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図面 (1)

目的

本発明は、核酸を精製するためのセライトを提供することを目的とする。

構成

本発明は、モノマーユニット組成物

化1

(但し、R’はOH;RはSiO2;およびR’’はOHである)および、式;

化2

(但し、R’は別々にOHまたは

化3

;RはSiO2、そしてR’’は別々にOHまたは

化4

である)の該組成物の繰り返しユニットを提供する。上記繰り返しユニットは約2以上含まれうる。範囲は約2から約100,000,000、および約2から約100,000を含む。

概要

背景

分子生物学における絶え間無い進歩および関連した技術が、進歩した技術の十分な賞賛および開発に関連した手段の改良に対する絶え間無い要求を示す。

広い範囲の技術は、さまざまな形態のデオキシリボ核酸(DNA)の使用を含む。例えば、組換えDNA技術の領域における進歩は、プローブ、ゲノミックDNA、およびプラスミドDNAの形態の使用を絶えず必要とする。

治療の領域における進歩もさまざまな方法でDNAを利用し続ける。例えば、DNAプローブはヒトの病原体の検出および治療において日常的に使用されている。同様に、DNAは遺伝的疾患の検出において使用される。DNAは、食物汚染物の検出にも使用される。そして、DNAプローブは、遺伝子マッピングからクローニングおよび組換え体発現にわたる範囲のさまざまな動機に対して興味あるDNAの所在を見つけだし、同定し、そして単離するのに日常的に使用される。

多くの例において、DNAは極めて微量で利用でき、そして単離法および精製法は骨が折れそして時間を浪費しうる。時間を浪費し、骨の折れる方法はしばしばDNAを損失する。血清、尿、および細菌培養物から得られた検体からのDNAの精製においては、付加的な汚染の危険および偽陽性の結果が存在する。

典型的なDNA精製プロトコル腐食性組成物および毒性組成物の使用を含む。典型的なDNA精製プロトコルは、高濃度のカオトロピック(chaotropic)な塩、例えば、ヨージドナトリウムおよび過塩素酸ナトリウムを用いる。

DNA精製のためのプロトコルは多数存在する。DNA精製の領域における最近の活動により明らかなとおり、最適なDNA精製プロトコルのための絶え間無い研究が存在する。米国特許第4,923,978号は、蛋白質およびDNAの溶液ヒドロキシル化された支持体に通過させて蛋白質を結合させ、そしてDNAを溶出するDNAの精製法を開示している。米国特許第4,935,342号は、アニオン交換体に選択的にDNAを結合させ、そして次に溶出するDNAの精製法を開示している。米国特許第4,946,952号は、水溶性ケトンを用いた沈殿によるDNA単離法を開示している。カオトロプを用いてDNAを透析するDNA精製法は、米国特許第4,900,677号に開示されている。

概要

本発明は、核酸を精製するためのセライトを提供することを目的とする。

本発明は、モノマーユニットの組成物:

(但し、R’はOH;RはSiO2;およびR’’はOHである)および、式;

(但し、R’は別々にOHまたは

;RはSiO2、そしてR’’は別々にOHまたは

である)の該組成物の繰り返しユニットを提供する。上記繰り返しユニットは約2以上含まれうる。範囲は約2から約100,000,000、および約2から約100,000を含む。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

式:

請求項

ID=000006HE=040 WI=051 LX=0345 LY=0450(但し、R’はOH;RはSiO2;およびR’’はOHである)の組成物または、式;

請求項

ID=000007HE=040 WI=051 LX=0345 LY=1000(但し、R’は別々にOHまたは

請求項

ID=000008HE=035 WI=023 LX=0485 LY=1500;RはSiO2、そしてR’’は別々にOHまたは

請求項

ID=000009HE=035 WI=023 LX=0485 LY=1950である)の該組成物の繰り返しユニットまたは、上記モノマーおよびその繰り返しユニットを含む組成物を、DNAと接触させることからなる、DNAの精製法

