〜30℃が好ましい。この方法でデラミノマイシンA、BおよびCの生産量は、振盪培養通気攪拌培養共に培養5〜7日間で最高に達する。このようにしてデラミノマイシン A、BおよびCが培地中に生産、蓄積されて培養物が得られる。

0134

得られた培養物中では、デラミノマイシンA、BおよびCは菌体中および培養濾液中に存在するが、菌体中により主に存在する。このような培養物からデラミノマイシン A、BおよびCを採取するには、合目的な任意の方法が利用可能である。それらの方法には、抽出の原理に基づく方法であって、具体的には、例えば、培養濾液中からデラミノマイシンA、BおよびCを水不混和性有機溶媒、例えば酢酸ブチルn−ブタノールなどで抽出する方法がある。また菌体内のデラミノマイシンA、BおよびCを回収する場合は濾過または遠心分離などで得た菌体集体をメタノール、エタノール、アセトンなどで処理して抽出することにより回収する方法がある。菌体を分離せずに培養物をそのままを上記の抽出操作に付すこともできる。適当な溶媒を用いた向流分配法抽出方法の範ちゅうに入れることができる。例えば遠心分配クロマトグラフィー(Centrifugal Partition Chromatograph ;三鬼エンジニアリング社製CPC) (注;CPCは商標名)も使用できる。

0135

培養物からデラミノマイシンA、BおよびCを採取する他の方法のひとつは、吸着の原理に基づくものである。例えば、培養濾液あるいは上記のようにして抽出操作を行なうことによって得られる抽出液を用い、適当な吸着剤ゲル濾過剤、例えば、シリカゲル、セファデックスLH−20(ファルマシア社製)、トヨパールHW−40(東ソー社製)、ダイヤイオンHP−20(三菱化成工業社製)などを用いたカラムクロマトグラフィーヌクレオシル5C18(西独ナーゲル社製)などを用いた高速液体クロマトグラフィー又はその他の手段によって目的の抗生物質を吸着剤に吸着させ、その後溶離させることによりデラミノマイシン A、BおよびCを単独に又は混合物として得ることができる。このようにして得られたデラミノマイシン Aおよび/またはデラミノマイシン Bおよび/またはデラミノマイシン Cの含有溶液減圧濃縮乾固すれば、デラミノマイシンAおよび/またはデラミノマイシン Bおよび/またはデラミノマイシン Cの粗標品が得られる。

0136

このようにして得られるデラミノマイシンAおよび/またはデラミノマイシンBおよび/またはデラミノマイシン Cの粗標品を更に精製するためには、上記の抽出法および吸着法を必要に応じて組み合わせ必要回数行なえばよい。例えば、ダイヤイオンHP−20、セファデックスLH−20(商品名)などの吸着剤またはゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィー、CPCを用いた遠心液々分配クロマトグラフィー、シリカゲルを用いた順相クロマトグラフィーおよびヌクレオシル5C18などを用いた高速液体クロマトグラフィーを適宜組合わせて実施することができる。

0137

更に、本発明者らは研究を進めて、その結果、上記の一般式〔I〕または〔I′〕で表される抗生物質デラミノマイシンA、BまたはCを無水の有機溶媒中に溶解し、その溶液無機酸とともに撹拌すると、脱水を伴う閉環反応が起きて前記の一般式〔II〕で表される抗生物質デラミノマイシン A2またはB2またはC2を生成することが認められた。

0138

従って、第4の本発明によると、デラミノマイシンAまたはデラミノマイシン Bまたはデラミノマイシン Cを、脱水閉環反応にかけることを特徴とする、新規な抗生物質デラミノマイシン A2またはデラミノマイシン B2またはデラミノマイシン C2の製造法が提供される。

0139

この第4の本発明の方法を実施するには、原料としてデラミノマイシンAまたはBまたはCを無水の有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、n−ブタノールまたはアセトンにとかし、その溶液へ無機酸、例えば塩酸または硫酸を加えて室温または加温下に反応することができる。反応液から目的のデラミノマイシン A2またはB2またはC2を採取するのには、溶剤を留去後に、得られた残渣を各種のクロマトグラフィー法にかけることにより行い得る。

0140

第1の本発明による一般式〔I〕または〔I′〕のデラミノマイシンAまたはBまたはCまたはそれらの塩、あるいは第2の本発明による一般式〔II〕のデラミノマイシン A2またはB2またはC2は、免疫抑制剤またはその他の医薬として使用する場合、製薬学的に許容できる通常の固体または液体状の担体混和することにより医薬組成物として製剤できる。

0141

従って、第4の本発明によると、デラミノマイシンA、デラミノマイシンB、デラミノマイシン C、デラミノマイシン A2、デラミノマイシン B2およびデラミノマイシン C2からなる群より選ばれる少くとも1つの抗生物質またはそれの製薬学的に許容される塩を有効成分として含有し且つこれと混和された製薬学的に許容できる固体または液体状の担体を含有する医薬組成物が提供される。