請求項2

カオトロプ(chaotropes)の使用をさらに含む、請求項1記載の方法。

請求項3

水和されたSiO2からのDNAの溶出をさらに含む、請求項1記載の方法。

請求項4

加熱および水により溶出する、請求項3記載の方法。

請求項5

式:

請求項

ID=000010HE=040 WI=051 LX=1245 LY=0350(但し、R’はOH;RはSiO2;およびR’’はOHである)の組成物または、式;

請求項

ID=000011HE=040 WI=051 LX=1245 LY=0900(但し、R’は別々にOHまたは

請求項

ID=000012HE=035 WI=023 LX=1385 LY=1400;RはSiO2、そしてR’’は別々にOHまたは

請求項

ID=000013HE=035 WI=023 LX=1385 LY=1850である)の該組成物の繰り返しユニットを含む、DNAの精製用キット

請求項6

式:

請求項

ID=000014HE=040 WI=051 LX=1245 LY=2400(但し、R’はOH;RはSiO2;およびR’’はOHである)の組成物および、式;

請求項

ID=000015HE=040 WI=051 LX=0345 LY=0450(但し、R’は別々にOHまたは

請求項

ID=000016HE=035 WI=023 LX=0485 LY=0950;RはSiO2、そしてR’’は別々にOHまたは

請求項

ID=000017HE=035 WI=023 LX=0485 LY=1400である)の該組成物の繰り返しユニットまたは、上記モノマーおよびその繰り返しユニットを含む組成物の化合物

請求項7

SiO2と水和剤反応生成物

請求項8

SiO2と水和剤を反応させることからなる、SiO2と水和剤の反応生成物の製造法

請求項9

水和剤がNaOHである、請求項7記載の方法。

請求項10

水和剤がNaOHである、請求項8記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、分子生物学の分野に関する。特定すれば、本発明は、デオキシリボ核酸の精製の領域に関する。

背景技術

0002

分子生物学における絶え間無い進歩および関連した技術が、進歩した技術の十分な賞賛および開発に関連した手段の改良に対する絶え間無い要求を示す。

0003

広い範囲の技術は、さまざまな形態のデオキシリボ核酸(DNA)の使用を含む。例えば、組換えDNA技術の領域における進歩は、プローブ、ゲノミックDNA、およびプラスミドDNAの形態の使用を絶えず必要とする。

0004

治療の領域における進歩もさまざまな方法でDNAを利用し続ける。例えば、DNAプローブはヒトの病原体の検出および治療において日常的に使用されている。同様に、DNAは遺伝的疾患の検出において使用される。DNAは、食物汚染物の検出にも使用される。そして、DNAプローブは、遺伝子マッピングからクローニングおよび組換え体発現にわたる範囲のさまざまな動機に対して興味あるDNAの所在を見つけだし、同定し、そして単離するのに日常的に使用される。

0005

多くの例において、DNAは極めて微量で利用でき、そして単離法および精製法は骨が折れそして時間を浪費しうる。時間を浪費し、骨の折れる方法はしばしばDNAを損失する。血清、尿、および細菌培養物から得られた検体からのDNAの精製においては、付加的な汚染の危険および偽陽性の結果が存在する。

0006

典型的なDNA精製プロトコル腐食性組成物および毒性組成物の使用を含む。典型的なDNA精製プロトコルは、高濃度のカオトロピック(chaotropic)な塩、例えば、ヨージドナトリウムおよび過塩素酸ナトリウムを用いる。

0007

DNA精製のためのプロトコルは多数存在する。DNA精製の領域における最近の活動により明らかなとおり、最適なDNA精製プロトコルのための絶え間無い研究が存在する。米国特許第4,923,978号は、蛋白質およびDNAの溶液ヒドロキシル化された支持体に通過させて蛋白質を結合させ、そしてDNAを溶出するDNAの精製法を開示している。米国特許第4,935,342号は、アニオン交換体に選択的にDNAを結合させ、そして次に溶出するDNAの精製法を開示している。米国特許第4,946,952号は、水溶性ケトンを用いた沈殿によるDNA単離法を開示している。カオトロプを用いてDNAを透析するDNA精製法は、米国特許第4,900,677号に開示されている。

発明が解決しようとする課題

0008

DNAを精製するための本発明のプロトコルはその目的を達成することができるが、得るDNA量を増加させることに加えて、腐食性および毒性化合物、例えばもっともしばしば用いられるカオトロプ(chaotropes)を用いずにDNAを精製することが望まれる。

課題を解決するための手段

0009

本発明は、モノマーユニットの組成物:

0010

本発明を実施することにより、さまざまな源から、さまざまな形態のDNAを精製することができる。その方法は、本発明の組成物を用い、そして結合緩衝液、例えばカオトロプを随意に用いることが回避される。DNAは水性溶液、例えばTE緩衝液(10mMトリス、1mMEDTA)に室温で結合させることができる。さらに、加熱により本発明の組成物から水中にDNAを溶出するか、または通常用いられる緩衝液、例えばTEまたは1×TAEを用いることができる。精製されるDNAの源は、バクテリアバクテリオファージ、検体、植物、動物、および類似物を含む。DNAはさまざまな形態で見いだされ、そして一本鎖二本鎖、環状、および直鎖状を含みうる。本発明は、あらゆる源のあらゆる形態のDNAを用いて実施できる。

0011

本発明は、モノマーユニットの組成物:

0012

表面はDNAの結合のために提供され、そして表面からDNAが容易に回収される。また、DNAを、式

0013

水和剤とSiO2の反応生成物も提供される。

0014

本発明は、また、式

0015

上記繰り返しユニットは約2以上含まれうる。範囲は約2から約100,000,000、および約2から約100,000を含む。

0016

通常、水和剤とSiO2の反応生成物は、上記モノマーユニットの繰り返しユニットからなるビーズ様構造になる。

0017

このポリマー電気特性は、より慣用的な特性である表面修飾を形成しうるが、このポリマーの存在により、ビーズの中心において電気特性を変えることができる(本開示において記載されている目的のためのより効果的な表面にする)。例えば、表面は、SiCl4を用いて、次に表面にシアノールコーティングをもたらす水和により修飾されうる。繰り返しユニットの接触とはDNAとの相互作用であり、即ち、繰り返しユニットからなる表面も本発明の実施に適するようになる。本発明の組成物からなるように構成されうる表面は、ディップスティックの形状、チューブバイアル濾過装置、および類似物を含む。

0018

本発明の組成物を得るための方法は、通常水和剤、例えばNaOH(水性)をSiO2に添加し、そして還流することを含む。

0019

本発明は、本発明の組成物とDNAを接触させることからなるDNA精製法も提供する。

0020

本発明の組成物およびNaOHとSiO2の反応物の生成法は、NaOHをSiO2に添加することからなる。Na+以外のあらゆるカウンターイオンは、任意の濃度で、SiO2に対する任意の比率で使用できる。例えば、水酸化カリウムも使用できる。SiO2に対するNaOHの比率は約0.1:1から10:1、好ましくは、約2:1である。その結果得られる生成物濾過し、次に洗浄および乾燥する。適切な洗浄剤アセトンおよび類似物を含む。生成物は、今DNAの精製の使用のために準備された。