0142

本発明による一般式〔I〕または〔I′〕あるいは一般式〔II〕のデラミノマイシン類の1種又はそれ以上を免疫抑制剤または免疫調節剤あるいはその他の医薬として用いる場合は、一般に経口的にまたは非経口的に投与できる。

0143

デラミノマイシンAはICRマウスに腹腔内投与した場合に500mg/kg以上のLD50値を示し、毒性が極めて低い。

0144

本発明の組成物における有効成分化合物、すなわち、デラミノマイシンA、B、C、またはそれらの塩、あるいはデラミノマイシン A2、B2またはC2は単独に、または賦形剤あるいは担体と混合して注射剤経口剤または坐剤などの製剤の形で投与される。賦形剤および担体としては製薬学上許容されるものが選ばれ、その種類および組成投与経路投与方法によって決まる。例えば、液状担体として水、アルコールもしくは大豆油ゴマ油ミネラル油などの動植物油、または合成油などが用いられる。固体担体としてマルトース、シュクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体シクロデキストリンなどの多糖類ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。

0145

注射剤として製剤する場合には、一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトールなどの糖類溶液エチレングリコールポリエチレングリコールなどのグリコール類が望ましい。また、イノシトール、マンニトール、グルコース、マンノース、マルトース、シュクロースなどの糖類、フェニルアラニンなどのアミノ酸類などの賦形剤と共に凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖液電解質溶液アミノ酸などの静脈投与用液体に溶解して用いることもできる。

0146

製剤された組成物中におけるデラミノマイシン化合物の含量は製剤型により種々異なるが、通常は 0.1−100重量%、好ましくは1−90重量%である。例えば注射液の場合には、通常0.1−5重量%のデラミノマイシン化合物を含むようにすることがよい。経口投与の場合には、前記固体担体もしくは液状担体と共に錠剤カプセル剤粉剤顆粒剤ドライシロップ剤液剤シロップ剤などの形態で用いられる。カプセル、錠剤、顆粒、粉剤の場合、一般にデラミノマイシン化合物の含量は3−100重量%、好ましくは5−90重量%であり、残部は担体である。

0147

本発明によるデラミノマイシンまたはその塩の投与量は、患者年令、体重、症状、治療目的などにより決定されるが、投与量は一般的な指針として非経口投与で1−100mg/kg/日、また経口投与で5−500mg/kg/日である。しかし、その投与量は動物試験の結果など種々の状況を案して総投与量が一定量を越えない範囲で、連続的または間けつ的に投与できる。

0148

非経口投与の場合におけるその総投与量は投与方法、患者の状況、例えば年令、体重、性別食事併用薬剤などに応じて適宜変更して投与することはもちろんである。一定の条件下における適量と投与回数は、上記の指針を基にして専門医の決定によらなければならない。これらの投与条件は経口投与においても同様である。

0149

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。以下において「%」は「w/v,%」を示す。

0150

実施例1
本例はMJ202−72F3株の培養による抗生物質デラミノマイシンA、BおよびCの製造例を示す。

0151

(1)種母の調製
種母の調製に使用した培地は、下記の成分を1lの水に溶解した組成のものである。pHは無調整とした。
グルコース1.5 %
酵母エキス(大五栄養社製) 0.25%
カザミノ酸ディフコ社製) 0.25%
炭酸カルシウム0.4%

0152

上記培地110mlを500mlの三角フラスコ分注し殺菌後、ストレプトミセス・エスピーMJ202−72F3株(微工研菌寄第12674号またはFERM BP−4079)をスラントより1白金耳摂取し、30℃、180rpmのロータリーシェーカーにて72時間回転培養したものを種母として得た。

0153

(2)培 養
生産培地として使用した培地は、下記の成分を1lの水に溶解した組成のものである。pHは無調整とした。この培地を110mlずつ500mlの三角フラスコへ分注殺菌したものへ、上記種母2.2mlを添加し、ロータリーシェーカーを用いて27℃、180rpmにて攪拌下に培養を行なった。

0154

グルコース3.0%
酵母エキス(大五栄養社製) 0.5%
カザミノ酸(ディフコ社製) 0.5%
NaNO3 0.2%
KCl 0.2%
CaCO3 0.4%

0155

(3)抗生物質デラミノマイシンA、デラミノマイシンBおよび/またはデラミノマイシン Cの採取
上記(2)の条件で6日間のMJ202−72F3株を培養の後、培養液約20lを遠心分離し(3000rpm、15分間)、菌体をメタノールで抽出処理後、メタノールを溜去した後、残った水層をn−ブタノールにて抽出し、n−ブタノール層を減圧下にて濃縮乾固した。得られた粗抽出物約3gを遠心液々分配クロマトグラフ(CPC,三鬼エンジニアリング)に付す。クロロホルム−メタノール−水(2:2:1)の下層固定相とし、上層移動相として20℃、400rpm、1ml/minの条件下、上昇法にて分離精製を行なった。正溶出画分にデラミノマイシン A、BおよびCは溶出され、これを減圧下濃縮乾固した。