0021

あらゆるDNA精製法および単離法の開始は、源から所望のDNAを得ることを必要とする。検体、例えば血清、尿、およびバクテリア培養物からDNAを得るための典型的なプロトコルはよく知られており、そして日常的に実施されている。同様に、ゲノミックライブラリーおよび類似物からDNAを得るための能力は日常的である。本発明の鍵は、ひとたび源から得られたDNAを精製する可能性にある。DNAを得るための典型的な方法は、DNAを溶液に懸濁することにより終了する。引用文献は生物学的サンプルからのDNAの単離法として、ハーディング(Harding,J.D.)、ゲビエフ(Gebeyehu,G.)、ベビー(Bebee,R.)、シムズ(Simms,D.)、クテバン(Ktevan,L.)、Nucleic AcidsResearch,17:6947(1989)、およびマルコ(Marko,M.A.)、チッパーフィールド(Chipperfield.R.)およびバーンボイム(Birnboim,H.C.)、Analytical Biochemistry,121:382(1982)を含む。プラスミドDNAの単離法は、ルッツェ(Lutze,L.H.)、ワインガー(Winger,R.A.)、Nucleic Acids Research 20:6150(1990)に見いだすことができる。二本鎖DNA抽出法は、ヤマダ(Yamada,O.)、マツモト(Matsumoto,T.)、ナカシマ(Nakashima,M.)、ハグリ(Hagri,S.)、カマホラ(Kamahora,T.)、ウエヤマ(Ueyama,H.)、キシ(Kishi,Y.)、ウエムラ(Uemura,H.)、クリムラ(Kurimura,T.)、Journal of Virological Methods 27:203(1990)に見いだすことができる。ほとんどのDNA溶液は、適切な緩衝液、例えばTE(トリス−EDTA(10mM:1mM))、TEA(40mM トリス−酢酸、1mM EDTA)緩衝液中のDNA、または溶菌液からなる。DNAが適切な溶液中に得られれば、典型的には結合マトリックスを溶液に添加する。通常用いられる結合マトリックスはガラスまたは珪藻の形態のシリカである。しかしながら、シリカを用いる方法は、表面にDNAを結合させるために高濃度のカオトロプ(chaotropes)またはアルコールを必要とする。最近用いられているカオトロプはヨージドナトリウム(NaI)、尿素塩酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム(NaClO4)、および臭化カリウムKBr)を含む。カオトロプおよびアルコールは、毒性、腐食性、引火性および/または高価でありうる。本発明の方法は、本発明の表面への結合にカオトロプまたはアルコールを必要としない。本発明の方法は、室温において水性溶液中でDNAを結合し、そして37℃においてDNAを水中に溶出する。しかしながら、もし必要であれば、カオトロプ、アルコールおよび類似物を本発明の方法において使用することができる。

0022

本発明の方法を用いるための典型的な方法は、DNA溶液に本発明の組成物を添加することを含むが、添加は通常、結合緩衝液の添加の次に行われる。この点において、本発明の方法が結合緩衝液を必要としないことは利点である。溶液は短時間室温でインキュベートする。遠心分離後、上清を捨て、そして沈殿を洗浄することができる。次にDNAを溶出する。

0023

本発明の組成物は、組成物重量:水が約1:10から約1:1の比率の範囲で用いられるのが典型的である。好ましくは、過剰量の水を避け、緩衝液、例えばTEを水の代わりに用いることができる。

0024

次に、もし用いるのならば結合緩衝液を添加する。室温において約1分から約20分間、好ましくは約10分間の短時間インキュベートした後に、コンテナーを遠心分離後、沈殿画分上清画分を得る。上清を別にし、そして沈殿を試薬、例えば、50mMトリスで希釈したエタノールで洗浄する。好ましい洗浄試薬濃度は80%エタノールである。次に、溶出緩衝液、例えばTE緩衝液、1×TAE緩衝液、および1×TBE緩衝液を用いてDNAを本発明の組成物から溶出する。より重要なことは、溶出緩衝液の使用が避けられ、そして、DNAは加熱により水中に溶出することである。収量を最大にするためには、溶出工程を繰り返す。

0025

本発明の化学組成物は、便利なようにキットを組むことができる。本発明の組成物を含むキットはコンテナー、例えばバイアル中に、適切な緩衝液、例えばTE緩衝液およびTAE緩衝液と共に含むことができ、そして必要であれば、結合緩衝液、例えばカオトロプのコンテナー、洗浄緩衝液、例えば50mMトリスで希釈したエタノール溶液、または1×TAEのコンテナー、および溶出緩衝液、例えばTE緩衝液、1×緩衝液溶液および1×TBE緩衝液のコンテナーを含むことができる。そのようなキットはDNAの精製を便利にする。