0156

得られた粗精製物830mgをセファデックスLH−20(ファルマシア社製)を用いたゲルクロマトグラフィーに付した。メタノールにて溶出を行ないデラミノマイシンA、BおよびC画分を集め減圧下にて濃縮乾固した。得られたデラミノマイシン A、BおよびC粗精製物813mgをメタノールに溶解し、その一定量をカプセルパック5C18(資生堂社製)のカラム(20mmφ×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、メタノール−25mM酢酸アンモニウムアセトニトリル(60:10:30)にて溶出し、デラミノマイシン AおよびBおよびCの各フラクションを得た。

0157

これらフラクションを各々に減圧下で濃縮乾固後、少量のメタノールに溶解後、セファデックスLH−20を用いたゲルクロマトグラフィーに付し、デラミノマイシンAまたはBまたはCを含むフラクションを減圧下濃縮乾固するとデラミノマイシン Aの無色〜白色の固体320mg、デラミノマイシン Bの無色〜白色の固体30mg、デラミノマイシン Cの無色〜白色の固体13mgが得られた。

0158

実施例2
本例はデラミノマイシンAの脱水閉環による抗生物質デラミノマイシン A2の製造を示す。

0159

デラミノマイシンA220mgをメタノール3mlに溶解後、1N塩酸1mlを添加し室温にて一晩攪拌した。TLCにて原料のデラミノマイシン Aが残っていないことを確認の後、反応液を減圧下濃縮乾固した。得られた残渣277mgを少量のメタノールに溶解後、シリカゲルカラム(20mmφ×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、n−ヘキサン−クロロホルム−アセトニトリル(60:27:13)にて溶出し、デラミノマイシン A2のフラクションを得た。

0160

このフラクションを減圧下濃縮乾固後、少量のメタノールに溶解後、カプセルパック5C18(資生堂社製)のカラム(20mmφ×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、メタノール−水(80:20)にて溶出し、デラミノマイシンA2のフラクションを得た。これを減圧下濃縮乾固すると64mgの粉末が得られた。さらにこれを少量のメタノールに溶解後、セファデックスLH−20を用いたゲルクロマトグラフィーに付し、デラミノマイシン A2を含むフラクションを減圧下濃縮乾固するとデラミノマイシン A2の無色〜白色の固体56.5mgが得られた。

0161

実施例3
本例はデラミノマイシンBの脱水閉環による抗生物質デラミノマイシン B2の製造を示す。

0162

デラミノマイシンB約200mgをメタノール3mlに溶解後、1N塩酸1mlを添加し室温にて一晩攪拌した。TLCにて原料のデラミノマイシン Bが残っていないことを確認の後、反応液を減圧下濃縮乾固した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解後、シリカゲルカラム(20mmφ×250mm)を用いた高速クロマトグラフィーにかけ、n−ヘキサン−クロロホルム−アセトニトリル(60:27:13)にて溶出し、デラミノマイシン B2のフラクションを減圧下濃縮乾固した。

0163

得られたデラミノマイシンB2の粗精製物65mgを少量のメタノールに溶解後、カプセルパック5C18(資生堂社製)のカラム(20mmφ×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、メタノール−水(80:20)にて溶出し、デラミノマイシン B2のフラクションを得た。これを減圧下濃縮乾固すると43mgの粉末が得られた。これを少量のメタノールに溶解後、セファデックスLH−20を用いたゲルクロマトグラフィーに付し、デラミノマイシン B2を含むフラクションを減圧下濃縮乾固するとデラミノマイシン B2の無色〜白色の固体34.6mgが得られた。

0164

実施例4
本例はデラミノマイシンCの脱水閉環による抗生物質デラミノマイシン C2の製造を示す。

0165

デラミノマイシンC約30mgをメタノール3mlに溶解後、1N塩酸1mlを添加し室温にて一晩攪拌した。TLCにて原料のデラミノマイシン Cが残っていないことを確認の後、反応液を減圧下濃縮乾固した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解後、カプセルパック5C18(資生堂社製)のカラム(20mmφ×250mm)を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、メタノール−水(80:20)からメタノールのグラジエント溶出法にて溶出し、デラミノマイシン C2のフラクションを得た。

0166

このフラクションを減圧下濃縮乾固すると、11mgの粉末が得られた。さらにこれを少量のメタノールに溶解後、セファデックスLH−20を用いたゲルクロマトグラフィーに付し、デラミノマイシンC2を含むフラクションを減圧下濃縮乾固するとデラミノマイシン C2の無色〜白色の固体9.8mgが得られた。

発明の効果

0167

以上のように、本発明において、免疫抑制活性とグラム陽性菌に対する抗菌活性と抗癌活性を有する新規抗生物質として、デラミノマイシンA、B、C、A2、B2およびC2が収得された。これらのデラミノマイシン類は、臓器移植に必要とされる免疫抑制剤として、あるいは免疫不全疾患および局所の炎症の治療に有用である治療薬として期待される。

図面の簡単な説明

0168

図1デラミノマイシンAのKBrディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。
図2デラミノマイシン BのKBrディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。
図3デラミノマイシン CのKBrディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。
図4デラミノマイシン A2のKBrディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。
図5デラミノマイシン B2のKBrディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。
図6デラミノマイシン C2のKBrディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。

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