0026

以下の実施例において、本発明の特定の態様を例示する。当業者には明らかなとおり、さまざまな変更および修飾は、記載された本発明の目的の範囲内であると考えられる。

0027

実施例1
本実施例の目的は、NaOHのさまざまな溶液中で還流することにより、酸で洗浄されたセライト545上のヒドロキシル基を増加させることである。ヒドロキシルの増加により、化学反応による表面の修飾が容易になる。

0028

材料
酸で洗浄されたセライト545(オルテック(Alltech)、Deerfield,il,ストック#9043、QC243)
NaOH(アルドリッヒ(Aldrich)、ロット#04027EP)
NaOH量を一つの実験から次の実験において変更する以外は、8つの実験を同じ方法で正確に行った。

0029

実験セライト545 NaOH
q mMol mg mMol eqセライト
1 0.5 8.33 16.8 0.42 0.05
2 0.5 8.33 33.2 0.83 0.1
3 0.5 8.33 100.0 2.50 0.3
4 0.5 8.33 168.0 4.20 0.5
5 0.5 8.33 233.0 5.83 0.7
6 0.5 8.33 333.0 8.33 1
7 0.5 8.33 500.0 12.50 1.5
8 0.5 8.33 666.0 16.66 2
典型的な実験においては、セライト545を丸底フラスコに添加し、次に10mlのH2Oに溶解したNaOHを添加した。撹拌しながら48時間還流した。濾過し、水およびアセトンで洗浄し、そして空気乾燥した。デシケーター中に保存した。実施例1の結果および結論:FTIR分析が行われ、出発物質に比較して、水和表面の−OHシグナルの増加を示した。

0030

実施例2
本実験は、スーパーファインスーパーフロスセライト(SUPERFINESUPREFLSSCELITE)(Manville)のDNA結合能力がいかにして測定されるか、およびPrep−A−Gene DNA精製キットといかにして比較されるかを記載する。

0031

材料
スーパーファインスーパーフロスセライト(SFSF)(マンビル(Manville)、Denver,COのサンプル、(水中で1:5w/w))
λDNA(BRLカタログ番号56125A、ロットAJU702)
50mMトリス(pH7.0)(1Mストックから希釈)(BRLカタログ番号5505UA、ロット60926)
(Prep−A−Geneキット(バイオラッド(Bio−Rad)、Richmond,CA))
結合緩衝液(6Mストックから希釈)、NaClO4:フィッシャー(Fisher)カタログ番号5490−500、ロット914199
洗浄緩衝液80%エタノール(50mMトリス中、pH7.0)
溶出緩衝液ミリQ水
エチジウムブロマイド(10mg/ml)シグマ(Sigma)カタログ番号E−8751、ロット99F3722
1%アガロースBRLカタログ番号5510UA、ロット9N2204
1×TAE(50×ストックより)トリス塩基−Sigmaカタログ番号T−1503,ロット80H5633、酢酸−フィッシャー A38−500、EDTA−Sigmaカタログ番号ED255、ロット117F−0026
TypeIIローディング染料(25%Ficoll400、0.25%ブロムフェノールブルー、0.25%キシレンシアノール、Ficoll400−Sigmaカタログ番号F4375、ブロムフェノールブルー−バイオラッドカログ番号161−0404、ロットM1264、キシレンシアノール−Sigmaカタログ番号X−4126、ロット8043740)
Type57およびType55ポラロイドフィルム(POLAROIDFilm)
方法
1.2グループの反応物を用意し、一つを各表面タイプに用いる。各表面は50μlのDNA溶液を含む8つのチューブを有する。この溶液は、50μlの50mMトリス(pH7.0)中に0.5μlのλDNAを含み、31μg/反応とする。滴定は0M NaClO4から6M NaClO4の範囲である。

0032

2.各反応物に20μlの各表面を加える。

0033

3.滴定に従い、400μlの結合緩衝液を加える。Prep−A−Geneについては、0M,2M,2.5M,3M,3.5M,4M,4.5M,および6MのNaClO4であった。SFSFについては、滴定は0M,1M,1.5M,2M,2.5M,3M,3.5M,および4M NaClO4であった。

0034

4.ロッキングして、室温で10分間インキュベートする。

0035

5.遠心分離し、そして上清を捨てる。

0036

6.80%エタノール/50mMトリス(pH7.0)により2回沈殿を洗浄する。

0037

7.37℃において10分間、20μl H2OにDNAを溶出する。

0038

8.遠心分離し、そして別のチューブに上清を移す。溶出工程を繰り返し、そして総量約40μlに上清を混合する。

0039

9.各チューブにTypeIIローディング染料を2μl加える。

0040

10.1×TAE緩衝液を用いた1%アガロースで電気泳動する。1×TAE緩衝液を用いて100−130ボルトで約25分間泳動する。

0041

11.エチジウムブロマイド水溶液(約1:1000)で15分間染色する。約20−30分間脱色する。

0042

12.Type57ポラロイドフィルムを用いて紫外線下写真を撮る。可能であれば、Type55フィルムでネガティブを撮る。

0043

結果および結論
SFSFセライトは、DNAを結合するために3M NaClO4を必要とするPrep−A−Geneのマトリックスと比較して、2.5mMの濃度のNaClO4を用いる結合緩衝液において強くDNAを結合する。この理由から、SFSFは、水和表面に匹敵する標準物として使用される。

0044

実施例3
以下の実験の目的は、どの濃度における結合緩衝液において、水和SiO2がサンプルからのDNA回収を可能にするかを決定することである。結果をスーパーファインスーパーフロスセライトと比較する。

0045

表面
1.酸洗浄セライト545+0.05eqNaOH
2.酸洗浄セライト545+0.1eqNaOH
3.酸洗浄セライト545+0.3eqNaOH
4.酸洗浄セライト545+0.5eqNaOH
5.酸洗浄セライト545+0.7eqNaOH
6.酸洗浄セライト545+1eqNaOH
7.酸洗浄セライト545+1.5eqNaOH
8.酸洗浄セライト545+2.0eqNaOH
9.スーパーファインスーパーフロスセライト
外の材料および方法は前記のとおりであり、そして実質的には実施例2にしたがって実施される。

0046

結果:
試験表面に対する強いDNA結合に
セライト+DNA 必要な結合緩衝液の濃度
DNA結合1N−4M[NaClO4]
0.05eqNaOH +
0.10eqNaOH +
0.30eqNaOH ++ 1.5M
0.50eqNaOH ++ 2.0M
0.70eqNaOH ++ 2.0M
1.0eqNaOH ++ 2.0M
1.5eqNaOH ++ 1.5M
2.0eqNaOH +++ *
SFSFセライト ++ 3.0M
+滴定を通じてわずかな量のDNAの溶出。

0047

++ 1.5,2.0または3.0M NaClO4においてほとんど全量のDNAが溶出。

0048

+++滴定を通じてほとんど全量のDNAが溶出。

0049

自然条件において溶出されたDNA。室温において水中においてDNAが結合し、そして37℃において溶出された。

0050

結論
ゲル電気泳動の結果から、セライトに対するNaOH量が増加するにつれて、もたらされる表面からのDNAの回収が増加したことが証明される。NaOH:セライトのモル比が2.0に到達すると自然条件下においてDNAが回収された(結合緩衝液を必要としない)。ほとんどの表面はSFSFセライトよりも良好にDNAを単離し、この結果を得るのに通常必要とする濃縮量の結合緩衝液を必要としなかった。

0051

本発明を特定の態様にしたがって記載してきたが、その詳細は限定されるように理解されるべきではなく、本発明の精神または範囲を逸脱することなく、さまざまな均等、変更および改変がなされるのは明らかであり、そしてそのような均等な態様はここに含まれると理解される。

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